CN107488158B - 一种从莲蓬壳中同时提取多糖和原花青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从莲蓬壳中同时提取多糖和原花青素的方法，其包括以下步骤：莲蓬壳粉碎过筛，进行亚临界萃取，得到莲蓬壳亲脂性成分和残渣；残渣采用不同浓度的乙醇溶液梯度递减式提取，合并多次提取液；提取液减压浓缩得到粗提浓缩液，粗提浓缩液醇沉，得上清液和沉淀物，沉淀物干燥后即为莲蓬壳多糖；上清液减压浓缩至无乙醇味，获得的浓缩液通过色谱柱A进行柱色谱分离，所得洗脱液减压浓缩、醇沉得到莲蓬壳多糖；然后将色谱柱A与色谱柱B串联，采用乙醇进行串联洗脱，至洗脱液为无色，停止收集，洗脱液减压浓缩、干燥后得到莲蓬壳原花青素。本发明工艺流程简单，绿色无毒，提取率、纯度较高，实现了同步分离的效果，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于植物有效活性成分提取技术领域，尤其是涉及一种从莲蓬壳中同时提取多糖和原花青素的方法。
背景技术
莲(荷)(Nelumbo nucifera)，科属：睡莲科、莲属，多年生水生植物、草本植物，在我国具有2000多年的种植历史。目前，我国拥有的荷花品种多达800个以上，主要分布于福建、浙江、湖北、湖南、江苏、安徽以及江西等地[李珊珊,等.植物学报,2014,49(6):738-750；Wu Y B,et al.African Journal of Pharmacy and Pharmacology,2011,5(22):2454-2461.]。莲除具观赏价值外，还可食用、饮用、药用和包装用。莲全身各处均可使用，荷叶可用于治疗心烦暑热、便血崩漏等；莲子心可用于治疗失眠多梦、血热吐血等；莲子具有养心安神、涩精益肾等作用；莲藕为日常食用水生蔬菜。莲富含生物碱、黄酮、糖苷类、三萜类、多糖、多酚、挥发油等多种活性成分，具有抗氧化、消炎、抗菌、抗心律失常、降血糖、止泻、免疫调控等生理活性[Sheikh S A.J Med Plants Res,2014,2(2):42-46；Zheng L J,et al.Journal of Medicinal Plants Research,2012,6(10):1902-1911；Huang B,etal.Food Chemistry,2010,120(3):873-878；Wu Y B,et al.International journal ofmolecular sciences,2012,13(6):7163-7173.]。目前关于莲产品的开发与研制多停留在莲叶、莲子与莲心等植物器官制品上，而对于废弃下脚料莲蓬壳的研究较少。
莲蓬壳，为睡莲科植物莲的干燥花托，也叫莲房。是在莲子的加工过程中产生的农业废弃物，目前只是用于动物饲料，甚至是作为废弃物被随意丢置于路边或沟旁，腐烂霉变，或直接掩埋和焚烧；即使利用，方式也比较初级，技术含量低，这不仅造成环境污染，还是对莲资源的极大浪费。国内外目前对莲子皮、莲蓬壳中化学成分及其药用作用的相关研究只有“零星”报道，一直未得到重视。迄今为止，莲蓬壳已知的成分仅仅限于生物碱(alkaloids)、黄酮类(flavonoids)物质[Hu W,et al.Horticulture,Environment,andBiotechnology,2015,56(5):712-720；Lee S et al.Journal of the Korean Societyfor Applied Biological Chemistry,2015,58(1):53-60.]。
发明内容
本发明的目的提供一种从莲蓬壳中同时提取多糖和原花青素的方法，其利用绿色脱脂、溶剂浓度递减式提取以及串联柱色谱方法同时从莲蓬壳中提取多糖和原花青素两种活性成分，工艺流程简单，易于操作，绿色无毒、高效，投资少，成本低，适合大规模生产。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其包括以下步骤：
