CN103494875A - 一种青钱柳提取物在制备预防和治疗白血病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青钱柳提取物在制备预防和治疗白血病药物中的应用。通过对青钱柳叶进行水提、醇提、膜透析和凝胶色谱柱相结合的纯化处理，得到高含量的青钱柳提取物，该青钱柳提取物中多糖含量为90%～98%。经杀伤活性检测实验后发现，该青钱柳提取物可以提高脾淋巴细胞体外杀伤人白血病细胞K562的活性，杀伤倍数最高可达2.47。本发明公开的青钱柳提取物再加以一定的附加剂，制成颗粒剂、片剂、口含片、胶囊、滴丸剂、粉针剂或口服液，经口服后，具有预防和治疗白血病的功效。

Description

一种青钱柳提取物在制备预防和治疗白血病药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药应用技术领域，具体涉及一种青钱柳多糖提取物在制备预防和治疗白血病药物中的应用。

背景技术

青钱柳Cyclocarya paliurus(Bata1.)Iljinskaja（CPs）又名青钱李、山麻柳、摇钱树、甜茶树、山化树、一串钱等，系胡桃科青钱柳属特有单种属植物，高大阔叶乔木，为我国所特有，属三类濒危树种，集用材、绿化、保健、药用于一身。因其树形似柳，果实圆形似铜钱，色青而下垂，故名“青钱柳”。

青钱柳产于长江以南至华南、西南、台湾等省区海拔420～2500m的山区，主要分布在安徽、江西、江苏、浙江、台湾、湖北、湖南、四川、贵州、广西、广东和云南等地。据《中国中药资源志要》记载，其树皮、叶具有清热消肿、止痛的功能，可用于治疗顽癣。民间用其嫩叶揉炒做茶，因味甜且具生津止渴，清热解暑，降血糖，降血压和延年益寿的作用，又称为甜茶、神茶等。

近十多年来研究表明青钱柳含氨基酸、有机酸、黄酮及其糖苷类、三萜及甾体、多糖、微量元素等70多种活性成分。药理研究显示其具有明显的降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、抗菌、舒张血管(Hiroshi Kurihara etal.Hypolipemic Effect of Cyclocarya paliurus(Batal)Iljinskaja in Lipid-LoadedMice.Biol.Pharm.Bull.2003,26(3)383—385)等方面的活性作用,以及提高巨噬细胞的吞噬功能，提高脾淋巴细胞自发增殖率。

公开号为CN103127158A的专利文献公开了一种青钱柳提取物及其应用，该文献公开了一种青钱柳提取物，至少含有如下有效成分：10-甲氧基-nb-α-甲基柯楠醇；硝酸壬酯；异-丁氧胺；十五烷酸4、6、10、14四甲基甲酯；己二酸,2-（2乙基己基）酯；2-丁基,1-辛醇；十八烷基乙烯醚和赤独-4,5-二甲基-2-十一烯碳；上述有效成分占青钱柳提取物干重的重量百分比为50-98%。该公开文献指出所述的青钱柳提取物能显著促进胰岛贝塔细胞胰岛素的分泌，以增强小鼠的血糖耐受来调节血糖，可用于制备预防和治疗糖尿病的药物。

近年来多糖的生物活性受到关注。研究显示青钱柳粗多糖提取物有明显的降血糖、清除自由基抗氧化、抗菌的活性作用，对体外培养宫颈癌细胞HeLa生长有抑制作用，可诱使人胃癌细胞发生凋亡，但对人脐带内皮细胞生长无影响。韩澄等（青钱柳多糖对人胃癌MGC_803细胞生长的影响，天然产物研究与开发，2009,21,952-955）研究了青钱柳多糖（PCP）对人胃癌MGC_803细胞生长的影响，采用噻唑蓝法（MTT）检测PCP对MGC_803细胞生长的影响；Annexin法检测PCP对MGC_803细胞诱导凋亡的作用。试验结果表明PCP在50、100、200、400μg/ml浓度条件下，均可极显著性抑制人胃癌MGC_803细胞生长，抑制率可达65.7%，细胞凋亡率可达25.44%。谢建华等（Purification physicochemical characterisation andanticancer activity of a polysaccharide from Cyclocarya paliurus leaves.FoodChemistry2013，136，1453-1460）应用大孔树脂柱色谱分离纯化青钱柳多糖，也采用噻唑蓝（MTT）法研究了青钱柳多糖对HeLa癌细胞的抑制作用，在50～200μg/ml的浓度范围内，随着青钱柳多糖浓度提高对HeLa细胞增殖的抑制率从16.2%上升到35.7%。

