CN114752585B - 一种核桃青皮抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种核桃青皮抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物蛋白的制备和应用领域，公开了一种核桃青皮抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用。具体制备方法是将新鲜核桃青皮阴干，然后将干核桃青皮剪碎，加入蛋白提取液4℃浸泡10‑16h，随后加入预冷的丙酮低温沉淀蛋白，离心后用蛋白提取液溶解得到核桃青皮粗蛋白；通过活性炭除色，得到纯化后的核桃青皮抗肿瘤活性蛋白。该蛋白可明显抑制HepG2和Bel‑7402肝癌细胞、大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF‑7细胞、宫颈癌HeLa细胞和卵巢腺癌SKOV3细胞的存活，可以在制备抗肿瘤药物中应用。

Description

一种核桃青皮抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物蛋白的制备和应用领域，具体属于一种核桃青皮抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
核桃青皮(Juglans regia L.)，属于胡桃科胡桃属的多年生乔木，又名胡桃、羌桃，核桃具有抗衰老、益脑、提高身体免疫力等功效，深受人们喜爱。在中医学中，核桃仁、核桃青皮、核桃花、叶、根、树皮均有极高的药用价值。核桃青皮是核桃外部新鲜的绿色果皮，在中草药中核桃青皮又名青龙衣，具有极高的药用价值。核桃青皮，苦辛、温，疏肝破气、消积化滞，可入药，在《本草纲目》中记有止痛、治疗皮肤瘙痒及治疗癌症等功效。自古以来民间便有用核桃青皮治疗癌症的偏方，现代医学研究表明，核桃青皮在抗肿瘤方面确有突出的作用。核桃绿皮提取物对肝癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞增殖均有抑制作用；从核桃青皮中分离出的萘醌、多糖及胡桃醌等物质有体外抗肿瘤作用，其中胡桃醌的抗肿瘤价值颇高。
核桃在我国大部分区域广泛栽培，核桃的种植主要是为了获得核桃仁，核桃果实成熟后，核桃青皮就会枯萎脱落，核桃青皮是核桃加工的主要副产品，由于其不可食用的特性，通常在没有考虑其潜在的功能活性和商业价值的情况下被丢弃。在核桃摘取后通常作为废弃物扔弃。大量的核桃青皮在没有任何控制的情况下变成了难以处理的农业废弃物。因此，评估核桃青皮的潜在利用价值至关重要。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种核桃青皮抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用。可用于制备抗肿瘤药物。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
第一、本发明提供了一种核桃青皮抗肿瘤活性蛋白，所述抗肿瘤活性蛋白是以核桃青皮为原料提取到的分子量为66～90kDa的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳显示是单一条带。
第二、本发明提供了一种上述核桃青皮抗肿瘤活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，取核桃青皮，阴干；
步骤2，取阴干后的核桃青皮，剪碎后，按每克加4～6mL的蛋白提取液，4℃下浸泡10～16h，离心后，取上清液；
步骤3，在步骤2的上清液中加入2～3倍体积-20℃提前预冷的丙酮，静置0.5～1.5h后，4℃离心收集沉淀，在-20℃下放置20～40min，得到沉淀为核桃青皮粗蛋白；
步骤4，将步骤3得到的沉淀用磷酸缓冲液溶解，离心后取上清液；
步骤5，将活性炭以8～12g/L加入到步骤4的上清液中，连续搅拌5min，静置20～40min吸附色素，过滤后得到纯化后的核桃青皮抗肿瘤活性蛋白。
进一步，所述步骤2中的蛋白提取液为pH7.4的磷酸缓冲液。
优选地，所述步骤2中核桃青皮与蛋白提取液的质量体积比为1：4，单位为g/mL。
进一步，所述步骤2、3、4和5均在0～4℃条件下进行。
第三、本发明提供了一种上述核桃青皮抗肿瘤活性蛋白的应用，用于制备抗肿瘤药物。
第四、本发明还提供了一种含有上述核桃青皮抗肿瘤活性蛋白的药物组合物。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明获得了一种核桃青皮抗肿瘤活性蛋白，经体外抗肿瘤活性检测，该蛋白具有良好的抗肿瘤细胞活性，可明显的抑制肝癌HepG2和Bel-7402细胞、大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF-7细胞、宫颈癌HeLa细胞和卵巢腺癌SKOV3细胞的存活，而对正常细胞没有明显毒副作用，可以在制备抗肿瘤药物中应用。
附图说明
图1核桃青皮抗肿瘤活性蛋白SDS-PAGE电泳图(图中：M，标准分子量；1，粗蛋白；2，活性炭除色后的纯化蛋白)。
图2核桃青皮抗肿瘤活性蛋白对细胞存活的影响。图中*代表P<0.05，**代表P<0.01。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1
核桃青皮抗肿瘤活性蛋白的制备：
第一步：取新鲜核桃青皮，阴干。取干核桃青皮250g，剪刀剪碎后，加入1L的磷酸缓冲液(1L的磷酸缓冲液体系里含8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4.12H2O，0.24g KH2PO4，pH7.4)，4℃下浸泡10h，4℃，11000rpm离心30min后取上清液。离心后的滤渣重复提取1次；
第二步：向第一步上清液中加入2倍体积-20℃提前预冷的丙酮，边加边搅拌，将其置于4℃冰箱放置40min，4℃，11000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀，将沉淀置于-20℃中40min，使丙酮完全挥发，将沉淀冷冻干燥，获得核桃青皮粗蛋白。
第三步：将第二步中得到的核桃青皮粗蛋白用磷酸缓冲液在冰上溶解，离心(4℃，11000rpm离心30min，)后取上清液。
第四步：将第三步中得到的上清液，加入活性炭，以10g/L的量加入到上清液中，连续搅拌5min，静置30min吸附色素，过滤后得到纯化后的核桃青皮蛋白。
实施例2
核桃青皮抗肿瘤活性蛋白的制备：
第一步：取新鲜核桃青皮，阴干。取干核桃青皮250g，剪刀剪碎后，加入1.5L的磷酸缓冲液(1L的磷酸缓冲液体系里含8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4.12H2O，0.24gKH2PO4，pH7.4)，4℃下浸泡16h，4℃，11000rpm离心30min后取上清液；
第二步：向第一步上清液中加入3倍体积-20℃提前预冷的丙酮，边加边搅拌，将其置于4℃冰箱放置30min，4℃，11000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀，将沉淀置于-20℃中20min，使丙酮完全挥发，将沉淀冷冻干燥，获得核桃青皮粗蛋白。
第三步：将第二步中得到的核桃青皮粗蛋白用磷酸缓冲液在冰上溶解，离心(4℃，11000rpm离心30min，)后取上清液。
第四步：将第三步中得到的上清液，加入活性炭，以8g/L的量加入到上清液中，连续搅拌5min，静置20min吸附色素，过滤后得到纯化后的核桃青皮蛋白。
实施例3
核桃青皮抗肿瘤活性蛋白的制备：
第一步：取新鲜核桃青皮，阴干。取干核桃青皮250g，剪刀剪碎后，加入1.25L的磷酸缓冲液(1L的磷酸缓冲液体系里含8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4.12H2O，0.24gKH2PO4，pH7.4)，4℃下浸泡12h，4℃，11000rpm离心30min后取上清液。离心后的滤渣重复提取2次；
第二步：向第一步上清液中加入2.5倍体积-20℃提前预冷的丙酮，边加边搅拌，将其置于4℃冰箱放置90min，4℃，11000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀，将沉淀置于-20℃中30min，使丙酮完全挥发，将沉淀冷冻干燥，获得核桃青皮粗蛋白。
第三步：将第二步中得到的核桃青皮粗蛋白用磷酸缓冲液在冰上溶解，离心(4℃，11000rpm离心30min，)后取上清液。
第四步：将第三步中得到的上清液，加入活性炭，以12g/L的量加入到上清液中，连续搅拌5min，静置40min吸附色素，过滤后得到纯化后的核桃青皮蛋白。
采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，通过与标准分子量对比，得到核桃青皮抗肿瘤活性蛋白的分子量在66～90kDa之间，约为70kDa。显示是单一条带(图1)。
实施例4
核桃青皮抗肿瘤活性蛋白对肿瘤细胞存活的影响
将对数生长期的HepG2和Bel-7402肝癌细胞、正常肝细胞HL7702、大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF-7细胞、宫颈癌HeLa细胞和卵巢腺癌SKOV3细胞，以8×103个/孔接种于96孔培养板。在含5％的CO2培养箱37℃培养24h后，分别加入实施例1的核桃青皮抗肿瘤活性蛋白，使终浓度分别为5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、45μg/mL和60μg/mL，用含相同体积磷酸缓冲液的培养基作为对照，每个浓度设六个复孔。处理24h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续孵育4h后终止培养。弃去各孔培养液，每孔加150μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。在酶标仪上570nm波长处，测定各孔光吸收值。
图2结果表明：核桃青皮抗肿瘤活性蛋白可明显抑制HepG2和Bel-7402肝癌细胞、大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF-7细胞、宫颈癌HeLa细胞和卵巢腺癌SKOV3细胞的存活，而对人正常肝细胞HL7702生长基本无影响。
实施例5
将纯化出的核桃青皮抗肿瘤活性纯蛋白送往上海生工生物工程有限公司进行质谱鉴定。鉴定结果显示，该抗肿瘤蛋白与英国核桃中的β-葡萄糖苷酶(登录号：A0A6P9E268)同源性较高。
表1核桃青皮抗肿瘤活性蛋白质谱鉴定

