CN106692257A - 一种果胶组合物、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有高抑制人类肠腺癌细胞活性的果胶组合物、及其制备技术和药物、食品。本发明的果胶组合物包含食品果胶多糖和景天科植物提取物，景天科植物提取物为水的提取物或水/醇类混合溶剂的提取物。果胶和景天科植物提取物在食品原位状态下进行促酯化反应，最后制备高活性的果胶多糖组合物。制备的组合物具有高抗人类肠腺癌细胞的活性，且比较稳定。该组合物克服了原来果胶多糖及植物提取物在物理化学及功能性上的缺点，更适合于使用。本发明所提供的果胶组合物的制备方法，避免传统有机化学反应技术的许多缺点具有制备过程安全无毒、产物为食品级产物、较低制备成本、可应用食品加工过程等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种果胶组合物，以及该组合物的医药和食品用途，属于医药食品领域。
背景技术
抗老化与抑制癌原发生是人们关注的热点，因此相关素材及产品研发是健康产业经济发展的亮点。抗老化与抗氧化活性密切相关，具有优异高抗氧化活性的天然活性成份包括酚酸类、类黄酮、萜烯类、叶绿素类、茄红素、维生素C和E等，这些成分常见于蔬菜水果及传统中草药的提取物中。
许多体外与动物实验研究结果已发现，这些具高抗氧化活性的天然成份常具有优良的抑制癌细胞生长或促进癌细胞凋亡的效果，对膳食预防肠胃相关癌症，尤其是大肠癌相当重要。但这些高抗氧化活性物具有含量低、化学反应性高、稳定性差、不容易保存等诸多缺点。另一问题是，这些高抗氧化活性物的常见提取方式大都是醇类水溶液萃取、层析技术配合低极性溶剂(如乙酰乙酯)冲提纯化，所得产物并不代表原来食物中抗氧化活性成份分布，其活性功效已与天然食物复方的功效大不相同。
果胶多糖为通认为安全(GRAS级)的天然食品材料，常应用于食品、化妆保养品与医药领域，具有多样化的功能(如凝胶性、粘稠性、稳定性性、增稠性等)及多种膳食纤维所具有的的生理活性(如降低血液中胆固醇、降血脂、降血糖、预防便秘与大肠癌发生等活性)。果胶多糖的优点是具有较强的稳定性，应用广泛且量多，是膳食纤维主要成份，建议每人每日摄取膳食纤维量25-35克。但缺点：抗氧化活性低、抑制人类肠癌细胞活性低也是很明显的。
发明内容
本发明就是为了尽量避免单纯的果胶多糖的上述缺点，给出了一种稳定性高的的高抗氧化活性，并且高抗人类肠腺癌细胞活性的果胶多糖组合物。
由于，直接组合天然未处理的果胶多糖及高活性植物活性成分时，容易反应不足或过度，造成组合物沉淀、溶解度不佳、活性降低的问题。本发明给出的制备上述的果胶组合物的方法的关键点在于选择具有高活性成份、关键活性结构和分子量的植物，并且建立植物提取物与果胶活性成份间的酯化反应的技术条件，从而制备高活性果胶组合物。为此，发明人经过多次实验探索和无数次创造性配方组合尝试，最终，发现景天科植物提取物为最佳组合材料。
景天科(Crassulaceae)植物包括红景天属(Rhodiola spp.)、风车草属(别名石莲花属)(Graptopetalum spp.)、景天属(Sedum spp.)、拟石莲花属(Echeveria spp.)、厚叶草属(Pachyphytum spp.)、青锁龙属(别名肉叶草属)(Crassula spp.)、莲花掌属(Aeoniumspp.)、长生草属(Sempervivum spp.)、伽蓝菜属(Kalanchoe spp.)、落地生根属(Bryophyllum spp.)、银波锦属(Cotyledon spp.)、瓦松属(Orostachys spp.)…等十多属，为世界各国传统草药。其叶、根或茎部份的提取物含有丰富的酚酸类、类黄酮、萜烯类、生物碱等高抗氧化和抑制癌细胞的活性植化物、以及果胶分子。以国内常见且研究较多如红景天和石莲花，其提取物的生物活性多，体外细胞、及体内动物或人体实验成果显示，具有优良的抗氧化、抗疲劳、激活抗氧化酶、抑制肝损伤、保肝、抗肿瘤、抑制人类肠腺癌细胞、及降血脂等活性。
