CN109575137A - 一种α-淀粉酶抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种α-淀粉酶抑制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种α‑淀粉酶抑制剂及其制备方法和应用，属于天然活性物质制备技术领域。本发明以α‑淀粉酶为抗原，利用抗原抗体反应原理，在蛋鸡中得到了一种IgY，此IgY能与α‑淀粉酶结合，从而特异性抑制其活性，是一种优良的新型α‑淀粉酶抑制剂，且其具有制备成本低、特异性好(IC50值可低至1mg/mL)、稳定性高、抑制活性强(对α‑淀粉酶的抑制率可高达100％)等的优势，在制备糖尿病的防治药物方面具有极大的应用前景。

Description

一种α-淀粉酶抑制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种α-淀粉酶抑制剂及其制备方法和应用，属于天然活性物质制备技术领域。
背景技术
糖尿病是21世纪的最大疾病，每年都有数百万人因糖尿病死亡。在国内，糖尿病患者在过去20年间增加12倍以上，2025年很可能每4人当中就有1人是糖尿病患者，因此，国家也在积极准备对策。另外，50岁以上男性中30％、50岁以上女性中20％以上处于糖尿病前期(pre-diabetes)的调查结果也提示糖尿病的严峻性。
糖尿病受遗传因素及肥胖、饮食、运动不足及压力等影响，是胰腺细胞分泌的胰岛素的分泌障碍及作用不足而引发的代谢障碍，是一种慢性代谢性疾病，其伴有葡萄糖的过剩，体脂肪的分解及蛋白质的浪费，并且，糖尿病患者的胰高血糖素分泌非正常亢进，会引发代谢紊乱，进而导致糖尿，使得体内代谢调节功能异常，出现高血糖症，如不进行治疗和调理就会伴随循环系统的并发症，其中，严重的并发症，如糖尿病性神经病(neuropathy)、视网膜病变(retinopathy)、白内障(cataract)、肾病(nephropathy)等，不仅会使患者无法维持正常生活，甚至会导致患者丧命，危害极大。因此，急需找到更有效的治疗糖尿病的药物或治疗方法。
治疗糖尿病的首要目的是调节患者血糖使其接近正常值，其中，空腹血糖和餐后血糖的调节对于糖尿病症状的改善和并发症的预防及治疗非常重要。各餐饮食中的碳水化合物以淀粉为主，淀粉会在唾液和胰液中的α-淀粉酶的作用下，可以水解成麦芽糖，最终以葡萄糖的形式被肠道吸收。而α-淀粉酶抑制剂能有效降低α-淀粉酶的活性，从而降低淀粉的水解，进而减少糖分的摄取，以达到抑制餐后血糖的目的。因此，α-淀粉酶抑制剂是一种很好的糖尿病防治药物。
天然存在的α-淀粉酶抑制剂主要有三类：蛋白质类、多酚类和多糖类抑制剂。其中，蛋白质类抑制剂是α-淀粉酶抑制剂的主要来源，大多存在于小麦、豆类、薯蓣、野生苋属等植物种子中，可通过化学提取等方式得到，但蛋白质类抑制剂的化学提取容易造成化学残留，其提取要求的酸碱条件也会对生态环境造成影响，并且，其提取过程中存在植物凝集素去除不完全等安全隐患；而多酚类和多糖类抑制剂对α-淀粉酶的抑制活性相对较低(一般抑制率分别为80％和30％)，且多酚类对α-淀粉酶的作用不具有专一性，不能特异性抑制α-淀粉酶。
因此，急需找到一种新的天然安全、易获得、产量高、成本低、便于大规模生产、稳定性好、抑制活性高的α-淀粉酶抑制剂以供糖尿病的防治。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种天然安全、易获得、产量高、成本低、便于大规模生产、稳定性好、抑制活性高的α-淀粉酶抑制剂，可以用于防治糖尿病。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明尝试以α-淀粉酶为抗原，利用抗原抗体反应原理，在蛋鸡中得到了一种IgY，经研究发现，此IgY能与α-淀粉酶结合，从而特异性抑制其活性，是一种优良的新型α-淀粉酶抑制剂，且其具有制备成本低、特异性好(IC50值可低至1mg/mL)、稳定性高、抑制活性强(对α-淀粉酶的抑制率可高达100％)等的优势，在制备糖尿病的防治药物方面具有极大的应用前景。