CN110078840A - 一种海蒿子多糖硒及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海蒿子多糖硒及其制备方法与应用。该制备方法主要包括原料预处理、热水提取、脱色、脱蛋白、冷冻干燥和硒化反应;其中,硒化反应是将海蒿子多糖与稀硝酸混合,室温下搅拌,然后分别加入亚硒酸钠和氯化钡,加热至60~80℃,搅拌混匀,于100~500W微波功率下,反应3~5min,得海蒿子多糖硒溶液,冷却到室温后,置于透析袋进行透析,冷冻干燥得海蒿子多糖硒。本发明制备方法简单,反应条件温和,无污染,硒化程度高,具有显著的α‑葡萄糖苷酶抑制活性,其活性优于阿卡波糖,且能显著提高细胞抗氧化酶活性,降低丙二醛的含量,可开发一种具有抗氧化和降血糖功效的膳食补充剂,应用于食品或医药领域。

Description

一种海蒿子多糖硒及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及功能性食品和医药领域,具体涉及一种海蒿子多糖硒及其制备方法与在制备抗氧化和降血糖健康食品和药品中的应用。
背景技术
海蒿子(Sargassum pallidum)习称“大叶海藻”,属于褐藻门马尾藻科,广泛分布于暖温带水域,海蒿子植物形态呈皱缩卷曲,长度范围为30~60cm;圆柱形主干,两侧发出主枝,主枝叶腋处生出侧枝;单叶互生,初生叶和次生叶呈披针形或线形等,固着器呈盘状,黑褐色气囊直径为2~5mm,球形或倒卵形。海蒿子水浸后膨胀,具有粘滑、柔软、味咸等特点。海蒿子在我国的渤海、黄海、东海等区有广泛的分布,生长于低潮线下海水激荡处的岩石上,暗褐色,是典型的海洋褐藻,性味苦咸、寒,入脾、肾、肺。功能主治利水、泄热、疼痛核肿、慢性气管炎等,具有很高的药用价值。对褐、红、蓝、绿海藻的多糖研究表明褐藻多糖具有比较显著的生物活性,开发前景十分广阔。海蒿子富有多种营养成分并含有大量的褐藻多糖,主要由褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉组成。
现有技术中对于海蒿子多糖有一定的研究基础,例如:李湘师等(食品工业科技,2015,36:101-106;海蒿子多糖的提取分离机及其生物活性,硕士论文,2015)研究了海蒿子多糖的不同提取方法、理化性质、分离纯化和生物活性,当海蒿子粗多糖浓度为2mg/mL时,对α-淀粉酶、α-D-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、麦芽糖酶的抑制率依次为85.02%、53.25%、42.96%和49.67%;当500μg/mL浓度时,对HepG2和SiHa细胞的抑制率分别为28.92%,和27.29%。方飞等(安徽农业科学,2011,39(16):9590-9591)报道了海蒿子多糖具有良好的体外羟基自由基(.OH)、超氧阴离子自由基(O2-·)的清除作用及对卵黄蛋白(LPO)的抑制作用。赵宇(海蒿子多糖的提取、分离纯化及结构研究,硕士论文,2004)报道了海蒿子多糖由木糖、岩藻糖、半乳糖、果糖、甘露糖和葡萄糖组成,具有良好的抗白血病及肺癌活性。李俊卿等(天然产物研究与开发,2005,17:564-567)经过热水抽提、乙醇沉淀和DEAE-SephadexA-25柱层析分离,得到两种海蒿子多糖组分DEI和DEII,单糖均为木糖、岩藻糖、半乳糖、果糖、甘露糖、葡萄糖。其中岩藻糖含量最高,对P388肿瘤具有抑制活性。因此,现有技术表明海蒿子多糖具有良好的生物活性,具有开发应用价值,但是现有技术尚未发现海蒿子多糖具有细胞抗氧化酶活性和α-葡萄糖甘酶的抑制活性。