另外，本发明还提供了一种含有上述的果胶组合物的抗大肠腺细胞的药物和含有果胶组合物的保健食品。
一种果胶组合物，其特征在于，包括果胶多糖和景天科植物提取物，景天科植物提取物为水的提取物或水/醇类混合溶剂的提取物。
本发明的果胶组合物，还可以具有这样的特征，其特征在于还包括：任意一种或多种的强化剂、稳定剂、分散剂、调整剂、水活性控制剂。
本发明的果胶组合物，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，强化剂为没食子酸、阿魏酸、异抗坏血酸、氨基酸中的任意一种，稳定剂为葡萄糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、海藻糖、葡萄糖脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯中的任意一种或多种的混合物，分散剂为麦芽糊精、淀粉水解物、阿拉伯胶、多糖、食用级硅化合物中的任意一种或多种的混合物，调整剂为氯化盐类、磷酸盐类、盐酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙中的任意一种或多种的混合物，水活性控制剂为醇类、糖醇类、氨基酸类、脂肪酸类中的任意一种或多种的混合物。
本发明的果胶组合物，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，果胶多糖为高甲氧基果胶多糖、低甲氧基果胶多糖、热处理的高甲氧基果胶多糖、热处理的低甲氧基果胶多糖、经酸或碱处理的高甲氧基果胶多糖、经酸或碱处理的低甲氧基果胶多糖、经超声波处理的高甲氧基果胶多糖、经超声波处理的低甲氧基果胶多糖、经微波处理的高甲氧基果胶多糖、经微波处理的低甲氧基果胶多糖、酶修饰的高甲氧基果胶多糖、酶修饰的低甲氧基果胶多糖中的任意一种或多种的混合物。
本发明的果胶组合物，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，果胶多糖的分子量为1kDa～10kDa或大于10kDa，景天科植物提取物的分子量为200Da～10kDa或大于10kDa。
本发明的果胶组合物，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，果胶多糖与景天科植物提取物的质量比为100：1～1：100。
本发明还提供一种制备上述的果胶组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，配制果胶多糖和景天科植物提取物的混合水溶液；
步骤二，50-130℃加热混合水溶液1分钟至12小时得到反应物；
步骤三，收集反应物并干燥，所得干燥物即为果胶组合物。
本发明的果胶组合物的制备方法，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤一中的混合溶液是经过pH调整的，pH调整后的pH值为2-5为9-13，步骤二中混合水溶液添加有任意一种或多种的强化剂、稳定剂、分散剂、调整剂、水活性控制剂。
本发明还提供一种抗肠腺癌细胞的药物，其特征在于含有上述的果胶组合物。
本发明还提供一种食品，其特征在于含有上述的果胶组合物和膳食纤维。
发明作用与效果
本发明所提供的果胶组合物，使用天然食品的安全制备的条件，在食品加工过程原位状态下，制备得到了具有高抗人类肠腺癌细胞的活性，且稳定的的果胶多糖与景天科植物提取物的组合物。
