CN107286267A - 一种海带多糖‑锌配合物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海带多糖‑锌配合物及其制备和应用，所述海带多糖‑锌配合物由纯化后的海带多糖与锌在一定温度、pH条件下反应形成海带多糖‑锌配合物。动物活性实验表明，海带多糖‑锌配合物能提高动物机体的抗氧化能力和免疫调节能力。因而可用于制备免疫调节剂的药物和保健食品中，也可用于制备动物免疫调节剂的药物中。
Description
技术领域
本发明涉及海带多糖-锌配合物及其制备和应用，属于医药领域。
背景技术
海带及藻类多糖具有增强免疫、抗肿瘤作用。海洋蕴含着80%以上的生物种类，是生物多样性的巨大储存库。海带是一种分布较广、营养价值较高的食用藻类，且我国海带资源丰富。研究表明，海带多糖（ BSP）对正常及免疫低下小鼠免疫功能具有显著影响。BSP经腹腔注射给药后，测定了各组小鼠胸腺、脾指数、外周血白细胞数、脾的T、B细胞增殖能力，脾细胞产生IL- 2能力以及血清和脾细胞溶血素含量等的变化。结果BSP 100mg/（kg·d）×10d能显著提高免疫低下小鼠胸腺、脾指数及外周血白细胞数，还能提高正常小鼠胸腺、脾指数；明显促进正常及免疫低下小鼠脾的T、B细胞增殖能力和脾细胞产生IL-2能力；BSP还能增加正常及免疫低下小鼠血清和脾细胞溶血素的含量。结论：BSP是一种免疫调节剂，对正常及免疫低下小鼠的免疫功能具有促进作用。
锌是正常碳水化合物和脂类代谢所必需的微量元素，三价锌参与糖代谢，是维持动物及人体正常的葡萄糖耐量不可缺少的元素，它除了具有降低血糖的作用外，还具有较强的提高免疫和抗应激作用。通常动物补锌是采用无机锌盐制剂，但却不能达到所期待的效果。
有机配体与金属离子形成螯合物后，其性能将发生较大变化，它不但能更好发挥原有配体和金属离子的功能，并赋予其高生物利用率等特殊性能，可能还具有其他的功能，很多的抗癌药物、抗生素与金属螯合以及多糖铁的合成应用也证明了这一点。鉴于此，如果将海带多糖与金属离子螯合，其性能也必将发生很大的改善。由于多糖有丰富的羟基，是很好的配体，而锌有空3d轨道是很好的中心离子，只要条件合适必将形成稳定的螯合物。本项目拟用海带多糖与锌螯合形成海带多糖-锌螯合物，研究其提高免疫力的效果，为开发新型高效、安全、不良反应小的免疫增强剂奠定基础，为充分开发和利用海带资源提供借鉴。实验表明，海带多糖锌配合物能提高小鼠机体的抗氧化能力和免疫调节能力，因而可用于制备抗氧化、免疫调节剂的药物和保健食品中，也可用于制备动物免疫调节剂的药物中。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种海带多糖-锌配合物及其制备和应用。该海带多糖-锌配合物能提高动物机体的抗氧化能力和免疫调节能力。因而可用于制备免疫调节剂的药物和保健食品中，也可用于制备动物免疫调节剂的药物中。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明所述的海带多糖-锌配合物是将海带粗多糖通过胰蛋白酶-Sevage法脱蛋白进行去蛋白提纯，将提纯后的海带多糖在不同的温度、不同的pH值、不同的反应时间与Zn2+自组装反应获得海带多糖-锌化合物。经红外光谱仪检测，海带多糖与锌配位形成络合物。动物活性实验表明，海带多糖-锌配合物能提高小鼠机体的抗氧化能力和免疫调节能力，因而可用于制备抗氧化、免疫调节剂的药物和保健食品中，也可用于制备动物免疫调节剂的药物中。
本发明所述的海带多糖-锌配合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）海带多糖的纯化；
（2）取10g纯化海带多糖溶于200mL超纯水中，充分搅拌直至海带多糖完全溶解；将海带多糖溶液放入恒温水浴锅中在60℃下不断搅拌，同时缓慢加入0.2mol/L ZnSO4和2mol/LNaOH，维持溶液的pH为8~9；反应中刚加入的ZnSO4生成ZnOH沉淀，随着反应的进行又逐渐溶解，直至沉淀不再减少，停止滴加ZnSO4溶液和NaOH溶液，将反应液置于60℃恒温水浴锅中保温1h，将反应液取出冷却至室温，于高速离心机上3800r／min离心1min，弃去上清液收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，重复三次，置于冷冻干燥机中干燥；
