DE10029705A1

DE10029705A1 - Herstellung von IgY(AFc)-Antikörpern und deren Verwendung

Info

Publication number: DE10029705A1
Application number: DE10029705A
Authority: DE
Inventors: Victor Chiou
Original assignee: Good Biotech Corp
Current assignee: Good Biotech Corp
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2002-01-03
Also published as: US6608172B1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von IgY(DELTAFc)-Antikörpern aus Vogeleigelb, das im Allgemeinen folgende Schritte umfasst: Immunisierung eines weiblichen Geflügels mit einem Antigen, teilweise Reinigung der gesamten Antikörper aus den von der Henne gelegten Eiern und Immunoaffinitätsreinigung der gegen das Antigen gebildeten Antikörper, wobei die Bindung der Antikörper an das Antigen im Immunoaffinitätsreinigungsschritt bei einem pH-Wert zwischen 4 und 7 und einer Ionenstärke von weniger als 50 mM stattfindet. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem den damit hergestellten IgY(DELTAFc)-Antikörper sowie verschiedene Verwendungsmöglichkeiten des neuen IgY(DELTAFc)-Antikörpers.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung des IgY(ΔFc)-Antikörpers aus Vogeleigelb und den daraus hergestellten IgY(ΔFc)- Antikörper. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verwendungen des neuen IgY(ΔFc)-Antikörpers zur quantitativen oder qualitativen Analyse eines betreffenden ätiologischen Agens.

2. Beschreibung des verwandten Fachgebiets

Die Verwendung von Antikörpern ist in vielen biologischen Untersuchungen und kli nischen Anwendungen weit verbreitet. Die gebräuchlichste Quelle für polyklonale Antikörper sind Seren, die aus hyperimmunisierten Säugetieren gewonnen werden. Antikörper, die man aus derartigen Quellen erhält, gehören einer Gruppe von Protei nen mit der Bezeichnung "Immunoglobuline" an, unter denen das Immunoglobulin G (IgG) am häufigsten vorkommt. Das IgG-Molekül besteht aus drei Domänen, nämlich zwei Fab-Regionen und einer Fc-Region. Die Fab-Region ist hauptsächlich an der Antigen-Bindung beteiligt. Obwohl die Fc-Region nicht an ein Antigen bindet, kontrolliert sie mehrere biologische Aktivitäten eines Antikörpers, wie beispielsweise Komplementbindung und Fc-Rezeptor-Bindung.

Auf dem Gebiet der Immundiagnose ist ein intaktes IgG-Molekül nicht für die Verwendung in Nachweissystemen und immunologischen Assays geeignet, bei denen Seren von Säugetieren beteiligt sind, da die Fc-Region eines IgG-Moleküls in der Lage ist, an Fc-Rezeptoren zu binden, das Komplementsystem zu aktivieren und mit dem rheumatoiden Faktor in Seren von Säugern zu reagieren. Das Entfernen der Fc-Region eines IgG-Moleküls führte häufig zu einer Verringerung dieser Beeinträchtigung (E. Lamoyi, Methods in Enzymology 121: 652-663, (1986)).

Einige der vorgeschlagenen Möglichkeiten zur Verwendung von Antikörpern in der Immuntherapie beinhalten die Behandlung von Patienten, die mit Bakterientoxinen oder Schlangengiften vergiftet wurden (siehe z. B. U.S. 5,340,923 und U.S. 5,601,823) und den Schutz von neugeborenen Ferkeln vor einer tödlichen enteri schen Kolibazilleninfektion (siehe, z. B. H. Brussow et al., J. Clin. Microbiol. 25: 982 (1987); und C. O. Tacket et al., New Eng. J. Med. 318: 1240 (1988)). Da das Fc- Fragment eines Antikörper-Moleküls den Teil des Immunoglobulins darstellt, der die meisten antigenen Eigenschaften besitzt (E. M. Akita et al., J. Immunol. Methods 162: 155-164 (1993)), wird dessen Abspaltung, aus der die Bildung eines F(ab')₂- Fragments resultiert, die Zahl möglicher allergener Stellen auf dem Immunoglobulin- Molekül beträchtlich verringern und ist daher für Menschen oder Tiere vorteilhaft, welche Immunoglobuline verabreicht bekommen.

Vor kurzem wurde gezeigt, dass das divalente F(ab')₂-Antikörper-Fragment in im mundiagnostischen Tests vorteilhafter (M. Muratsugu et al., J. Colloid Interface Sci. 147: 378 (1991); und J. L. Ortega-Vinuesa et al., J. Immunol. Methods 90: 29 (1996)) und für die Entwicklung von Immunoassays, an denen Säugetier-Seren beteiligt sind, besser geeignet ist als das Ausgangs-IgG.

Dennoch fand das F(ab')₂-Antikörper-Fragment keine so breite Verwendung in klini schen immundiagnostischen Kits wie man erwarten würde. Dies mag daran liegen, dass die Massenproduktion von F(ab')₂-Antikörper-Fragmenten, die her kömmlicherweise durch Pepsinverdauung von IgG und anschließender Reinigung mittels Chromatographie erreicht wird, schwierig und kostenineffizient ist.

Enten und ihre phylogenetisch engen Verwandten sowie einige Reptilien, wie bei spielsweise Schildkröten, besitzen drei Arten von Serumimmunoglobulinen: ein makromolekulares Immunoglobulin IgM (800 kDa bei Enten), sowie zwei Isoformen von IgG mit niedrigem Molekulargewicht, die einen Sedimentationskoeffizienten von 7,8 S (180 kDa bei Enten) bzw. 5,7 S (130 kDa bei Enten) haben (E. R. Unanue et al., J. Exp. Med. 121: 697-714 (1965); H. M. Grey, J. Immunol. 98: 811-819 (1967); und B. Zimmermann et al., Biochemistry 10: 482-484 (1971)). Vogel-IgG wird oft IgY genannt, weil es im Eigelb vorhanden ist. Das 5,7 S IgY, das kürzere schwere Ketten enthält, gleicht in seiner Struktur und Antigenwirkung dem F(ab')₂-Fragment des 7,8 S IgY (Fig. 1), und diese Tatsache führt dazu, dass die Nomenklatur von IgY (Entsprechung zum 7,8 S IgY) und IgY(ΔFc) (Äquivalent zum 5,7 S IgY) beide Isoformen des IgY repräsentiert (K. E. Magor et al., J. Jmmunol. 149: 2627-2633 (1992)).

Studien, die an Hand von infizierten oder experimentell immunisierten Vögeln durchgeführt wurden, zeigten, dass den Antikörpern von Enten eine Reihe biologi scher Effektorfunktionen fehlen, einschließlich Komplementbindung und Fc-Rezep tor-Bindung, ohne dass sie ihre Bindeaktivität an die entsprechenden Antigene verlieren (G. W. Litman et al., Immunochemistry 10: 323 (1973); und T. E. Toth et al., Avian Dis. 25: 17-28 (1981)). Dies könnte durchaus vom offensichtlichen Fehlen einer Fc-äquivalenten Region des IgY(ΔFc)-Antikörpers herrühren, der men genmäßig die Hauptkomponente in der Antikörper-Antwort von Enten darstellt. Es wird daher angenommen, dass der IgY(ΔFc)-Antikörper, der scheinbar ein strukturelles und funktionelles Analogon des F(ab')₂-Fragments ist, enorme Vorteile bei der immunologischen Verwendung bieten würde, wenn ein vielversprechendes Verfahren für die Herstellung des Antikörpers entwickelt und die entsprechende physikalischen Voraussetzungen für seine Aktivität werden identifiziert werden könnten.

Es wurde berichtet, dass Vogeleigelb-Antikörper genauso wie Säuger-Antikörper nützliche Eigenschaften sowohl für die Forschung als auch für die klinische Anwen dung besitzen (siehe z. B. U.S. 5,340,923; U.S. 5,585,098; U.S. 5,601,823; und U.S. 5,976,519). Eigelb, das man von einer Legehenne erhält, ist kostengünstig und praktischer und sicherer im Umgang verglichen mit hyperimmunisierten Seren von Säugern. Noch wichtiger ist, dass die Eigelb-Antikörper die genaue Prüfung unter den heutigen Tierschutzvorschriften bestehen kann (A. Polson et al., Immunol. Commun. 9: 475 (1980); und B. Gottstein et al., Z. Parasitenkunde 71: 273 (1985)). Diese Tatsachen legen eine mögliche Verwendung von Eigelb als kommerzielle Quelle für Antikörper nahe.

Es wurden Versuche unternommen, IgY aus Eigelb zu isolieren und zu reinigen. So wurden beispielsweise Materialien einschließlich Agar, Pektin (Japanese Kokai No. 64-38098, veröffentlicht am 8. Februar 1989), Dextransulfat (J. C. Jensenius et al., J. Immunol. Methods 108: 205 (1988)), natürliche Gummi (H. Hatta et al., J. Food Sci ence 53: 425 (1988)) und Polyethylenglycol (PEG) (A. Polson et al., Immunol. Invest. 14: 323 (1985); siehe auch U.S. 4,550,019 erteilt für A. Polson) benutzt, um nicht- wässerige Biomoleküle - hauptsächlich Lipide und Dotter-Granula - auszufällen, um dadurch eine wasserlösliche Phase zu erhalten, die eine Vielzahl an Eigelb-Antikör pern enthält. A. Hassl et al. entwickelten zur weiteren Isolierung von Eigelb-Antikör pern aus einer PEG-gereinigten Fraktion ein zwei Schritte umfassendes chromato graphisches Verfahren, das eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und eine Größen-Ausschluss-Chromatographie umfasst (A. Hassl und H. Aspock, J. Immunol. Methods 110: 225 (1988)). Akita et al. beschrieben ein verbessertes Ver fahren zur Isolierung von IgY, bei dem Eigelb-Antikörper aus Hühnereiern extrahiert wurden, indem das Eigelb mit einem großen Volumen an Wasser verdünnt und der daraus entstandene Überstand dann der Größen-Ausschluss-Chromatographie und/oder der Ionenaustauschchromatographie unterzogen wurde (E. M. Akita et al., J. Immunol. Methods. 160: 207 (1993); und E. M. Akita und S. Nakai, J Food Sci. 57: 629 (1993)).