本发明所提供的果胶组合物的制备方法，制备得到了天然具有高抗人类肠腺癌细胞的果胶多糖组合物，该组合物克服了原来果胶多糖及植物提取物在物理化学及功能性上的缺点，更适合于使用。
本发明所提供的果胶组合物的制备方法，避免传统有机化学反应技术的许多缺点：不易控制反应程度、使用有毒溶剂、反应产物不可于食品加工、对生态环境有污染危害、化学反应设备不能利用食品加工设备须另行设置、化学反应的实验场所须特别设置与严格规范、较高的制备成本等缺点，因而具有制备过程安全无毒、产物为食品级产物、较低制备成本、可应用食品加工过程原位状态下进行组合反应，制备高抗人类肠腺癌细胞的活性的果胶多糖组合物。
附图说明
图1为石莲花叶热水提取物的照片；
图2为石莲花叶42％乙醇水溶液提取物的照片
图3是石莲大分子提取物GWE、高甲氧基果胶HMP、经果胶酶处理的果胶与石莲的中分子提取物的组合物HMP-EF1的抗人类肠腺癌细胞(Caco-2)的抑制活性实验结果。
具体实施方式
一种具有高抗人类肠腺癌活性的果胶多糖组合物，该组合物由果胶多糖和景天科植物提取物组成，其中，
果胶多糖采用各种来源的高、低甲氧基果胶多糖及其热、化学性(酸、碱)、物理性(超声波、微波处理等)和酶等修饰的制备物或某分子量区段的混合物及纯化物。
景天科植物采用景天科植物的叶、茎及根的总提取物或某分子量区段的混合物。
上述组合物在进行原位标靶式反应时，按照果胶多糖和景天科植物提取物的质量比范围为100:1至1:100进行投料混合。
具有高抗人类肠腺癌活性的果胶多糖组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备不同分子量和结构特征的果胶多糖。
2)制备景天科植物的提取物、或进一步从提取物中分离得到某分子量区段的混合物。
3)将果胶多糖与景天科植物提取物组合物，在溶液状态、胶态及固态下，不添加或添加强化剂、稳定剂、分散剂、调整剂、水活性控制剂等任一情况下，施予反应条件(包括加热、加酸、加碱、超音波、微波、酶及发酵处理等任一项)，收集并干燥得到制备物，该制备物经过均质或不均质处理。
强化剂包括没食子酸、阿魏酸、异抗坏血酸、胺基酸类等任一项。
稳定剂包括葡萄糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、海藻糖、葡萄糖脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯及其他相关他合物等任一种或多种。
分散剂包括麦芽糊精、淀粉水解物、阿拉伯胶及其他多糖、食用级硅化合物等任一种或多种。
调整剂包括:氯化盐类、磷酸盐类、盐酸、硫酸、氢氧化钠、钾、钙等任一种或多种。
水活性控制剂:醇类(乙醇或丙醇)、糖醇类、胺基酸类、脂肪酸类等及其衍生物。
对富集目标功能活性的组合物的分离、纯化得到某分子量区段的混合物及纯化物的方法包括醇类溶剂沉降、盐类沉降、离子层析、亲水性或疏水性层析、胶滤层析、分子筛层析、活性碳吸附性层析、膜分离、膜透析。
果胶多糖的制备
高甲氧基果胶多糖、低甲氧基果胶多糖可提取自天然蔬菜水果，或购买自市售多糖胶质商品。其中，凡分子量太高或粘度太高或凝胶性太高、溶易沉淀不易进行反应者，须进行特定改质、某分子量区段的混合物分离及富集处理。
本发明所采果胶多糖，改质目标为控制多糖分子量在1000-100k范围，依不同果胶多糖种类而异。改质方法可采用的降解包括热降解、酸降解、超声波及微波降解、以及酶降解法中的任意一种，根据需要而定。
景天科植物的提取物制备
取景天科植物材料，使用水和醇类混合溶液(醇类浓度为0-95％)提取，不加热或加热，收集提取液不经或经下列分离纯化工艺处理得到总提取物、某分子量区段的混合物或纯化物。处理纯化方法包括醇类溶剂沉降法、盐类离子性沉降法、离子吸附或交换层析法。胶体过滤层析法、分子筛析层析法、活性炭吸附性层析法、膜分离法、电气泳动法、膜透析法。
