CN104894198A - 一种具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽制备方法。本发明的方法包括对牡蛎进行磨浆和酶解处理。按照本发明方法得到牡蛎活性肽的抗原性较牡蛎蛋白降低70％以上，并能最大程度保留牡蛎自身所含的各类营养物质，并且该牡蛎活性肽中分子量小于1000Da的组分占80％以上，可以作为新的功能性营养成分应用于食品、保健食品和药品的开发与生产。

Description

一种具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽制备方法

技术领域

本发明涉及一种肽的制备方法，尤其涉及一种具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽制备方法，可应用于功能食品和营养保健制品，属生物技术领域。

背景技术

自1975年Hughes等报道从动物组织中发现了具有类吗啡活性的小肽以来，人们已经从动、植物和微生物中分离出多种多样的生物活性肽，并且已经有研究证明，经酶解天然来源蛋白原料后得到的各种生物活性肽类制品不仅更易于人体吸收，而且其特有的结构和性质通常能表现出抗氧化、抗疲劳、降血脂、降血压、增强免疫力等一系列生理功能，对天然来源的蛋白实施酶解制备生物活性肽，还具有原料来源广泛、无毒副作用、可规模化生产、价格便宜等优点。

牡蛎是我国四大经济水产之一，蕴含丰富的蛋白质、多肽、多糖和功能氨基酸等生理活性物质,以及多种人体必需的维生素、矿物质，具有很高的营养价值。近年诸多以牡蛎为原材料进行的活性肽研究屡见报道，然而这些报道中多中存在活性肽产率低，制备过程复杂，以及在制备过程丢失大量牡蛎除了蛋白质以外的其他营养成分等问题。并且同时由于鱼类、甲壳类、贝类、头足类等水产动物普遍存在致敏问题，如何在制备牡蛎活性肽的过程中降低其致敏性，同时能最大程度保留活性肽的生理活性、提高牡蛎活性肽的产率，以及最大程度保留牡蛎自身所含的各类营养物质成为有待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽制备方法，以拓宽牡蛎蛋白的加工和利用途径，同时得到具有保健功效的牡蛎活性肽，并可应用于工业化方法。

本发明还提供了一种具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽，所述牡蛎活性肽通过以上方法制得，该牡蛎活性肽的抗原性较牡蛎蛋白降低70％以上，最大程度保留了牡蛎自身所含的各类营养物质，并且该牡蛎活性肽中分子量小于1000Da的组分占80％以上。

本发明提供的一种具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽制备方法，包括

1)将牡蛎去壳清洗后，加水碾磨成牡蛎浆，去壳牡蛎与水的重量比为1:1-5；

2)在所述牡蛎浆中加入柠檬酸调整pH至5-7，然后进行以下4步酶解：

(1)将该牡蛎浆加热至60℃-90℃，按每克牡蛎加入10-100U的α-淀粉酶酶解2-6小时，将得到的酶解液1加热灭酶；

(2)将酶解液1温度调节至40℃-70℃，按每克牡蛎加入20-80U的糖化酶酶解2-6小时，将得到的酶解液2加热灭酶；

(3)将酶解液2加入NaOH调整pH至6-8，在30℃-60℃条件下，按每克牡蛎加入10-100U的木瓜蛋白酶酶解2-4小时，得到酶解液3；

(4)将酶解液3按每克牡蛎加入10-50U的风味蛋白酶酶解2-4小时，将得到的酶解液4进行加热灭酶，收取酶解液4，经后处理成为所述活性肽。

本发明采用了磨浆处理与酶解相结合的工艺，对牡蛎蛋白进行酶解，最终得到具有生物活性的牡蛎肽，本发明称为“牡蛎活性肽”。可以根据需要对酶解产物实施适当的加工纯化，得到相关形态的牡蛎活性肽产品，例如液态或粉体等。

根据本发明的一个实施方案，还包括以下制备牡蛎活性肽粉的步骤：

1)对所得到的酶解液4进行离心，转速10000-16000r/min，留用离心清液，即牡蛎肽上清液；

2)将上述牡蛎肽上清液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固含量为20-50％，条件为蒸汽压0.1±0.02MPa，温度40-80℃；

3)用板框过滤设备对浓缩后的牡蛎肽上清液进行过滤，条件为压力0.2-0.4MPa，温度30-80℃，制得牡蛎肽透过液；在牡蛎肽透过液中按照固体重量加入0.1％-0.5％的硬脂酰乳酸钠，然后进行均质得到牡蛎肽均质液，并对该均质液实施灭菌；