Dennoch konzentrieren sich all diese Studien und Patente lediglich auf die Isolierung der gesamten Population an Eigelb-Antikörpern (die mindestens IgY und IgY(ΔFc) einschließen) aus Vogeleiern, anstatt auf die Reinigung allein des IgY(ΔFc)- Antikörpers. Da der IgY(ΔFc)-Antikörper außerdem nur bei Vögeln vorkommt, die der Ordnung Anseriformes angehören, einschließlich Ente und Gans, stellen die Isolierungsverfahren, die bei Hühnervögeln wie Huhn und Truthahn eingesetzt werden, keine Anregung für eine erfolgreiche Reinigung von IgY(ΔFc)-Antikörpern dar.

Im Jahre 1989 versuchte D. A. Higgins, Antikörper aus hyperimmunisierten Entense ren herzustellen, wobei die Antikörper, die einer Affinitätsreinigung bei einem pH- Wert von 8,0 und 0,5 M NaCl unterzogen wurden, im Allgemeinen keine effektiven Ausfällungs- oder Agglutinationsreaktion gezeigt haben (D. A. Higgins, Comp. Biochem. Physiol. 93B: 135-144 (1989)). Wie Higgins in der Literatur behauptete, liegt der optimale pH-Wert für die Bildung von Enten-Antikörper-Präzipitinen zwischen pH 8,5 und pH 9,05. Seitdem gab es keine kritische Studie mehr, welche die Isolierung des IgY(ΔFc)-Antikörpers und seine mögliche Anwendung betrifft.

Daher besteht für dieses Fachgebiet der Bedarf an einem schnellen, kosteneffizienten Verfahren mit hohem Durchsatz, das die einfache Isolierung des gewünschten IgY(ΔFc)-Antikörpers aus dem Antikörper-Pool unter Aufrechterhaltung von dessen Aktivität bietet. Darüber hinaus ist auf dem Fachgebiet ein im Wesentlichen gereinigter IgY(ΔFc) von Nöten, der eine neue Art F(ab')₂-Antikörper für verschiedene Verwendungsmöglichkeiten auf dem Gebiet der Immundiagnostik und der Immuntherapie darstellt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde umfassend geforscht, um die industriellen Anforderungen für die oben ge nannten Eigelb-Antikörper zu erfüllen. Überraschenderweise fanden wir heraus, dass sich eine erfolgreiche Isolierung von IgY(ΔFc)-Antikörpern aus Vogeleigelb problemlos mit Hilfe eines vereinfachten Verfahrens unter einer optimalen Bindungsvoraussetzung für die Wechselwirkung zwischen dem Antigen und dem Antikörper während der Immunaffinitätsreinigung durchführen lässt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine neue Art von F(ab')₂-Antikörpern, also der im Wesentlichen gereinigte IgY(ΔFc), ganz einfach mit einer hohen Ausbeute nach wirtschaftlichen Gesichtspunkten hergestellt werden. Die so produzierten IgY(ΔFc)- Antikörper können für eine Vielzahl von verschiedenen immunologischen Anwendungsmöglichkeiten verwendet werden.

Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Her stellung von IgY(ΔFc)-Antikörpern aus von Hennen gelegten Eiern zur Verfügung zu stellen. Allgemein umfasst das Verfahren die Schritte der Immunisierung eines weiblichen Geflügels mit einem Immunogen, der teilweisen Reinigung der gesamten Antikörper aus den von der Henne gelegten Eier, und einer Affinitätsreinigung der gegen das Immunogen gebildeten Antikörper, wobei das Binden der Antikörper an das Immunogen/Antigen im Immunaffinitäts-Reinigungsschritt in einer leicht sauren Umgebung mit einer geringen Ionenstärke durchgeführt wird. Besonders die Antikörper-Antigen-Wechselwirkung wird bei einem pH-Wert zwischen pH 4 und pH 7 und mit einer Ionenstärke von weniger als 50 mM durchgeführt, um ein optimales Ergebnis zu erhalten.

Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Herstellung von IgY(ΔFc) aus Eigelb zur Verfügung, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Immunisierung eines weiblichen Geflügels mit einem ausgesuchten Antigen, so dass sich die gegen das Antigen gebildeten Geflügel-Antikörper im Eigelb ansammeln;
b) Gewinnung des Eigelbs der immunisierten Henne und Entfernen der nicht wässerigen Biomoleküls und Granula daraus, um dadurch eine wasserlösliche Fraktion zu erhalten, die die Eigelb-Antikörper enthält;
c) Durchleiten der wasserlöslichen Fraktion durch eine inerte Trägermatrix die mit dem darauf befindlichen Antigen immobilisiert wurde bei einem pH- Bereich zwischen pH 4 und pH 7 und mit einer Ionenstärke von weniger als 50 mM, um die Bildung von Immunkomplexen aus dem immobilisierten Antigen und der Eigelb-Antikörpern zu ermöglichen; und
d) Dissoziation und Elution der Eigelb-Antikörper von dem immobilisierten Antigen.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen IgY(ΔFc)- Antikörpers, der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wird. Darüber hinaus ist es Gegenstand der Erfindung, Verwendungsmöglichkeiten des derart hergestellten IgY(ΔFc)-Antikörpers in Klinik und Forschung zur Verfügung zu stellen. Neben der Kosteneffizienz und der einfachen Herstellung hat der erfindungsgemäße IgY(ΔFe)-Antikörper den Vorteil, gegenüber dem Komplementsystem und den rheumatoiden Faktoren in Säugetier-Seren inaktiv zu sein, und geringe Kreuzreaktivität mit IgG von Säugern zu zeigen. Damit ist er für die Verwendung in immunologischen Assays, bei denen Seren von Säugern beteiligt sind, besonders geeignet, da es nur zu minimalen Interferenzen kommt. Dem Fachmann ist bekannt, dass der Antikörper in Form eines einzelnen Reagens für die Verwendung in Klinik, Forschung und anderen Gebieten vorkommen kann oder, als aktive Komponente, Teil eines kommerziellen Kits sein kann.

Ein weiterer spezieller Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Rea gens für die Analyse eines gewünschten ätiologischen Agens mittels Immunoassay, welches einen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten IgY(ΔFc)- Antikörper umfasst.

Ziel dieser Erfindung ist es auch, ein Immunoassay-Verfahren und einen handelsüblichen Kit für die Durchführung des genannten Immunoassays zur Verfügung zu stellen, wobei ein Antikörper, bevorzugt ein erfindungsgemäß gereinigter IgY(ΔFc)-Antikörper, gegen ein ätiologisches Agens in An- oder Abwesenheit des betreffenden ätiologischen Agens unter für die Bindung an das ätiologische Agens optimalen Bedingungen inkubiert wird, um dadurch das ätiologische Agens quantitativ oder qualitativ zu analysieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine optimale Bedingung dann vorhanden, wenn der pH- Wert in einem Bereich von pH 4 und pH 7 liegt und die Ionenstärke geringer als 50 mM ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Die oben genannten sowie weitere Ziele und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen in Bezug auf die folgende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen offensichtlich, wobei:

Fig. 1 ein schematisches Diagramm darstellt, das ein repräsentatives IgG eines Primaten und die IgY-Isoform der Ente zeigt;

Fig. 2 den Enten-Eigelb-Antikörper zeigt, der in dieser Erfindung herge stellt, über ein SDS-Polyacrylamidgel geleitet und mit Coomassie Blue gefärbt wurde: ein Molekulargewichtsmarker in Spur 1; den Antikörper-Roh-Extrakt in Spur 2; den Durchfluss des Antikörper- Roh-Extraktes nach der Immunaffinitätschromatographie in Spur 3; und die affinitätsgereinigten Antikörper in dem Eluat in Spur 4;

Fig. 3 die Standardkurve für C-reaktives Protein (CRP) zeigt: Durchmesser des Immunopräzipitinrings gegen die Konzentration an C-reaktivem Protein (mg/dl, in logarithmischem Maßstab) für Serum-Standards;

Fig. 4 einen Vergleich der CRP-Konzentration zeigt, einmal erhalten mittels eines erfindungsgemäßen SRID-Assays, und einmal mittels eines kommerziellen immunturbidimetrischen Assays;

Fig. 5 einen ELISA-Assay zeigt, in dem der erfindungsgemäße IgY(ΔFc)- Antikörper verwendet wird, um die Konzentration von CRP zu bestimmen; und

Fig. 6a-b einen partikelverstärkten turbidimetrischen Immunoassay zeigen, in dem der erfindungsgemäße IgY(ΔFc)-Antikörper mit einem Latex- Partikel verbunden ist und zur Bestimmung der CRP-Konzentration verwendet wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Verfahren zur Herstellung von IgY(ΔFc) aus Eigelb allgemein die folgenden Schritte umfassen: (1) Immunisierung einer Le gehenne; (2) teilweise Reinigung des Eigelbs; (3) Immunoaffinitätsreinigung; und (4) Elution des Antikörpers.

