CN106589154B - 一种野西瓜硒多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种野西瓜硒多糖的制备方法。本发明涉及一种野西瓜硒多糖的制备方法。本发明目的是为了解决目前野西瓜多糖抗肿瘤活性低的问题。方法：一、野西瓜多糖的提取；二、野西瓜粗多糖的制备；三、野西瓜粗多糖除蛋白；四、野西瓜粗多糖除色素及小分子；五、野西瓜多糖醇沉；六、野西瓜多糖精提；七、野西瓜多糖的硒化。本发明的制备方法简单易操作，成本低，所得硒多糖Se‑CSPS可显著抑制肿瘤生长，抑制率高达61.08％。

Description

一种野西瓜硒多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种野西瓜硒多糖的制备方法。

背景技术

天然硒多糖存在于植物、动物和微生物中，这些富硒生物主要分布于我国西北和西南等富硒地区，特别是在目前世界唯一探明的具备独立硒矿床的恩施地区广泛存在。在富硒地区的植物和微生物通过吸收土壤中硒将无机硒转换为有机硒，以硒多糖、硒蛋白等形式储存，并通过食物链进入动物体内。但由于硒属稀散元素，在自然界中分布零散且含量稀少，并且这些动植物和微生物受到气候、地域、生物转化率等因素制约，因此总体来说天然硒多糖较少且硒含量低。

硒多糖兼有硒和多糖二者活性，生物活性普遍高于多糖和硒，且易被机体吸收和利用。研究证实，硒多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗重金属、提高机体免疫力等作用，具有广阔的应用前景。

硒(Selenium，Se)分布零散且稀少，是稀散元素之一。在自然界中以无机和有机两种状态存在，无机硒主要是单质、亚硒酸盐和矿质结合体类，有机硒则以蛋白、生物酶、多糖形式存在于微生物、动植物体内。现代研究表明，硒具有良好的药理作用，如抗肿瘤、抗氧化、解毒排毒、降血脂降血糖等，可用于预防和治疗诸多疾病，如克山病等地方病及高血压、冠心病、肿瘤等慢性病。

野西瓜(Capparis spinosa.L)为白花菜科山柑仔属植物，在我国新疆地区作为民族药物被广泛应用治疗各种疾病。

Huseini等人在临床中应用野西瓜提取物治疗糖尿病，在服用野西瓜提取物(每次400mg，一天三次)两个月后，糖尿病人血糖、糖化血红蛋白、血脂水平显著下降，并对肝、肾无毒副作用。提示野西瓜是安全的降血糖降血脂的药用植物。

野西瓜多糖是野西瓜的主要有效成分之一。研究表明，经过纯化得到的野西瓜多糖可以通过诱导HepG2细胞凋亡达到抗肿瘤作用。此外，野西瓜多糖能提高S₁₈₀荷瘤小鼠免疫器官重量，降低S₁₈₀荷瘤小鼠的瘤重，增强荷瘤小鼠网状内皮系统吞噬功能，表明野西瓜多糖可以通过提高S₁₈₀荷瘤小鼠的免疫功能而发挥其抗肿瘤活性。

多糖具有广泛的药理活性，在抗肿瘤领域主要通过提高机体免疫能力的途径发挥抗肿瘤作用，这在一定程度上限制了多糖的应用。而具有优良抗肿瘤活性的硒却在无机状态下毒性大、稳定性差，这也制约了硒在抗肿瘤领域中的使用。因此，硒多糖作为一种新兴的抗肿瘤药物逐渐成为研究热点。它既可提高多糖活性，扩大多糖的应用范围，也能将无机硒转化为有机硒，降低硒的毒性。与此同时，硒多糖对肿瘤的生长具有更强的抑制率，增强了机体清除氧自由基和抗氧化损伤的能力，进而发挥抗肿瘤作用。

但是，天然硒多糖在动植物和微生物体内含量甚微，这使得硒多糖的研究和应用受到了极大限制。因此，通过人工方式获取硒多糖变得十分迫切且现实。目前，人们主要通过富硒种植、富硒发酵和富硒养殖获得硒多糖，但这种方式得到的硒多糖收率低、成本高、时间长、受外界因素影响大。