白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病，在导致儿童及35岁以下成年人死亡的恶性肿瘤中排首位。目前白血病最有效的治疗方法是骨髓或外周血造血干细胞移植，但仍存在复发、移植物抗宿主病及移植相关病死率等并发症，部分病人因无合适的供体或因年龄、机体状况等原因而不适合移植治疗。近来，白血病的过继性细胞免疫治疗已愈益受到临床应用和关注，进一步提高人淋巴细胞对白血病细胞的特异性杀伤活性成为开发预防治疗白血病药物的重要途径。人慢性髓源性白血病细胞K562常被用于淋巴细胞杀伤活性的研究，青钱柳对淋巴细胞杀伤人白血病细胞的影响目前尚未见有文献和专利报道。

发明内容

本发明提供了一种以青钱柳提取物为原料制备的药物，该药物具有潜在预防和治疗白血病的功效；本发明还提供了该青钱柳提取物的制备方法，制得的青钱柳提取物中的多糖具有更高的得率、纯度及活性，其多糖含量为90%～98%。

所述的青钱柳提取物的制备步骤如下：

（1）以青钱柳叶为原料，经清洗、烘干、粉碎过筛后置于提取罐中，加入蒸馏水，料液质量比为1:5～15，60℃～120℃下加压提取0.2～3h，提取液经离心、过滤、浓缩滤液至每ml相当于原干生药1.0～4.0g，再经冷冻干燥后得提取物Ⅰ；

（2）提取物Ⅰ在8～20倍有机溶剂中浸泡回流2～3次，过滤，挥干有机溶剂后溶于适量水中，加入乙醇，冰浴放置，过滤，冷冻干燥得到提取物Ⅱ；

所述有机溶剂为乙醇、乙醇水溶液、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、石油醚中的一种；

（3）取上述提取物Ⅱ溶于适量水中，加入体积比为4:1的氯仿与正丁醇混合液，搅拌后低温静置分层，上层水相重复操作4～7次后，用截留分子量为2000～10000的透析膜透析1～2天，取出透析袋内液体，减压浓缩后加入乙醇，冰浴放置，过滤，冷冻干燥得到提取物Ⅲ；

（4）将上述提取物Ⅲ用凝胶柱或阴离子交换色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪收集活性主峰合并，加入乙醇，冰浴放置，过滤，冷冻干燥得到所述的青钱柳提取物。

作为优选，步骤（1）所述的提取次数为2～3次，经过多次提取，可以提高青钱柳提取物的得率；但提取次数过多，会造成提取效率的下降。

作为优选，步骤（1）所述的提取温度为100℃～120℃，在此温度条件下，可缩短提取时间，蛋白质杂质可因高温变性而在后续操作中除去。

步骤（2）～（4）中加入的乙醇，其体积百分含量为60%～85%，优选含量为75%～85%，此乙醇含量下提取物得率较高且稳定。

上述方法制备得到的青钱柳提取物中主要含有青钱柳多糖，以重量百分比计，青钱柳多糖的含量为90%～98%。采用该方法制备的青钱柳提取物中的多糖具有更高的得率，纯度及活性。

本发明的另一个目的是提供所述的青钱柳多糖提取物在制备治疗和预防白血病药物、保健品中的应用。

所制备的药物还含有制药学上可接受的附加剂的药物组合物。

所述青钱柳提取物与制药学上可接受的附加剂的药物组合物可以制成颗粒剂、片剂、口含片、胶囊等固体制剂，也可以制成滴丸剂、粉针剂或口服液等液体制剂。

由于青钱柳资源主要依赖野生，人工规模繁育种植技术还不成熟，全国可以利用的青钱柳春夏嫩叶、青叶总量不过20吨，2～5月采摘的青钱柳叶可以炒制叶茶，6～7月采摘的青叶仅用于制作袋泡茶，远远满足不了市场需要，而产量较多的青钱柳秋天的老叶、落叶只能作为废物而丢弃。