（3）将步骤（2）冷冻干燥后的产品用透析袋透析除盐，离心、冷冻干燥，得纯化后的海带多糖-锌配合物。
步骤（3）中透析袋的截留分子量为3500Da。
步骤（1）具体为：
①取10.00g海带粗多糖溶于100mL水中搅拌混匀，制得海带粗多糖粗液；将海带粗多糖液和0.25%胰蛋白酶液按体积比1:0.4混合，放入恒温水浴锅中37℃水浴加热，5h后加入0.2倍体积的pH=7.0、10wt%H2O2溶液反应12h；然后取反应液6mL，加入2mLsevage试剂，在恒温震荡仪上剧烈震荡20min后，于高速离心机上3800r/min离心1min，溶液分层，取出上层溶液加入2mL Sevage试剂，重复以上步骤直至没有蛋白质出现；
②将定量的无水乙醇缓慢倒入海带多糖滤液中，室温下静置12 h后于高速离心机中以3800r／min的速度离心1min后弃去上清液取沉淀，沉淀依次用95wt%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，重复三次；充分洗涤后滤渣加适量蒸馏水复溶，小心移至透析袋中进行透析，透析完毕后，将海带多糖浓缩液放入冷冻干燥机中干燥，干燥后得到纯化海带多糖。
步骤①所述的sevage试剂为体积比为4:1的氯仿-正丁醇混合液。
步骤②所述的透析袋的截留分子量为8000-14000Da。
一种如上所述的制备方法制得的海带多糖-锌配合物，Zn的含量为5.3wt%。
将海带多糖-锌配合物的样品与KBr混匀、研磨后压片，用红外光谱分析海带多糖-Zn配合物的配位结构。
对海带多糖-锌配合物的抗氧化能力和免疫调节能力的活性进行试验研究，结果显示海带多糖-锌配合物能显著提高小鼠机体的抗氧化能力和免疫调节能力。
本发明的有益效果在于：
1、海带多糖为天然产物提取物，可药食两用；而锌是机体正常代谢所必需的微量元素，是维持动物及人体正常生理活动的不可缺少的元素，二者形成螯合物后不但能更好发挥原有配体和金属离子的功能，而且其毒性更小、吸收率更高。与现有同类药物相比，无毒副性，无不良反应，可长期使用；
2、可用于制备抗氧化、免疫调节剂的药物和保健食品，也可用于制备动物免疫调节剂药物；
3、原料易得，配合物制备工艺简单（反应温度50～80℃，反应时间1～3小时，pH7～9。），价廉，生产方便，开发价值高。可为开发系列新型高效、安全、不良反应小的抗氧化、免疫调节剂的药物和保健食品及饲料添加剂奠定基础。
附图说明
图1 海带多糖-锌络合物、海带多糖红外吸收光谱；
图2 小鼠脾脏变化对比图；
图3 CAT活力测定结果对比图；
图4 LDH活力测定结果对比图；
图5 SOD活力测定结果对比图；
图6 C3含量测定结果对比图；
图7 C4含量测定结果对比图。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
1海带粗多糖的提纯：胰蛋白酶一Sevage法脱蛋白
（1）取10.00g海带粗多糖溶于100mL水中搅拌混匀，制得海带粗多糖粗液；将海带粗多糖液和0.25%胰蛋白酶液按体积比1:0.4混合，放入恒温水浴锅中37℃水浴加热，5h后加入0.2倍体积的10wt%H2O2溶液（pH=7.0）反应12h，取海带粗多糖溶液6mL加入2mL Sevage试剂（体积比为4:1的氯仿-正丁醇液），在恒温震荡仪上剧烈震荡20min后于高速离心机上3800r/min离心1min，溶液分层，取出上层溶液加入2mL Sevage试剂，重复以上步骤直至没有蛋白质出现；
（2）将定量的无水乙醇缓慢倒入海带多糖滤液中，室温下静置12 h后于高速离心机中以3800r/min的速度离心1min后弃去上清液取沉淀，沉淀依次用95wt%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，重复三次；充分洗涤后滤渣加适量蒸馏水复溶，小心移至透析袋中进行透析，样品液与透析液(超纯水)体积比为l:20，透析48h（期间不断换水）。透析完毕后，将海带多糖浓缩液放入冷冻干燥机中干燥，干燥后样品密封保存于干燥器。
多糖纯度分析:将海带粗多糖、纯化后的海带多糖用蒸馏水配成一定浓度的溶液，用蒸馏水作为空白对照组，用紫外分光光度计在190-400nm波长处进行光谱扫描，查看是否有特征吸收峰出现。若纯化后的多糖在280nm处无吸收峰，说明已无蛋白质和核酸。