发明内容

本发明目的是为了解决目前野西瓜多糖抗肿瘤活性低的问题，而提供一种野西瓜硒多糖的制备方法。

本发明的一种野西瓜硒多糖的制备方法按以下步骤进行：

一、野西瓜多糖的提取：将野西瓜干燥，然后加入95％的乙醇进行醇沉，醇沉3次，干燥后得到醇沉淀多糖；其中醇沉温度为80～100℃，醇沉时间为2h～4h；

二、野西瓜粗多糖的制备：向步骤一得到的醇沉淀多糖中加水进行萃取，对萃取液脱水，然后依次用无水乙醇、丙酮和苯洗脱，干燥后得到多糖含量为80％的野西瓜粗多糖；

三、野西瓜粗多糖除蛋白：①将步骤二得到的多糖含量为80％的野西瓜粗多糖用蒸馏水溶解，配成饱和粗多糖水溶液Ⅰ；②向饱和粗多糖水溶液Ⅰ中加入质量为饱和粗多糖水溶液Ⅰ质量1％的木瓜蛋白酶，在温度为50～70℃的水浴条件下酶解反应1.5h～2.5h，酶解反应后置于沸水中灭活8min～12min，然后加入氯仿和正丁醇的混合液，震荡15min～25min，转至分液漏斗中静置25min～35min，除去水相与有机相之间的白色蛋白，得到剩余水相；③对剩余水相重复步骤②的操作至水相与有机相之间无白色蛋白，得到待浓缩水相；④对待浓缩水相进行浓缩，浓缩至原体积的40％～60％，得到浓缩后水相，然后加入4倍浓缩后水相体积的无水乙醇沉淀过夜，再依次用无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤，干燥后得除蛋白野西瓜粗多糖；

所述氯仿和正丁醇的混合液中氯仿与正丁醇的体积比为4:1；

四、野西瓜粗多糖除色素及小分子：将步骤三得到的除蛋白野西瓜粗多糖用蒸馏水溶解，配成饱和粗多糖水溶液Ⅱ，然后加入氨水调节pH值至8～9，再加入过氧化氢，调节过氧化氢体积分数为饱和粗多糖水溶液Ⅱ体积的10％，然后置于温度为50～70℃的水浴条件下加热反应1.5h～2.5h，冷却后装入透析袋，先流水透析3天，再用蒸馏水透析1天后取出，然后在转速为3000r/min～4000r/min的条件下离心8min～12min，除去沉淀后将溶液浓缩至原体积的40％～60％，得到脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液；

五、野西瓜多糖醇沉：将无水乙醇加入至步骤四得到的脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液中，沉淀静置过夜，离心分离得到多糖沉淀，然后依次无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤多糖沉淀，干燥后，得到醇沉后野西瓜多糖；

步骤五中所述无水乙醇与步骤四得到的脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液的体积比为10:100；

六、野西瓜多糖精提：采用DEAE-52柱对步骤五得到的醇沉后野西瓜多糖进行层析，然后用4倍柱体积的浓度为0.1mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂进行洗脱，NaCl溶液流速为20mL/3min，收集洗脱液先用流水透析3天，再用蒸馏水透析至无Cl^-后冷冻干燥，得到野西瓜多糖，即CSPS；

七、野西瓜多糖的硒化：将步骤六得到的CSPS和Na₂SeO₃溶于0.5％硝酸水溶液中，混匀后得到混合液，然后将装有混合液的三角烧瓶密封置于水浴中，在温度为60～80℃和转速为35r/min～45r/min的条件下反应6.5h～7.5h，反应完成后使其冷却，然后用无水Na₂CO₃调节反应溶液的pH值至5～6，再用离心机在3000r/min～4000r/min的条件下离心8min～12min，将离心后的上清液置于透析袋中，流水透析至游离HSeO₃ ^-去除完全，然后将透析液浓缩至原体积的的40％～60％，真空冷冻干燥后得到野西瓜硒多糖，即Se-CSPS；

所述CSPS与Na₂SeO₃的质量比为1：0.7～0.9；所述混合液中CSPS的浓度为0.008g/mL～0.012g/mL。

本发明的有益效果：

本发明的制备方法简单易操作，成本低，所得硒多糖Se-CSPS可显著抑制肿瘤生长，Se-CSPS用量为50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)、150mg/(kg·d)时的抑制率分别为35.08％、58.15％、61.08％；还可提升S₁₈₀荷瘤小鼠体内CAT含量，增强机体分解H₂O₂的能力，而且由于SOD的提升，使得机体内MDA含量显著下降，同时，由于通过硒多糖形式补充硒，显著提高了S₁₈₀荷瘤小鼠机体内的GSH-Px活力，也使得机体分解H₂O₂的能力进一步增强。