S1、将莲蓬壳阴干、粉碎、过筛，加入有机溶剂丁烷后进行亚临界萃取，得到莲蓬壳亲脂性成分和残渣；亚临界丁烷萃取条件为：莲蓬壳与有机溶剂丁烷的料液比为1:3～7kg/L，萃取温度为40～90℃，超声波功率为500～800W，萃取压力为0.2～1.0MPa，萃取时间为30～100min；
S2、将上述残渣采用不同浓度的乙醇溶液梯度递减式提取，合并多次提取液；
S3、将步骤S2中得到的提取液减压浓缩至原体积的1/2～1/20得到粗提浓缩液，粗提浓缩液中加入乙醇溶液醇沉，使溶液最终浓度为70～85vt％，4～10℃静置冷藏10～12h；离心过滤后，得上清液和沉淀物，所得沉淀物干燥后即为莲蓬壳多糖；
S4、将步骤S3中得到的上清液减压浓缩至无乙醇味，获得的浓缩液加入到色谱柱A中进行柱色谱分离，先用水洗脱，所得洗脱液采用步骤S3中的操作得到莲蓬壳多糖；
S5、将步骤S4中的色谱柱A再用浓度为5～30％的乙醇水溶液洗脱后与色谱柱B串联，采用浓度为40～80％乙醇进行串联洗脱，至洗脱液为无色，停止收集，洗脱液减压浓缩、干燥后得到莲蓬壳原花青素。
进一步地，上述的步骤S2中不同浓度的乙醇溶液梯度递减式提取，乙醇溶液依次为90％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、10％乙醇。
进一步地，上述的步骤S4中的色谱柱A使用的填料为大孔树脂，其型号为XDA-6、DM130、NKA-9、AB-8、S-8、ADS-7、D101、HPD-100、HPD-300、HPD-450中的一种或两种以上组合。
进一步地，上述的步骤S5中的色谱柱B所用色谱填料为大孔树脂、聚酰胺树脂、MIC、葡聚糖凝胶和反相ODS中的一种或两种以上组合。
进一步地，上述的步骤S4对层析柱A中的大孔树脂进行洗脱的水为蒸馏水、纯净水或去离子水。
进一步地，上述的步骤S3、S5中的干燥采用喷雾干燥、真空干燥、常压干燥和/或冷冻干燥。
本发明从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其莲蓬壳多糖得率为5～20％，莲蓬壳原花青素得率为3～10％。
本发明从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其制得的莲蓬壳多糖在制备免疫调节药物中的应用。
由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：
本发明从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其运用亚临界流体萃取脱脂技术具有节能、环保和效率高的优点，采用溶剂不同浓度递减式提取，利用乙醇和水的不同配比，协同作用，对原材料进行充分提取，节约溶剂用量，减低成本；通过色谱柱A与色谱柱B串联达到了对原花青素分离效果；能够同时制备莲蓬壳多糖和原花青素，制备过程没有毒性有机溶剂的使用，绿色制备，适合工业化生产，有效减少农林废弃物环境污染且能实现废弃物高值化利用。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图；
图2是MTT法检测莲蓬壳多糖对细胞存活率的影响；
图3是Griess试剂和ELISA试剂盒测定细胞NO和PGE2、TNF-α的含量；
图4是莲蓬壳多糖刺激RAW264.7细胞对iNOS、TNF-α和COX-2mRNA转录水平的影响。
具体实施方式
参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
如图1所示，一种从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其包括以下具体步骤：