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种α-淀粉酶抑制剂的制备方法，所述方法为将α-淀粉酶加入缓冲液，得到抗原溶液；将抗原溶液与完全弗氏佐剂混合后注射进入禽类体内进行首次免疫，将抗原溶液与不完全弗氏佐剂混合后注射进入禽类体内进行强化免疫，得到获得免疫的禽类；将获得免疫的禽类产下的蛋消毒后，分离卵黄和蛋清，收集卵黄液；将卵黄液加入水中进行稀释后，调节pH至4.0～6.0，得到稀释液；将稀释液进行第一次静置后进行第一次离心，收集上清；在上清中加入硫酸铵，得到混合液A；将混合液A进行第二次静置后进行第二次离心，收集沉淀A；将沉淀A溶于缓冲液中，得到混合液B；在混合液B中加入饱和度为100％的饱和硫酸铵溶液，得到混合液C；将混合液C进行第三次静置后进行第三次离心，收集沉淀B；将沉淀B溶于缓冲液中进行透析，得到α-淀粉酶抑制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述抗原溶液中α-淀粉酶的浓度为0.1～1mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述抗原溶液中α-淀粉酶的浓度为0.2～0.6mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述完全弗氏佐剂与抗原溶液进行混合的体积比为2:1～1:2，不完全弗氏佐剂与抗原溶液进行混合的体积比为2:1～1:2。
在本发明的一种实施方式中，所述首次免疫的剂量为0.5～2mL/只，强化免疫的剂量为0.5～2mL/只。
在本发明的一种实施方式中，所述首次免疫与强化免疫之间间隔14天，强化免疫之间间隔14天。
在本发明的一种实施方式中，所述首次免疫的次数为1次，强化免疫的次数为3次。
在本发明的一种实施方式中，所述注射为将抗原溶液在鸡的胸部和腿部进行散点注射。
在本发明的一种实施方式中，所述卵黄液与水的体积比为1：(4～12)。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次静置的条件为温度4℃、时间6～10h。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次离心的条件为转速4000～10000r/min、时间10～30min。
在本发明的一种实施方式中，所述混合液A中硫酸铵的饱和度为30～60％。
在本发明的一种实施方式中，所述第二次静置的时间为1～4h。
在本发明的一种实施方式中，所述第二次离心的条件为转速4000～10000r/min、时间10～30min。
在本发明的一种实施方式中，所述混合液B与卵黄液等体积。
在本发明的一种实施方式中，所述混合液C中硫酸铵的饱和度为20～60％。
在本发明的一种实施方式中，所述第三次静置的时间为1～4h。
在本发明的一种实施方式中，所述第三次离心的条件为转速4000～10000r/min、时间10～30min。
在本发明的一种实施方式中，所述透析的条件为截留分子量14kD、时间6～12h。
在本发明的一种实施方式中，所述透析的条件为截留分子量14kD、时间8h。
本发明提供了应用上述方法制备得到的α-淀粉酶抑制剂。
本发明提供了上述α-淀粉酶抑制剂在制备治疗和/或预防糖尿病以及糖尿病并发症的产品方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述α-淀粉酶抑制剂、药物载体和/或药用辅料。
本发明提供了一种用于治疗和/或预防糖尿病以及糖尿病并发症的产品，所述产品含有上述α-淀粉酶抑制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有上述α-淀粉酶抑制剂、药物载体和/或药用辅料。
有益效果：
(1)本发明以α-淀粉酶为抗原，利用抗原抗体反应原理，在蛋鸡中得到了一种IgY，此IgY能与α-淀粉酶结合，从而特异性抑制其活性，是一种优良的新型α-淀粉酶抑制剂；
(2)本发明的α-淀粉酶抑制剂以鸡等可大规模养殖的禽类产的蛋为原料，不仅具有天然安全、易获得、产量高、成本低、便于大规模生产等优势，还具有稳定性好、抑制活性高等特点，；
(3)本发明的α-淀粉酶抑制剂具有特异性好(IC50值可低至1mg/mL)、稳定性高、抑制活性强(对α-淀粉酶的抑制率可高达100％)等的优势，在制备糖尿病的防治药物方面具有极大的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的鸡购自山西省万荣县里望乡和井村养殖场；α-淀粉酶购自美国Sigma-Aldrich公司。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