(1) Immunisierung einer Legehenne

Ein weiblicher Vogel der Ordnung Anseriformes, vorzugsweise eine Ente oder eine Gans, wurde mit einem Antigen immunisiert, um die Produktion eines betreffenden Antikörpers oder von betreffenden Antikörpern auszulösen. Das Antigen schließt einen Mikroorganismus ein, wie beispielsweise ein pathogenes oder nicht pathogenes Bakterium, ein Virus, einen Pilz, Protozoa, Nematoden oder ähnliches, ein natürlich vorkommendes oder synthetisches Protein wie beispielsweise ein Toxin oder ein Hormon, ein natürlich vorkommendes oder synthetisches Oligopeptid, ein rekombinantes Protein oder ein Fragment davon, und jegliches anderes Material, das in der Lage ist, die Produktion von Antikörpern anzuregen, sowie eine Kombination davon, beschränkt sich jedoch nicht auf die genannten.

Es wird angenommen, dass der Antikörper entweder aus dem Vogelserum oder den von dem Vogel gelegten Eiern erhalten werden kann. Dennoch wird, wie oben beschrieben, die Gewinnung des Antikörpers aus dem Ei aus Kostengründen bevorzugt. Die Legehenne überträgt beide Isotypen, sowohl IgY als auch IgY(ΔFc) aus dem Serum in das Eigelb. Im Prinzip enthält das Ei einer Ente im Eigelb etwa 1-4 mg IgY/ml und etwa 3-12 mg IgY(ΔFc)/ml und daher könnte jedes Ei möglicherweise 15-80 mg IgY und 45-240 mg IgY(ΔFc) bereitstellen. Das riesige Volumen an Eigelb, das in großen Mengen produziert wird, übersteigt das Volumen des Serums, das man auf sichere Art und Weise von einem Vogel über einen beliebigen Zeitraum erhalten kann. Darüber hinaus kann die Gewinnung von Eigelb-Antikörpern in großem Umfang ohne teure Investitionen durchgeführt werden.

Die Verfahren zur Immunisierung einer Henne mit ausgewählten Antigenen sind dem Fachmann wohl bekannt. Es wird nicht beabsichtigt, auf ein bestimmtes Immunisie rungsverfahren hinzuweisen. Die vorliegende Erfindung zieht alle Immunisierungs verfahren in Betracht, die durch Inokulation mit einem Antigen auf geeignete Weise, einschließlich subkutaner, intrakutaner, intramuskulärer und intravaskulärer Injektion, durchgeführt werden können.

Vorzugsweise wird ein geeignetes Adjuvans in Verbindung mit dem Antigen verab reicht, um die Immunantwort zu verbessern. Besonders bevorzugt wird eine Dosis komplettes Freund-Adjuvans allein oder gegebenenfalls in Kombination mit einer nachfolgenden Dosis inkomplettem Freund-Adjuvans verwendet. Man fand heraus, dass die Verwendung eines geeigneten Adjuvans äußerst wirksam ist, wenn es darum geht, einen hohen Antikörper-Titer in den Eiern einer immunisierten Henne über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten, und dadurch die effiziente Herstellung der gewünschten Antikörper zu ermöglichen.

Während der Immunisierung wird eine Henne anfangs am Tag Null mit dem Antigen geimpft. Anschließend wird das Antigen in Intervallen verabreicht. Das Intervall zwi schen der anfänglichen Immunisierung und der ersten Auffrischungsimpfung sowie zwischen den einzelnen Auffrischungsimpfungen hängt von den spezifischen Eigen schaften des Antigens ab und beträgt vorzugsweise mindestens zwei Wochen. Ge wöhnlich wird 10 Wochen nach der ersten Immunisierung sowohl im Körper der Henne als auch im gelegten Ei eine große Menge an reaktiven Antikörpern gegen das Antigen produziert. Das Vorhandensein und das Niveau des Titers des spezifischen Antikörpers gegen das Antigen in den Seren der Eier der Henne kann mit Hilfe einer Reihe von im Stand der Technik bekannten Verfahren bestätigt werden.

(2) Teilweise Reinigung des Eigelbs

Ein Verfahren zur teilweisen Reinigung wird ausgeführt, um die Mehrheit der nicht wässerigen Biomoleküle und Granula und vorzugsweise die Mehrheit an unwichtigen Proteinen aus dem Eigelb zu entfernen. In der vorliegenden Erfindung kann jedes herkömmliche Verfahren, das diesen Zweck wirksam erfüllt, verwendet werden - bei spielhaft seien die Verwendung von PEG, Dextransulfat oder natürlichem Gummi wie beispielsweise Natriumalginat, Karragheen- und Xanthangummi genannt - um die unerwünschten Substanzen mit auszufällen und die Verwendung eines wässerigen Puffers oder von Wasser, um eine wässerige Phase zu erhalten, die reich an Antikörpern ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Eigelb zuerst vom Eiweiß getrennt und dann mit destilliertem Wasser gewaschen, um so viel Albumen zu entfernen wie möglich. Die das Eigelb umgebende Vitellinschicht wird punktiert und die getrennte Eigelbfraktion wird dann mit einer wirksamen Menge an wässerigem Puffer oder Wasser verdünnt, um eine Suspension des Eigelbs zu erhalten. Vorzugsweise wird das gewonnene Eigelb mit einem wässerigen Puffer oder destilliertem Wasser in einem Verhältnis von ungefähr 1 : 2 bis 1 : 40 Vol.-% verdünnt und besonders bevorzugt liegt das Verhältnis zwischen 1 : 5 und 1 : 30 Vol.-%. Es wird berichtet, dass der pH-Wert während des Stadiums der teilweisen Reinigung ein entscheidender Faktor ist (E. M. Akita und S. Nakai, J. Food Sci. 57: 629 (1993)). Um am meisten Eigelb-Antikörper gewinnen zu können, wird der pH- Wert in einem Bereich zwischen pH 5 und pH 7 eingestellt. Bevorzugterweise liegt die Temperatur bei diesem Schritt zwischen 0°C und 60°C. Die Eigelb-Suspension wird leicht geschüttelt, um eine homogene Mischung zu erhalten, anschließend wird sie über einen Zeitraum stehengelassen, der für die Bildung wässeriger und nichtwässeriger Phasen ausreichend ist. Die wasserunlöslichen Bestandteile, einschließlich der nichtwässerigen Biomoleküle wie Lipoproteine, Phospholipide, Sterine und ähnliche werden dann aus der wässerigen Eigelb-Suspension mittels Zentrifugation entfernt. Der resultierende den Antikörper enthaltende Überstand kann dann durch Dekantieren, Saugen oder ähnlichen im Stand der Technik bekannten Verfahren von dem viskosen Präzipitat getrennt werden.

Gegebenenfalls, aber vorzugsweise, wird der Eigelb-Überstand mit einer hohen Konzentration an nicht denaturierenden Salzen weiter behandelt, um die Ausfällung der Antikörper zu erreichen. Beispiele für Salze, die für die Ausfällung von Eigelb- Antikörpern von Nutzen sind, schließen NaCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, KCl, CaCl₂ und MgSO₄ ein, beschränken sich jedoch nicht auf diese. Vorzugsweise werden Na₂SO₄ und (NH₄)₂SO₄ verwendet. Die Salzkonzentration für die Ausfällung der Antikörper ist wichtig und beträgt, abhängig von der Art des Salzes, gewöhnlich mehr als 15 Gewichtsprozent und weniger als 35 Gewichtsprozent, vorzugsweise liegt sie zwischen 20 und 30 Gewichtsprozent auf der Basis des Endvolumens des Eigelbüberstands.

(3) Immunoaffinitätsreinigung

Der Begriff "Immunoaffinitätsreinigung" oder "Immunoaffinitätschromatographie", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf eine Art des Auftrennungsverfahrens, das auf den Adsorptionsmerkmalen von Antikörpern gegen ein spezifisches Antigen basiert. Das bedeutet, dass die Antikörper, die unter einer bestimmten Voraussetzung an ein spezifisches Antigen binden, von den unter dieser Voraussetzung ungebundenen Antikörpern getrennt werden. Die vorliegende Erfindung schlägt die Verwendung einer Immunoaffinitätsreinigung zur Entfernung unwichtiger Proteine, einschließlich Proteine anderer Immunglobuline und nicht-Antigen-bindender Immunglobuline, vor. Viel wichtiger ist, dass das erfindungsgemäße Immunoaffinitätsreinigungsverfahren ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung entscheidend erfüllt, nämlich die wesentliche Trennung der gewünschten IgY(ΔFc)-Antikörper von der gesamten Population an Eigelb-Antikörpern, einschließlich IgY.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Immunoaffinitätsreinigung unter Ver wendung einer "Antigen-Matrix" durchgeführt, die ein Antigen umfasst, welches auf einem unlöslichen Träger immobilisiert wird. Die Art des Träger spielt keine entscheidende Rolle für die erfindungsgemäße Immunoaffinitätsreinigung. Jedes herkömmliche Trägermaterial, das sich für die kovalente Anlagerung eines Antigens eignet und das inert ist gegenüber der Interaktion zwischen dem gewünschten Antikörper und dem darauf immobilisierten Antigen, kann dabei verwendet werden. Normalerweise besteht der Träger aus quervernetzter Agarose oder quervernetztem Dextran wie beispielsweise der CNBr-aktivierten Sepharose 4B, die von Pharmacia vertrieben wird.