S1、将莲蓬壳阴干、粉碎、过40～60目筛，加入有机溶剂丁烷后进行亚临界萃取，得到莲蓬壳亲脂性成分和残渣；亚临界丁烷萃取条件为：莲蓬壳与有机溶剂丁烷的料液比为1:3～7kg/L，萃取温度为40～90℃，超声波功率为500～800W，萃取压力为0.2～1.0MPa，萃取时间为30～100min，萃取次数为2～5次；
S2、将上述残渣采用不同浓度的乙醇溶液梯度递减式提取，乙醇初始浓度为90％，经减压浓缩后，回收的乙醇再加水配制成浓度为70％的乙醇进行二次提取，依次类推，使乙醇浓度依次为50％、30％、10％进行五级提取，合并多次提取液；
S3、将步骤S2中得到的提取液减压浓缩至原体积的1/2～1/20得到粗提浓缩液，粗提浓缩液中加入乙醇溶液醇沉，使溶液最终浓度为70～85vt％，4～10℃静置冷藏10～12h；离心过滤后，得上清液和沉淀物，所得沉淀物干燥后即为莲蓬壳多糖；
S4、将步骤S3中得到的上清液减压浓缩至无乙醇味，获得的浓缩液加入到色谱柱A中进行柱色谱分离，浓缩液上柱量为1/3～2/3BV，上柱流速为1.5～2.0BV/h，然后对大孔树脂先用蒸馏水、纯净水或去离子水洗脱，洗脱体积2～4BV，洗脱流速1～2BV/h，所得洗脱液采用步骤S3中的操作，得到莲蓬壳多糖；
S5、将步骤S4中的色谱柱A再用浓度为5～30％的乙醇水溶液洗脱除杂，洗脱体积为1.5～2BV，洗脱流速为1～2BV/h，洗脱除杂后的色谱柱A与色谱柱B串联，采用浓度为40～80％乙醇进行串联洗脱，至洗脱液为无色，停止收集，洗脱液减压浓缩、干燥后得到莲蓬壳原花青素。
在步骤S4中，色谱柱A使用的填料为大孔树脂，其型号为XDA-6、DM130、NKA-9、AB-8、S-8、ADS-7、D101、HPD-100、HPD-300、HPD-450中的一种或两种以上组合。
在步骤S5中，色谱柱B所用色谱填料为大孔树脂、聚酰胺树脂、MIC、葡聚糖凝胶和反相ODS中的一种或两种以上组合。
本发明从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其制得的莲蓬壳多糖得率为5～20％，莲蓬壳原花青素得率为3～10％。
本发明从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其制得的莲蓬壳多糖在制备免疫调节药物中的应用。
实施例1
(1)、将莲蓬壳阴干、粉碎，过40目筛，称取500克莲蓬壳样品，加入有机溶剂丁烷后进行亚临界萃取，萃取条件为：料液比为1:7kg/L，萃取温度为40℃，超声功率500W，萃取压力为0.2MPa，萃取时间为30min，萃取次数为3次，脱溶剂，得到莲蓬壳亲脂性成分和残渣；
(2)、将步骤(1)中得到的残渣采用浓度为90％、70％、50％、30％、10％的乙醇溶液进行五级提取，合并多次提取液；
(3)、将步骤(1)中得到的提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至原液体积的1/5得到粗提浓缩液，粗提浓缩液中加入乙醇溶液醇沉，使溶液最终浓度为85％，放置冰箱4℃静置冷藏10h；离心过滤后，得上清液和沉淀物，所得沉淀物干燥后即为莲蓬壳多糖；
(4)、将步骤(3)中得到的上清液减压浓缩至无乙醇味，获得的浓缩液加入到填充有D101型大孔树脂的色谱柱A中进行柱色谱分离，然后对大孔树脂先用蒸馏水洗脱，所得洗脱液采用步骤(3)中的减压浓缩、醇沉、干燥操作，得到莲蓬壳多糖；合并两次所得莲蓬壳多糖，称重、计算，所得莲蓬壳多糖得率为7％；
(5)、将步骤(4)中的色谱柱A再用浓度30％的乙醇水溶液洗脱除杂后与色谱柱B串联，色谱柱B所用填料为粒径大小为200微米的反相ODS，采用浓度60％乙醇进行串联洗脱，至洗脱液为无色，停止收集，洗脱液减压浓缩、干燥后得到莲蓬壳原花青素，称重，计算，莲蓬壳原花青素得率为5％。
实施例2