下面的实施例以高甲氧基果胶多糖、石莲提取物为例来具体说明。
步骤1果胶多糖改质物的制备
高甲氧基果胶多糖购买自市售多糖胶质商品，并通过下列的方法进行改质出来:
1)热降解法:取果胶多醣样品100g溶于10公升去离子水中(即重量百分比为1％w/w)，加热搅拌至完全溶解(70℃，2小时)，加热(90-130℃，10分钟至6小时)，流水冷却、经膜分离技术收集特定分子量区段的混合物、真空干燥或冷冻干燥而得。
2)酸降解法:取果胶多醣样品100g溶于10公升去离子水中(1％w/w)，加热搅拌至完全溶解(70℃、2小时)，加入10公升0.001-2mol/L盐酸或硫酸溶液，水解1分钟至12小时后，加入10公升0.001-2mol/L氢氧化钠或氢氧化钾水溶液中和，经膜分离技术脱盐并收集特定目标分子量区段的混合物、真空干燥或冷冻干燥而得。
3)酶降解法:针对果胶类分子进行酶修饰，选择性制备具有特定的第一类的鼠李糖半乳糖醛酸结构片段(简称为RG1)，具有抑制人类肠腺癌细胞活性的活性链段。取高甲氧基果胶30g溶于3公升去离子水中(1％w/w)，加热搅拌至完全溶解(60℃，400rpm，1h)，加入果胶内切酶(1U/mL)，50℃下作用1小时(温和搅拌150rpm)后，加热(95℃，20分鐘)使酵素失活，冷却、离心(4500g，10分鐘)去除酵素蛋白，所收集的上清液即为酶降解物，经膜分离技术收集特定目标分子量区段的混合物、真空干燥或冷冻干燥而得。
步骤2果胶多糖特定分子量区段的混合物的制备
将果胶多糖修饰物溶液，经离心(10000g，15min)后，收集上清液进行抽气过滤(Whatman No.4滤纸及0.22μm滤膜)以除去杂质，再以切向流超过滤膜(Millipore TFF系统，分子量切(MWCO))，收集大分子(分子量>10kDa)及中分子(分子量1kDa-10kDa)的混合物，经真空浓缩，真空干燥或冷冻干燥后用。
步骤3.景天科植物提取物的制备
采用景天科植物食用部位，例如石莲花叶子和红景天根。本实施例以石莲叶的提取物为例，说明提取制备过程。
将石莲叶洗净，新鲜叶加水于果汁机打汁，或冻干叶后以粉碎机打碎后，加1-10倍水或乙醇水溶液(3-70％)混合，加热提取1-6小时，冷却后去渣(以Whatman No.4滤纸过滤、或用滤布或压榨过滤)，不经或再经精滤处理，得粗提取液，直接真空浓缩后冷冻干燥，为石莲总提取物(GWt)。
粗提取液经切向流超过滤膜分离区分(Millipore TFF系统，分子量切(MWCO)200Da及10kDa)区分，收集大分子(分子量>10kDa)及中分子(分子量200Da-10kDa)及小分子(分子量<200Da)的混合物，经真空浓缩、冷冻干燥后用。
另外，粗提取液加入2-3倍体积95％乙醇沉淀，以6000g离心15分钟，收集沉淀物，经冷冻干燥，为石莲大分子提取物(GWE)。
石莲花叶提取物外观如图1、2所示。不同景天科植物原料、不同提取条件及不同分子量区段的混合物、纯化及干燥处理方法不同，所得产物外观可能白色中带浅灰、粉红、淡黄、淡褐或淡绿，或呈褐色。
步骤4.果胶多糖-石莲花提取物组合物的制备
采用果胶多糖特定分子量区段的混合物(分子量1kDa-10kDa或>10kDa)及景天科植物食用部位的提取物的区分物。本实施例以石莲花叶子的提取物为例，说明组合制备过程。
果胶多糖特定分子量区段的混合物与石莲花叶子提取物的特定分子量区段的混合物，在下列三种情况任一项下混合后进行促酯化反应：
(1)提取过程中溶液状态下混合；
(2)干燥状态混合；
(3)干燥状态先混合后加热溶于水溶液中，或先各别溶于水溶液中后混合。