Die in Schritt (2) teilweise gereinigten Antikörper werden in einem "Bindungspuffer" gelöst und auf die Antigen-Matrix aufgetragen, so dass die Immunkomplexe des immobilisierten Antigens und die Eigelb-Antikörper gebildet werden können. Jegliches Puffersystem, das gegenüber der Antigen-Antikörper-Interaktion inert bleibt und das in der Lage ist, die gewünschten Bedingungen für eine Bindung aufrechtzuerhalten, ist für die vorliegende Erfindung geeignet. Vorzugsweise wird der Bindungspuffer aus der Gruppe bestehend aus einem Phosphatpuffer, einem MES- (2-[N-Morpholino-]Ethan-Sulfonsäure)Puffer und einem bis-Tris-Puffer ausgewählt, wobei ein MES-Puffer in einer Konzentration von 20 mM besonders bevorzugt ist.

Der Begriff "Durchfluss", so wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, soll die An tikörper-Lösung darstellen, die die Antigen-Matrix passiert und die die Mehrheit der nicht bindenden Substanzen enthält.

Auf der Grundlage des allgemeinen Fachwissens über Immunoaffinitätsreinigung, wird die Bildung eines Immunkomplexes gewöhnlich bei einem pH-Wert von etwa pH 7 bis pH 9 und bei einer Ionenstärke, die höher als 150 mM ist, empfohlen. Unter diesen Bedingungen jedoch scheinen die Eigelb-Antikörper, insbesondere die aus dem Eigelb von Enten gewonnenen, weniger leicht maximal an das auf den chro matographischen Trägern immobilisierte Antigen zu binden. Die aktiven Antikörper waren noch immer im Durchfluss vorhanden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren sind die Voraussetzungen für die Immunoaffinitätsreinigung von IgY(ΔFc)-Antikör pern einmalig. In der Erfindung binden aus Eigelb gewonnene Antikörper optimal in einer leicht sauren Umgebung und mit einer niedrigen Ionenstärke, das heißt bei ei nem pH-Wert zwischen pH 4 und pH 7 und einer Ionenstärke, die unter 50 mM liegt. Vorzugsweise konnten die Antikörper mit dem immobilisierten Antigen bei einem pH- Wert zwischen pH 5 und pH 6 interagieren, besonders bevorzugt lag der pH-Wert zwischen pH 5,6 und pH 5,8. Unter den in der vorliegenden Erfindung offenbarten Bedingungen für eine Bindung wurde kein aktiver Antikörper mehr in dem Durchfluss nachgewiesen.

(4) Elution des Antikörpers

Der Begriff "Elutionsmittel", wie er hier benutzt wird, bezieht sich auf eine chemische Lösung, die in der Lage ist, einen an die Antigen-Matrix gebundenen Antikörper zu dissoziieren, die Antigen-Matrix zu passieren und ein "Eluat" zu umfassen. Im Allgemeinen sind die Elutions-Bedingungen, welche die Eigelb-Antikörper-Antigen Interaktion aufheben, milder als die bei einer Säuger-Antikörper-Antigen Interaktion.

Typischerweise zeigt ein Elutionsmittel, das bei einem pH-Wert von unter pH 4 oder über pH 8 gepuffert ist, eine gute Wirkung bei der Eliminierung von IgY(ΔFc)-Antigen Wechselwirkungen. Die Elutionsmittel mit einem extremen pH-Wert jedoch sind normalerweise nicht zu empfehlen, da eine solch extreme Bedingung möglicherweise dazu führen könnte, dass die Antigen-Bindungsfähigkeit der Antikörper in einem beträchtlichen Maße verloren geht.

Als Alternative kann ein Elutionsmittel, das eine hohe Konzentration eines chaotropen Agens enthält, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Be griff "chaotropes Agens" oder "Chaotrop", wie er hier gebraucht wird, bezieht sich auf eine Chemikalie, die in der Lage ist, eine Konformationsänderung in einem Protein- Molekül wie beispielsweise dem erfindungsgemäßen IgY(ΔFc)-Molekül auszulösen und daher oft als Protein denaturierendes Agens bekannt ist. Ein chaotropes Elutionsmittel unterbricht die Wechselwirkung zwischen dem Antigen und dem Anti körper dadurch, dass es im Wesentlichen die hydrophoben Bindungsregionen in einer wässerigen Phase löst. Gemäß der Erfindung können die meisten der gebundenen Antikörper erfolgreich mit jedem neutralen Puffer, der eine moderate Konzentration (< 1 M) eines chaotropen Agens enthält, eluiert werden. In den meisten Fällen wird die Entfernung des Chaotrops nach der Elution die native Protein-Struktur wieder herstellen.

Die Elutionsmittel, die für die Immunaffinitätsreinigung verwendet werden können, schließen 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,3; 0,1 M Glycin-HCl, pH 10,0; 6 M Guanidin-HCl, pH 3,0; 3,0 M Kaliumchlorid; 5 M Kaliumiodid; 3,5 M Magnesiumchlorid; 1-3 M Am monium-/Natriumthiocyanat und 6 M Harnsäure ein, sie beschränken sich jedoch nicht auf diese Beispiele. Im Hinblick auf die Aktivität der gewonnenen Antikörper ist jedoch ein Chaotrop-haltiger, neutraler pH-Puffer sowie 3 M Natriumthiocyanat, gepuffert in 20 mM MES-Puffer (pH 5,8) oder 20 mM Tris(hydroxymethyl)- Aminomethan (pH 7,5) mit einer moderaten Ionenstärke besser für die Durchführung der Erfindung geeignet.

Der aktive Zustand der gewonnenen Antikörper kann ganz einfach wiederhergestellt werden, indem, beispielsweise, eine extensive Dialyse gegen einen schwach sauren, nicht Chaotropen-haltigen Puffer mit geringer Ionenstärke durchgeführt wird. Die auf der Matrix immobilisierten Antigene können ohne Schwierigkeiten ihre native Kon formation wiederherstellen, indem die Antigen-Matrix mit einem Chaotropen-freien Puffer gewaschen wird.

In der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von IgYΔFc aus Eigelb bereitgestellt, wobei dieses Verfah ren die folgenden Schritte umfasst:

a) Immunisierung eines weiblichen Geflügels mit einem ausgesuchten Antigen, so dass sich die gegen das Antigen gebildeten Geflügel-Antikörper im Eigelb ansammeln;
b) Gewinnung der Eigelb-Antikörper durch Verdünnung des Eigelbs der immunisierten Henne mit einer wirksamen Menge an Wasser bei einem pH- Wert von etwa pH 5 bis pH 7 und einer Temperatur von 0°C bis 60°C, um für mindestens eine Stunde eine Mischung zu bilden; und
c) Trennen der wasserlöslichen, die Eigelb-Antikörper enthaltenden Fraktion von den Eigelbgranula und -lipiden durch Zentrifugation bei 1.500-30.000 × g für 0,5-6 Stunden bei 0°C bis 60°C oder Filtern durch Filterpapier;
d) Ausfällung der Eigelb-Antikörper in der wasserlöslichen Fraktion mit Ammoni umsulfat oder Natriumsulfat;
e) Wiederauflösung der Eigelb-Antikörper in einer Pufferlösung bei einer Salzkonzentration von 1-50 mM und einem pH von etwa pH 4 bis pH 9; und
f) Auftragen der gelösten Eigelb-Antikörper auf eine chromatographische Träger matrix, die mit dem Antigen darauf immobilisiert wurde, um die Eigelb-Antikörper zu immunadsorbieren;
g) Waschen der chromatographischen Trägermatrix mit einem Puffer bei einer Salzkonzentration von 1-50 mM und einem pH-Wert von pH 4 bis pH 9;
h) Eluieren der an die chromatographische Trägermatrix gebundenen Eigelb-Anti körper mit einem chaotropen Salz in einer Konzentration, die größer ist als 50 mM, oder mit einem Puffer bei einem pH-Wert, der niedriger als pH 4 oder höher als pH 8 ist, so dass ein Eluat, das die IgY(ΔFc)-Antikörper enthält, erhalten wird.

Der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte Eigelb-Antikörper ist ein ho mogenes IgY(ΔFc). Die Reinheit wurde mittels nicht denaturierender Natriumdode cylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) überprüft und das Moleku largewicht des erhaltenen IgY(ΔFc) wurde mit 120 kDa bestätigt. In dem Gel wurde keine Verunreinigung mit IgY gefunden. Auf Grund des polyklonalen Wesens des Antikörpers besitzt der isoelektrische Punkt von IgY(ΔFc) ein breites Spektrum (5,2 bis 7,3).

Das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte IgY(ΔFc) aktiviert weder das Komplementsystem, noch bindet es an den rheumatoiden Faktor von Säugetier-Se ren. Die immunologische Kreuzreaktivität zwischen IgY(ΔFc) und dem IgG von Säu gern ist nicht signifikant. Daher stellt die Erfindung ebenso eine neue Art eines An tikörpers bereit, der für die Verwendung in Klinik und Forschung geeignet ist.

Die Erfindung stellt außerdem eine große Vielzahl an Verwendungsmöglichkeiten des erfindungsgemäß hergestellten IgY(ΔFc)-Antikörpers in Klinik und Forschung zur Verfügung.

So bietet die vorliegende Erfindung beispielsweise ein Verfahren zur Immunisierung eines Tieres (z. B. Geflügeltiere, Nutzvieh und Haustiere) oder menschlicher Patien ten, indem dem Patienten eine therapeutische Menge des erfindungsgemäßen IgY(ΔFc)-Antikörpers verabreicht wird, um diesen vor verschiedenen ätiologischen Agenzien, einschließlich Mikroorganismen wie Bakterien, Viren, Pilze, Protozoa, Nematoden oder ähnliche, und proteinhaltigen und nicht proteinhaltigen Substanzen wie Allergenen, Toxinen, tierischen Giften, Hormonen, oder allen anderen Immuno genen zu schützen, die in der Lage sind, eine Immunantwort auszulösen. Vorzugs weise wird der gereinigte IgY(ΔFc)-Antikörper in Kombination mit einem pharmazeu tisch verträglichen Träger wie Wasser, Salinen und ähnlichem verabreicht.