附图说明

图1为试验一得到的Se-CSPS在202nm处的紫外光谱图；

图2为Se-CSPS硒特征吸收紫外光谱图；

图3为CSPS硒特征吸收紫外光谱图；

图4为试验一得到的Se-CSPS红外光谱图；

图5为试验一得到的Se-CSPS核磁共振氢谱谱图；

图6为试验一得到的Se-CSPS粒径分布图；

图7为CSPS粒径分布图；

图8为试验一得到的Se-CSPS电位在0.0889mV时Zeta电位图；

图9为CSPS电位在-0.0927mV时Zeta电位图；

图10为试验一得到的Se-CSPS和CSPS与刚果红对比试验图；

图11为20000放大倍数下Se-CSPS的SEM照片；

图12为5000放大倍数下Se-CSPS的SEM照片；

图13为5000放大倍数下CSPS的SEM照片；

图14为1000放大倍数下CSPS的SEM照片。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种野西瓜硒多糖的制备方法按以下步骤进行：

一、野西瓜多糖的提取：将野西瓜干燥，然后加入95％的乙醇进行醇沉，醇沉3次，干燥后得到醇沉淀多糖；其中醇沉温度为80～100℃，醇沉时间为2h～4h；

二、野西瓜粗多糖的制备：向步骤一得到的醇沉淀多糖中加水进行萃取，对萃取液脱水，然后依次用无水乙醇、丙酮和苯洗脱，干燥后得到多糖含量为80％的野西瓜粗多糖；

三、野西瓜粗多糖除蛋白：①将步骤二得到的多糖含量为80％的野西瓜粗多糖用蒸馏水溶解，配成饱和粗多糖水溶液Ⅰ；②向饱和粗多糖水溶液Ⅰ中加入质量为饱和粗多糖水溶液Ⅰ质量1％的木瓜蛋白酶，在温度为50～70℃的水浴条件下酶解反应1.5h～2.5h，酶解反应后置于沸水中灭活8min～12min，然后加入氯仿和正丁醇的混合液，震荡15min～25min，转至分液漏斗中静置25min～35min，除去水相与有机相之间的白色蛋白，得到剩余水相；③对剩余水相重复步骤②的操作至水相与有机相之间无白色蛋白，得到待浓缩水相；④对待浓缩水相进行浓缩，浓缩至原体积的40％～60％，得到浓缩后水相，然后加入4倍浓缩后水相体积的无水乙醇沉淀过夜，再依次用无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤，干燥后得除蛋白野西瓜粗多糖；

所述氯仿和正丁醇的混合液中氯仿与正丁醇的体积比为4:1；

四、野西瓜粗多糖除色素及小分子：将步骤三得到的除蛋白野西瓜粗多糖用蒸馏水溶解，配成饱和粗多糖水溶液Ⅱ，然后加入氨水调节pH值至8～9，再加入过氧化氢，调节过氧化氢体积分数为饱和粗多糖水溶液Ⅱ体积的10％，然后置于温度为50～70℃的水浴条件下加热反应1.5h～2.5h，冷却后装入透析袋，先流水透析3天，再用蒸馏水透析1天后取出，然后在转速为3000r/min～4000r/min的条件下离心8min～12min，除去沉淀后将溶液浓缩至原体积的40％～60％，得到脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液；

五、野西瓜多糖醇沉：将无水乙醇加入至步骤四得到的脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液中，沉淀静置过夜，离心分离得到多糖沉淀，然后依次无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤多糖沉淀，干燥后，得到醇沉后野西瓜多糖；

步骤五中所述无水乙醇与步骤四得到的脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液的体积比为10:100；

六、野西瓜多糖精提：采用DEAE-52柱对步骤五得到的醇沉后野西瓜多糖进行层析，然后用4倍柱体积的浓度为0.1mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂进行洗脱，NaCl溶液流速为20mL/3min，收集洗脱液先用流水透析3天，再用蒸馏水透析至无Cl^-后冷冻干燥，得到野西瓜多糖，即CSPS；

