CN104523814A - 一种可工业化提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可工业化提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法，属于植物有效成分的制备领域。本方法先将浸泡去皮的白芸豆加水磨浆，过筛去除残渣，所得滤液经静置、离心、灭酶、离心、乙醇沉淀后得到蛋白质，将所得蛋白质用磷酸盐缓冲液溶解，用碱性蛋白酶适度酶解以改变杂蛋白的等电点，然后酸沉，收集上清液，经乙醇沉淀、冷冻干燥后即得α-淀粉酶抑制剂产品。本发明制备的α-淀粉酶抑制剂纯度高、活性强，而且本发明所需设备简单、成本低、无污染，有着较好的经济效益和环境效益，可用于工业化大规模生产。

Description

一种可工业化提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法
技术领域
本发明涉及一种可工业化提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法，属于植物有效成分的制备领域。
背景技术
随着社会经济的发展和生活水平的提高，糖尿病逐渐成为了一种普遍的疾病，给人类的健康造成了严重的威胁。糖尿病是一种以糖代谢紊乱为主的全身性疾病，而餐后高血糖是糖尿病的一个典型特征。餐后血糖的持续升高会产生葡萄糖毒性，损伤心血管系统，最终对人体造成不可逆的伤害。因此，控制餐后血糖升高，对于控制和延缓糖尿病的发生和发展至关重要。目前全球糖尿病人已超过1.5亿，预计到2025年将会达到3亿，其中我国的糖尿病患者人数超过5000万，而且发病年龄呈现年轻化趋势。因此，对有关预防和控制糖尿病产品的研究与开发有着现实的意义和广阔的前景。
α-淀粉酶抑制剂是一种被广泛研究的抗糖尿病的物质，属于糖苷水解酶抑制剂，其化学本质是多肽、大分子蛋白质或含氮碳水化合物，主要通过特异性抑制唾液及肠道α-淀粉酶的活性来减少糖分摄取，从而抑制血糖浓度升高。目前已从许多植物种子的胚乳和微生物的代谢产物中分离得到了α-淀粉酶抑制剂，其中从白芸豆中提取的α-淀粉酶抑制剂因具有抑制活性高、安全无副作用等优点而被更多地研究和应用。白芸豆是世界上第二大豆科作物，在我国各省区均有种植，其中云南、贵州、四川等省份有较大的种植面积。据我国古医籍记载，白芸豆性味甘、平，是一种滋补食疗佳品。
现有从白芸豆中提取α-淀粉酶抑制剂的方法依赖色谱层析柱，无法工业化大规模应用，或者不能得到活性较高的α-淀粉酶抑制剂，因而不能适应当今社会的迫切需求。因此，开发一种可工业化提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法不仅可以促进国内农产品资源的开发利用，而且对于糖尿病的预防和控制也有着积极的作用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种可工业化提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法，适用于白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的工业化大规模提取。
所述方法主要包括以下步骤：
(1)白芸豆的预处理：浸泡、磨浆，过滤除渣，得到滤液；
(2)静置：将滤液在室温下静置，使淀粉充分沉降，然后离心取上清液；
(3)灭酶：将上清液灭除内源性α-淀粉酶活性，然后离心取上清液；
(4)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇适当搅拌，沉淀蛋白质，然后离心取下层沉淀物；
(5)溶解蛋白质：将下层沉淀物中残留的乙醇除去，然后用pH6.9的磷酸盐缓冲液溶解蛋白质，得到蛋白液；
(6)酶解：将蛋白液调至合适的浓度、温度和pH后，加入碱性蛋白酶酶解杂蛋白；
(7)酸沉：用1mol/L的盐酸将酶解液调节至合适的pH进行酸沉，然后离心取上清液；
(8)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇，沉淀α-淀粉酶抑制剂，然后离心取下层沉淀物，该沉淀物为α-淀粉酶抑制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括冷冻干燥的步骤：将沉淀物在通风橱中放置1-2h后，于-80℃冷冻干燥48h，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)白芸豆的预处理，是按每100g白芸豆300-500mL蒸馏水的量，将白芸豆于室温下浸泡7-10h后去皮，然后按100g白芸豆600-800mL蒸馏水的量，将白芸豆磨浆，过100目筛去除残渣，得到滤液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)的灭酶是将上清液在70℃水浴灭酶15-30min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)乙醇沉淀，是向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，在4℃下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物，得到蛋白质。