2海带多糖与Zn2+配合
（1）取10g海带多糖溶于200mL超纯水中，充分搅拌直至海带多糖完全溶解。将海带多糖液放入恒温水浴锅中在60℃恒温水浴下不断搅拌，同时缓慢加入0.2mol/L ZnSO4（aq）和2mol/L NaOH（aq），维持溶液的pH为8～9；反应中刚加入的ZnSO4（aq）生成ZnOH沉淀，在反应过程又逐渐溶解，直至沉淀不再减少，停止滴加ZnSO4（aq）和NaOH（aq），将反应液置于60℃恒温水浴锅中保温1h。将反应液取出冷却至室温，于高速离心机上3800r/min离心1min，弃去上清液收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，重复三次，置于冷冻干燥机中干燥。
（2）得到的海带多糖锌络合物粗品放入用一定浓度的EDTA溶液处理过透析袋中，将透析袋放入超纯水中匀速搅拌24h（期间不断换水）除盐。
（3）当海带多糖锌络合物粗品除盐完毕后取出，于高速离心机上3800r/min离心1min，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮依次洗涤，重复三次，置于冷冻干燥机中至干燥无水分，即得到海带多糖-锌络合物。
3海带多糖锌配合物红外光谱分析
将无水干燥的样品与KBr混匀、研磨后压片，用红外光谱仪分析海带多糖、以及海带多糖—Cr配合物的结构差异。结果如图1。
由图1可以看出海带多糖-锌配合物在波长3400cm-1左右有羟基伸缩振动(νO-H)，而且其羟基伸缩振动的氢键缔合峰强度比相应海带多糖的吸收峰有明显减弱，而且波长发生红移(从 3405cm-1到 3450cm-1 )，这是由于二价锌离子与羟基氧原子形成配位键，导致羟基的分子间和分子内氢键能力减弱。并且海带多糖锌络合物的红外吸收峰相比于海带多糖，骨架特征峰没有发生太大变化。糖醛酸中COOH伸缩振动的特征峰为1400-1的吸收峰，海带多糖-Zn配合物和海带多糖的两条谱线在1400-1的吸收峰发生了某些变化，说明糖醛酸中COOH发生变化，与二价锌离子发生配位反应。
4海带多糖Zn配合物的免疫调节活性
4.1动物分组及处理
（1）小鼠分组及处理：小鼠分为六组，每组十只。其分别是生理盐水组、海带多糖组、无机锌组、海带多糖-Zn配合物高剂量组、海带多糖-Zn配合物中剂量组、海带多糖-Zn配合物低剂量组。海带多糖组、无机锌组、海带多糖—Zn配合物高剂量组、海带多糖—Zn配合物中剂量组、海带多糖—Zn配合物低剂量组分别给药剂量为200mg/kg,、10mg/kg,、400mg/kg、300mg/kg、400mg/kg。灌胃0.2mL/d，连续10天。
（2）摘除眼球采血：用手指固定住小鼠，轻轻挤压眼部使眼球充血突出，用镊子夹取眼球，使血液流出，滴入离心管中，取血完毕后，脱臼处死。
（3）放置血液于室温下两小时后于高速离心机上3500r／min离心15分钟分离血清冻存备用。
4.2免疫活性指标的测定
将试剂盒各组分从盒中取出，按照试剂盒说明书上方法对小鼠的过氧化氢酶（CAT）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、补体C3、补体C4进行测定。
4.3免疫器官脾脏指数，见图2；
4.4过氧化氢酶（CAT）活力
由图3可知：海带多糖锌络合物高剂量、中剂量组有明显提高过氧化氢酶的活力，这一实验说明高剂量的海带多糖锌络合物可以有效的提高小鼠内的过氧化氢酶（CAT）的活力。
4.5乳酸脱氢酶（LDH）活性
由图4可知：海带多糖-锌高剂量组、中剂量组LDH活性均比空白组、海带多糖组、无机锌组高。实验结果表明海带多糖的锌配合物的溶液对小鼠发育均有较海带多糖更好的作用，并间接证明了不是Zn2+直接提高了乳酸脱氢酶（LDH）的活性，而是海带多糖与Zn2+产生络合作用的结果。
4.6超氧化物歧化酶（SOD）含量
由图5可知：海带多糖-锌高剂量组、海带多糖-锌中剂量组SOD含量均比空白组、海带多糖组、无机锌组高。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)在保护细胞免受氧自由基的毒害中发挥着重要作用。在超氧化物歧化酶（SOD）含量测定实验中，通过对比可知：海带多糖-锌各剂量组均含有比空白组、多糖组、无机锌组较高的SOD含量。说明各剂量的海带多糖-锌配合物均可以有效提高小鼠体内超氧化物歧化酶（SOD）含量。