4)用离心喷雾干燥器将上述牡蛎肽均质液进行干燥处理，条件为进口温度140-160℃，出口温度80-90℃，制成牡蛎活性肽粉。

根据本发明的方法，首先要求对作为原料的牡蛎肉实施磨浆目的是把牡蛎肉的组织充分细化、均匀化，从而提供作为用于酶解制取牡蛎活性肽的原料(酶解底物)。在本申请的方案中，对牡蛎浆不进行分离而直接进行酶解处理，最大程度保留牡蛎的自身所含的各类营养物质。

本发明采用的酶解过程包括了对磨浆处理的料液进行α-淀粉酶、糖化酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的酶解，而所使用的酶制剂均可来自市售产品，并按照其要求的酶解条件实施即可，例如，在所使用酶制剂的适宜的pH环境及酶解温度下控制适当的酶解时间完成所需酶解。在一个具体方案中，可按照每克牡蛎加入10-100U(酶活力单位，U)的α-淀粉酶酶，每克牡蛎加入20-80U的糖化酶，每克牡蛎加入10-100U的木瓜蛋白酶，以及每克牡蛎加入10-50U的风味蛋白酶进行酶解。对所购得的酶制剂的酶活力通过简单换算即可确定具体用量。

对于经过酶解的酶解物料需要实施灭酶，可以通过维持对该物料加热一定时间，实现灭酶。例如，灭酶条件可以为：将酶解物料加热到100-130℃，维持10s-15min。也可以根据所使用的酶制剂以及酶解程度而自行确定适当的灭酶操作，例如，也可以采用高温瞬时灭酶。

在本发明的一个具体实施方式中，所述酶解液加热灭酶的条件是，加热到100℃，灭酶15min。对均质液实施灭菌的条件为超高温瞬时灭菌135℃，10s。

酶解液经灭酶和必要分离浓缩处理，即可成为本发明所需要的牡蛎活性肽产物，可以根据最终产品的要求，经调配成液体产品，或者经干燥成为粉状产品。

本发明提供的是一种工业化生产工艺，所使用的设备均可商购得到，具体规格和型号均按照需要选择配套即可。例如，

对灭酶后的酶解液实施离心分离时，可使用管式离心机或其它可行的设备。然后对离心后的上清液进行蒸发浓缩，制取固含量为20-50％的浓缩液，可使用三效降膜蒸发器，控制蒸汽压0.1±0.02MPa，浓缩温度不高于80℃，例如40-80℃，当然，也可使用其它常用的蒸发设备。

对浓缩后的牡蛎肽上清液可通过膜过滤实现纯化，得到澄清的牡蛎活性肽透过液，可以选择采用的板框过滤设备进行过滤，得到牡蛎肽透过液。

本发明还提供了按照上述方法制备的一种具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽。

本发明还提供了所述的具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽作为产品或原料在保健功能性食品或药剂中的应用。

按照本发明方法得到牡蛎活性肽，通过间接竞争ELISA方法检测的抗原性较牡蛎蛋白降低70％以上，并能最大程度保留牡蛎自身所含的各类营养物质例如糖组分，锌、硒等微量元素的含量，以及牛磺酸的含量也得到很好的保留。采用凯氏定氮法方法检测牡蛎活性肽的蛋白含量达到了50％以上，并且该牡蛎活性肽中分子量小于1000Da的组分占80％以上。本发明的方案最大程度保留了牡蛎自身所含的各类营养物质，获得的牡蛎活性肽可以作为新的功能性营养成分应用于食品、保健食品和药品的开发与生产。