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)溶解蛋白质，是挥发除去蛋白质中残留的乙醇，然后用0.02mol//L、pH6.9的磷酸盐缓冲液溶解蛋白质，得到蛋白液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(6)酶解是将蛋白液浓度调整为10-20mg/mL，温度为50-60℃，pH为6.5-7.5，碱性蛋白酶的添加量为2-6U/g蛋白质，酶解时间为2-4h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(7)酸沉，是用1mol/L的盐酸将酶解液调节至pH3.0-5.5，于4℃下静置1-2h，然后离心取上清液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(8)乙醇沉淀，是向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，在4℃下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物。
在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括如下步骤：
(1)浸泡去皮：按每100g白芸豆300-500mL蒸馏水的量，将白芸豆于室温下浸泡7-10h后去皮；
(2)磨浆：按100g白芸豆600-800mL蒸馏水的量，将白芸豆磨浆，过100目筛去除残渣，得到滤液；
(3)静置：将滤液在室温下静置2-3h，使淀粉充分沉降，然后离心取上清液；
(4)灭酶：将上清液在70℃水浴灭酶30min，然后离心取上清液；
(5)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，在4℃下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物，该沉淀物为蛋白质；
(6)溶解蛋白质：将蛋白质在通风橱中放置1-2h以挥发去除残留的乙醇，然后用200-400mL0.02mol/L、pH6.9的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解蛋白质，得到蛋白液；
(7)酶解：将蛋白液调至蛋白液浓度为10-20mg/mL，温度为50-60℃，pH为6.5-7.5，加酶量为2-6U/g蛋白质，酶解时间为2-4h，得到蛋白酶解液；
(8)酸沉：用1mol/L的盐酸将酶解液调节至pH3.0-5.5进行酸沉，于4℃下静置1-2h，然后离心取上清液；
(9)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，在4℃下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物，该沉淀物为α-淀粉酶抑制剂；
(10)冷冻干燥：将沉淀物在通风橱中放置1-2h后，于-80℃冷冻干燥48h，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。
上述的离心条件是：4℃，9000r/min，离心20min。
本发明提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法，采用浸泡、磨浆、灭酶、乙醇沉淀的方法获得蛋白液，利用酶解、酸沉、乙醇沉淀、冷冻干燥的方法得到α-淀粉酶抑制剂产品。本发明方法能够用于α-淀粉酶抑制剂的工业化生产，所得产品的比活力可达22.38U/mg，不仅能够促进白芸豆的综合利用，提高其附加值，而且也有助于糖尿病的预防与控制。
附图说明
图1为本发明实施例1-3中白芸豆蛋白液和所得α-淀粉酶抑制剂产品的SDS-PAGE电泳图。图中：1、标准分子量蛋白；2、白芸豆蛋白液；3、实施例1中所得α-淀粉酶抑制剂产品；4、实施例2中所得α-淀粉酶抑制剂产品；5、实施例3中所得α-淀粉酶抑制剂产品。图中箭头所指条带即为α-淀粉酶抑制剂的条带。
图2为本发明实施例4中相关步骤中蛋白样品的SDS-PAGE电泳图。图中：1、标准分子量蛋白；2、白芸豆蛋白液；3、蛋白酶解液；4、酸沉所得上清液；5、酸沉所得上清液的醇沉蛋白。图中箭头所指条带即为α-淀粉酶抑制剂的条带。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的具体说明，但应该理解本发明并不受这些内容所限制。