(1)、将莲蓬壳阴干、粉碎，过60目筛，称取1000克莲蓬壳样品，加入有机溶剂丁烷后进行亚临界萃取，萃取条件为：料液比为1:5kg/L，萃取温度为30℃，超声功率600W，萃取压力为0.5MPa，萃取时间为50min，萃取次数为3次，脱溶剂，得到莲蓬壳亲脂性成分和残渣；
(2)、将步骤(1)中得到的残渣采用浓度为90％、70％、50％、30％、10％的乙醇溶液进行五级提取，合并多次提取液；
(3)、将步骤(1)中得到的提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至原液体积的1/10得到粗提浓缩液，粗提浓缩液中加入乙醇溶液醇沉，使溶液最终浓度为80％，放置冰箱6℃静置冷藏10.5h；离心过滤后，得上清液和沉淀物，所得沉淀物干燥后即为莲蓬壳多糖；
(4)、将步骤(3)中得到的上清液减压浓缩至无乙醇味，获得的浓缩液加入到填充有AB-8型大孔树脂的色谱柱A中进行柱色谱分离，然后对大孔树脂先用纯净水洗脱，所得洗脱液采用步骤(3)中的减压浓缩、醇沉、干燥操作，得到莲蓬壳多糖；合并两次所得莲蓬壳多糖，称重、计算，所得莲蓬壳多糖得率为12％；
(5)、将步骤(4)中的色谱柱A再用浓度20％的乙醇水溶液洗脱除杂后与色谱柱B串联，色谱柱B所用填料为聚酰胺树脂，采用浓度80％乙醇进行串联洗脱，至洗脱液为无色，停止收集，洗脱液减压浓缩、干燥后得到莲蓬壳原花青素，称重，计算，莲蓬壳原花青素得率为6％。
实施例3
(1)、将莲蓬壳阴干、粉碎，过40目筛，称取1500克莲蓬壳样品，加入有机溶剂丁烷后进行亚临界萃取，萃取条件为：料液比为1:3kg/L，萃取温度为90℃，超声功率800W，萃取压力为1.0MPa，萃取时间为100min，萃取次数为5次，脱溶剂，得到莲蓬壳亲脂性成分和残渣；
(2)、将步骤(1)中得到的残渣采用浓度为90％、70％、50％、30％、10％的乙醇溶液进行五级提取，合并多次提取液；
(3)、将步骤(1)中得到的提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至原液体积的1/20得到粗提浓缩液，粗提浓缩液中加入乙醇溶液醇沉，使溶液最终浓度为70％，放置冰箱8℃静置冷藏11h；离心过滤后，得上清液和沉淀物，所得沉淀物干燥后即为莲蓬壳多糖；
(4)、将步骤(3)中得到的上清液减压浓缩至无乙醇味，获得的浓缩液加入到填充有XDA-6型大孔树脂、XDA-6型大孔树脂的色谱柱A中进行柱色谱分离，然后对大孔树脂先用去离子水洗脱，所得洗脱液采用步骤(3)中的减压浓缩、醇沉、干燥操作，得到莲蓬壳多糖；合并两次所得莲蓬壳多糖，称重、计算，所得莲蓬壳多糖得率为20％；
(5)、将步骤(4)中的色谱柱A再用浓度10％的乙醇水溶液洗脱除杂后与色谱柱B串联，色谱柱B所用填料为MIC和葡聚糖凝胶的混合物，采用浓度70％乙醇进行串联洗脱，至洗脱液为无色，停止收集，洗脱液减压浓缩、干燥后得到莲蓬壳原花青素，称重，计算，莲蓬壳原花青素得率为8％。
实施例4
(1)、将莲蓬壳阴干、粉碎，过60目筛，称取1500克莲蓬壳样品，加入有机溶剂丁烷后进行亚临界萃取，萃取条件为：料液比为1:5.5kg/L，萃取温度为80℃，超声功率700W，萃取压力为1.0MPa，萃取时间为90min，萃取次数为4次，脱溶剂，得到莲蓬壳亲脂性成分和残渣；
(2)、将步骤(1)中得到的残渣采用浓度为90％、70％、50％、30％、10％的乙醇溶液进行五级提取，合并多次提取液；
(3)、将步骤(1)中得到的提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至原液体积的1/18得到粗提浓缩液，粗提浓缩液中加入乙醇溶液醇沉，使溶液最终浓度为80％，放置冰箱10℃静置冷藏12h；离心过滤后，得上清液和沉淀物，所得沉淀物干燥后即为莲蓬壳多糖；