七、野西瓜多糖的硒化：将步骤六得到的CSPS和Na₂SeO₃溶于0.5％硝酸水溶液中，混匀后得到混合液，然后将装有混合液的三角烧瓶密封置于水浴中，在温度为60～80℃和转速为35r/min～45r/min的条件下反应6.5h～7.5h，反应完成后使其冷却，然后用无水Na₂CO₃调节反应溶液的pH值至5～6，再用离心机在3000r/min～4000r/min的条件下离心8min～12min，将离心后的上清液置于透析袋中，流水透析至游离HSeO₃ ^-去除完全，然后将透析液浓缩至原体积的的40％～60％，真空冷冻干燥后得到野西瓜硒多糖，即Se-CSPS；

所述CSPS与Na₂SeO₃的质量比为1：0.7～0.9；所述混合液中CSPS的浓度为0.008g/mL～0.012g/mL。

用抗坏血酸检测透析液中是否存在游离HSeO₃ ^-，吸取少量透析液置于烧杯，当溶液变红时表明透析液中仍有游离HSeO3-存在，继续透析，直至检测无红色时取出透析袋。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述醇沉温度为90℃，醇沉时间为3h。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三、本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：其特征在于步骤三②中在温度为60℃的水浴条件下酶解反应2h。其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三②中酶解反应后置于沸水中灭活10min。其他步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三②中加入氯仿和正丁醇的混合液，震荡20min，转至分液漏斗中静置30min。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四中置于温度为60℃的水浴条件下加热反应2h。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四中在转速为3500r/min的条件下离心10min。其他步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤七中将装有混合液的三角烧瓶密封置于水浴中，在温度为70℃和转速为40r/min的条件下反应7h。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤七中所述CSPS与Na₂SeO₃的质量比为1：0.8。其他步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤七中所述混合液中CSPS的浓度为0.01g/mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。

用以下试验验证本发明的有益效果

试验一、本试验的一种野西瓜硒多糖的制备方法按以下步骤进行：

一、野西瓜多糖的提取：将野西瓜干燥，然后加入95％的乙醇进行醇沉，醇沉3次，干燥后得到醇沉淀多糖；其中醇沉温度为90℃，醇沉时间为3h；

二、野西瓜粗多糖的制备：向步骤一得到的醇沉淀多糖中加水进行萃取，对萃取液脱水，然后依次用无水乙醇、丙酮和苯洗脱，干燥后得到多糖含量为80％的野西瓜粗多糖；

三、野西瓜粗多糖除蛋白：①将步骤二得到的多糖含量为80％的野西瓜粗多糖用蒸馏水溶解，配成饱和粗多糖水溶液Ⅰ；②向饱和粗多糖水溶液Ⅰ中加入质量为饱和粗多糖水溶液Ⅰ质量1％的木瓜蛋白酶，在温度为60℃的水浴条件下酶解反应2h，酶解反应后置于沸水中灭活10min，然后加入氯仿和正丁醇的混合液，震荡20min，转至分液漏斗中静置30min，除去水相与有机相之间的白色蛋白，得到剩余水相；③对剩余水相重复步骤②的操作至水相与有机相之间无白色蛋白，得到待浓缩水相；④对待浓缩水相进行浓缩，浓缩至原体积的50％，得到浓缩后水相，然后加入4倍浓缩后水相体积的无水乙醇沉淀过夜，再依次用无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤，干燥后得除蛋白野西瓜粗多糖；

所述氯仿和正丁醇的混合液中氯仿与正丁醇的体积比为4:1；

四、野西瓜粗多糖除色素及小分子：将步骤三得到的除蛋白野西瓜粗多糖用蒸馏水溶解，配成饱和粗多糖水溶液Ⅱ，然后加入氨水调节pH值至8～9，再加入过氧化氢，调节过氧化氢体积分数为饱和粗多糖水溶液Ⅱ体积的10％，然后置于温度为60℃的水浴条件下加热反应2h，冷却后装入透析袋，先流水透析3天，再用蒸馏水透析1天后取出，然后在转速为3500r/min的条件下离心10min，除去沉淀后将溶液浓缩至原体积的50％，得到脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液；

五、野西瓜多糖醇沉：将无水乙醇加入至步骤四得到的脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液中，沉淀静置过夜，离心分离得到多糖沉淀，然后依次无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤多糖沉淀，干燥后，得到醇沉后野西瓜多糖；

步骤五中所述无水乙醇与步骤四得到的脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液的体积比为10:100；