目前现有技术表明硒化改性能够显著提高多糖的生物活性。中国发明专利申请CN200910161061.5公开了一种微波合成硒化多糖的方法,该方法以亚硒酸氢钠和氯化亚砜合成硒化试剂,以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂,沙蒿多糖或蕨麻为原料,微波合成硒化多糖。中国发明专利CN201611189833.2公开了一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法,该方法将黄芪多糖加入到脱水吡啶中,然后滴入氯化亚硒酰和丁二酸,搅拌后加入硝酸钠溶液,在常温下硒化反应12~20h,然后加入硫酸,沉淀离心、透析,再用无水乙醇沉淀离心,真空冷冻,用四氯化碳干燥后得硒化黄芪多糖。中国发明专利CN201210031988.9公开了党参多糖硒化的方法及其应用,该方法将亚硒酸加入到党参多糖的水溶液中,再加入氯化钡,然后在50~70℃下反应4~8小时,冷却,分离纯化得到硒化的党参多糖产物,硒含量为500-5000μg/g,具有显著的抗肿瘤和提高免疫力活性。中国发明专利CN201710418708.2公开了硒化莲藕多糖及其制备方法与应用,该方法采用莲藕多糖与亚硒酸钠进行反应,制备方法简单,产品硒含量高,能够有效抑制脂肪细胞分化,起到有效控脂、降脂作用。但是上述专利或专利申请中硒化技术存在试剂环境污染,反应时间长,产品得率低,副产物多等缺点。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种具有显著的细胞抗氧化酶活性和α-葡萄糖甘酶的抑制活性的海蒿子多糖硒及其制备方法,所得海蒿子多糖硒具有抗氧化和降血糖作用。
本发明另一目的在于提供海蒿子多糖硒在制备具有抗氧化与降血糖功效的膳食补充剂中的应用。
硒是哺乳动物的必需微量元素,是谷胱甘肽过氧化物酶的主要活性成分,具有清除自由基、保护细胞、拮抗毒素、提高人体免疫功能等作用。还有保护骨髓造血功能及潜在的抗癌、抗衰老的多种作用即。目前己知的与缺硒有关的疾病有多种,包括心血管疾病、糖尿病、肝病、甲状腺功能失衡、癌症、免疫系统功能紊乱等。有些疾病特别是危害老年人内分泌代谢性疾病,如糖尿病、前列腺增生症、脑萎缩等均与缺硒有关。机体缺硒时,淋巴细胞的特异性和细胞毒作用会明显降低。而吞噬细胞的活性及抗体的生成也减少。自由基和脂质过氧化物参与了病毒性肝炎的病理过程,使肝脏超微结构发生病理性改变,硒能清除自由基及其脂质过氧化物,加速肝功能改善,达到保肝抗炎的目的。硒与金属有很强的亲和力,它在人体内同金属结合能形成金属-硒-蛋白质复合物,通过这种方式将对人体有毒害的铅、汞、砷、银等元素排出体外。因此,人们把硒元素誉为“天然解毒剂”。但同时,硒又是极毒元素,营养剂量范围小,使用时剂量难以控制。摄入过量的硒可导致体内累积,引发毒性和致畸变性。
硒在自然界中的存在形式分为无机硒和有机硒两种,常见的无机硒有亚硒酸钠和硒酸钠,有机硒包括:硒多糖、硒蛋白、硒核酸等。与无机硒相比,有机硒具有吸收率和生物活性高、毒性低、环境污染小等特点,是目前硒化学研究的一个热点;硒多糖的生物活性普遍高于多糖和硒,更易于为机体吸收和利用。
海蒿子多糖作为海蒿子中的主要功能成分之一,来源广泛,由多种单糖组成,具有较好水溶性和稳定性,可以用于液体、固态、粉末、片剂、冲剂,胶囊,口服液等保健品中,具有较好的市场应用价值。
本发明目的通过以下技术方案实现:
一种海蒿子多糖硒的制备方法,包括以下步骤:
1)原料预处理:将海蒿子原料,干燥,粉碎;以g和mL分别为质量和体积单位,将海蒿子干粉和乙醇按照固液质量体积比1:3~1:6混合,于60~80℃加热回流2~6h,离心分离残留物,重复加热回流和过滤,残留物干燥;