(4)、将步骤(3)中得到的上清液减压浓缩至无乙醇味，获得的浓缩液加入到填充有HPD-100型大孔树脂的色谱柱A中进行柱色谱分离，然后对大孔树脂先用去离子水洗脱，所得洗脱液采用步骤(3)中的减压浓缩、醇沉、干燥操作，得到莲蓬壳多糖；合并两次所得莲蓬壳多糖，称重、计算，所得莲蓬壳多糖得率为20％；
(5)、将步骤(4)中的色谱柱A再用浓度10％的乙醇水溶液洗脱除杂后与色谱柱B串联，色谱柱B所用填料为大孔树脂、聚酰胺树脂和MIC的混合物，采用浓度80％乙醇进行串联洗脱，至洗脱液为无色，停止收集，洗脱液减压浓缩、干燥后得到莲蓬壳原花青素，称重，计算，莲蓬壳原花青素得率为10％。
实施例5
细胞实验评价所得莲蓬壳多糖免疫调节活性
(1)RAW264.7细胞的常规培养
正常小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞购自美国，用含终浓度为10％胎牛血清、青霉素(100U/mL)及链霉素(100μg/mL)的1640培养液培养并置于5％CO2、37℃细胞培养箱中。根据细胞生长情况约12～24h换液1次；待细胞状态稳定，取对数生长期的细胞用于实验。
(2)MTT实验测定细胞存活率
采用MTT法测定莲蓬壳多糖对细胞毒性的影响。按照每孔1×106的浓度接种于96孔板中，每孔加入100μL，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，弃去旧培养液，初始加入100μL1640培养液，然后加样品溶液至终浓度为25μg/mL、50μg/mL、
200μg/mL和400μg/mL，空白对照组则加含0.1％DMSO的完全培养基，处理24h，吸出孔内培养液，加入100μLMTT溶液培养4小时后，加入MTT终止液继续培养16-20个小时，酶标仪下测其吸光度。按照以下计算细胞存活率：细胞存活率＝(空白组OD值-样品组OD值)/空白组OD值×100％。结果如图2所示，证实不同浓度的莲蓬壳多糖对小鼠腹腔巨噬细胞并无毒性作用。
(3)Griess法测定NO的分泌量和ELISA法检测TNF-α、PGE2的分泌量
按照每孔1×106的浓度接种于96孔板中，每孔加入100μL，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，吸弃孔内培养液，然后加样品溶液至终浓度为25μg/mL、50μg/mL、
200μg/mL和400μg/mL，每个浓度设3个复孔，在CO2培养箱中培养24h后，用Griess法检测细胞上清液NO含量，代入NO标准曲线，计算NO含量。同理，按ELISA检测试剂盒测定方法用酶标仪在450nm波长处测定吸光值，依据标准曲线，计算TNF-α、PGE2的分泌量，实验重复3次。结果如图3所示，腹腔巨噬细胞释放NO、PGE2和TNF-α的量明显增高，表明莲蓬壳多糖能显著诱导腹腔巨噬细胞释放NO、PGE2和TNF-α。
(4)莲蓬壳多糖诱导的RAW 264.7细胞iNOS、COX-2和TNF-α的mRNA表达水平的影响
Griess法测定NO的分泌量和ELISA法检测TNF-α、PGE2的分泌量的描述中已经表明莲蓬壳诱导的巨噬细胞释放NO、PGE2和TNF-α，通过考察与炎症因子释放相关的iNOS、COX-2和TNF-α的基因表达，已经证实iNOS与NO的释放相关，COX-2调控PGE2的释放。iNOS、COX-2和TNF-α的过量表达会导致NO、PGE2和TNF-α的过多释放，从而导致各种疾病的发生。以GAPDH作为内参基因，考察莲蓬壳多糖诱导的iNOS、TNF-α和COX-2mRNA的变化，实验结果如图4所示，随着加入多糖浓度的增加，细胞内的iNOS、TNF-α和COX-2mRNA表达逐渐增强，并呈现良好的剂量依赖性，表明莲蓬壳多糖能够增强iNOS、TNF-α和COX-2的mRNA表达水平。
