CN110684090A - 一种α-淀粉酶抑制剂及其制备工艺和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了天然活性物质制备技术领域的一种α‑淀粉酶抑制剂及其制备工艺和应用。α‑淀粉酶抑制剂的制备工艺包括，制备沙棘蛋白；向所述沙棘蛋白中加入去离子水，调节溶液pH值为6.0～8.0，30～55℃搅拌1～2h，第一次离心分离得到第一上清液和沉淀；冻干所述第一上清液，即得α‑淀粉酶抑制剂I。向所述沉淀中加入氯化钠溶液，调节溶液pH为7.0～9.0，35～50℃搅拌0.5～2.5h，第二次离心分离得到第二上清液；冻干所述第二上清液，即得α‑淀粉酶抑制剂II。本发明制备工艺反应条件温和、操作简单、设备投资少，适用于工业化生产。制备的α‑淀粉酶抑制剂具有纯度高、抑制活性强、耐热性好、无食品添加剂残留以及产品无毒安全等优点。
Description
技术领域
本发明涉及天然活性物质制备技术领域，具体涉及一种α-淀粉酶抑制剂及其制备工艺和应用。
背景技术
α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor，简称α-AI)是一种纯天然生物活性物质，存在于植物种子的胚乳和微生物的代谢产物中，来源广泛。目前，主要是从小麦、大米、高粱、花生、豆类等植物籽实中提取分离α-淀粉酶抑制剂。α-淀粉酶抑制剂的来源不同，其分离纯化的方法也不相同。
《野生苋属植物籽实中新型α-淀粉酶抑制剂的分离纯化和结构与功能研究》张琳等，采用氯化钠浸泡野生苋属植物籽实、研磨、离心取上清液，对野生苋属植物籽实重复提取3次，合并上清液后离心，直至无沉淀出现，收集上清，70℃水浴，使β-淀粉酶失活，同时使大分子蛋白变性沉淀，减少对目的成分(小分子量的多肽)的干扰。冷至室温后，离心取上清液，用微米滤膜抽滤，然后通过反相高效液相色谱分离纯化技术得到纯化的WAI-1和WAI-2两种蛋白类α-淀粉酶抑制剂。
《沙棘中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选》郭凤霞等，以沙棘枝叶为原料，依次采用极性不同的溶剂乙酸乙酯、甲醇、蒸馏水对沙棘粗粉进行提取，所得各部位的提取物干燥。以沙棘枝叶粗粉为原料，采用乙醇回流脱脂热水浸提法提取沙棘粗多糖，进一步通过Sevage法除沙棘粗多糖中的蛋白质，得到脱去游离蛋白的沙棘粗多糖。四种提取成分对α-葡萄糖甘酶的抑制活性分别为20.34％、13.43％、71.28％和90.43％，沙棘粗多糖对α-葡萄糖甘酶的抑制活性的最高。
目前，关于沙棘中α-淀粉酶抑制剂鲜有报道。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种α-淀粉酶抑制剂及其制备工艺和应用。
一种α-淀粉酶抑制剂的制备工艺，包括，
制备沙棘蛋白；
向所述沙棘蛋白中加入去离子水，调节溶液pH值为6.0～8.0，30～55℃搅拌1～2h，第一次离心分离得到第一上清液和沉淀；优选地，调节溶液pH值为7.0，50℃搅拌1h；
冻干所述第一上清液，即得α-淀粉酶抑制剂I。
所述沙棘蛋白为沙棘籽粕蛋白。
所述沙棘蛋白与所述去离子水的重量比为1:5～15，优选为1:10；
所述搅拌速度为200～500rpm/min；
所述第一次离心的转速为3000～5000rpm/min，时间为5～20min；优选地，转速为4000rpm/min，时间为20min；
所述冻干的温度为-50～-40℃，压力为-0.1～0MPa，时间22-26h；优选地，冻干的温度为-45℃，压力为0MPa，时间24h。
进一步地，所述的制备工艺，还包括，
向所述沉淀中加入氯化钠溶液，调节溶液pH为7.0～9.0，30～50℃搅拌0.5～2.5h，第二次离心分离得到第二上清液；优选地，调节溶液pH为9.0，30℃搅拌1h；
冻干所述第二上清液，即得α-淀粉酶抑制剂II。
所述氯化钠溶液的质量浓度为1-5％，优选为2％；
所述沉淀与所述氯化钠溶液的重量比为1:10-1:15，优选为1:10；
所述搅拌速度为200～500rpm/min；
所述第二次离心的转速为6000～8000rpm/min，时间为10～20min；