混合后两者的质量比范围为100:1至1:100。不调整或调整pH值至2-5或9-13，进行热促处理(50-130℃反应1分钟至12小时)，加热设备可采用水浴锅、二重釜、杀菌釜、管式加热、微波加热、超声波中的任意一种，热干燥采用烘箱、滚筒干燥、流动床干燥、喷雾干燥中的任意一种或多种的结合，亦可利用生物反应或发酵槽设备进行反应。可在不添加或必要时添加适量的强化剂、稳定剂、分散剂、调整剂、水活性控制剂等任一情况下施予反应条件。最后收集产物并干燥，可以经过均质或不均质处理。
强化剂为没食子酸、阿魏酸、异抗坏血酸、氨基酸中的任意一种，稳定剂为葡萄糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、海藻糖、葡萄糖脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯中的任意一种或多种的混合物，分散剂为麦芽糊精、淀粉水解物、阿拉伯胶、多糖、食用级硅化合物中的任意一种或多种的混合物，调整剂为氯化盐类、磷酸盐类、盐酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙中的任意一种或多种的混合物，水活性控制剂为醇类、糖醇类、氨基酸类、脂肪酸类中的任意一种或多种的混合物。
可对反应产物先行分离、按分子量大小区分及纯化处理，以取得更高抗人类肠腺癌细胞或高抗氧化活性的特定分子量区段的混合物或纯化物，处理技术包括醇类溶剂沉降、盐类沉降、离子层析、亲水性或疏水性层析、胶滤层析、分子筛层析、活性碳吸附性层析、膜分离、膜透析等任一项。其中，本实施例是采用膜分离处理，详细条件如步骤2。
组合物作用与效果
人类大肠腺癌细胞抑制率测试:
所采人类肠腺癌(Caco-2)细胞为贴盘细胞，培养条件为37℃，5％CO2，以10cm培养皿进行培养，培养期间每两天更换一次培养基或进行分盘。细胞存活率分析采用MTT分析法(试剂为3-[4,5-dimethylthylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)。将人类肠腺癌(Caco-2)细胞活化后，利用细胞计数器将细胞浓度调整为1x 105个/mL，取100μL细胞液加入96孔培养盘中，在37℃、5％CO2培养箱中培养37℃，5％CO2培养箱中培养，观察细胞长满约90％(约24小时)，吸除上清液(培养基)，即可在每个孔中加入100μL的糖类样品溶液，再于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，加入MTT与培养基混合液(10μL/孔)，于37℃，5％CO2培养箱中反应4小时，每孔添加0.1mL的浓溶液(solubilization solution)将蓝紫色结晶甲瓒(formazan)结晶分解，再利用酶标仪(ELISA reader)在595nm波长下读取吸光值(A595)，得到细胞抑制率：
细胞抑制率(％)＝样品处理组A595值/控制组A595值。
每数据重复测定三次，并取平均值，得到图3的实验结果。
图3是石莲大分子提取物GWE、高甲氧基果胶HMP、经果胶酶处理的果胶与石莲的中分子提取物的组合物HMP-EF1的抗人类肠腺癌细胞(Caco-2)的抑制活性实验结果
图3结果显示果胶多糖与石莲提取物區分物具有抗人类肠腺癌细胞(Caco-2)的抑制活性，抑制率提高呈浓度一级反应的正相关。在浓度1.0mg/mL下，高甲氧基果胶(HMP)具有抑制Caco-2细胞的活性大约34％；经过果胶酶处理降解物、经膜分离画分得中分子区分物(HMP-EF1)具有特定带有鼠李糖和阿拉伯糖分枝的聚半乳糖结构片段，呈现高抑制Caco-2细胞的活性(约66％)。石莲花叶热水提取物中分子区分物具有更高的抑制活性83％。此抑制活性的关键因子是果胶特定分子结构片段及抗氧化性植化物，包括酚酸类(尤其没食子酸)、类黄酮、萜烯类等。将活性果胶片段和石莲花叶活性区分子皆具有少量的羧基，在食品加工原位状态下进行选择性、标的性的酯化反应、增加活性基团，可增加抑制Caco-2细胞的活性。