Der erfindungsgemäße IgY(ΔFc)-Antikörper kann außerdem für den Nachweis eines betreffenden ätiologischen Agens, einschließlich beispielsweise eines pathogenen oder nicht pathogenen Organismus wie Escherichia coli, Salmonella enterititis und anderer bakterieller Organismen; eines Hormons wie Östrogen, Progesteron, Thyroxin und ähnliche; eines Haupthistokompatibilitätskomplexes und ähnlichem; eines Tumormarkers wie α-Fetoprotein, Prostata-spezifisches Antigen und ähnliches; eines Krankheitsstadiummarkers wie C-reaktives Protein, Ferritin und ähnliches; in einer Körperprobe wie Flüssigkeit, Gewebe, Zellextrakt und ähnliches, das vom Menschen oder vom Tier abstammt, verwendet werden. Bei Verwendung des erfindungsgemäß erhaltenen IgY(ΔFc)-Antikörpers, kann ein betreffendes ätiologisches Agens quantitativ oder qualitativ mit Hilfe jeglichen herkömmlichen im Stand der Technik bekannten Verfahrens nachgewiesen werden, wie dem Ouchterlony-Verfahren (MO), der Einzelradialimmunodiffusion (SRID), der Immunoelektrophorese (IEP), des Radioimmunoassays (RIA), des enzym gekoppelten Immuntests (ELISA), Western Blot (WB), des turbidimetrischen Immunoassays (TIA) oder des partikelverstärkten immunoturbidimetrischen Assays.

Auf der Grundlage der oben definierten optimalen Bedingungen für die Bindung stellt die vorliegende Erfindung darüber hinaus ein quantitatives oder qualitatives Verfah ren eines Immunoassays zur Analyse eines wie oben erwähnten ätiologischen Agens zur Verfügung, wobei ein Antikörper, vorzugsweise der erfindungsgemäß gereinigte IgY(ΔFc)-Antikörpers, der gegen das ätiologische Agens gebildet wird, in An- oder Abwesenheit des ätiologischen Agens unter optimalen Bedingungen inkubiert wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine optimale Bedingung dann gegeben, wenn der pH-Wert zwischen pH 4 und pH 7 liegt und die Ionenstärke niedriger als 50 mM ist. Vorzugsweise konnten die Antikörper Wechselwirkungen mit dem ätiolo gischen Agens bei einem pH zwischen pH 5 und pH 6 und besonders bevorzugt zwischen pH 5,6 und pH 5,8 interagieren.

Außerdem wird ein Kit zur Durchführung des oben genannten Immunoassays bereit gestellt, einschließlich eines Reagens, das den Eigelb-Antikörper, vorzugsweise den IgY(ΔFc)-Antikörper enthält, der erfindungsgemäß gereinigt wurde und spezifisch für das betreffende ätiologischen Agens ist, wobei der Immunoassay bei einem pH-Wert zwischen pH 4 und pH 7 und unter einer Ionenstärke von weniger als 50 mM ausgeführt wird. Vorzugsweise konnten die Antikörper mit dem ätiologischen Agens bei einem pH zwischen pH 5 und pH 6 und besonders bevorzugt zwischen pH 5,6 und pH 5,8 interagieren.

Wenn der erfindungsgemäße IgY(ΔFc)-Antikörper beispielsweise in der Einzelradial immunodiffusion (SRID) verwendet wird, kann der erfindungsgemäße Antikörper in einem Trägermedium bestehend aus zum Beispiel Agar, Agarose, Stärke, Polyacrylamid-Gel und ähnlichem mittels jeder beliebigen herkömmlichen Methode formuliert sein. So kann ein Trägermedium beispielsweise in einer Pufferlösung unter Hitze suspendiert werden, der der IgY(ΔFc)-Antikörper zugegeben wird, wobei das Ergebnis vermischt wird. Die resultierende Lösung wird auf eine Glasplatte oder in ein Plastikgefäß gegossen und abgekühlt, damit es fest wird. Um die zu untersuchende Probe aufzutragen, wird eine Probenvertiefung auf der resultierenden Gelplatte geschaffen. Obwohl das Prinzip dieser Technik dem Fachmann bereits bekannt ist, sind die physikalischen Voraussetzungen für die IgY(ΔFc)-Antikörper- Antigen Interaktion strenger als diejenigen für eine allgemeine Antikörper-Antigen Interaktion. Besonders die IgY(ΔFc)-Antikörper der Ente binden an das Antigen und zeigen die Ausfällungseigenschaften nur unter der speziellen erfindungsgemäßen Bedingung zur Bindung. Die speziellen Bindungsbedingung treffen auch auf andere Immunoassays zu, wie beispielsweise das Ouchterlony-Verfahren (MO) und den turbidimetrischen Immunoassay (TIA), bei denen die Ausfällung oder Agglutination eines Antigens durch den IgY(ΔFc)-Antikörper als wesentlicher Schritt angesehen wird.

Dementsprechend ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Einzelradialimmuno diffusion einer der am meisten bevorzugten Aspekte der vorliegenden Erfindung. Es umfasst die folgenden Schritte:

a) Zubereitung des Agar Gels, das den Eigelb-Antikörper enthält, in einer Pufferlösung bei einer Salzkonzentration von 1-50 mM und einem pH-Wert von etwa pH 5 bis pH 7;
b) Ausstechung von Vertiefungen in dem Agar und Entfernung der Agarpfropfen aus den Vertiefungen;
c) Zubereitung von Verdünnungen des Antigens in Phosphatpuffer-Saline; und
d) Pipettieren jeder Antigenverdünnung und jeder Probe in getrennte Vertiefungen;
e) Inkubation für mindestens 24 Stunden; und
f) Messung des Durchmessers des Immunopräzipitinrings, der eine lineare Korrelation mit einer log₁₀-Konzentration des Antikörpers darstellt.

Im enzymgekoppelten Immuntest (ELISA) oder im partikelverstärkten turbidimetri schen Immunoassay wird ein betreffendes Antigen, das sich in der Probe befindet, durch einen IgY(ΔFc)-Antikörper gefangen, der auf einer Harztestplatte, wie bei spielsweise Polyvinylchlorid, Polystyrol und ähnlichem, oder durch einen feinen Par tikel, der beispielsweise aus Polystyrol-Latex, Polyester-Latex, Polyvinylchlorid, Bentonit, Glasperlen und ähnlichem besteht, immobilisiert ist, in einer Menge, die ausreichend ist, um Wechselwirkungen mit einer Probe zu zeigen, die das Vorhandensein des betreffenden Antigens beweisen. Im partikelverstärkten turbidimetrischen Immunoassay wird das gefangene Antigen dann unmittelbar an Hand von Veränderungen der Trübung nachgewiesen. Veränderungen der Trübung wurden bei 320-900 nm gemessen. Im enzymgekoppelten Immuntest (ELISA) wird das gefangene Antigen außerdem durch einen mit einer Signalsubstanz verbundenen Antikörper nachgewiesen.

BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN FÜR DIE DURCHFÜHRUNG DER ER FINDUNG

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung lediglich erläutern und nicht deren Umfang einschränken.

BEISPIEL 1 Immunisierung zur Stimulierung einer spezifischen Antikörperpro duktion

Zwölf 16 Wochen alte Hausenten (Anas platyrhynchos var. domestica) wurden zur Antikörper- und Eiproduktion einzeln gehalten. Den Enten wurde eine anfängliche subkutane Injektion mit 1,5 mg/ml des menschlichen C-reaktiven Proteins (CRP; gereinigt von menschlichen Aszites) in Phosphatpuffer, pH 7,5 emulgiert mit gleichem Volumen an kompletten Freund-Adjuvans verabreicht. Die Antigenkonzentration lag im Allgemeinen im Bereich von 1 bis 5 mg/ml. Nach der ersten Injektion bekamen die jungen Entenweibchen alle zwei Wochen vier weitere Injektionen von 1-5 mg Antigen. Eine Woche später wurden die Eier gesammelt, markiert und bei 4°C gelagert, bis sie zur Extraktion und Reinigung der Antikörper weiter verarbeitet wurden. Die Nachimpfungen wurden alle vier Wochen während des Experiments durchgeführt. Am siebten Tag nach der Auffrischung wurden Blutproben genommen. Jede Blutprobe wurde zentrifugiert und das resultierende Serum wurde aufbewahrt.

BEISPIEL 2 Physikalische Voraussetzungen für die Ausfällung von Enten-Antikör pern

In diesem Beispiel wurden die Auswirkungen von pH-Wert und Salz auf die Ausfäl lung der Antikörper untersucht. Agarose-Pulver wurde unter Hitze in 0,02 M Phos phatpufferlösungen mit verschiedenen pH-Werten und Konzentrationen an Natrium chlorid suspendiert. Die Agaroselösung wurde auf ungefähr 56°C abgekühlt und un ter Rühren wurde 0,5 ml einer Antigenlösung, die 0,4 mg/ml des gereinigten CRP enthält, zugegeben. Die Lösung wurde in ein Plastikgefäß gegeben und abgekühlt. Auf der Platte wurden in regelmäßigen Abständen Vertiefungen für die Enten-Antise ren geschaffen. Ein in Beispiel 1 erhaltenes Antiserum wurde ein- bis zweifach mit Phosphatpuffer verdünnt, der zur Herstellung der Platten verwendet wurde, und 2 µl der ursprünglichen und verdünnten Antiseren wurden in getrennte Vertiefungen der Agaroseplatte gegeben.