Claims (5)

1.一种核桃青皮抗肿瘤活性蛋白，其特征在于：所述抗肿瘤活性蛋白是以核桃青皮为原料提取到的分子量为66～90kDa的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳显示是单一条带；
所述抗肿瘤活性蛋白的制备方法包括以下步骤：
步骤1，取核桃青皮，阴干；
步骤2，取阴干后的核桃青皮，剪碎后，按每克加4～6mL的蛋白提取液，4℃下浸泡10～16h，离心后，取上清液；所述蛋白提取液为pH7.4的磷酸缓冲液；
步骤3，在步骤2的上清液中加入2～3倍体积-20℃提前预冷的丙酮，静置0.5～1.5h后，4℃离心收集沉淀，在-20℃下放置20～40min，得到沉淀为核桃青皮粗蛋白；
步骤4，将步骤3得到的沉淀用磷酸缓冲液溶解，离心后取上清液；
步骤5，将活性炭以8～12g/L加入到步骤4的上清液中，连续搅拌5min，静置20～40min吸附色素，过滤后得到纯化后的核桃青皮抗肿瘤活性蛋白。
2.根据权利要求1所述的核桃青皮抗肿瘤活性蛋白，其特征在于：所述步骤2中核桃青皮与蛋白提取液的质量体积比为1：4，单位为g/mL。
3.根据权利要求1所述的核桃青皮抗肿瘤活性蛋白，其特征在于：所述步骤2、3、4和5均在0～4℃条件下进行。
4.一种权利要求1所述的核桃青皮抗肿瘤活性蛋白的应用，其特征在于：用于制备抗肝癌、大肠癌、乳腺癌、宫颈癌以及卵巢腺癌的药物。
5.一种含有权利要求1所述的核桃青皮抗肿瘤活性蛋白的药物组合物。
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