所述冻干的温度为-50～-40℃，压力为-0.1～0MPa，时间22-26h；优选地，冻干的温度为-45℃，压力为0MPa，时间24h。
所述溶液pH值用氢氧化钠溶液和/或盐酸溶液调节。
所述沙棘蛋白的制备，包括，
(1)向沙棘原料粉末中加入乙醇溶液，搅拌条件下保温处理，得到混合溶液；
(2)所述混合溶液过滤，得到滤液和第一沉淀；
(3)所得滤液进行沉降离心处理，得到第二沉淀；
(4)合并所述第一沉淀和所述第二沉淀；
(5)烘干，即为沙棘蛋白。
所述的制备工艺，还包括合并所述第一沉淀和所述第二沉淀后，将其按照步骤(1)-(4)重复2-4次。
所述沙棘原料粉末的粒径为60-100目；
所述乙醇溶液的体积浓度是50％-75％；
所述沙棘原料粉末与乙醇溶液的重量比为1:20～1:30。
所述搅拌速度为200～500rpm/min；
所述保温处理的温度为45～65℃，时间为0.5～3h；
所述沉降离心的离心速度为5000～8000rpm/min，时间为10～20min；
所述烘干的温度为45～60℃，时间为0.5～2h。
上述制备工艺制备的α-淀粉酶抑制剂。
所述α-淀粉酶抑制剂的分子量为15kDa、25-35kDa或35kDa。
本发明还提供所述制备工艺制备的α-淀粉酶抑制剂，或所述的α-淀粉酶抑制剂在制备防治II型糖尿病或肥胖症的药物或食品中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明发现沙棘蛋白具有抑制α-淀粉酶活性的作用，并以沙棘籽粕为原料，通过水浸提制备α-淀粉酶抑制剂I。进一步利用盐溶液对制备α-淀粉酶抑制剂I后的沉淀处理，制备得到α-淀粉酶抑制剂II。本发明制备工艺反应条件温和、操作简单、设备投资少，适用于工业化生产。本发明以沙棘籽粕为原料，使沙棘加工副产物得到有效利用。
2、本发明制备的α-淀粉酶抑制剂为蛋白类抑制剂，共制备出两种α-淀粉酶抑制剂，分别为α-淀粉酶抑制剂I和α-淀粉酶抑制剂II，两者具有不同的分子量和结构。α-淀粉酶抑制剂I的分子量为15kDa和25-35kDa，α-淀粉酶抑制剂Ⅱ的分子量接近35kDa。本发明制备的α-淀粉酶抑制剂具有纯度高、抑制活性强、耐热性好、无食品添加剂残留以及产品安全无毒等优点，可直接应用于食品和药品领域。
经80℃热处理后，α-淀粉酶抑制剂的抑制活性增强。α-淀粉酶抑制剂I未进行热处理时，活性呈降低趋势，经80℃热处理后，随着浓度的增加呈现增长趋势，抑制率最高可达77.35％。
3、α-淀粉酶抑制剂能抑制肠道内唾液及淀粉酶的活性，阻碍或延缓人体对食物中主要的碳水化合物的水解和消化，降低食物中淀粉糖类物质的分解和吸收，从而能降低血糖，抑制血糖浓度的升高，减少胰岛素分泌，降低脂肪合成，减轻体重，是治疗糖尿病和减肥的有效成分，本发明制备的α-淀粉酶抑制剂可用于制备防治II型糖尿病或肥胖症药物或食品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中α-淀粉酶抑制剂I和α-淀粉酶抑制剂II的电泳图；
图2是本发明实施例1中α-淀粉酶抑制剂I和α-淀粉酶抑制剂II的红外光谱图；
图3是本发明实验例4中α-淀粉酶抑制剂I和α-淀粉酶抑制剂II的α-淀粉酶的抑制活性测定结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例1
本实施例提供的α-淀粉酶抑制剂，为分离自沙棘籽粕的蛋白质，制备工艺包括，
将沙棘籽粕用粉碎机粉碎为细颗粒并过筛，得到粒径为80目的沙棘原料粉末，储存于-20℃冰箱备用。
向10g原料粉末中加入其重量25倍的50％的乙醇溶液，50℃温度下，300rpm/min搅拌2h，得到混合溶液。所得混合溶液用纱布过滤，得到滤液和第一沉淀。所得滤液进行沉降离心处理，6000rpm/min离心15min，得到第二沉淀。合并所得第一沉淀和所得第二沉淀。所得合并后沉淀重复上述操作2次。将最后所得合并后沉淀50℃温度下干燥1h，得到沙棘籽粕蛋白。