与现有技术相比，本发明具有下述优点：

本发明采用的青钱柳叶可以为老叶或落叶，其有效成分的活性和含量与嫩叶相当，通过对青钱柳有效成分的提取，并将该有效成分用于制备保健食品、饮料和药物，提高了青钱柳叶的利用率，有效避免了因老叶和落叶口感、外形较差引起的浪费。以青钱柳提取物为活性成分制备的药物具有预防和治疗白血病的功效。

附图说明

图1为不同浓度青钱柳提取物处理的淋巴细胞对人白血病细胞K562的杀伤倍数。

具体实施方式

实施例1青钱柳提取物的制备

（1）提取：新鲜青钱柳落叶，分拣去除杂物后用自来水清洗干净，晾干水分后于70℃恒温烘箱中烘干至水分含量低于13%以下，粉碎过100目筛；加入10倍质量的蒸馏水，100℃提取3次，每次1小时，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪45℃温度条件下浓缩至每ml相当于含2克原干料的青钱柳浓缩液，冷冻干燥后得提取物Ⅰ；

（2）脱脂醇沉：上述青钱柳提取物Ⅰ，用10倍量乙醇浸泡回流3次，过滤，挥干有机溶剂后溶于适量水中，加入乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置过夜，5层纱布布氏漏斗过滤，冷冻干燥得到提取物Ⅱ；

（3）除蛋白和寡糖：取上述青钱柳多糖提取物Ⅱ适量溶于水中，加入体积比为4:1的氯仿与正丁醇混合液，搅拌后低温静置分层，上层水相重复操作4次，用截留分子量2000～10000的透析膜透析2天，取出透析袋内液体，减压浓缩后加入适量乙醇至乙醇含量80%，冰浴放置过滤，冷冻干燥得到提取物Ⅲ；

（4）柱纯化：将上述青钱柳多糖提取物Ⅲ用DEAE Sephacel凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪收集活性主峰合并，加入乙醇，冰浴放置，过滤，冷冻干燥得青钱柳提取物。

经硫酸苯酚法测定可知，该青钱柳提取物中多糖含量为95.6%。

实施例2青钱柳多糖提取物的制备

（1）提取：新鲜青钱柳老叶，分拣去除杂物后用自来水清洗干净，晾干水分后于70℃恒温烘箱中烘干至水分含量低于9%，粉碎过100目筛；加入10倍质量的蒸馏水，100℃提取2次，每次1小时，过滤，滤渣加10倍质量的水，60℃提取2次，合并滤液，用旋转蒸发仪45℃温度条件下浓缩至每ml相当于含2克原干料的青钱柳浓缩液，冷冻干燥后得提取物Ⅰ；

（2）脱脂醇沉：上述青钱柳提取物Ⅰ，用10倍量80%乙醇浸泡回流3次，过滤，挥干有机溶剂后溶于适量水中，加入乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置过夜，5层纱布布氏漏斗过滤，冷冻干燥得到提取物Ⅱ；

（3）除蛋白和寡糖：取上述青钱柳多糖提取物Ⅱ适量溶于水中，加入适量氯仿和正丁醇，搅拌后低温静置分层，上层水相重复操作5次，用截留分子量2000～10000的透析膜透析2天，取出透析袋内液体，减压浓缩后加入适量乙醇至乙醇含量80%，冰浴放置，过滤，冷冻干燥得到提取物Ⅲ；

（4）柱纯化：将上述青钱柳多糖提取物Ⅲ用DEAE Sepharose FF凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪收集活性主峰合并，加入乙醇，冰浴放置12小时，过滤，冷冻干燥得青钱柳提取物。

经硫酸苯酚法测定可知，该青钱柳提取物中多糖含量为95.8%。

实施例3青钱柳多糖提取物的制备

（1）提取：取干燥粉碎过筛后的青钱柳嫩叶2kg，加入8倍质量的蒸馏水，加压120℃提取2次，每次20分钟，过滤，滤渣加8倍质量的水，60℃提取2次，合并滤液，用旋转蒸发仪50℃温度条件下浓缩至1000毫升，即每ml相当于含2g原干料的青钱柳浓缩液，冷冻干燥得提取物Ⅰ；