六、野西瓜多糖精提：采用DEAE-52柱对步骤五得到的醇沉后野西瓜多糖进行层析，然后用4倍柱体积的浓度为0.1mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂进行洗脱，NaCl溶液流速为20mL/3min，收集洗脱液先用流水透析3天，再用蒸馏水透析至无Cl^-后冷冻干燥，得到野西瓜多糖，即CSPS；

七、野西瓜多糖的硒化：将步骤六得到的CSPS和Na₂SeO₃溶于0.5％硝酸水溶液中，混匀后得到混合液，然后将装有混合液的三角烧瓶密封置于水浴中，在温度为70℃和转速为40r/min的条件下反应7h，反应完成后使其冷却，然后用无水Na₂CO₃调节反应溶液的pH值至5～6，再用离心机在3500r/min的条件下离心10min，将离心后的上清液置于透析袋中，流水透析至游离HSeO₃ ^-去除完全，然后将透析液浓缩至原体积的的50％，真空冷冻干燥后得到野西瓜硒多糖，即Se-CSPS；

所述CSPS与Na₂SeO₃的质量比为1：0.8；所述混合液中CSPS的浓度为0.01g/mL。

用抗坏血酸检测透析液中是否存在游离HSeO₃ ^-，吸取少量透析液置于烧杯，当溶液变红时表明透析液中仍有游离HSeO3-存在，继续透析，直至检测无红色时取出透析袋。

A结构表征

(一)基本理化性质检测

对试验一得到的Se-CSPS进行基本理化性质检测，结果如下：

Se-CSPS为黄色絮状粉末无味，易溶于温水、热水及酸、碱、盐溶液，不溶于有机试剂；

苯酚-硫酸反应、Molish反应、Fehling试剂反应结果证明Se-CSPS为糖类物质；

硫酸-咔唑反应证明含有糖醛酸；

茚三酮反应及双缩脲反应证明不含有氨基酸、多肽或蛋白质；

I₂-KI反应证明不含有淀粉；

FeCl₃反应证明不含鞣质或酚类；

Se-CSPS中糖含量为78.80％；糖醛酸含量分别为19.45％；硒含量为5416.24μg/g。

(二)紫外光谱检测

对试验一得到的Se-CSPS进行紫外光谱扫描，得到如图1所示的试验一得到的Se-CSPS在202nm处的紫外光谱图，从图1中可以看出Se-CSPS在202nm处具有多糖特征峰，说明为Se-CSPS为多糖类物质；在260nm和280nm处无吸收，说明Se-CSPS中没有核酸和蛋白质存在。同时发现，Se-CSPS的最大吸收波长与CSPS的最大吸收波长相比，均向Na2SeO3的最大吸收波长(214nm)方向偏移，这应该是由于硒与多糖结合后硒进入多糖内部造成的。

为进一步确认硒是否进入多糖内部，还采用了紫外光谱在300～400nm范围内对硒的特征吸收进行扫描，得到如图2所示的Se-CSPS硒特征吸收紫外光谱图，得到如图3所示的CSPS硒特征吸收紫外光谱图；从图2可以看出，Se-CSPS在334nm处存在一个强吸收峰，且与Na₂SeO₃中硒的最大吸收波长一致，而从图3可以看出，CSPS在此范围内无特征吸收，表明硒已与多糖结合，Se-CSPS中存在硒。

(三)红外光谱检测

对试验一得到的Se-CSPS进行红外光谱扫描，得到如图4所示的试验一得到的Se-CSPS红外光谱图，从图4可以看出，Se-CSPS的红外光谱在3416.19cm^-1具有强的宽吸收峰，这主要是由Se-CSPS中的-OH伸缩振动造成的；3000～2800cm^-1范围是C-H伸缩振动；C-H变角振动的吸收峰为1384.29cm^-1，此三个峰为多糖特征峰，可以推断Se-CSPS为多糖。1609.29cm^-1及1425.29cm^-1则由-COOH伸缩振动引起；1143.85cm^-1及1095.89cm^-1是因吡喃环上C-O-C和C-O-H伸缩振动造成；890cm^-1附近的吸收峰表明Se-CSPS为β构型；在760～455cm^-1附近为硒的特征吸收峰。可以推断出Se-CSPS为β-型吡喃环结构。