向沙棘籽粕蛋白中加入其重量10倍的去离子水，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，50℃搅拌1h，4000rpm/min离心20min，所得沉淀备用。所得上清液进行冻干处理，冻干的温度为-45℃，压力为0MPa，时间24h，即得到α-淀粉酶抑制剂，记为α-淀粉酶抑制剂I。
向所得沉淀中加入其重量10倍的2％的氯化钠溶液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH为9.0，30℃搅拌1h，7000rpm/min离心15min，所得上清液进行冻干处理，冻干的温度为-45℃，压力为0MPa，时间24h，即得到α-淀粉酶抑制剂，记为α-淀粉酶抑制剂II。
α-淀粉酶抑制剂I和α-淀粉酶抑制剂II的蛋白质含量和蛋白质提取率如表1所示。
蛋白质含量测定采用凯氏定氮法(蛋白质转化系数为6.25)。
蛋白质提取率＝样品中蛋白质的质量/原料中蛋白质的质量×100％
表1两种淀粉酶抑制剂的蛋白质含量和蛋白质提取率
实施例2
本实施例提供的α-淀粉酶抑制剂，为分离自沙棘籽粕的蛋白质，制备工艺，包括，
将沙棘籽粕用粉碎机粉碎为细颗粒并过筛，得到粒径为60目的沙棘原料粉末，储存于-20℃冰箱备用。
向10g沙棘原料粉末中加入其重量30倍的65％的乙醇溶液，65℃温度下，500rpm/min搅拌0.5h，得到混合溶液。所得混合溶液用纱布过滤，得到滤液和第一沉淀。所得滤液进行沉降离心处理，5000rpm/min离心20min，得到第二沉淀。所得合并后沉淀重复上述操作2次。将最后所得合并后沉淀45℃温度下干燥2h，得到沙棘籽粕蛋白。
向沙棘籽粕蛋白中加入其重量8倍的去离子水，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.0，50℃搅拌2h，5000rpm/min离心10min，所得沉淀备用。所得上清液进行冻干处理，冻干的温度为-45℃，压力为0MPa，时间24h，即得到α-淀粉酶抑制剂，记为α-淀粉酶抑制剂I。
向所得沉淀中加入其重量10倍的2％的氯化钠溶液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH为9.0，30℃搅拌1h，7000rpm/min离心15min，所得上清液进行冻干处理，冻干的温度为-45℃，压力为0MPa，时间24h，即得到α-淀粉酶抑制剂，记为α-淀粉酶抑制剂II。
经测定，这两种淀粉酶抑制剂的蛋白质含量分别为14wt％和7wt％。
实施例3
本实施例提供的α-淀粉酶抑制剂，为分离自沙棘籽粕的蛋白质，制备工艺，包括，
将沙棘籽粕用粉碎机粉碎为细颗粒并过筛，得到粒径为100目的沙棘原料粉末，储存于-20℃冰箱备用。
向10g原料颗粒(原料粉末)中加入其重量20倍的75％的乙醇溶液，45℃温度下，200rpm/min搅拌3h，得到混合溶液。所得混合溶液用纱布过滤，得到滤液和第一沉淀。所得滤液进行沉降离心处理，8000rpm/min离心10min，得到第二沉淀。所得合并后沉淀重复上述操作2次。将最后所得合并后沉淀60℃温度下干燥0.5h，得到沙棘籽粕蛋白。
向沙棘籽粕蛋白中加入其重量15倍的去离子水，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为6.0，30℃搅拌2h，3000rpm/min离心20min，所得沉淀备用。所得上清液进行冻干处理，冻干的温度为-45℃，压力为0MPa，时间24h，即得到α-淀粉酶抑制剂，记为α-淀粉酶抑制剂I。
向所得沉淀中加入其重量10倍的1％的氯化钠溶液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH为7.0，50℃搅拌2.5h，8000rpm/min离心10min，所得上清液进行冻干处理，冻干的温度为-45℃，压力为0MPa，时间24h，即得到α-淀粉酶抑制剂，记为α-淀粉酶抑制剂II。
实施例4
本实施例提供的α-淀粉酶抑制剂，分离自沙棘籽粕的蛋白质，制备工艺，包括，
将沙棘籽粕用粉碎机粉碎为细颗粒并过筛，得到粒径为100目的沙棘原料粉末，储存于-20℃冰箱备用。