实验证实所得莲蓬壳多糖能够刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌炎症因子，进一步的结果显示，是由于莲蓬壳多糖能够增加其COX-2、iNOS和TNF-α的基因表达，从而证实莲蓬壳多糖具有免疫调节作用，能够应用于食品、保健品以及医药制备领域。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其特征是：其包括以下步骤：
S1、将莲蓬壳阴干、粉碎、过筛，加入有机溶剂丁烷后进行亚临界萃取，得到莲蓬壳亲脂性成分和残渣；亚临界丁烷萃取条件为：莲蓬壳与有机溶剂丁烷的料液比为1:3～7kg/L，萃取温度为40～90℃，超声波功率为500～800W，萃取压力为0.2～1.0MPa，萃取时间为30～100min；
S2、将上述残渣采用不同浓度的乙醇溶液梯度递减式提取，合并多次提取液；
S3、将步骤S2中得到的提取液减压浓缩至原体积的1/2～1/20得到粗提浓缩液，粗提浓缩液中加入乙醇溶液醇沉，使溶液最终浓度为70～85vt％，4～10℃静置冷藏10～12h；离心过滤后，得上清液和沉淀物，所得沉淀物干燥后即为莲蓬壳多糖；
S4、将步骤S3中得到的上清液减压浓缩至无乙醇味，获得的浓缩液加入到色谱柱A中进行柱色谱分离，先用水洗脱，所得洗脱液采用步骤S3中的操作得到莲蓬壳多糖；
S5、将步骤S4中的色谱柱A再用浓度为5～30％的乙醇水溶液洗脱后与色谱柱B串联，采用浓度为40～80％乙醇进行串联洗脱，至洗脱液为无色，停止收集，洗脱液减压浓缩、干燥后得到莲蓬壳原花青素。
2.根据权利要求1所述的从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其特征是：步骤S2中不同浓度的乙醇溶液梯度递减式提取，乙醇溶液依次为90％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、10％乙醇。
3.根据权利要求1所述的从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其特征是：步骤S4中色谱柱A使用的填料为大孔树脂，其型号为XDA-6、DM130、NKA-9、AB-8、S-8、ADS-7、D101、HPD-100、HPD-300、HPD-450中的一种或两种以上组合。
4.根据权利要求1所述的从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其特征是：步骤S5中的色谱柱B所用色谱填料为大孔树脂、聚酰胺树脂、MIC、葡聚糖凝胶和反相ODS中的一种或两种以上组合。
5.根据权利要求1所述的从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其特征是：步骤S3、S5中的干燥采用喷雾干燥、真空干燥、常压干燥和/或冷冻干燥。
6.根据权利要求1所述的从莲蓬壳中同时提取制备多糖和原花青素的方法，其特征是：其莲蓬壳多糖得率为5～20％，莲蓬壳原花青素得率为3～10％。
7.一种权利要求1～6中任一权利要求的方法所制备的莲蓬壳多糖在制备免疫调节药物中的应用。
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|---|
| 莲天然产物及其生物活性研究进展;曹杨 等;《食品工业科技》;20121231;第33卷(第8期);第402-405页 * |
| 莲房原花青素的稳定性及热降解动力学研究;汪志慧 等;《食品科学》;20111231;第32卷(第7期);第77-82页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107488158A (zh) | 2017-12-19 |
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