2)多糖提取:以g和mL分别为质量和体积单位,将经预处理的干粉按料液质量体积比为1:10~1:50与水混合,于温度为65~95℃下浸提,浸提时间为1.0~5h,浸提次数为2~5次;离心分离得到海蒿子多糖提取液,减压浓缩到原体积的1/4~1/10,得到海蒿子多糖的浓缩液;
3)脱蛋白:采用Sevag法对海蒿子多糖浓缩液进行脱蛋白处理,多糖浓缩液与Sevag试剂的体积比为3:1~6:1,振荡20~40min,离心后保留上层糖液,重复脱蛋白处理10~20次,并去除残留的Sevag试剂;
4)脱色:将脱蛋白后的海蒿子多糖,加入大孔树脂,进行静态脱色处理;浓缩液与大孔树脂的体积比为1:1~5:1,温度为30~45℃,时间为8~12h,用滤纸过滤后得到脱色后的多糖滤液;
5)醇沉:将步骤4)中浓缩液加入无水乙醇,调节乙醇的最终体积浓度为60~85%,在0~5℃中静置12~24h,离心得到沉淀,收集沉淀,冷冻干燥后得到海蒿子多糖样品;
6)硒化反应:以g和mL分别为质量和体积单位,将海蒿子多糖按料液质量体积比10:1~50:1与稀硝酸混合,室温下搅拌30~60min,使其充分溶解,然后分别加入亚硒酸钠和氯化钡,加热至60~80℃,搅拌混匀,于100~500W微波功率下,反应3~5min,间歇重复反应10~25次,得海蒿子多糖硒溶液,冷却到室温后,用氢氧化钠溶液调节pH至7~10,再加入硫酸钠除去钡离子,离心得上清液,置于透析袋进行透析,收集透析袋内的溶液,冷冻干燥得海蒿子多糖硒。
为进一步实现本发明目的,优选地,海蒿子原料干燥为鼓风干燥,干燥温度低于65℃;所述重复加热回流和过滤的次数为2~4次;所述残留物干燥的温度为45~65℃,时间为24~48h。
优选地,步骤1),步骤2)和步骤5)的离心分离的离心力4000~8000g,离心时间10~20min;所述步骤6)中离心力为4000~10000g,离心时间2~5min。
优选地,Sevag试剂的氯仿和正丁醇体积比为3:1~6:1;所述的大孔树脂为AB-8、大孔树脂D101。
优选地,步骤6)中,所述的亚硒酸钠和氯化钡与海蒿子多糖质量比分别为1:1~3:1和1:1~4:1;所述稀硝酸的为体积分数为0.3%~0.8%的硝酸溶液;所述氢氧化钠溶液的质量分数为0.1%~1.0%;所述硫酸钠的添加量是氯化钡质量的2~3倍。
优选地,步骤6)中,所述浓缩透析是用截留分子量为1000~5000Da的透析袋透析,透析时间为24~48h,透析的温度为0~5℃。
一种海蒿子多糖硒,由上述方法制备;所述海蒿子多糖硒具有显著的α-葡萄糖甘酶抑制活性,优于阿卡波糖,并能提高细胞抗氧化能力,减轻氧化应激。
所述的海蒿子多糖硒在具有抗氧化与降血糖功效的健康食品和药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下效果和优点:
(1)本发明首次制备了海蒿子多糖硒,具有较理想的α-葡萄糖甘酶抑制活性,并且具有显著的细胞抗氧化酶活性,其α-葡萄糖甘酶抑制率提高40%-75%,已经明显优于降血糖药物阿卡波糖,可开发一种降血糖剂,用于预防和治疗2型糖尿病。
(2)本发明采用间歇式微波加热技术制备海蒿子多糖硒,反应时间短,硒化程度高,硒含量为2500-5000mg/kg,制备方法简单,所采用硒化试剂绿色环保,对环境无污染,可应用于产业化生产中。
(3)本发明通过对海蒿子多糖提取以及纯化步骤进行选择和调整,使得制备的海蒿子多糖纯度高,不含蛋白质和核酸等杂质。
附图说明
图1为实施例1海蒿子多糖的单糖组成离子色谱图。
图2为实施例1海蒿子多糖的红外光谱图。
图3为实施例1海蒿子多糖硒的红外光谱图。
图4为实施例1海蒿子多糖和海蒿子多糖硒对细胞内SOD活性的影响。
图5为实施例1海蒿子多糖和海蒿子多糖硒对细胞内GSH活性的影响。
图6为实施例1海蒿子多糖和海蒿子多糖硒对细胞内MDA含量的影响。