(1)IgY对α-淀粉酶的抑制率的检测方法：
将0.25mLα-淀粉酶溶液和0.25mL IgY加入到0.5mL PBS缓冲液中，37℃水浴孵育10min，加入0.5mL底物溶液。反应5min后，加入lmL DNS试剂并沸水浴10min以终止反应，迅速冷却，加入5mL去离子水进行稀释，540nm处测定吸光值。对照管以同体积PBS代替α-淀粉酶液，空白组以PBS代替IgY，其余操作同抑制管；
IgY对α-淀粉酶的抑制率可按式(1)计算：
抑制率(％)＝[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100 式(1)；
式中，A1、A2、A3和A4分别为540nm处空白管、空白对照管、抑制管、抑制对照管的吸光值。
(2)IgY对α-淀粉酶的抑制的特异性的检测方法：
将IgY进行梯度稀释，测定不同浓度IgY对α-淀粉酶的抑制率，计算其对α-淀粉酶的半抑制浓度(IC50)。
实施例1
具体步骤如下：
(1)将α-淀粉酶加入PBS缓冲液中，得到α-淀粉酶浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6mg/mL的抗原溶液；
(2)将得到的抗原溶液分别与完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂按1:1比例混合进行乳化，乳化均匀后，用经完全弗氏佐剂乳化的抗原溶液于鸡胸部和腿部散点注射进行首次免疫，剂量为1mL/只，14天后，每隔两周用经不完全弗氏佐剂乳化的抗原溶液于鸡胸部和腿部散点注射进行强化免疫，剂量为1mL/只，次数为3次，得到获得免疫的鸡；
(3)等鸡下蛋后，将鸡蛋表面消毒，分离卵黄和蛋清，收集卵黄液，加入6倍体积去离子水稀释，调节pH至4.5，4℃静置10h，6000r/min离心20min，收集上清；
(4)向上清中加入硫酸铵至终浓度60％，静置1h，6000r/min离心20min，收集沉淀；
(5)将沉淀溶解于PBS缓冲液中至原卵黄液体积，加入饱和硫酸铵溶液至终浓度20％，静置2h，6000r/min离心20min，再次收集沉淀；
(6)将沉淀溶解于PBS缓冲液中，以截留分子量为14kD透析袋透析8h，得到α-淀粉酶抑制剂。
检测α-淀粉酶抑制剂对α-淀粉酶的抑制率以及特异性，检测结果如表1。
表1 抑制率以及特异性检测结果
由表1可知，α-淀粉酶浓度为0.2～0.6mg/mL时所得抑制剂对α-淀粉酶抑制率均较高，其中，α-淀粉酶浓度为0.4mg/mL时所得抑制剂对α-淀粉酶抑制效果最佳。
实施例2
具体步骤如下：
(1)将α-淀粉酶加入PBS缓冲液中，得到α-淀粉酶浓度为0.2mg/mL的抗原溶液；
(2)将得到的抗原溶液分别与完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂按1:1比例混合进行乳化，乳化均匀后，用经完全弗氏佐剂乳化的抗原溶液于鸡胸部和腿部散点注射进行首次免疫，剂量为1mL/只，14天后，每隔两周用经不完全弗氏佐剂乳化的抗原溶液于鸡胸部和腿部散点注射进行强化免疫，剂量为1mL/只，次数为3次，得到获得免疫的鸡；
(3)等鸡下蛋后，将鸡蛋表面消毒，分离卵黄和蛋清，收集卵黄液，加入6倍体积去离子水稀释，分别调节pH至4.5、5.0、5.5、6.0，4℃静置10h，6000r/min离心20min，收集上清；
(4)向上清中加入硫酸铵至终浓度60％，静置1h，6000r/min离心20min，收集沉淀；
(5)将沉淀溶解于PBS缓冲液中至原卵黄液体积，加入饱和硫酸铵溶液至终浓度20％，静置2h，6000r/min离心20min，再次收集沉淀；
(6)将沉淀溶解于PBS缓冲液中，以截留分子量为14kD透析袋透析8h，得到α-淀粉酶抑制剂。
检测α-淀粉酶抑制剂对α-淀粉酶的抑制率以及特异性，检测结果如表2。
表2 抑制率以及特异性检测结果
pH 4.5 5.0 5.5 6.0
抑制率(％) 70 100 80 60
特异性(mg/mL) 2 1 1.8 3
由表2可知，pH为4.5～5.5时所得抑制剂对α-淀粉酶抑制效果较好。
实施例3
具体步骤如下：
(1)将α-淀粉酶加入PBS缓冲液中，得到α-淀粉酶浓度为0.2mg/mL的抗原溶液；