附图说明

图1为4种已知相对分子质量的标准品配成标准溶液的凝胶渗透色谱图。

图2为牡蛎活性肽样品1的凝胶渗透色谱图。

图3为牡蛎活性肽样品2的凝胶渗透色谱图。

图4为牡蛎活性肽样品3的凝胶渗透色谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。

牡蛎活性肽的制备

实施例1

1)将600kg去壳牡蛎搅碎后，加入600kg水，投入胶体磨中碾磨成牡蛎浆；

2)在所述牡蛎浆中加入食品级柠檬酸调整pH至5，然后在20℃条件下搅拌该牡蛎浆1小时；

3)将该牡蛎浆加热至60℃，按每克牡蛎加入50U的α-淀粉酶酶解4小时，将得到的酶解液1加热灭酶；

将酶解液1温度调节至40℃，按每克牡蛎加入20U的糖化酶酶解2小时，将得到的酶解液2加热灭酶；

将酶解液2加入NaOH调整pH至6，在30℃条件下，按每克牡蛎加入30U的木瓜蛋白酶酶解2小时，得到酶解液3；

将酶解液3按每克牡蛎加入30U的风味蛋白酶酶解3小时，将得到的酶解液4进行加热灭酶。

4)用管式离心机对上述灭酶后的酶解液4进行离心处理，转速14000r/min，分离出清液和渣料，留用离心清液，即牡蛎肽上清液；

用三效降膜蒸发器将上述牡蛎肽上清液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固形物含量约为25％停止，浓缩时的蒸汽压0.1MPa，温度45℃；

将上述浓缩后的牡蛎肽上清液用板框过滤设备进行过滤，条件为压力0.2MPa，温度35℃，制得牡蛎活性肽透过液；在牡蛎肽透过液中按照固体重量加入0.1％的硬脂酰乳酸钠，然后进行均质得到牡蛎肽均质液，并对该均质液实施灭菌，条件为超高温瞬时灭菌135℃，10s；

5)用离心喷雾干燥器将该牡蛎活性肽浓缩液进行干燥处理，进口温度160℃，出口温度85℃。收集干燥产物，制得72Kg牡蛎活性肽样品1。

实施例2

1)将600kg去壳牡蛎搅碎后，加入1800kg水，投入胶体磨中碾磨成牡蛎浆；

2)在所述牡蛎浆中加入食品级柠檬酸调整pH至6，然后在30℃条件下搅拌该牡蛎浆3小时；

3)将该牡蛎浆加热至90℃，按每克牡蛎加入60U的α-淀粉酶酶解6小时，将得到的酶解液1加热灭酶；

将酶解液1温度调节至70℃，按每克牡蛎加入80U的糖化酶酶解2小时，将得到的酶解液2加热灭酶；

将酶解液2加入NaOH调整pH至6.5，在60℃条件下，按每克牡蛎加入100U的木瓜蛋白酶酶解2小时，得到酶解液3；

将酶解液3按每克牡蛎加入50U的风味蛋白酶酶解2小时，将得到的酶解液4进行加热灭酶。

4)用管式离心机对上述灭酶后的酶解液4进行离心处理，转速14000r/min，分离出清液和渣料，留用离心清液，即牡蛎肽上清液；

用三效降膜蒸发器将上述牡蛎肽上清液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固形物含量约为40％停止，浓缩时的蒸汽压0.1MPa，温度45℃；

将上述浓缩后的牡蛎肽上清液用板框过滤设备进行过滤，条件为压力0.2MPa，温度35℃，制得牡蛎活性肽透过液；在牡蛎肽透过液中按照固体重量加入0.3％的硬脂酰乳酸钠，然后进行均质得到牡蛎肽均质液，并对该均质液实施灭菌，条件为超高温瞬时灭菌135℃，10s；

5)用离心喷雾干燥器将该牡蛎活性肽浓缩液进行干燥处理，进口温度140℃，出口温度85℃。收集干燥产物，制得60Kg牡蛎活性肽样品2。

实施例3

1)将600kg去壳牡蛎搅碎后，加入3000kg水，投入胶体磨中碾磨成牡蛎浆；

2)在所述牡蛎浆中加入食品级柠檬酸调整pH至7，然后在50℃条件下搅拌该牡蛎浆5小时；

3)将该牡蛎浆加热至70℃，按每克牡蛎加入20U的α-淀粉酶酶解6小时，将得到的酶解液1加热灭酶；

将酶解液1温度调节至50℃，按每克牡蛎加入50U的糖化酶酶解4小时，将得到的酶解液2加热灭酶；

将酶解液2加入NaOH调整pH至6-8，在45℃条件下，按每克牡蛎加入60U的木瓜蛋白酶酶解3小时，得到酶解液3；

将酶解液3按每克牡蛎加入30U的风味蛋白酶酶解3小时，将得到的酶解液4进行加热灭酶。

4)用管式离心机对上述灭酶后的酶解液4进行离心处理，转速16000r/min，分离出清液和渣料，留用离心清液，即牡蛎肽上清液；

用三效降膜蒸发器将上述牡蛎肽上清液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固形物含量约为50％停止，浓缩时的蒸汽压0.1MPa，温度45℃；