4.7补体C3、补体C4含量测定
由图6、图7可知：海带多糖-Zn各剂量组补体C3、C4含量均比空白组、海带多糖组、无机锌组低。
5结论
海带多糖与Zn2+在碱性条件下络合成海带多糖-Zn配合物，采用红外光谱法分析产品配位结构；通过试剂盒来检测小鼠血清中的过氧化氢酶（CAT）活性、乳酸脱氢酶（LDH）活性、补体C3、C4、超氧化物歧化酶（SOD）活性，讨论海带多糖-Zn配合物免疫调节活性。结果表明，多糖-锌配合物在海带多糖与七水硫酸锌采用1:1的质量比，在反应温度60℃、pH=9条件下合成效果较佳。免疫调节活性实验发现，给药海带多糖-Zn配合物的实验组能提高小鼠体内CAT、LDH与SOD酶活力，降低C3、C4含量，说明适量的海带多糖-Zn配合物能提高小鼠机体的抗氧化能力和非特异性免疫。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种海带多糖-锌配合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）海带多糖的纯化；
（2）取10g纯化海带多糖溶于200mL超纯水中，充分搅拌直至海带多糖完全溶解；将海带多糖溶液放入恒温水浴锅中在60℃下不断搅拌，同时缓慢加入0.2mol/L ZnSO4和2mol/LNaOH，维持溶液的pH为8~9；反应中刚加入的ZnSO4生成ZnOH沉淀，随着反应的进行又逐渐溶解，直至沉淀不再减少，停止滴加ZnSO4溶液和NaOH溶液，将反应液置于60℃恒温水浴锅中保温1h，将反应液取出冷却至室温，于高速离心机上3800r／min离心1min，弃去上清液收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，重复三次，置于冷冻干燥机中干燥；
（3）将步骤（2）冷冻干燥后的产品用透析袋透析除盐，离心、冷冻干燥，得纯化后的海带多糖-锌配合物。
2.根据权利要求1所述的海带多糖-锌配合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中透析袋的截留分子量为3500Da。
3.根据权利要求1所述的海带多糖-锌配合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）具体为：
①取10.00g海带粗多糖溶于100mL水中搅拌混匀，制得海带粗多糖粗液；将海带粗多糖液和0.25%胰蛋白酶液按体积比1:0.4混合，放入恒温水浴锅中37℃水浴加热，5h后加入0.2倍体积的pH=7.0、10wt%H2O2溶液反应12h；然后取反应液6mL，加入2mLsevage试剂，在恒温震荡仪上剧烈震荡20min后，于高速离心机上3800r/min离心1min，溶液分层，取出上层溶液加入2mL Sevage试剂，重复以上步骤直至没有蛋白质出现；
②将定量的无水乙醇缓慢倒入海带多糖滤液中，室温下静置12 h后于高速离心机中以3800r／min的速度离心1min后弃去上清液取沉淀，沉淀依次用95wt%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，重复三次；充分洗涤后滤渣加适量蒸馏水复溶，小心移至透析袋中进行透析，透析完毕后，将海带多糖浓缩液放入冷冻干燥机中干燥，干燥后得到纯化海带多糖。
4.根据权利要求3所述的海带多糖-锌配合物的制备方法，其特征在于：步骤①所述的sevage试剂为体积比为4:1的氯仿-正丁醇混合液。
5.根据权利要求3所述的海带多糖-锌配合物的制备方法，其特征在于：步骤②所述的透析袋的截留分子量为8000-14000Da。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的海带多糖-锌配合物，其特征在于：所述的配合物中Zn的含量为5.3wt%。
7.根据权利要求6所述的海带多糖-锌配合物在制备免疫调节剂药物和保健食品中的应用。
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