(2)将得到的抗原溶液分别与完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂按1:1比例混合进行乳化，乳化均匀后，用经完全弗氏佐剂乳化的抗原溶液于鸡胸部和腿部散点注射进行首次免疫，剂量为1mL/只，14天后，每隔两周用经不完全弗氏佐剂乳化的抗原溶液于鸡胸部和腿部散点注射进行强化免疫，剂量为1mL/只，次数为3次，得到获得免疫的鸡；
(3)等鸡下蛋后，将鸡蛋表面消毒，分离卵黄和蛋清，收集卵黄液，加入6倍体积去离子水稀释，分别调节pH至5.0，4℃静置10h，6000r/min离心20min，收集上清；
(4)向上清中加入硫酸铵至饱和度20％、30％、50％、60％、70％，静置1h，6000r/min离心20min，收集沉淀；
(5)将沉淀溶解于PBS缓冲液中至原卵黄液体积，加入饱和硫酸铵溶液至饱和度20％，静置2h，6000r/min离心20min，再次收集沉淀；
(6)将沉淀溶解于PBS缓冲液中，以截留分子量为14kD透析袋透析8h，得到α-淀粉酶抑制剂。
检测α-淀粉酶抑制剂对α-淀粉酶的抑制率，检测结果如表3。
表3 抑制率以及特异性检测结果
硫酸铵饱和度(％) 20 30 50 60 70
抑制率(％) 50 60 90 98 50
特异性(mg/mL) 4 3 1.3 1.1 4
由表3可知，第一次硫酸铵沉淀中硫酸铵终饱和度为60％左右时所得抑制剂对α-淀粉酶抑制率效果较好。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种α-淀粉酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述方法为将α-淀粉酶加入缓冲液，得到抗原溶液；将抗原溶液与完全弗氏佐剂混合后注射进入禽类体内进行首次免疫，将抗原溶液与不完全弗氏佐剂混合后注射进入禽类体内进行强化免疫，得到获得免疫的禽类；将获得免疫的禽类产下的蛋消毒后，分离卵黄和蛋清，收集卵黄液；将卵黄液加入水中进行稀释后，调节pH至4.0～6.0，得到稀释液；将稀释液进行第一次静置后进行第一次离心，收集上清；在上清中加入硫酸铵，得到混合液A；将混合液A进行第二次静置后进行第二次离心，收集沉淀A；将沉淀A溶于缓冲液中，得到混合液B；在混合液B中加入饱和度为100％的饱和硫酸铵溶液，得到混合液C；将混合液C进行第三次静置后进行第三次离心，收集沉淀B；将沉淀B溶于缓冲液中进行透析，得到α-淀粉酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的一种α-淀粉酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液。
3.如权利要求1或2所述的一种α-淀粉酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述抗原溶液中α-淀粉酶的浓度为0.1～1mg/mL。
4.如权利要求1-3任一所述的一种α-淀粉酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述卵黄液与水的体积比为1：(4～12)。
5.如权利要求1-4任一所述的一种α-淀粉酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述混合液A中硫酸铵的饱和度为30～60％。
6.如权利要求1-5任一所述的一种α-淀粉酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述混合液C中硫酸铵的饱和度为20～60％。
7.如权利要求1-6任一所述的一种α-淀粉酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述透析的条件为截留分子量14kD、时间6～12h。
8.应用权利要求1-7任一所述的方法制备得到的α-淀粉酶抑制剂。
9.权利要求8所述的α-淀粉酶抑制剂在制备治疗和/或预防糖尿病以及糖尿病并发症的产品方面的应用。
10.一种用于治疗和/或预防糖尿病以及糖尿病并发症的产品，其特征在于，所述产品含有权利要求8所述的α-淀粉酶抑制剂。
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