(四)核磁共振检测

对试验一得到的Se-CSPS进行核磁共振检测，得到如图5所示的试验一得到的Se-CSPS核磁共振氢谱，从图5可以看出，H-1(δ4.858～δ3.985)、H-2(δ3.919～δ3.845)、H-3(δ3.768～δ3.696)、H-4(δ3.839～δ3.810)、H-5(δ3.511～δ3.210)、H-6(δ3.670～δ3.521)。可以看出，Se-CSPS质子峰的位移值大部分小于5，提示Se-CSPS为β-型糖苷键。

(五)粒径分布检测

对试验一得到的Se-CSPS和CSPS进行粒径分布检测，得到如图6所示的试验一得到的Se-CSPS粒径分布图，得到如图7所示的CSPS粒径分布图；从图6和图7中可以看出，Se-CSPS粒径为220.40nm，CSPS粒径为449nm。这说明相同浓度下，硒化后多糖粒径小于未硒化多糖。其主要原因为在硒化过程中，多糖在硝酸水溶液中部分酸水解，从而导致硒多糖粒径减小。这一结果还进一步提示硒多糖与原多糖相比可能更易穿透细胞，更易被机体或细胞吸收，更能发挥药理活性。

(六)Zeta电位检测

对试验一得到的Se-CSPS和CSPS进行Zeta电位检测，得到如图8所示的试验一得到的Se-CSPS电位在(0.0889mV)时Zeta电位图，得到如图9所示的CSPS电位在(-0.0927mV)时Zeta电位图；从图8和图9中可以看出，结果表明，硒化多糖在水溶液中比未硒化多糖易于聚集。当Zeta电位在(0±5)mV时，表明溶液趋向于快速凝结或聚集，因此总体来说，不论是否硒化，多糖在溶液中均易于聚集和凝聚，因此提示如果为注射用多糖，应在溶解后尽快注射完毕，不宜给药时间过久，以免多糖聚集或沉淀。

(七)刚果红试验

对试验一得到的Se-CSPS和CSPS进行刚果红试验，得到如图10所示的刚果红试验图；其中1为刚果红，2为CSPS，3为试验一得到的Se-CSPS；从图10可以看出，Se-CSPS刚果红络合物的最大吸收波长在0～0.3mol/L时缓慢降低，当大于0.3mol/L时，Se-CSPS刚果红络合物的最大吸收波长出现迅速下降，表明Se-CSPS具有三股螺旋结构。CSPS在0.3mol/L后，最大吸收波长也迅速下降，表明CSPS同样具有三股螺旋结构。

(八)扫描电镜检测

对试验一得到的Se-CSPS和CSPS进行扫描电镜扫描，得到如图11所示的20000放大倍数下Se-CSPS的SEM照片和如图12所示的5000放大倍数下Se-CSPS的SEM照片；从图11和图12可以看出，Se-CSPS均匀地铺在了导电胶表面，在视野中可以看到有大面积的絮状结构存在，呈现圆形和球形结构，从形貌上观察近似于微晶结构。

得到如图13所示的5000放大倍数下CSPS的SEM照片和如图14所示的1000放大倍数下CSPS的SEM照片；从图13和图14可以看出，CSPS形貌为棒状和长条状。

B性能表征

野西瓜硒多糖对S₁₈₀荷瘤小鼠抗氧化系统的影响

1、实验分组：120只昆明种小鼠18～22g，雌雄各半，分别为：阴性对照组、阳性对照组、多糖组、硒多糖高、中、低剂量组。

2、给药剂量：分组小鼠接种S₁₈₀ 24h后开始腹腔注射(ip)给药，每天1次，连续给药10d，每天给药量如下：

阴性对照组：生理盐水，0.2mL/只；

阳性对照组：香菇多糖，100mg/(kg·d)；

多糖组：CSPS，100mg/(kg·d)；

硒多糖高剂量组：Se-CSPS150mg/(kg·d)；

硒多糖中剂量组：Se-CSPS100mg/(kg·d)；

硒多糖低剂量组：Se-CSPS50mg/(kg·d)。

(九)试验一得到的野西瓜硒多糖Se-CSPS对S₁₈₀荷瘤小鼠肿瘤抑制率的影响试验

抑瘤率：末次给药24h后，颈椎脱臼处死动物，剥离肿瘤，称质量，计算抑瘤率，计算公式如下所示：

结果：得到如表1所示的野西瓜硒多糖对S₁₈₀荷瘤小鼠抑瘤率，从表1中可以看出，Se-CSPS各剂量组对小鼠肉瘤S₁₈₀的抑制作用，抑瘤率分别为35.08％、58.15％、61.08％，抑瘤率随给药剂量增加而增加，但在高剂量时抑瘤率增加平缓。Se-CSPS中高剂量组抑瘤率大于阳性对照组。