Im ersten Teil des Experiments wurden die CRP-haltigen Agarosegele jeweils bei ei nem pH-Wert von pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 und pH 9 hergestellt. 2 µl des ursprünglichen und verdünnten Antiserums wurden in die getrennten Vertiefungen in der Agarose gegeben. Nach 48-stündiger Inkubation wurde der Durchmesser und die Schärfe des Immunpräzipitinrings bestimmt, wie Tabelle 1 zeigt.

Tabelle 1

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, wurden in der Agaroseplatte bei einem pH von 4,0 keine Immunopräzipitinringe beobachtet. Obwohl die Immunopräzipitinringe in den Agaroseplatten bei einem pH von über 5,0 sichtbar wurden, verlor das Präzipitin nach und nach an Schärfe, sobald der pH-Wert bis auf 7 erhöht wurde. Die beste Ausfällung auf der Grundlage von Schärfe und der Größe der Präzipitinringe wurde bei einem pH-Wert von 5,0 erhalten. Dieses Ergebnis macht deutlich, dass die Enten-Antikörper bei einem pH von 5,0 richtig an ein Antigen binden.

Im zweiten Teil des Experiments wurde die oben geschilderte Prozedur wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Agarosegele in 20 mM Phosphatpuffer, pH 5,0 hergestellt wurden, die jeweils 0,5, 1,0 oder 1,5 M Natriumchlorid enthielten. Nach Inkubation waren die Präzipitinringe weniger deutlich ausgeprägt als diejenigen auf einer natriumchloridfreien Agaroseplatte. Das Ergebnis verdeutlicht, dass die Ausfällung der Enten-Antikörper durch die Anwesenheit von Salz wesentlich inhibiert werden kann.

Zusammenfassend läßt sich sagen, dass die Agaroseplatten, die in 20 mM Phos phatpuffer bei einem pH von 5,0 hergestellt wurden, für die Bildung von Ausfällungen von Enten-Antikörpern besser geeignet scheinen.

BEISPIEL 3 Test der Höhe des Antikörpertiters

Die Höhe des Titers des in Beispiel 1 erhaltenen Antiserums wurde mittels SRID bestimmt. Die CRP-haltigen Agaroseplatten wurden zubereitet, indem 20 mM Phosphatpuffer (pH 5,0) wie in Beispiel 2 beschrieben verwendet wurden. 2 µl des in Beispiel 1 erhaltenen Antiserums wurden einzeln in getrennte in die Platten gestochene Vertiefungen gegeben. Nach der Inkubation bildete sich ein Immunopräzipitinring um die Vertiefung. Der Durchmesser, der für die Höhe des Titers der aufgetragenen Antiseren von Bedeutung ist, wurde bestimmt.

BEISPIEL 4 Extraktion der Antikörper aus Enteneigelb

Das Eigelb der von den hyperimmunisierten Enten aus Beispiel 1 gelegten Eier wurde mit einem schwachen Strahl destillierten Wassers gründlich gewaschen, um das Eiweiß zu entfernen. Das Volumen des Eigelbs wurde bestimmt und dann mit einer Menge destillierten Wassers, die 10 Mal größer war als die gemessene Eigelbmenge, gründlich vermischt. Die Mischung wurde dann für mindestens zwei Stunden unter 4°C gehalten und anschließend bei 10.000 UpM in einer Hitachi CR22F-Zentrifuge eine Stunde lang zentrifugiert. Eine blasse Überstandsschicht und eine halbfeste geschmeidige Schicht entstanden in den Zentrifugengläsern. Die Überstandsschicht wurde vorsichtig abgenommen, pulverisiertes Ammoniumsulfat wurde unter leichtem Rühren zugegeben bis zu einer Endkonzentration von 25 g Ammoniumsulfat pro 100 ml Eigelbextrakt, so dass die Eigelb-Antikörper komplett ausgefällt waren. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation bei 10.000 UpM für 30 Minuten bei 4°C erhalten. Nach der Dekantierung des Überstands wurde das resultierende Pellet wieder in einem geeigneten Puffer aufgelöst und gegen den Puffer dialysiert, um das restliche Ammoniumsulfat zu entfernen. Zwanzig Chargen des mit diesem Verfahren erhaltenen Roh-Antikörpers wurden gepoolt und bei 4°C für weitere Experimente gelagert. Die Höhe des Antikörpertiters des Pools betrug 6,1 mm im Durchmesser des Immunopräzipitinrings im in Beispiel 3 beschriebenen SRID-Assay.

BEISPIEL 5 Kovalente Bindung des Antigens an eine mit Cyanogenbromid akti vierte Agarosematrix

Eine CRP-Lösung wurde in 0,1 M Carbonatpuffer, pH 8,5 mit einer Konzentration von 5 mg/ml zubereitet. Mit CNBr aktivierte Sepharose 4B, bezogen von Pharmacia, wurde zunächst mit 1 mM kalter HCl in einer Menge, die 10 Mal größer war als das Volumen der Matrix, gewaschen und bei 4°C über Nacht zur Reaktion mit der CRP- Lösung, deren Menge doppelt so groß war wie die des Matrixvolumens, stehen gelassen. Die Bindungsaktivität wurde errechnet als die Menge des gebundenen Proteins (in A₂₈₀-Einheiten) geteilt durch die Ausgangsmenge an Protein (A₂₈₀). Das Ergebnis zeigt, dass die Bindungseffektivität der CNBr-aktivierten Sepharose 4B innerhalb des Bereichs von 80 bis 85% lag. Für den späteren Gebrauch wurde die Antigen-Matrix in einer Lösung aus 0,5 M Ethanolamin in 20 mM Tris-HCl (pH 8,5) in einem Verhältnis von 1 : 1 (Vol.-%) für zwei Stunden bei 4°C suspendiert, um verbliebene Protein-reaktiven Stellen zu blockieren. Anschließend wurde die Antigenmatrix mit PBS, das 0,02% Natriumazid enthielt, gewaschen und bei 4°C aufbewahrt.

BEISPIEL 6 Immunoaffinitätsreinigung der Eigelb-Antikörper

In den folgenden Beispielen 6-8 werden die in Beispiel 4 gewonnenen Antikörper und die in Beispiel 5 hergestellte Antigenmatrix gewählt, um die geeigneten Bin dungsbedingungen für die Immunoaffinitätsreinigung der Eigelb-Antikörper aufzuzei gen. 1 ml der Antigenmatrix wurde auf eine herkömmliche Säule aufgetragen und in einem der in Tabelle 2 aufgeführten Bindungspuffer eingeweicht. Die Antigenmatrix wurde zur Reaktion mit 0,25 ml der in dem gleichen Bindungspuffer vorliegenden Antikörper stehen gelassen. Die Antigenmatrix wurde mit dem Bindungspuffer gewa schen bis der Ausfluss im Wesentlichen frei von Proteinen war. Gebundene Antikörper wurden unmittelbar danach mit 4 M Guanidin-HCl eluiert, und die optische Dichte wurde nach vollständiger Dialyse bei 280 nm gemessen. Die Bindungskapazität des Entenantikörpers in verschiedenen Bindungspuffern wird durch die Antikörpermenge im Eluat dargestellt, wie die folgende Tabelle 2 zeigt.

Tabelle 2

Es wird ersichtlich, dass eine vergleichsweise große Menge an Entenantikörpern in einem leicht sauren Milieu gebunden wird.

BEISPIEL 7

Beispiel 6 wurde wiederholt mit der Ausnahme, dass der pH-Wert des Bindungspuf fers in jedem Test auf pH 5,2, pH 5,4, pH 5,6 oder pH 5,8 eingestellt wurde. Die nachfolgende Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 3

In Tabelle 3 scheint ein pH-Wert zwischen pH 5,6 und pH 5,8 für die Bindung der Entenantikörper am besten geeignet zu sein.

BEISPIEL 8

Beispiel 7 wurde bei einem pH-Wert von pH 5,8 wiederholt, mit der Ausnahme, dass der Phosphat-Bindungspuffer durch einen MES-Puffer oder einen bis-Tris-Puffer ersetzt wurde. Tabelle 4 zeigt das Ergebnis.

Tabelle 4

Das Ergebnis zeigt, dass 20 mM MES-Puffer, eingestellt auf einen pH-Wert von pH 5,8, der am besten geeignete Bindungspuffer für die Immunoaffinitätsreinigung von Entenantikörpern ist.

BEISPIEL 9 Effizienz der Elution

Beispiel 6 wurde unter Verwendung von 20 mM MES-Puffer (pH 5,8) als Bindungs puffer wiederholt mit der Ausnahme, dass 1-3 M Natriumthiocyanat (pH 7,5) als Chaotrop im Vergleich mit 4 M Guanidin-HCl im Elutionsmittel verwendet wurde. Die Wirksamkeit von 4 M Guanidin-HCl wird funktionell mit 100% als Referenzstandard definiert. Die relative Effizienz der Elution anderer Elutionsmittel wurde bestimmt, in dem die A₂₈₀-Einheit, die mit jedem Elutionsmittel erhalten wurde, durch die geteilt wurde, die mit 4 M Guanidin-HCl erhalten wurde. Tabelle 5 zeigt das Ergebnis.