3,5-二硝基水杨酸法
将0.25mLα-淀粉酶液(4U/mL)和0.25mL待测样品加入到0.5mL 0.02mol/L PBS(pH6.9)中，于37℃水浴10min后，加入1％可溶性淀粉溶液0.5mL，精确反应5min后加入lmLDNS试剂，沸水浴10min后迅速冷却，适当稀释后，在540nm波长下测定吸光值。对照管中不加α-淀粉酶液(以同体积PBS补足)，其他与抑制剂管相同，其反应体系如表1所示。
表1 α-淀粉酶抑制率测定体系
α-淀粉酶抑制剂的抑制率可按下式计算：
        (1)
式中A1、A2、A3和A4分别为540nm下空白管、空白对照管、抑制管和背景对照管的吸光值。
福林-酚法
(1)试剂的配制：
A液的配制：10gNa2CO3、2gNaOH、0.25g酒石酸钾钠定容至500mL。
B液的配制：0.25g五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)定容至50mL。
甲液：A液与B液按50:1(v/v)混合。
乙液：福林—酚试剂(Sigma公司)。
(2)牛血清蛋白(BSA)标准曲线的绘制：
配制0.5mg/mL的BSA溶液，按表2稀释至不同浓度。分别取1mL不同浓度的BSA与5mL甲液混合后静置10min，再加0.5mL福林—酚试剂振荡后静置30min，于650nm下测吸光值，以BSA浓度为横轴，吸光度为纵轴绘制标准曲线。
表2 不同浓度BSA的稀释方法
(3)样品蛋白浓度的测定：
取1mL样品与5mL甲液混合后静置10min，再加0.5mL福林—酚试剂振荡后静置30min，于650nm下测吸光值，按照标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
实施例1
取100g白芸豆于300mL蒸馏水中在室温下浸泡10h后手工去皮；
用高速组织捣碎机将去皮白芸豆用300mL蒸馏水磨浆后过100目筛，将筛上物用300mL蒸馏水再次磨浆后过100目筛，弃去筛上物，合并滤液，室温下静置2h后，于4℃下9000r/min离心20min，取上清液；
将上清液于70℃水浴灭酶30min，在4℃下9000r/min离心20min，收集上清液；
向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，4℃下搅拌2h后，于4℃下9000r/min离心20min，收集沉淀，该沉淀为蛋白质；
将蛋白质在通风橱中放置1h后，用300mL 0.02mol/L、pH6.9的磷酸盐缓冲液溶解后得到蛋白液；
将蛋白液的浓度调为15mg/mL后取该蛋白液400mL于酶反应器中，调节温度至50℃，调节pH至6.5，加入碱性蛋白酶(18U)酶解4h后得到蛋白酶解液；
将蛋白酶解液的pH调至4.0，于4℃下静置2h，在4℃下9000r/min离心20min，收集上清液；
向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，4℃下搅拌2h后，于4℃下9000r/min离心20min，收集沉淀物，该沉淀物为α-淀粉酶抑制剂；
冷冻干燥：将沉淀物在通风橱中放置1-2h后，于-80℃冷冻干燥48h,超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。
将α-淀粉酶抑制剂与蛋白液进行SDS-PAGE电泳比较，杂蛋白的条带显著减少。用3,5-二硝基水杨酸法和福林-酚法分别测定α-淀粉酶抑制剂的抑制率和蛋白量，经计算，α-淀粉酶抑制剂产品的比活力为15.46U/mg，反应体系中蛋白浓度高于0.23mg/mL时对α-淀粉酶的抑制率保持在90％以上。
实施例2
取100g白芸豆于400mL蒸馏水中在室温下浸泡8h后手工去皮；
用高速组织捣碎机将去皮白芸豆用400mL蒸馏水磨浆后过100目筛，将筛上物用300mL蒸馏水再次磨浆后过100目筛，弃去筛上物，合并滤液，室温下静置3h后，于4℃下9000r/min离心20min，取上清液；
将上清液于70℃水浴灭酶30min，在4℃下9000r/min离心20min，收集上清液；
向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，4℃下搅拌2h后，于4℃下9000r/min离心20min，收集沉淀，该沉淀为蛋白质；
将蛋白质在通风橱中放置2h后，用400mL 0.02mol/L、pH6.9的磷酸盐缓冲液溶解后得到蛋白液。
将蛋白液的浓度调为20mg/mL后取该蛋白液400mL于酶反应器中，调节温度至60℃，调节pH至7.5，加入碱性蛋白酶(20U)酶解2h后得到蛋白酶解液；
将蛋白酶解液的pH调至3.0，于4℃下静置1h，在4℃下9000r/min离心20min，收集上清液；