图7为实施例1海蒿子多糖硒对α-葡萄糖苷酶抑制作用。
具体实施方式
为更好地理解本发明,下面结合实施例对本发明做进一步的说明,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1)将干燥的海蒿子粉,以g和mL分别为质量和体积单位,按海蒿子粉与95%乙醇的质量体积比为1:3,加入95%乙醇,于温度60℃下,加热回流为2h,于4000g离心力下,离心20min,分离得残留物,残留物重复上述操作2次,在45℃下干燥24h;
2)以g和mL分别为质量和体积单位,将经预处理的干粉按料液质量体积比为1:20与水混合,于温度为65℃下浸提,浸提时间为2h,浸提次数为2次;离心分离,合并提取液,50℃下减压浓缩到原体积的1/4,得到海蒿子多糖的浓缩液;
3)向浓缩液中加入Sevag试剂,浓缩液与Sevag试剂(氯仿与正丁醇体积比为3:1)的体积比为3:1,振荡20min,离心除去变性的蛋白质,重复脱蛋白10次,收集上层糖液,蒸发去除残留Sevag试剂;
4)将脱蛋白后的海蒿子多糖,加入大孔树脂,进行静态脱色处理;浓缩液与大孔树脂的体积比为1:1,温度为30℃,时间为12h,用滤纸过滤后得到脱色后的多糖滤液;
5)将步骤4)所得浓缩液加入无水乙醇,调节乙醇的最终体积浓度为75%,在0~5℃中静置12h,离心得到多糖沉淀,收集沉淀,冷冻干燥后得到海蒿子多糖样品;
6)以g和mL分别为质量和体积单位,按料液质量体积比10:1,将海蒿子多糖与0.6%稀硝酸进行混合,室温下搅拌6h,使其充分溶解,然后加入亚硒酸钠和氯化钡,亚硒酸钠和氯化钡的添加量,分别是海蒿子多糖用量的2倍和4倍,加热至65℃,于100W微波功率下反应5min,间歇式重复反应10次,得海蒿子多糖硒混合液,冷却到室温后,用0.1%氢氧化钠溶液调节pH至7,加入2倍氯化钡质量的硫酸钠除去钡离子,离心得上清液,置于3000Da透析袋进行透析36h,收集透析袋内的溶液,冷冻干燥制得海蒿子多糖硒。
实施例2
1)将干燥的海蒿子粉,以g和mL分别为质量和体积单位,按海蒿子粉与95%乙醇的质量体积比为1:5,加入95%乙醇,于温度70℃下,加热回流为4h,于4000g离心力下,离心20min,分离得残留物,残留物重复上述操作2次,在45℃下干燥24h;
2)以g和mL分别为质量和体积单位,将经预处理的干粉按料液质量体积比为1:50与水混合,于温度为85℃下浸提,浸提时间为1h,浸提次数为3次;离心分离,合并提取液,50℃下减压浓缩到原体积的1/10,得到海蒿子多糖的浓缩液;
3)向浓缩液中加入Sevag试剂,浓缩液与Sevag试剂(氯仿:正丁醇=3:1)的体积比为4:1,振荡30min,离心除去变性的蛋白质,重复脱蛋白10次,收集上层糖液,蒸发去除残留Sevag试剂;
4)将脱蛋白后的海蒿子多糖,加入大孔树脂,进行静态脱色处理;浓缩液与大孔树脂的体积比为5:1,温度为45℃,时间为8h,用滤纸过滤后得到脱色后的多糖滤液;
5)将步骤4)中浓缩液加入无水乙醇,调节乙醇的最终体积浓度为60%,在0~5℃中静置12h,离心得到多糖沉淀,冷冻干燥后得到海蒿子多糖样品;
6)按料液质量体积比20:1,将海蒿子多糖与0.3%稀硝酸进行混合,室温下搅拌6h,使其充分溶解,然后加入亚硒酸钠和氯化钡,亚硒酸钠和氯化钡的添加量,分别是海蒿子多糖用量的3倍和2倍,加热至50℃,于500W微波功率下反应3min,间歇式重复反应20次,得海蒿子多糖硒混合液,冷却到室温后,用1.0%的氢氧化钠溶液调节pH至8,加入2倍氯化钡质量的硫酸钠除去钡离子,离心得上清液,置于5000Da透析袋进行透析24h,收集透析袋内的溶液,冷冻干燥得海蒿子多糖硒。
实施例3