表1 野西瓜硒多糖对S₁₈₀荷瘤小鼠抑瘤率

与阴性组比较^**P<0.01

(十)试验一得到的野西瓜硒多糖Se-CSPS对S180荷瘤小鼠过氧化氢酶(CAT)的影响结果

结果：得到如表2所示的野西瓜硒多糖对S₁₈₀荷瘤小鼠CAT的影响结果，表2显示Se-CSPS各剂量组与阴性组比较均有显著性差异(P<0.01，P<0.05)，Se-CSPS可以显著提升S₁₈₀荷瘤小鼠中血清、心脏和肝脏中CAT活性。表明Se-CSPS对于提高CAT含量优于阳性药和CSPS。

表2 野西瓜硒多糖对S₁₈₀荷瘤小鼠CAT的影响结果

与阴性组比较^*P<0.05，^**P<0.01；与各自未结合硒的多糖比较^#P<0.05，^##P<0.01

(十一)试验一得到的野西瓜硒多糖对S₁₈₀荷瘤小鼠丙二醛(MDA)的影响结果

结果：得到如表3所示的Se-CSPS对S₁₈₀荷瘤小鼠中MDA的影响。Se-CSPS可以显著降低血清、心脏和肝脏中MDA(与阴性组比较，P<0.01)。说明Se-CSPS能够降低小鼠体内MDA。

表3 野西瓜硒多糖对S₁₈₀荷瘤小鼠MDA的影响结果

与阴性组比较^*P<0.05，^**P<0.01；与各自未结合硒的多糖比较^#P<0.05，^##P<0.01

(十二)试验一得到的野西瓜硒多糖对S180荷瘤小鼠丙二醛(MDA)的影响结果

结果：得到如表4所示的Se-CSPS对S₁₈₀荷瘤小鼠中MDA的影响。从图中可以看出，Se-CSPS可以显著降低血清、心脏和肝脏中MDA(与阴性组比较，P<0.01)。说明Se-CSPS能够降低小鼠体内MDA。

表4 野西瓜硒多糖对S₁₈₀荷瘤小鼠MDA的影响结果

与阴性组比较^*P<0.05，^**P<0.01；与各自未结合硒的多糖比较^#P<0.05，^##P<0.01

(十三)试验一得到的野西瓜硒多糖对S180荷瘤小鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的影响结果

结果：得到如表5所示的Se-CSPS对对S180荷瘤小鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的影响结果，表5显示与阴性对照组相比，Se-CSPS各组可显著提高GSH-Px活力(P<0.01)，呈剂量依赖关系。与CSPS比较发现，Se-CSPS各组均优于CSPS，且有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。

表5野西瓜硒多糖对S₁₈₀荷瘤小鼠GSH-Px的影响结果

与阴性组比较^*P<0.05，^**P<0.01；与各自未结合硒的多糖比较^#P<0.05，^##P<0.01。

Claims (10)

1.一种野西瓜硒多糖的制备方法，其特征在于一种野西瓜硒多糖的制备方法按以下步骤进行：

一、野西瓜多糖的提取：将野西瓜干燥，然后加入95％的乙醇进行醇沉，醇沉3次，干燥后得到醇沉淀多糖；其中醇沉温度为80～100℃，醇沉时间为2h～4h；

二、野西瓜粗多糖的制备：向步骤一得到的醇沉淀多糖中加水进行萃取，对萃取液脱水，然后依次用无水乙醇、丙酮和苯洗脱，干燥后得到多糖含量为80％的野西瓜粗多糖；

三、野西瓜粗多糖除蛋白：①将步骤二得到的多糖含量为80％的野西瓜粗多糖用蒸馏水溶解，配成饱和粗多糖水溶液Ⅰ；②向饱和粗多糖水溶液Ⅰ中加入质量为饱和粗多糖水溶液Ⅰ质量1％的木瓜蛋白酶，在温度为50～70℃的水浴条件下酶解反应1.5h～2.5h，酶解反应后置于沸水中灭活8min～12min，然后加入氯仿和正丁醇的混合液，震荡15min～25min，转至分液漏斗中静置25min～35min，除去水相与有机相之间的白色蛋白，得到剩余水相；③对剩余水相重复步骤②的操作至水相与有机相之间无白色蛋白，得到待浓缩水相；④对待浓缩水相进行浓缩，浓缩至原体积的40％～60％，得到浓缩后水相，然后加入4倍浓缩后水相体积的无水乙醇沉淀过夜，再依次用无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤，干燥后得除蛋白野西瓜粗多糖；