向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，4℃下搅拌2h后，于4℃下9000r/min离心20min，收集沉淀物，该沉淀物为α-淀粉酶抑制剂。
冷冻干燥：将沉淀物在通风橱中放置1-2h后，于-80℃冷冻干燥48h，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。
将α-淀粉酶抑制剂与蛋白液进行SDS-PAGE电泳比较，杂蛋白的条带明显减少。用3,5-二硝基水杨酸法和福林-酚法分别测定α-淀粉酶抑制剂的抑制率和蛋白量，经计算，α-淀粉酶抑制剂产品的比活力为15.31U/mg，反应体系中蛋白浓度高于0.24mg/mL时对α-淀粉酶的抑制率保持在90％以上。
实施例3
取100g白芸豆于500mL蒸馏水中在室温下浸泡7h后手工去皮；
用高速组织捣碎机将去皮白芸豆用400mL蒸馏水磨浆后过100目筛，将筛上物用400mL蒸馏水再次磨浆后过100目筛，弃去筛上物，合并滤液，室温下静置2h后，于4℃下9000r/min离心20min，取上清液；
将上清液于70℃水浴灭酶30min，在4℃下9000r/min离心20min，收集上清液；
向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，4℃下搅拌2h后，于4℃下9000r/min离心20min，收集沉淀，该沉淀为蛋白质；
将蛋白质在通风橱中放置1.5h后，用200mL 0.02mol/L、pH6.9的磷酸盐缓冲液溶解后得到蛋白液。
将蛋白液的浓度调为15mg/mL后取该蛋白液400mL于酶反应器中，调节温度至55℃，调节pH至7.0，加入碱性蛋白酶(30U)酶解3h后得到蛋白酶解液；
将蛋白酶解液的pH调至5.0，于4℃下静置2h，在4℃下9000r/min离心20min，收集上清液；
向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，4℃下搅拌2h后，于4℃下9000r/min离心20min，收集沉淀物，该沉淀物为α-淀粉酶抑制剂。
冷冻干燥：将沉淀物在通风橱中放置1-2h后，于-80℃冷冻干燥48h,超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。
将α-淀粉酶抑制剂与蛋白液进行SDS-PAGE电泳比较，杂蛋白的条带显著减少。用3,5-二硝基水杨酸法和福林-酚法分别测定α-淀粉酶抑制剂的抑制率和蛋白量，经计算，α-淀粉酶抑制剂产品的比活力为22.12U/mg，反应体系中蛋白浓度高于0.16mg/mL时对α-淀粉酶的抑制率保持在90％以上。
实施例4
取100g白芸豆于400mL蒸馏水中在室温下浸泡9h后手工去皮；
用高速组织捣碎机将去皮白芸豆用400mL蒸馏水磨浆后过100目筛，将筛上物用200mL蒸馏水再次磨浆后过100目筛，弃去筛上物，合并滤液，室温下静置2.5h后，于4℃下9000r/min离心20min，取上清液；
将上清液于70℃水浴灭酶30min，在4℃下9000r/min离心20min，收集上清液；
向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，4℃下搅拌2h后，于4℃下9000r/min离心20min，收集沉淀，该沉淀为蛋白质；
将蛋白质在通风橱中放置1h后，用400mL 0.02mol/L、pH6.9的磷酸盐缓冲液溶解后得到蛋白液。
将蛋白液的浓度调为20mg/mL后取该蛋白液400mL于酶反应器中，调节温度至60℃，调节pH至7.5，加入碱性蛋白酶(48U)酶解4h后得到蛋白酶解液；
将蛋白酶解液的pH调至5.5，于4℃下静置2h，在4℃下9000r/min离心20min，收集上清液；
向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％(v/v)，4℃下搅拌2h后，于4℃下9000r/min离心20min，收集沉淀物，该沉淀物为α-淀粉酶抑制剂。
冷冻干燥：将沉淀物在通风橱中放置1-2h后，于-80℃冷冻干燥48h，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。
将该实施例中四个关键点的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳比较，产品中杂蛋白的条带显著减少。用3,5-二硝基水杨酸法和福林-酚法分别测定α-淀粉酶抑制剂的抑制率和蛋白量，经计算，α-淀粉酶抑制剂产品的比活力为22.38U/mg，反应体系中蛋白浓度高于0.16mg/mL时对α-淀粉酶的抑制率保持在90％以上。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提取白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)白芸豆的预处理：浸泡、磨浆，过滤除渣，得到滤液；