1)将干燥的海蒿子粉,以g和mL分别为质量和体积单位,按海蒿子粉与95%乙醇的质量体积比为1:5,加入95%乙醇,于温度70℃下,加热回流为4h,于4000g离心力下,离心20min,分离得残留物,残留物重复上述操作2次,在45℃下干燥24h;
2)以g和mL分别为质量和体积单位,将经预处理的干粉按料液质量体积比为1:40与水混合,于温度为75℃下浸提,浸提时间为1h,浸提次数为2次;离心分离,合并提取液,50℃下减压浓缩到原体积的1/8,得到海蒿子多糖的浓缩液;
3)向浓缩液中加入Sevag试剂,浓缩液与Sevag试剂(氯仿:正丁醇=3:1)的体积比为5:1,振荡20min,离心除去变性的蛋白质,重复脱蛋白15次,收集上层糖液,蒸发去除残留Sevag试剂;
4)将脱蛋白后的海蒿子多糖,加入大孔树脂,进行静态脱色处理;浓缩液与大孔树脂的体积比为4:1,温度为37℃,时间为10h,用滤纸过滤后得到脱色后的多糖滤液;
5)将步骤4)中浓缩液加入无水乙醇,调节乙醇的最终体积浓度为80%,在0~5℃中静置12h,离心得到多糖沉淀,冷冻干燥后得到海蒿子多糖样品;
6)按料液质量体积比15:1,将海蒿子多糖与0.8%稀硝酸进行混合,室温下搅拌6h,使其充分溶解,然后加入亚硒酸钠和氯化钡,亚硒酸钠和氯化钡的添加量,分别是海蒿子多糖用量的2倍和3倍,加热至60℃,于300W微波功率下反应4min,间歇式重复反应15次,得海蒿子多糖硒混合液,冷却到室温后,用0.5%的氢氧化钠溶液调节pH至7,加入1.5倍氯化钡质量的硫酸钠除去钡离子,离心得上清液,置于1000Da透析袋进行透析48h,收集透析袋内的溶液,冷冻干燥得海蒿子多糖硒。
按以上实施例1制得的海蒿子多糖硒通过以下方法进行结构鉴定和活性分析,实施例2和3的结果与实施例1相似。
实施例4:多糖的单糖组成分析
实验方法:称取5mg实施例1中制备的海蒿子多糖硒于安培瓶中,加入4mL的三氟乙酸(2M),酒精喷灯封口密封,置于105℃下水解6h,50℃条件下减压蒸干,并加入4mL的甲醇重复操作3次,保证完全去除过量的三氟乙酸,然后将残留物超声溶解,用5mL容量瓶定容,过0.22μm尼龙滤膜进行色谱分析。离子色谱检测条件为:采用离子色谱仪(ICS3000,美国戴安公司)进行检测,使用CarboPac PA20分析柱(3×150mm),检测器为安培电化学检测器;柱温:30℃;流速:0.5mL/min;进样量:20μL流动相:10%20mM NaOH和90%超纯水(0-16min),10%20mM NaOH,20%500mM CH3COONa和70%超纯水。根据标准品的保留时间,可以确定多糖样品中的单糖组成,并根据各单糖的峰面积及单糖的摩尔质量计算出样品单糖的摩尔百分比。
图1为海蒿子多糖的离子交换色谱可知,该海蒿子多糖主要由岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖糖醛酸和半乳糖醛酸组成,摩尔百分比含量分别为30.14%、18.00%、26.90%、9.24%、4.84%、1.10%、7.66%和2.16%,表明该多糖是一种酸性杂多糖。
实施例5:海蒿子多糖硒中硒含量测定
实验方法:精确称取0.1g(精确至0.001g)实施例1中制备的海蒿子多糖硒,在10mL的烧瓶中溶解,之后取其中1mL。置于150mL消化杯中,加入12mL混合酸溶液,浓硝酸与高氯酸的体积比为5:1,盖上表面皿冷消化过夜。次日于电热板上140-150℃加热消解,当溶液变为清亮无色并伴有浓白烟产生时,再继续加热至烧杯内剩余体积为1-2mL左右,切不可蒸干。冷却后,加入10mL超纯水继续加热赶酸至剩余体积为1-2mL,此步骤重复两次赶酸彻底。后转移至50mL容量瓶中,超纯水定容,备用。采用AFS-9130系列原子荧光光度计(AFS)进行测定。