Tabelle 5

Aus Tabelle 5 ist ersichtlich, dass 3 M Natriumthiocyanat, das ungefähr 95% der ge bundenen Antikörper von der Antigenmatrix löste, fast genauso wirksam ist wie 4 M Guanidin-HCl.

BEISPIEL 10 Reinheit und Aktivität von Entenantikörpern nach Immunoaffinitäts reinigung an einer Antipenmatrix

Um die Zusammensetzung des erfindungsgemäß hergestellten Antikörpers zu unter suchen, wurde ein analytisches SDS-PAGE auf einem 8%-igen nicht reduzierenden Acrylamid-Gel durchgeführt, wobei 60 µg des Roh-Antikörpers und 40 µg des in Beispiel 3 gewonnenen Durchflusses (jeweils Spur 2 und Spur 3) und 20 µg des Antikörperprodukts, das mit 3 M Natriumthiocyanat (pH 5,8) in Beispiel 9 (Spur 4) erhalten wurde, aufgetragen wurden. Fig. 1 zeigt das Ergebnis.

Sowohl das Roh-Produkt als auch der Durchfluss weisen zwei vorherrschende Banden mit 180 kDa und 120 kDa (diese Größen sind Schätzungen vom Molekulargewichtsmarker in Spur 1), die jeweils der relativen Mobilität des Enten-IgY und IgY(ΔFc) entsprechen. Auf der anderen Seite bestehen die affinitätsgereinigten Antikörper aus dem IgY(ΔFc)-Antikörper, der durch eine einzige Bande auf dem Gel vertreten ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine hervorragende Strategie zur Isolierung der gewünschten IgY(ΔFc)-Antikörper aus dem Pool des Immunoglobulingemisches, das sowohl IgY als auch IgY(ΔFc) enthält, darstellt. Fast alle IgY-Antikörper konnten nicht an die Antigenmatrix binden und ver blieben im Durchfluss. Densitometrische Untersuchungen des Gels zeigen, dass über 95% der gereinigten Antikörper homogenes IgY(ΔFc) sind. Darüber hinaus sind weniger als 60% der gesamten in den Roh-Antikörpern vorhandenen Proteine IgY(ΔFc) (Daten nicht gezeigt), und 24% der gesamten Proteine im Roh-Produkt, vom dem angenommen wird, dass es dem Inhalt des gewünschten IgY(ΔFc) entspricht, in der Lage, in dem Affinitätsreinigungsschritt an die Antigenmatrix zu binden.

Die Aktivität der gereinigten Antikörper wird mittels SRID wie in Beispiel 3 beschrie ben bestimmt. Der Durchmesser des Immunopräzipitinsrings der gereinigten Antikörper beträgt 5,9 und liegt damit nur wenig unter dem Wert der Roh-Antikörper (6,1).

BEISPIEL 11 Bestimmung der CRP-Konzentration mit SRID

Agaroseplatten wurden unter Verwendung von 20 mM Phosphatpuffer (pH 5,0) wie in Beispiel 2 vorbereitet mit der Ausnahme, dass der in Beispiel 10 affinitätsgereinigte Enten-anti-CRP-Antikörper an Stelle von CRP bis zum Erreichen einer Endkonzen tration von 10 µg/ml zugegeben wurde. 2 µl Dosen menschlichen Serums von CRP- positiven Spendern wurden einzeln in getrennte, in die Platten in regelmäßigen Abständen gestochene Vertiefungen gegeben, und die Platten 48 Stunden lang inkubiert. Der Durchmesser des Immunopräzipitinrings wurde gemessen und gegen die log₁₀-Konzentration des CRP-Standards graphisch in einer Standardkurve dargestellt. Über den gesamten Messbereich hinweg war ein linearer Verlauf zu beobachten, wie in Fig. 3 gezeigt. Die CRP-Konzentration in unbekannten Proben kann durch Interpolation der Standardkurve abgeschätzt werden. Das mit der SRID- Methode erhaltene Ergebnis stimmt voll und ganz mit dem mit einem kommerziellen CRP-Latex-Kit von Denka Seiken Co., Ltd., 3-4-2 Nihonbashi Kayabacho, Chuo-ku, Tokyo, Japan gemessenen Ergebnis (siehe Fig. 4) überein.

BEISPIEL 12 Bestimmung der CRP-Konzentration mit ELISA

Der in Beispiel 10 affinitätsgereinigte Anti-CRP-Antikörper der Ente wurde mit einem Beschichtungspuffer (20 mM Phosphatpuffer, pH 8,2) bis zu einer Endkonzentration von 16 µg/ml verdünnt. Aliquots mit 100 µl der verbleibenden Lösung wurden an schließend in jede Vertiefung auf der ELISA-Platte (bezogen von Costar Corporation) gefüllt. Die Platte wurde über Nacht bei 4°C oder für 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden 200 µl eines Blocking-Agens (1% fettarme Milch im Beschichtungspuffer) in jede Vertiefung gegeben, um die Beschichtung des IgY(ΔFc) auf der Platte zu stoppen. Seriell verdünntes CRP konnte mit dem beschichteten Entenantikörper in einem Reaktionspuffer (140 mM NaCl in 20 mM Tris-Puffer) bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang in Wechselwirkung treten. Dann wurde die Platte gründlich mit einem Waschpuffer (Reaktionspuffer, der 0,05% Tween-20 enthält) gewaschen. Eine mit Reaktionspuffer verdünnte Menge Ziege-anti-CRP-Antikörper (erhältlich bei Good Biotech. Corp.) wurde in jede Vertiefung zugegeben, die Platte wurde für 30 Minuten inkubiert und anschließend gründlich mit Waschpuffer gewaschen. Als nächstes wurde eine mit Reaktionspuffer verdünnte Menge HRP- konjugiertes Kaninchen-anti-Ziege-IgG (Sigma) in jede Vertiefung zugegeben und die Platte wurde noch einmal für 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert und dann gründlich mit Waschpuffer gewaschen. 100 µl o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (Sigma) wurde als Substrat für das konjugierte Enzym in jede Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde bei Zimmertemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wurde mit 100 µl 1 N H₂SO₄ gestoppt. Die Extinktion jeder Vertiefung wurde bei 450 nm gemessen und in Fig. 5 graphisch dargestellt. Die Empfindlichkeit dieses Assays kann bis zu 2,5 ng/ml (O.D. < 1) betragen. R² kann bis zu 0,9941 betragen.

BEISPIEL 13 Bestimmung der CRP-Konzentration in partikelverstärktem TIA (LAT, Latex-Immunoturbidimetrischer Assay)

Die Kopplung des anti-CRP-IgY(ΔFc) auf Latexpartikel wurde bei 4°C für 2 Stunden in einer Reaktionsmischung durchgeführt, die 100 µl 10%-ige (w/v) Latexsus pension, 400 µl 20 mM Tris-Puffer (pH 7,2), 10 mg/ml des in Beispiel 10 gereinigten Enten-anti-CRP-Antikörpers und 0,1% Natriumazid enthielt. 5 ml 20 mM Tris-Puffer (pH 7,2), der 1% Rinderserumalbumin (RSA, erhältlich von Sigma) enthält, wurden der Latex-IgY(ΔFc)-Mischung zugegeben und die resultierende Suspension wurde unter Rühren für 1,5 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach Zentrifugation bei 15.000 UpM bei 4°C für 1 Stunde wurde das gewonnene Pellet in 5 ml 20 mM Tris-Puffer (pH 7,2), der 1% BSA enthielt, zur späteren Verwendung resuspendiert.

Das CRP-haltige Standardserum wurde als Standardantigen in den folgenden Kon zentrationen verwendet: 0, 1, 5, 10 und 20 mg/dl in einem hohen Bereich und 0, 0,5, 1, 1,5 und 2 mg/dl in einem niedrigen Bereich. R1: 20 mM Tris-Puffer (pH 7,2) und R2: die IgY(ΔFc)-gekoppelte Latexsuspension in R1 stellten zwei zusätzliche Rea genzien dar. Der Anstieg der Extinktion (bei 570 nm), der aus dem Mischen von R2 mit dem Standardantigen resultierte, wurde über einen Zeitraum in einem Hitachi 7020 turbidimetrischen Autoanalyzer gemessen und die dabei erhaltenen Daten wurden gegen den niedrigen und hohen Bereichen der CRP-Konzentration graphisch dargestellt, wie Fig. 6a und 6b jeweils zeigen. Damit ist es möglich, die CRP- Konzentration von unbekannten Proben durch Interpolation der Standardkurve zu schätzen.

Alle in der vorliegenden Beschreibung zitierten Patente und Literaturstellen sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit inkorporiert. Im Falle von Widersprüchen ist die vorliegende Beschreibung einschließlich Definitionen maßgebend.