（2）脱脂醇沉：上述青钱柳提取物Ⅰ，用10倍量80%乙醇浸泡回流6小时，过滤，挥干有机溶剂后溶于适量水中，加入乙醇至乙醇含量为80%，冰浴放置24小时，5层纱布布氏漏斗过滤，冷冻干燥得到提取物Ⅱ；

（3）除蛋白和寡糖：取上述青钱柳多糖提取物Ⅱ4.0g适量溶于400ml水中，加入适量75ml氯仿和25ml正丁醇，搅拌30min后低温静置分层，上层水相重复操作7次，用截留分子量2000-10000的透析膜透析2天，取出透析袋内液体，减压浓缩后加入乙醇至乙醇含量80%，冰浴放置，过滤，冷冻干燥得到提取物Ⅲ；

（4）柱纯化：将上述青钱柳多糖提取物Ⅲ用DEAE Sepharose CL-6B凝胶色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪收集活性主峰合并，加入乙醇，冰浴放置12小时，过滤，冷冻干燥得青钱柳提取物。

经硫酸苯酚法测定可知，该青钱柳提取物中多糖含量为97.2%。

实施例4青钱柳提取物对淋巴细胞杀伤白血病细胞的作用

主要试剂：IMDM培养液、FBS购自Gibco公司；LDH杀伤试剂盒（Cytotox96）购自Promega公司。

实验动物：6-8周龄雄性BALB/c小鼠，购自浙江省医学科学院。

首先制备小鼠脾脏淋巴细胞，步骤如下：断颈处死小鼠，无菌操作取出脾脏，用10ml注射器将脾脏细胞吹出，用IMDM培养液制成细胞悬液，小心加至小鼠淋巴细胞分离液上，800g离心25min，吸出淋巴细胞层，IMDM洗涤一次，250g离心10min，用IMDM（10%FBS）悬浮。台盼蓝染色，计数活细胞≥95%，调整密度至1.5×10⁶/ml备用。

将制备好的小鼠脾淋巴细胞加入96孔板内，每孔50μl，然后加入50μlK562细胞悬液（密度为1.5×10⁵/ml），效靶比为10:1，再加入不同浓度上述实施例1制备的青钱柳提取物（提取物干粉预先用IMDM培养液溶解），记为实验孔（每试验重复3个）；同时设效应细胞自然释放孔（加入与实验孔相同数量的脾淋巴细胞和等质量的青钱柳提取物）、靶细胞自然释放孔（加入与实验孔相同数量的K562细胞和等质量的青钱柳提取物）、最大释放孔（靶细胞自然释放孔培养结束前45min，向每孔加入细胞裂解液）、对照孔1（IMDM培养液加细胞裂解液）对照孔2（IMDM培养液），各孔的终体积均为100μl。置于5%CO2培养箱，37℃培养24小时后，按照LDH杀伤试剂盒说明书操作，采用酶标仪在490nm波长处测定A值，并依据以下公式计算得到杀伤倍数。

脾淋巴细胞杀伤率/%=(A_实验-A_{效应细胞自然释放}-A_{靶细胞自然释放})/(A_最大释放-A_{靶细胞自然 释放})×100%；

其中：

A_实验=A_实验孔-A_对照孔2；

A_{效应细胞自然释放}=A_{效应细胞自然释放孔}-A_对照孔2；

A_{靶细胞自然释放}=A_{靶细胞自然释放孔}-A_对照孔2；

A_最大释放=A_{最大释放孔}-A_对照孔1。

杀伤倍数=青钱柳提取物处理的脾淋巴细胞杀伤率/未处理的脾淋巴细胞杀伤率。

本实施例中青钱柳提取物最终浓度按常规倍数递增设置为20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，该不同浓度提取物处理的淋巴细胞对人白血病细胞K562的杀伤倍数如图1所示。

图1结果显示，青钱柳提取物可以显著提高脾淋巴细胞体外杀伤人白血病细胞K562的活性，提高的幅度与青钱柳提取物的浓度有关，当青钱柳提取物浓度为40μg/ml时，提高幅度最大，青钱柳提取物处理后的淋巴细胞对人白血病细胞K562杀伤率是未经处理的淋巴细胞对人白血病细胞K562杀伤率的2.47倍，