采用硒标准溶液绘制标准曲线,测得实施例1中海蒿子多糖硒的硒含量为2500mg/kg,而海蒿子多糖中未检测到硒。
实施例6:红外光谱分析
实验方法:称取2mg实施例1中制备的海蒿子多糖硒与200mg干燥的KBr粉末混合均匀,在玛瑙研钵中研磨均匀后取少量混合物压片,制成约1mm厚的透明薄片。把压成的薄片放入傅里叶红外变换光谱仪(Vector 33,德国Bruker公司)中,在400-4000cm-1区间进行扫描,采集样品的红外吸收光谱图。其结果如附图2和附图3。
图2是海蒿子多糖的红外光谱图,图3是本实施例制备的样品的红外光谱图。通过对比,实施例1中制备的海蒿子多糖与海蒿子多糖硒的红外谱图很相似,表明它们具有相同的基本骨架。海蒿子多糖在3313cm-1和2930cm-1处吸收峰为O-H和C-H的伸缩振动吸收峰,1036cm-1处特征吸收峰为C-O伸缩振动吸收峰,1605cm-1处吸收峰峰是δ(OH)弯曲振动吸收峰。但是,与海蒿子多糖相比,多糖硒在675cm-1附近出现了一个明显的新的吸收峰,此峰对应的是Se-O-C的特征吸收峰,与此同时某些吸收峰有所减弱,在3479cm-1处吸收宽峰减弱变窄,说明O-H键减少,同时该吸收峰向高波段移动,说明O-H基团与硒发生了配位反应,而在1036cm-1处C-O伸缩振动吸收峰也显著减弱,表明海蒿子多糖与硒成功地发生了螯合反应。
实施例7:细胞抗氧化酶活性
实验方法:选用人肝癌细胞HepG2进行细胞抗氧化活性测定。首先将复苏的HepG2细胞于37℃、5%CO2培养箱中进行培养,每2-3天更换1次培养液,到细胞数长到培养瓶80%左右时进行传代。选用12-40代的处于对数生长期的HepG2细胞,调整细胞浓度为5×105个/mL,接种于6孔细胞培养板中,分别向每孔中添加2mL的细胞悬浮液,将6孔板置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养,24h后吸去培养基,并用2mL的无菌PBS洗涤1次,样品组加入不同浓度的样品溶液,正常组(Normal组)和模型组(Model组)加入相同体积的细胞培养基,继续放在培养箱中孵育2h,再次吸去每个孔中的培养基,并用PBS洗涤6次,然后分别向每孔中加入2mL ABAP溶液(600μM),正常组每孔中加入2mL PBS。于培养箱中孵育1.5h后,弃掉ABAP溶液,并用预冷的PBS冲洗2次,每孔加入150μL的细胞裂解液,冰浴10min,采用细胞刮刀收集细胞悬浮液,于14000g离心力下,离心10min,收集上清液,分装后储存于-80℃冰箱备用。采用BCA法测定细胞裂解液中的蛋白含量,并根据ELISA试剂盒测定步骤测定细胞裂解液的抗氧化酶活性:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px);和丙二醛(MDA)的含量。
通过测定胞内SOD、GSH-Px的活性和MDA含量来评价海蒿子多糖和海蒿子多糖硒的细胞抗氧化能力,结果如附图4,5,6所示。氧化损伤模型组中抗氧化酶活性显著低于空白对照组,其中SOD和GSH-Px的活性分别下降了66.65%和63.41%,而MDA含量提高了87.5%,这表明ABAP诱导氧化损伤HepG2细胞模型造模成功。海蒿子多糖和海蒿子多糖硒能够提高氧化损伤HepG2细胞的胞内SOD和GSH-Px活性,而MDA含量下降,表明二者均能够提高细胞抗氧化能力,但海蒿子多糖硒的抗氧化酶活性比原海蒿子多糖提高了10%-25%。这可能由于硒是机体抗氧化酶的重要组成元素,海蒿子多糖硒以有机硒的形式,被细胞吸收利用,从而参与合成细胞抗氧化酶,提高抗氧化能力。
实施例8:α-葡萄糖甘酶的抑制活性