Obwohl die Erfindung in Bezug auf die obigen spezifischen Ausführungsformen be schrieben wurde, sollte bemerkt werden, dass möglicherweise verschiedene für den Fachmann offensichtliche Modifikationen und Änderungen gemacht wurden, ohne dabei vom Sinn und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers (IgYΔFc) aus Eigelb, wobei der Antikörper im Wesentlichen frei von einem Fc-äquivalenten Bereich ist und das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) Immunisierung eines weiblichen Geflügels mit einem ausgewählten Antigen, so dass sich die gegen das Antigen gebildeten Geflügel- Antikörper im Eigelb ansammeln;
b) Gewinnung des Eigelbs der immunisierten Henne und Entfernen der nichtwässerigen Biomoleküle und Granula daraus, um dadurch eine was serlösliche Fraktion zu erhalten, die Eigelb-Antikörper enthält;
c) Durchleiten der wasserlöslichen Fraktion durch eine inerte Trägermatrix die mit dem darauf befindlichen Antigen immobilisiert ist, bei einem pH- Wert zwischen 4 und 7 und bei einer Ionenstärke von weniger als 50 mM, um die Bildung von Immunkomplexen aus dem immobilisierten Antigen und den Eigelb-Antikörpern zu ermöglichen; und
d) Dissoziation und Elution der Eigelb-Antikörper von dem immobilisierten Antigen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (b) das gewonnene Eigelb mit ei ner wirksamen Menge einer wässerigem Pufferlösung oder Wasser verdünnt und anschließend einer Zentrifugation oder Filtration unterzogen wird, um dadurch die nichtwässerigen Biomoleküle und Granula zu entfernen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das gewonnene Eigelb mit einer wässerigen Pufferlösung oder Wasser im Verhältnis von ungefähr 1 : 5 bis 1 : 30 Volumen-% verdünnt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (b) die nichtwässerigen Biomole küle und Granula durch mehrmaliges Ausfällen mit PEG, Dextransulfat oder ei nem natürlichen Gummi und anschließende Zentrifugation oder Filtration entfernt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei vor Schritt (c) die Eigelb-Antikörper in der wasserlöslichen Fraktion durch ein nichtdenaturierendes Salz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NaCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, KCl, CaCl₂ und MgSO₄ weiter ausgefällt und dann wieder gelöst werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) die Immunkomplexe bei einem pH-Wert in einem Bereich von 5 bis 6 gebildet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei in Schritt (c) die Immunkomplexe bei einem pH-Wert in einem Bereich von 5,6 bis 5,8 gebildet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) die Immunkomplexe in einem Puffer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Phosphatpuffer, einem MES(2-[N-Morpholino]-Ethansulfonsäure)-Puffer und einem bis-Tris-Puffer ge bildet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Immunkomplex in 20 mM MES-Puffer gebildet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (d) die Eigelb-Antikörper vom Anti gen mit Hilfe eines chaotropen Salzes oder bei einem pH-Wert von weniger als 4 oder höher als 8 dissoziiert werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das chaotrope Salz aus der Gruppe bestehend aus 4 M Guanidin-HCl und 1-3 M Natriumthiocyanat gewählt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zu immunisierende weibliche Geflügel zur Ordnung Anseriformes gehört.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das weibliche Geflügel eine Ente ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die inerte Trägermatrix aus quervernetzter Agarose oder quervernetztem Dextran hergestellt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Antigen aus der Gruppe bestehend aus einem pathogenen oder nichtpathogenen Mikroorganismus, einem natürlich auftretenden oder synthetischen Protein, einem natürlich auftretenden oder synthetischen Oligopeptid, einem rekombinanten Protein oder einem Fragment davon, und einer Kombination davon ausgewählt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das weibliche Geflügel mit dem Antigen in Verbindung mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionsadjuvans immunisiert wird.

17. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers (IgYΔF) aus Eigelb, wobei der Antikörper im Wesentlichen frei von einem Fc-äquivalenten Bereich ist und das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Immunisierung eines weiblichen Geflügels mit einem ausgewählten Antigen, so dass sich die gegen das Antigen gebildeten Geflügel- Antikörper im Eigelb ansammeln;
b) Gewinnung der Eigelb-Antikörper durch Verdünnung des Eigelbs der im munisierten Henne mit einer wirksamen Menge Wasser bei einem pH- Wert von ungefähr 5-7 und einer Temperatur von etwa 0°C bis 60°C, um für mindestens eine Stunde ein Gemisch zu bilden; und
c) Abtrennung der wasserlöslichen, die Eigelb-Antikörper enthaltenden Fraktion von den Eigelbgranula und -lipiden durch Zentrifugation bei 1.500-30.000 × UpM für 0,5-6 Stunden bei 0°C bis 60°C oder Filtration durch Filterpapier;
d) Ausfällen der Eigelb-Antikörper in der wasserlöslichen Fraktion mit Am moniumsulfat oder Natriumsulfat;
e) Wiederauflösen der Eigelb-Antikörper mit einer Pufferlösung bei einer Salzkonzentration von 1-50 mM und einem pH-Wert von etwa 4-9; und
f) Auftragen der gelösten Eigelb-Antikörper auf eine chromatographische Trägermatrix, mit der das Antigen immobilisiert wurde, um die Eigelb- Antikörper zu immunadsorbieren;
g) Waschen der chromatographischen Trägermatrix mit einer Pufferlösung bei einer Salzkonzentration von 1-50 mM und einem pH-Wert von etwa 4-9;
h) Eluieren der an die chromatographische Trägermatrix gebundenen Eigelb- Antikörper mit einem chaotropen Salz in einer Konzentration, die höher ist als 50 mM, oder mit einem Puffer bei einem pH-Wert, der niedriger als 4 oder höher als 8 ist, so dass ein Eluat, das die IgY(ΔFc)-Antikörper enthält, erhalten wird.

18. Antikörper (IgYΔFc), der im Wesentlichen frei von einem Fc-äquivalenten Bereich ist und durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1-17 hergestellt wurde.

19. Arzneimittel, das einen nach einem der Ansprüche 1-17 hergestellten Antikörper und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

20. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Medi kaments zur Immunisierung eines Patienten, bei dem eine derartige Immunisie rung notwendig ist.

21. Kit für Immunoassay, der den Antikörper nach Anspruch 18 enthält.

22. Reagens für Immunoassay, der einen durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1-17 hergestellten Eigelb-Antikörper enthält.

23. Reagens nach Anspruch 22, wobei der Immunoassay aus einer Gruppe beste hend aus enzymgekoppeltem Immunosorbens-Test (ELISA), immuno turbidimetrischem Assay, partikelverstärktem immunoturbidimetrischen Assay, Einzelradialimmunodiffusionsassay, Western-Blot- und Ouchterlony-Verfahren ausgewählt wird.

24. Reagens nach Anspruch 22, das für einen enzymgekoppelten Immunotest ver wendet wird, wobei das Reagens in Form einer gehärteten Platte vorliegt und durch Lösen des Antikörpers zusammen mit einem Trägermedium und Härten des Reagens in Form einer Platte hergestellt wird.

25. Reagens nach Anspruch 22, das für den partikelverstärkten immunoturbidime trischen Assay verwendet wird, wobei der Antikörper an ein unlösliches Trä gerpartikel adsorbiert wird.

26. Reagens nach Anspruch 25, wobei das unlösliche Trägerpartikel ein organisches makromolekulares Latex, ein anorganisches Oxid oder ein Metall ist.

27. Einzelradialimmunodiffusionsassay für ein Antigen umfassend:

a) Herstellung von Agar-Gelen, die Eigelb-Antikörper in einer Pufferlösung mit einer Salzkonzentration von 1-50 mM und einem pH-Wert von etwa 5-7 enthalten;
b) Ausstechung von Vertiefungen im Agar und Entfernung der Agarpfropfen aus den Vertiefungen;
c) Herstellung von Verdünnungen des Antigens in phosphatgepufferter Saline; und
d) Pipettieren jeder Antigenverdünnung und Probe in getrennte Vertiefungen;
e) Inkubation für mindestens 24 Stunden; und
f) Messung des Durchmessers der Immunopräzipitinringe, der eine lineare Korrelation mit einer log₁₀-Konzentration des Antigens darstellt.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei der Eigelb-Antikörper ein Antikörper (IgYΔFc) ist, der im Wesentlichen frei von einem Fc-äquivalente Bereich ist und der nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-17 hergestellt wird.

29. Immunoassay, der die quantitative oder qualitative Analyse eines ätiologischen Agens in einer Probe durch Reaktion der Probe mit einem gegen das ätiologische Agens in einem weiblichen Geflügel gebildeten Antikörper bei einem pH-Wert von 4-7 und einer Ionenstärke unter 50 mM umfasst.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das weibliche Geflügel ein Vogel der Ordnung Anseriformes ist.

31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das weibliche Geflügel eine Ente ist.

32. Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Antikörper nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-17 hergestellt wird.

33. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Verfahren bei einem pH-Wert von 5-6 durchgeführt wird.

34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Verfahren bei einem pH-Wert von 5,6-5,8 durchgeführt wird.

35. Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Immunoassay aus der Gruppe beste hend aus enzymgekoppeltem Immunosorbens-Test (ELISA), immuno turbidimetrischem Assay, partikelverstärktem immunoturbidimetrischen Assay, Einzelradialimmunodiffusionsassay, Western-Blot- und Ouchterlony-Verfahren ausgewählt wird.

36. Kit für Immunoassay umfassend ein Reagens, das einen gegen ein aus gewähltes Antigen spezifischen Eigelb-Antikörper enthält, wobei der Immu noassay bei einem pH-Wert von 4-7 und einer Ionenstärke von unter 50 mM durchgeführt wird.

37. Kit nach Anspruch 36, wobei der Antikörper nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-17 hergestellt wird.

38. Kit nach Anspruch 36, wobei der Immunoassay bei einem pH-Wert von 5-6 durchgeführt wird.

39. Kit nach Anspruch 38, wobei der Immunoassay bei einem pH-Wert von 5,6-5,8 durchgeführt wird.

40. Kit nach Anspruch 36, wobei der Immunoassay aus der Gruppe bestehend aus enzymgekoppeltem Immunosorbens-Test (ELISA), immunoturbidimetrischem Assay, partikelverstärktem immunoturbidimetrischen Assay, Einzelradial immunodiffusion Assay, Western-Blot- und Ouchterlony-Verfahren ausgewählt wird.