将上述浓缩后的牡蛎肽上清液用板框过滤设备进行过滤，条件为压力0.2MPa，温度35℃，制得牡蛎活性肽透过液；在牡蛎肽透过液中按照固体重量加入0.5％的硬脂酰乳酸钠，然后进行均质得到牡蛎肽均质液，并对该均质液实施灭菌，条件为超高温瞬时灭菌135℃，10s；

5)用离心喷雾干燥器将该牡蛎活性肽浓缩液进行干燥处理，进口温度155℃，出口温度85℃。收集干燥产物，制得54Kg牡蛎活性肽样品3。

牡蛎活性肽中蛋白质含量测定

采用凯氏定氮法对牡蛎活性肽中蛋白质含量进行测定，参照国标GB/T5009.5进行。

测得的实施例1-3制备的牡蛎活性肽样品1-3中的蛋白质含量分别为57.15％，61.09％，65.33％，均为干基数据。

牡蛎活性肽中各组分相对分子量及分布范围检测

利用GEL-HPLC检测所述牡蛎活性肽样品1-3中各组分的相对分子量及分布范围：

(1)液相色谱条件

色谱柱：TSKgel G2000SWXL 300mm×7.8mm或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和肽的凝胶柱。

流动相：乙腈:水:三氟乙酸，45:55:0.1(体积比)；检测波长：UV220nm；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样体积：10μL

为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数(N)按三肽标准品(乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸)峰计算不低于10000，低聚肽的分配系数(Kd)应在0-1之间。

(2)相对分子量校正曲线制作

四种不同相对分子质量的肽标准品为：细胞色素C(MW12500)，杆菌酶(MW1450)，乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(MW451)，乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(MW189)。

分别用流动相配制成0.1％(W/V)不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为0.2μm-0.5μm聚四氟乙烯过滤膜或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数(lgMW)对保留时间作图得到相对分子质量校正曲线及其方程。

(3)样品的制备

称取肽样品20.0mg于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2μm-0.5μm聚四氟乙烯过滤膜或尼龙过滤膜过滤后，上机进样。

(4)实验数据分析与处理

由4种已知相对分子质量的标准品配成标准溶液后进样，通过凝胶渗透色谱图得出4种标准品的保留时间，见图1。

将牡蛎活性肽样品1-3于GEL-HPLC中进样以后，得到其凝胶色谱图，如图2-4所示。其中横坐标为保留时间，纵坐标为220nm下检测响应值。

将制备的实施例1-3的牡蛎活性肽样品1-3溶液在上述色谱条件下分析，然后用数据处理软件将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即可得到样品的肽的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一化法计算相对分子质量分布范围。如表1所示。

表1

分子量1000Da以下组分中的二肽、三肽的在人体内的吸收利用率极高，具有比游离氨基酸更高的营养价值和生理功能。以最小二肽(Gly-Gly)的分子量132Da和最大三肽(Trp-Trp-Trp)的分子量576Da作为分子量范围界值，用峰面积归一化法计算所述牡蛎活性肽样品的相对分子质量分布范围，

由分子量分布结果可以看出，上述样品中分子量小于1000Da的组分均在80％以上。如果按氨基酸的平均分子量137Da来计算，分子量1000Da以下的组分则多是八肽以下的低聚肽，也包括部分游离氨基酸。其中分子量在132Da-576Da的肽占据了1000Da以下的绝大部分，这部分主要是二肽、三肽和四肽。

牡蛎活性肽样品的致敏性检测

用包被液稀释牡蛎主要过敏原蛋白Crag 1抗原，以100μL/孔的量加入酶标板中，4℃过夜。加封闭液进行封闭，每孔200μL，37℃放置1h。然后，加入100μL PBS稀释的牡蛎活性肽样品溶液和一定量稀释的兔抗Crag 1蛋白多克隆抗体，作为样品孔；不加抗原孔作为无竞争反应体系，即仅添加稀释的兔抗Crag 1蛋白多克隆抗体的孔，作为阴性孔；同时以未经任何处理的牡蛎蛋白PBS溶液和一定量稀释的兔抗Crag 1蛋白多克隆抗体作为对照孔。37℃放置2h。倾去孔内的液体，用250μL/孔清洗液4次洗板，甩干。用封闭液将HRP-羊抗兔IgG稀释，加入100μL/孔，37℃温育1h。用清洗液洗4次，甩干。加新鲜配制的TMB底物溶液100μL/孔,37℃暗处反应10min显示蓝色，加50μL/孔终止液以终止反应，颜色变黄，最后用酶联免疫检测仪双波长测定各孔的吸光值。