向10g原料粉末中加入其重量20倍的50％的乙醇溶液，45℃温度下，200rpm/min搅拌0.5h，得到混合溶液。所得混合溶液用纱布过滤，得到滤液和第一沉淀。所得滤液进行沉降离心处理，8000rpm/min离心10min，得到第二沉淀。所得合并后沉淀重复上述操作2次。将最后所得合并后沉淀60℃温度下干燥0.5h，得到沙棘籽粕蛋白。
向沙棘籽粕蛋白中加入其重量5倍的去离子水，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为8.0，55℃搅拌1h，5000rpm/min离心10min，所得沉淀备用。所得上清液进行冻干处理，冻干的温度为-45℃，压力为0MPa，时间24h，即得到α-淀粉酶抑制剂，记为α-淀粉酶抑制剂I。
向所得沉淀中加入其重量10倍的5％的氯化钠溶液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH为7.0，40℃搅拌2.5h，8000rpm/min离心10min，所得上清液进行冻干处理，冻干的温度为-45℃，压力为0MPa，时间24h，即得到α-淀粉酶抑制剂，记为α-淀粉酶抑制剂II。
实验例1
实施例1中α-淀粉酶抑制剂Ⅰ和α-淀粉酶抑制剂Ⅱ进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
SDS-PAGE结果如图1所示。α-淀粉酶抑制剂Ⅰ是由两个条带组成，分别是15kDa和25kDa-35kDa之间，而α-淀粉酶抑制剂Ⅱ只有一个条带，且分子量接近35kDa，表明α-淀粉酶抑制剂Ⅰ和Ⅱ属于两种不同的蛋白。
实施例1中α-淀粉酶抑制剂Ⅰ和α-淀粉酶抑制剂Ⅱ的红外光谱图如图2所示。α-淀粉酶抑制剂Ⅰ在3457.14，3430.10，1646.38具有显著特征峰，α-淀粉酶抑制剂Ⅱ在3443.68，3423.78，1637.40具有显著特征峰。α-淀粉酶抑制剂Ⅰ与Ⅱ相比发生红移，结构上发生了变化，进一步表面α-淀粉酶抑制剂Ⅰ和Ⅱ属于两种不同的蛋白。
实验例2
本实验例利用不同质量浓度的氯化钠溶液(1％，2％，3％，4％和5％)提取α-淀粉酶抑制剂II，共5个实验组。每一实验组按照如下步骤操作：
称取5g沙棘籽粕原料粉末，通过实施例1所述的制备工艺操作，取提取过α-淀粉酶抑制剂I的残渣(沉淀)，备用。
向所得沉淀中加入其重量10倍的氯化钠溶液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH为9.0，30℃搅拌1h，7000rpm/min离心15min，所得上清液进行冻干处理，即为α-淀粉酶抑制剂II。
5个实验组提取α-淀粉酶抑制剂II的蛋白质提取率和蛋白质含量如表2所示。
表2不同浓度氯化钠溶液提取α-淀粉酶抑制剂II
表2结果表明，采用不同浓度的氯化钠溶液提取α-淀粉酶抑制剂II，其蛋白质提取率随着氯化钠浓度的增加呈现先增长后降低的趋势，蛋白质含量没有明显差异。采用2％的氯化钠溶液对于α-淀粉酶抑制剂II的提取效果较好。
实验例3
将实施例2制备的α-淀粉酶抑制剂I和α-淀粉酶抑制剂II分别配置成不同蛋白浓度的溶液(0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml,0.8mg/ml，1.0mg/ml)，测定80℃热处理之后其抑制作用效果。
α-淀粉酶抑制率的测定采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法。具体如下：在25ml比色管中加入1ml淀粉酶溶液和1ml淀粉酶抑制剂混合后，恒温水浴箱中(37℃)预热15min，再加入1ml淀粉溶液(浓度2％)充分混合，反应5min中后，快速添加2mlDN试剂后于沸水浴中煮沸5min终止反应，在室温下冷却，波长540nm处测定吸光度。其中空白实验不添加淀粉酶抑制剂，其他操作相同。计算公式如下：
α-淀粉酶抑制率(％)＝(1-Ab/Aa)×100，
其中，Aa表示不添加抑制剂时的吸光度，Ab表示添加抑制剂时的吸光度。
结果如图3所示。未进行热处理的α-淀粉酶抑制剂Ⅰ的抑制活性随着浓度的增加呈现明显降低的趋势，其浓度为0.2mg/ml时，抑制率可以达到71.54％。80℃热处理之后，抑制率随着浓度的增加呈现增长的趋势，当浓度达到1mg/ml时，其抑制率可达77.35％。