因此对本发明提供的青钱柳提取物再加以一定的辅料，制成颗粒剂、片剂、口含片、胶囊，滴丸剂、粉针剂、口服液后，具有预防和治疗白血病的功效。

应用例1颗粒剂的制备

将50g实施例1制备的青钱柳提取物掺入200g葡萄糖、300g蔗糖和5g羧甲基纤维素中，混合过筛，羧甲基纤维素预先加水溶解，与其它物料混合均匀后过2号筛制粒，50℃热风恒温干燥，整粒，包装，即得颗粒剂。

应用例2片剂的制备

取50g实施例1制备的青钱柳提取物，与350g微晶纤维素、300g淀粉、1.5g微粉硅胶和4g硬脂酸镁充分混匀，过24目筛，经制粒，压片，包装，即得片剂。

应用例3口含片的制备

取40g实施例1制备的青钱柳提取物超微粉碎过400目筛后，与350g木糖醇，200g安塞蜜，1.5g薄荷脑，5g硬脂酸镁，8g质量分数为17%淀粉浆充分搅拌混匀，过2号筛造粒，40℃热风干燥30分钟，整粒，压片，包装，即得口含片。

应用例4胶囊剂的制备

取40g实施例1制备的青钱柳提取物，与400g淀粉，8g二氧化硅混合均匀，过120目筛，分装入胶囊，照射杀菌即得胶囊剂。

应用例5滴丸剂的制备

取0.6g实施例1制备的青钱柳提取物与11.4g聚乙二醇-6000，5%硬脂酸混合均匀，加热融化后移至滴丸滴罐中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油制得滴丸剂。

应用例6粉针剂的制备

取0.5g实施例1制备的青钱柳多糖提取物，5g甘露醇，3g L-精氨酸用500ml蒸馏水溶解，用5%氢氧化钠溶液调pH值至7.0～7.5，过滤，减压浓缩至500ml，0.45μm微孔滤膜过滤，消毒，按1ml每瓶分装于安瓿瓶中，冷冻干燥，封口即得。

应用例7口服液的制备

取4g实施例1制备的青钱柳提取物，0.25g天然甜菊甙，1g维生素C，0.5g苯甲酸钠，加蒸馏水至1000ml溶解，过滤，分装，杀菌，即得口服液。

以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，还可以做出许多变型和改进，所有未超出权利要求所述的变型或改进均应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种青钱柳提取物在制备预防和治疗白血病药物中的应用。

2.一种青钱柳提取物作为活性成分与制药学上可接受附加剂的药物组合物在制备预防和治疗白血病药物中的应用。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的青钱柳提取物的制备方法如下：

（1）以青钱柳叶为原料，经清洗、烘干、粉碎过筛后置于提取罐中，加入蒸馏水，料液质量比为1:5～15，60℃～120℃下加压提取0.2～3h，提取液经离心、过滤、浓缩滤液至每ml相当于原干生药1.0～4.0g，再经冷冻干燥后得提取物Ⅰ；

（2）提取物Ⅰ在8～20倍有机溶剂中浸泡回流2～3次，过滤，挥干有机溶剂后溶于适量水中，加入乙醇，冰浴放置，过滤，冷冻干燥得到提取物Ⅱ；

所述有机溶剂为乙醇、乙醇水溶液、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、乙醚或石油醚；

（3）取上述提取物Ⅱ溶于适量水中，加入体积比为4:1的氯仿与正丁醇混合液，搅拌后低温静置分层，上层水相重复操作4～7次后，用截留分子量为2000～10000的透析膜透析1～2天，取出透析袋内液体，减压浓缩后加入乙醇，冰浴放置，过滤，冷冻干燥得到提取物Ⅲ；

（4）将上述提取物Ⅲ用凝胶柱或阴离子交换色谱柱纯化，用硫酸苯酚法跟踪收集活性主峰合并，加入乙醇，冰浴放置，过滤，冷冻干燥得到所述的青钱柳提取物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的青钱柳提取物的制备方法中，所述加入蒸馏水提取的次数为2～3次。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述提取温度为100℃～120℃。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的青钱柳叶为新叶、老叶或落叶。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的预防和治疗白血病药物制成固体制剂或液体制剂，所述固体制剂为颗粒剂、片剂、口含片或胶囊，液体制剂为滴丸剂、粉针剂或口服液。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述固体制剂中青钱柳提取物的质量含量为1%～35%，液体制剂中青钱柳提取物的质量含量为0.1%～18%。

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