间接竞争ELISA中被测物和包被的牡蛎主要过敏原蛋白竞争与抗体结合，因此包被抗原与抗体生成复合物的量与被测物中抗原量成反比，被测物消除的抗原性大小可用抗原抑制率表示。

根据上述方法测得的实施例1-3制备的牡蛎活性肽样品1-3的抗原抑制率分别为77.55％，76.60％，71.87％。

牡蛎活性肽中糖类组分和微量元素的含量测定

1.牡蛎活性肽中糖类组分含量测定

采用滴定法对牡蛎活性肽中糖类组分含量进行测定，总糖含量测定参照国标GB/T 15672-2009进行，还原糖含量参照GB/T 5009.7-2008进行，均为干基数据。结果见下表2。

表2

可以看出，最终的牡蛎活性肽样品1-3中，糖类组分的含量仍然较高，其中只有少部分的糖被降解，相比于去壳牡蛎原料，糖组分在牡蛎活性肽样品1-3中均得到了很好的保留。

2.牡蛎活性肽中锌、硒、牛磺酸含量测定

采用氨基酸分析仪对牡蛎活性肽中牛磺酸含量进行测定。采用原子吸收法对牡蛎活性肽中微量元素含量进行测定，锌含量测定参照国标GB/T5009.14-2003进行，硒含量参照GB/T 5009.93-2010进行。结果见下表3，均为干基数据。

表3

从上表可以看出，相比于牡蛎原料，牡蛎活性肽样品1-3中营养物质例如锌、硒等微量元素的含量，以及牛磺酸的含量均得到极大程度的保留。

Claims (8)

1.一种具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

1)将牡蛎去壳清洗后，加水碾磨成牡蛎浆，去壳牡蛎与水的重量比为1:1-5；

2)在所述牡蛎浆中加入柠檬酸调整pH至5-7，然后进行以下4步酶解：

(1)将该牡蛎浆加热至60℃-90℃，按每克牡蛎加入10-100U的α-淀粉酶酶解2-6小时，将得到的酶解液1加热灭酶；

(2)将酶解液1温度调节至40℃-70℃，按每克牡蛎加入20-80U的糖化酶酶解2-6小时，将得到的酶解液2加热灭酶；

(3)将酶解液2加入NaOH调整pH至6-8，在30℃-60℃条件下，按每克牡蛎加入10-100U的木瓜蛋白酶酶解2-4小时，得到酶解液3；

(4)将酶解液3按每克牡蛎加入10-50U的风味蛋白酶酶解2-4小时，将得到的酶解液4进行加热灭酶，收取酶解液4，经后处理成为所述活性肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下制备牡蛎活性肽粉的步骤：

1)对所得到的酶解液4进行离心，转速10000-16000r/min，留用离心清液，即牡蛎肽上清液；

2)将上述牡蛎肽上清液进行蒸发浓缩，直到浓缩液的固含量为20-50％，条件为蒸汽压0.1±0.02MPa，温度40-80℃；

3)用板框过滤设备对浓缩后的牡蛎肽上清液进行过滤，条件为压力0.2-0.4MPa，温度30-80℃，制得牡蛎肽透过液，在牡蛎肽透过液中按照固体重量加入0.1％-0.5％的硬脂酰乳酸钠，然后进行均质得到牡蛎肽均质液，并对该均质液实施灭菌；

4)用离心喷雾干燥器将上述牡蛎肽均质液进行干燥处理，条件为进口温度140-160℃，出口温度80-90℃，制成牡蛎活性肽粉。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解液加热灭酶的条件是，加热到100℃，灭酶15min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对均质液实施灭菌的条件为超高温瞬时灭菌135℃，10s。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对酶解液4进行离心是采用管式离心机。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对所述牡蛎肽上清液采用三效降膜蒸发器进行蒸发浓缩。

7.一种具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽，根据权利要求1-6任一项所述方法制得，其特征在于，所述牡蛎活性肽的抗原性较牡蛎蛋白降低70％以上，其特征在于分子量小于1000Da的组分占80％以上。

8.权利要求7所述的具有低致敏性的全营养牡蛎活性肽作为产品或原料在保健功能性食品或药剂中的应用。