未进行热处理的α-淀粉酶抑制剂Ⅱ的抑制活性随着浓度的增加为呈现明显的降低趋势。80℃热处理后，其抑制活性略有提高，且随着浓度的增加，抑制率呈现下降趋势，在浓度为0.2mg/ml时，抑制率最高可达到78.59％。
α-淀粉酶抑制剂I和α-淀粉酶抑制剂II均表现出较好的耐热性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (13)
1.一种α-淀粉酶抑制剂的制备工艺，其特征在于，包括，
制备沙棘蛋白；
向所述沙棘蛋白中加入去离子水，调节溶液pH值为6.0～8.0，30～55℃搅拌1～2h，第一次离心分离得到第一上清液和沉淀；
冻干所述第一上清液，即得α-淀粉酶抑制剂I。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述沙棘蛋白为沙棘籽粕蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的制备工艺，其特征在于，所述沙棘蛋白与所述去离子水的重量比为1:5～15；
所述搅拌速度为200～500rpm/min；
所述第一次离心的转速为3000～5000rpm/min，时间为5～20min；
所述冻干的温度为-50～-40℃，压力为-0.1～0MPa，时间22-26h。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备工艺，其特征在于，还包括，
向所述沉淀中加入氯化钠溶液，调节溶液pH为7.0～9.0，30～50℃搅拌0.5～2.5h，第二次离心分离得到第二上清液；
冻干所述第二上清液，即得α-淀粉酶抑制剂II。
5.根据权利要求4所述的制备工艺，其特征在于，所述氯化钠溶液的质量浓度为1-5％；
所述沉淀与所述氯化钠溶液的重量比为1:10-1:15；
所述搅拌速度为200～500rpm/min；
所述第二次离心的转速为6000～8000rpm/min，时间为10～20min；
所述冻干的温度为-50～-40℃，压力为-0.1～0MPa，时间22-26h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备工艺，其特征在于，所述溶液pH值用氢氧化钠溶液和/或盐酸溶液调节。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备工艺，其特征在于，所述沙棘蛋白的制备，包括，
(1)向沙棘原料粉末中加入乙醇溶液，搅拌条件下保温处理，得到混合溶液；
(2)所述混合溶液过滤，得到滤液和第一沉淀；
(3)所得滤液进行沉降离心处理，得到第二沉淀；
(4)合并所述第一沉淀和所述第二沉淀；
(5)烘干，即为沙棘蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备工艺，其特征在于，还包括合并所述第一沉淀和所述第二沉淀后，将其按照步骤(1)-(4)重复2-4次。
9.根据权利要求7或8所述的制备工艺，其特征在于，所述沙棘原料粉末的粒径为60-100目；
所述乙醇溶液的体积浓度是50％-75％；
所述沙棘原料粉末与乙醇溶液的重量比为1:20～1:30。
10.根据权利要求7-9任一项所述的制备工艺，其特征在于，所述搅拌速度为200～500rpm/min；
所述保温处理的温度为45～65℃，时间为0.5～3h；
所述沉降离心的离心速度为5000～8000rpm/min，时间为10～20min；
所述烘干的温度为45～60℃，时间为0.5～2h。
11.权利要求1-10任一项所述制备工艺制备的α-淀粉酶抑制剂。
12.根据权利要求11所述的α-淀粉酶抑制剂，其特征在于，所述α-淀粉酶抑制剂的分子量为15kDa、25-35kDa或35kDa。
13.权利要求1-10任一项所述制备工艺制备的α-淀粉酶抑制剂，或权利要求11或12所述的α-淀粉酶抑制剂在制备防治II型糖尿病或肥胖症的药物或食品中的应用。
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