(2)静置：将滤液在室温下静置，使淀粉充分沉降，然后离心取上清液；
(3)灭酶：将上清液灭除内源性α-淀粉酶活性，然后离心取上清液；
(4)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇适当搅拌，沉淀蛋白质，然后离心取下层沉淀物；
(5)溶解蛋白质：将下层沉淀物中残留的乙醇除去，然后用磷酸盐缓冲液溶解蛋白质，得到蛋白液；
(6)酶解：将蛋白液调至合适的浓度、温度和pH后，加入碱性蛋白酶酶解杂蛋白；
(7)酸沉：用1mol/L的盐酸将酶解液调节至合适的pH进行酸沉，然后离心取上清液；
(8)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇，沉淀α-淀粉酶抑制剂，然后离心取下层沉淀物，该沉淀物为α-淀粉酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括冷冻干燥的步骤：将沉淀物在通风橱中放置1-2h后，于-80℃冷冻干燥48h，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)白芸豆的预处理，是按每100g白芸豆300-500mL蒸馏水的量，将白芸豆于室温下浸泡7-10h后去皮，然后按100g白芸豆600-800mL蒸馏水的量，将白芸豆磨浆，过100目筛去除残渣，得到滤液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的灭酶是将上清液在70℃水浴灭酶15-30min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)乙醇沉淀，是向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％，在4℃下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物，得到蛋白质。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)溶解蛋白质，是挥发除去蛋白质中残留的乙醇，然后用0.02mol//L、pH6.9的磷酸盐缓冲液溶解蛋白质，得到蛋白液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)酶解是将蛋白液浓度调整为10-20mg/mL，温度为50-60℃，pH为6.5-7.5，碱性蛋白酶的添加量为2-6U/g蛋白质，酶解时间为2-4h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)酸沉，是用1mol/L的盐酸将酶解液调节至pH3.0-5.5，于4℃下静置1-2h，然后离心取上清液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)乙醇沉淀，是向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％，在4℃下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法主要包括如下步骤：
(1)浸泡去皮：按每100g白芸豆300-500mL蒸馏水的量，将白芸豆于室温下浸泡7-10h后去皮；
(2)磨浆：按100g白芸豆600-800mL蒸馏水的量，将白芸豆磨浆，过100目筛去除残渣，得到滤液；
(3)静置：将滤液在室温下静置2-3h，使淀粉充分沉降，然后离心取上清液；
(4)灭酶：将上清液在70℃水浴灭酶30min，然后离心取上清液；
(5)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％，在4℃下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物，该沉淀物为蛋白质；
(6)溶解蛋白质：将蛋白质在通风橱中放置1-2h以挥发去除残留的乙醇，然后用200-400mL的0.02mol/L、pH6.9的磷酸盐缓冲液溶解蛋白质，得到蛋白液；
(7)酶解：将蛋白液调至蛋白液浓度为10-20mg/mL，温度为50-60℃，pH为6.5-7.5，加酶量为2-6U/g蛋白质，酶解时间为2-4h，得到蛋白酶解液；
(8)酸沉：用1mol/L的盐酸将酶解液调节至pH3.0-5.5进行酸沉，于4℃下静置1-2h，然后离心取上清液；
(9)乙醇沉淀：向上清液中加入无水乙醇至终浓度为70％，在4℃下搅拌2h，然后离心取下层沉淀物，该沉淀物为α-淀粉酶抑制剂；
(10)冷冻干燥：将沉淀物在通风橱中放置1-2h后，于-80℃冷冻干燥48h，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。
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