所述氯仿和正丁醇的混合液中氯仿与正丁醇的体积比为4:1；

四、野西瓜粗多糖除色素及小分子：将步骤三得到的除蛋白野西瓜粗多糖用蒸馏水溶解，配成饱和粗多糖水溶液Ⅱ，然后加入氨水调节pH值至8～9，再加入过氧化氢，调节过氧化氢体积分数为饱和粗多糖水溶液Ⅱ体积的10％，然后置于温度为50～70℃的水浴条件下加热反应1.5h～2.5h，冷却后装入透析袋，先流水透析3天，再用蒸馏水透析1天后取出，然后在转速为3000r/min～4000r/min的条件下离心8min～12min，除去沉淀后将溶液浓缩至原体积的40％～60％，得到脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液；

五、野西瓜多糖醇沉：将无水乙醇加入至步骤四得到的脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液中，沉淀静置过夜，离心分离得到多糖沉淀，然后依次无水乙醇、丙酮和石油醚洗涤多糖沉淀，干燥后，得到醇沉后野西瓜多糖；

步骤五中所述无水乙醇与步骤四得到的脱出色素及小分子的野西瓜粗多糖浓缩液的体积比为10:100；

六、野西瓜多糖精提：采用DEAE-52柱对步骤五得到的醇沉后野西瓜多糖进行层析，然后用4倍柱体积的浓度为0.1mol/L的NaCl溶液作为洗脱剂进行洗脱，NaCl溶液流速为20mL/3min，收集洗脱液先用流水透析3天，再用蒸馏水透析至无Cl^-后冷冻干燥，得到野西瓜多糖，即CSPS；

七、野西瓜多糖的硒化：将步骤六得到的CSPS和Na₂SeO₃溶于0.5％硝酸水溶液中，混匀后得到混合液，然后将装有混合液的三角烧瓶密封置于水浴中，在温度为60～70℃和转速为35r/min～45r/min的条件下反应6.5h～7.5h，反应完成后使其冷却，然后用无水Na₂CO₃调节反应溶液的pH值至5～6，再用离心机在3000r/min～4000r/min的条件下离心8min～12min，将离心后的上清液置于透析袋中，流水透析至游离HSeO₃ ^-去除完全，然后将透析液浓缩至原体积的40％～60％，真空冷冻干燥后得到野西瓜硒多糖，即Se-CSPS；

所述CSPS与Na₂SeO₃的质量比为1∶0.7～0.9；所述混合液中CSPS的浓度为0.008g/mL～0.012g/mL。

2.根据权利要求1所述的一种野西瓜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤一中所述醇沉温度为90℃，醇沉时间为3h。

3.根据权利要求1所述的一种野西瓜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤三②中在温度为60℃的水浴条件下酶解反应2h。

4.根据权利要求1所述的一种野西瓜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤三②中酶解反应后置于沸水中灭活10min。

5.根据权利要求1所述的一种野西瓜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤三②中加入氯仿和正丁醇的混合液，震荡20min，转至分液漏斗中静置30min。

6.根据权利要求1所述的一种野西瓜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤四中置于温度为60℃的水浴条件下加热反应2h。

7.根据权利要求1所述的一种野西瓜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤四中在转速为3500r/min的条件下离心10min。

8.根据权利要求1所述的一种野西瓜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤七中将装有混合液的三角烧瓶密封置于水浴中，在温度为70℃和转速为40r/min的条件下反应7h。

9.根据权利要求1所述的一种野西瓜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤七中所述CSPS与Na₂SeO₃的质量比为1：0.8。

10.根据权利要求1所述的一种野西瓜硒多糖的制备方法，其特征在于步骤七中所述混合液中CSPS的浓度为0.01g/mL。