实验方法:将100μLα-葡萄糖甘酶溶液(0.35U/mL)与50μL样品溶液(0.3125-5mg/mL)混合,涡旋均匀,于37℃条件下孵育10min,然后向混合溶液中加入100μL pPNG溶液(1.5mM)启动反应,混匀后,在37℃条件下孵育20min,最后加入1mL Na2CO3溶液(1M)终止反应,测定405nm波长处吸光度值。α-葡萄糖苷酶的抑制率计算公式如下:
抑制率(%)=[1—(Asample—Acontrol-1)/Acontrol-2]×100
其中,Asample是多糖,酶和pPNG混合液的吸光度值;Acontrol-1是缓冲溶液代替酶溶液后混合物的吸光度;Acontrol-2是缓冲溶液代替样品溶液的吸光度值。阿卡波糖用作阳性对照。
海蒿子多糖和海蒿子多糖硒对α-葡萄糖苷酶的抑制活性,结果如附图7所示。可以看出,海蒿子多糖和海蒿子多糖硒对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用,并且呈剂量依赖型。在多糖低浓度0.3125mg/mL时,阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率都大于海蒿子多糖和海蒿子多糖硒,而当浓度为0.625mg/mL时,抑制率顺序为:海蒿子多糖硒>阿卡波糖。此外,相比海蒿子多糖,海蒿子多糖硒对α-葡萄糖苷酶抑制率提高了40%-75%。
α-淀粉酶和α-葡萄糖甘酶是人体内碳水化合物的两种关键消化酶,α-淀粉酶特异催化水解α-(1,4)-糖苷键,生成寡糖;再通过α-葡萄糖苷酶使寡糖水解生成葡萄糖,进入血液使血糖升高。因此,抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖甘酶活性,能够有效降低碳水化合物的消化速度,降低餐后血糖水平,提高胰岛素的敏感性,用于预防和治疗2型糖尿病。本发明的海蒿子多糖硒是一种理想的α-葡萄糖苷酶抑制剂,其α-葡萄糖苷酶抑制活性强于常见降血糖药物阿卡波糖,由于阿卡波糖不仅价格高昂,而且长期服用会带来胰岛素抵抗和毒副作用,因此,海蒿子多糖硒可开发一种天然安全的降血糖剂,用于预防和治疗2型糖尿病。
实施例9:海蒿子多糖硒口服液的制备
制备过程:将实施例1中制备的海蒿子多糖硒溶于无菌超纯水,配制成5mg/mL的样品溶液,以样品溶液质量计,加入5.0%的蔗糖,3.0%的蜂蜜,0.2%的柠檬酸,0.15%的苯甲酸钠混合均匀后,至溶液澄清无沉淀,罐装于棕色玻璃瓶中,每支10mL,经紫外灭菌处理,即制得海蒿子多糖硒口服液,每日1支,餐后半小时服用。
实施例10:海蒿子多糖硒含片的制备
制备过程:将实施例1中的海蒿子多糖硒、乳糖、甘露糖醇、可溶性淀粉分别经粉碎机粉碎,过80目筛,将海蒿子多糖硒20%、甘露糖醇50%、乳糖15%和淀粉15%混合均匀后,慢慢加入适量蒸馏水,同时不断搅拌,制成软硬适中的软材。以20目筛为造粒工具,把软材紧握成团,压过筛子,使软材变为颗粒状。将湿粒置于60℃干燥箱中干燥3h左右,每隔0.5h翻动1次,以加快干燥速度。颗粒干燥后,再过1次16目筛。然后将1%硬脂酸镁和1%柠檬酸加入整粒混匀后,加盖静置一段时间,用三角形冲模压片机,压片成形;片剂放在紫外线下照射15~20min,然后及时包装。每片质量为1g,一次1片,每日1次。
本发明的实施方式并不受所述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种海蒿子多糖硒的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)原料预处理:将海蒿子原料,干燥,粉碎;以g和mL分别为质量和体积单位,将海蒿子干粉和乙醇按照固液质量体积比1:3~1:6混合,于60~80℃下,加热回流2~6h,离心分离残留物,残留物干燥;