因此，本发明的组合物可以用于制备具有抑制人类肠腺癌细胞活性药物，为此本发明还提供了一种抗大肠腺细胞的药物，含有适量的上述果胶组合物。
另外，本发明的组合物可以用于制备具有抑制人类肠腺癌细胞活性的健康效益的膳食纤维及果胶组合物，可用于健康食品及营养补充品，该食品含有适量的果胶组合物和膳食纤维。
Claims (10)
1.一种果胶组合物，其特征在于，包括果胶多糖和景天科植物提取物，所述景天科植物提取物为水的提取物或水/醇类混合溶剂的提取物。
2.根据权利要求1所述的果胶组合物，其特征在于，还包括：
任意一种或多种的强化剂、稳定剂、分散剂、调整剂、水活性控制剂。
3.根据权利要求2所述的果胶组合物，其特征在于：
其中，所述强化剂为没食子酸、阿魏酸、异抗坏血酸、氨基酸中的任意一种，
所述稳定剂为葡萄糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、海藻糖、葡萄糖脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯中的任意一种或多种的混合物，
所述分散剂为麦芽糊精、淀粉水解物、阿拉伯胶、多糖、食用级硅化合物中的任意一种或多种的混合物，
所述调整剂为氯化盐类、磷酸盐类、盐酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙中的任意一种或多种的混合物，
所述水活性控制剂为醇类、糖醇类、氨基酸类、脂肪酸类中的任意一种或多种的混合物。
4.根据权利要求1所述的果胶组合物，其特征在于：
其中，所述果胶多糖为高甲氧基果胶多糖、低甲氧基果胶多糖、热处理的高甲氧基果胶多糖、热处理的低甲氧基果胶多糖、经酸或碱处理的高甲氧基果胶多糖、经酸或碱处理的低甲氧基果胶多糖、经超声波处理的高甲氧基果胶多糖、经超声波处理的低甲氧基果胶多糖、经微波处理的高甲氧基果胶多糖、经微波处理的低甲氧基果胶多糖、酶修饰的高甲氧基果胶多糖、酶修饰的低甲氧基果胶多糖中的任意一种或多种的混合物。
5.根据权利要求1所述的果胶组合物，其特征在于：
其中，所述果胶多糖的分子量为1kDa～10kDa或大于10kDa，所述景天科植物提取物的分子量为200Da～10kDa或大于10kDa。
6.根据权利要求1所述的果胶组合物，其特征在于：
其中，所述果胶多糖与所述景天科植物提取物的质量比为100：1～1：100。
7.一种制备权利要求1-6中任意一项所述的果胶组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，配制所述果胶多糖和所述景天科植物提取物的混合水溶液；
步骤二，50-130℃加热所述混合水溶液1分钟至12小时得到反应物；
步骤三，收集所述反应物并干燥，所得干燥物即为所述果胶组合物。
8.根据权利要求7所述的制备果胶组合物的方法，其特征在于：
其中，步骤一中的所述混合溶液是经过pH调整的，pH调整后的pH值为2-5为9-13，
步骤二中所述混合水溶液添加有任意一种或多种的强化剂、稳定剂、分散剂、调整剂、水活性控制剂。
9.一种抗肠腺癌细胞的药物，其特征在于含有权利要求1-6中任意一项所述的果胶组合物。
10.一种食品，其特征在于含有权利要求1-6中任意一项所述的果胶组合物和膳食纤维。
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