2)多糖提取:以g和mL分别为质量和体积单位,将经预处理的干粉按料液质量体积比为1:10~1:50与水混合,于温度为65~95℃下浸提,浸提时间为1.0~5h,浸提次数为2~5次;离心分离得到海蒿子多糖提取液,减压浓缩到原体积的1/4~1/10,得到海蒿子多糖的浓缩液;
3)脱蛋白:采用Sevag法对海蒿子多糖浓缩液进行脱蛋白处理,离心后保留上层糖液,重复脱蛋白处理10~20次,并旋转蒸发去除残留的Sevag试剂;
4)脱色:将脱蛋白后的海蒿子多糖,加入大孔树脂,进行静态脱色处理;浓缩液与大孔树脂的体积比为1:1~5:1,温度为30~45℃,时间为8~12h,用滤纸过滤后得到脱色后的多糖滤液;
5)醇沉:将步骤4)中浓缩液加入无水乙醇,调节乙醇的最终体积浓度为60~85%,在0~5℃中静置12~24h,离心得到沉淀,收集沉淀,冷冻干燥后得到海蒿子多糖;
6)硒化反应:以g和mL分别为质量和体积单位,将海蒿子多糖按料液质量体积比10:1~50:1与稀硝酸混合,室温下搅拌30~60min,使其充分溶解,然后分别加入亚硒酸钠和氯化钡,加热至60~80℃,搅拌混匀,于100~500W微波功率下,反应3~5min,间歇重复反应10~20次,得海蒿子多糖硒溶液,冷却到室温后,用氢氧化钠溶液调节pH至7~10,再加入硫酸钠除去钡离子,离心得上清液,置于透析袋进行透析,收集透析袋内的溶液,冷冻干燥得海蒿子多糖硒。
2.根据权利要求1所述的海蒿子多糖的制备方法,其特征在于,步骤1)海蒿子原料干燥为鼓风干燥,干燥温度低于65℃;所述加热回流为重复加热回流,次数为2~4次;所述残留物干燥的温度为45~65℃,时间为24~48h。
3.根据权利要求1所述的海蒿子多糖硒的制备方法,其特征在于,所述步骤1),步骤2)和步骤5)的离心分离的离心力4000~8000g,离心时间10~20min;所述步骤6)中离心力为4000~10000g,离心时间2~5min。
4.根据权利要求1所述的海蒿子多糖硒的制备方法,其特征在于,步骤3)所述的Sevag试剂的氯仿和正丁醇体积比为3:1~6:1;所述的脱蛋白处理,每次振荡时间为10~30min。
5.根据权利要求1所述的海蒿子多糖硒的制备方法,其特征在于,步骤6)中,所述的亚硒酸钠和氯化钡的添加量与海蒿子多糖质量比分别为1:1~3:1和1:1~4:1;所述稀硝酸的为体积分数为0.3%~0.8%的硝酸溶液;所述的氢氧化钠溶液的质量分数为0.1%~1.0%;所述硫酸钠的添加量是氯化钡质量的2~3倍。
6.根据权利要求1所述的海蒿子多糖硒的制备方法,其特征在于,步骤6)中,所述浓缩透析是用截留分子量为1000~5000Da的透析袋透析,透析时间为24~48h,透析的温度为0~5℃。
7.根据权利要求1所述的海蒿子多糖硒的制备方法,其特征在于,步骤4)中,所述的大孔树脂为AB-8、大孔树脂D101。
8.根据权利要求1所述的海蒿子多糖硒的制备方法,其特征在于,步骤5)中,所述的海蒿子多糖是一种酸性杂多糖,主要由岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和葡萄糖糖醛酸组成,岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和葡萄糖糖醛酸的摩尔百分比含量分别为20~30%、15~25%、20~30%、5~15%和5~10%。
9.一种海蒿子多糖硒,其特征在于,其由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得。
10.权利要求9所述的海蒿子多糖硒在制备具有抗氧化与降血糖功效的膳食补充剂中的应用。
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