CN105768112A - 一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食药用菌蛋白肽‑锌螯合物的制备方法，包括：利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食药用菌中的蛋白质；采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶对食药用菌蛋白进行限制性酶解后，制备食药用菌蛋白酶解液；利用无机物醋酸锌或硫酸锌中的锌与食用菌蛋白肽螯合获得食用菌蛋白肽‑锌螯合物。本发明通过碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法可显著提高食用菌蛋白的提取率；通过控制酶解时间可有效控制蛋白的降解程度。多肽‑锌螯合物制备工艺简单。本发明制备的锌‑肽螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和锌，必将成为锌补充剂的首选；本发明为食用菌的应用提供了一条新思路。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种食用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法。
背景技术
锌是人体必需微量元素，是多种酶的成分或酶的激活剂，对机体的生长
发育、组织再生、促进食欲、促进性器官和性机能的正常发育、保护皮肤健康、增强免疫功能等多方面都有重要作用。尽管自然界中锌源十分丰富，但锌在人体内的吸收代谢受种种因素的限制，锌缺乏已成为我国及许多发展中国家的公共卫生问题。已获得卫生部批准的补锌药剂有无机锌和有机锌两大类补锌药剂。早期的无机锌盐有硫酸锌、氯化锌等，这些盐易吸潮、生物吸收率低、口感不适，对胃肠道具有较大的刺激作用，因而逐渐被淘汰；有机锌盐有醋酸锌、葡萄糖酸锌、蛋氨酸锌等。目前的补锌药剂合成复杂，得率低，含锌也较低，伴有轻度恶心，呕吐，便秘等不良反应，且不适宜于糖尿病患者，贫血患者，前列腺肥大患者。而多肽-锌螯合物经现代研究表明，锌可随着人体对氨基酸的吸收而被吸收，生物利用率远好于无机锌，好于其他有机锌，且无毒副作用，有望成为一种新型的补锌制剂。
食药用菌是一大类有大型子实体的高等真菌，俗称蘑菇或蕈，含有人体所
需要的多种营养成分，蛋白质含量非常高，如金针菇的蛋白质含量达20.9%，草菇中蛋白质含量达25.9%，大大超过我们常食的蔬菜和粮食食品，也超过畜禽品的蛋白质含量。同时，其还富含各类氨基酸，如香菇、平菇、银耳等氨基酸总量平均为15.76%（干重），必需氨基酸总量平均为6.43% （干重）。因此，食药用菌中的蛋白水解产生的多肽与普通动植物蛋白相比具有更高 的生物活性和营养价值。
利用生物技术对食药用菌(香菇、黑木耳、平菇、蟹味菇、茶树菇、茯苓、桑黄、草菇、金针菇、杏鲍菇、银耳、竹荪、灵芝、灰树花 和猴头菇等)进行蛋白质资源的深加工，进行生物活性肽的筛选和提取分离，然后利用醋酸锌、硫酸锌等进行螯合，制备多肽-锌螯合物。这种食药用菌生物活性多肽-锌螯合物在不同酸碱条件下稳定性好，能显著提高锌元素的吸收率和利用率，而且还具有抗氧化、抗菌、免疫调节、降血脂和降血糖等活性，有很高的开发价值和应用前景，同时能提高食药用菌的附加值，为食药用菌资源的利用开辟了新的途径，具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种食用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，具有工艺操作简便、安全性高的优点。所制得的锌-肽螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和锌。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）蛋白提取：利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食药用菌蛋白；
（2）酶解：采用蛋白酶对食药用菌蛋白进行有限酶解，制得食药用菌蛋白多肽复合物溶液；
（3）多肽-锌螯合物制备：利用固体高温混合法或者液体螯合法将步骤（2）的食药用菌蛋白多肽复合物溶液制成食药用菌蛋白肽-锌螯合物；
（4）对食药用菌蛋白肽-锌螯合物进行冷冻干燥。
所述食药用菌包括：香菇、黑木耳、平菇、蟹味菇、茶树菇、茯苓、桑黄、草菇、金针菇、杏鲍菇、银耳、竹荪、灵芝、灰树花 和猴头菇等食药用菌中的一种。
步骤（1）中，所述碱溶酸沉法的具体步骤如下：首先将食药用菌进行超微粉碎，将粉碎后的食药用菌与蒸馏水以1 g:20-60 mL的比例混合，利用0.5wt%-2wt%的NaOH或KOH溶液调节pH至9.0-11.0，先超声提取10-50 min，再在50-100 ℃水浴提取60-120 min，提取后过滤，取滤液；滤液为碱提的食药用菌蛋白溶液，用盐酸调节碱提的食用菌蛋白溶液pH至2.5-4.0进行蛋白沉淀，3000-5000 r/min离心5-10 min得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得食药用菌蛋白。
步骤（1）中，所述硫酸铵沉降法的具体步骤如下：首先将食药用菌超微粉碎，将粉碎后的食药用菌与蒸馏水以1 g:20-60mL的比例混合，逐步加入固体硫酸铵使硫酸铵的饱和度达40-60wt%，3000-5000 r/min离心5-10 min得食药用菌蛋白沉淀，利用透析法脱盐后冷冻干燥得食药用菌蛋白。
步骤（2）中，所述有限酶解的具体步骤如下：将食药用菌蛋白溶解在水中使蛋白的质量浓度达1.0-5.0%，调节pH至7.0-11.0，温度保持在40-60 ℃，加入1.0-5.0 wt%的蛋白酶，水解30-90 min，灭酶，得到食用菌蛋白多肽复合物溶液。
步骤（3）中，所述固体高温混合法的具体步骤如下：将食药用菌蛋白多肽复合物溶液冻干制得冻干粉；将醋酸锌粉末或硫酸锌粉末和食药用菌蛋白肽冻干粉按照质量比1:6-5:6混合，300-500℃加热1-3h制得食药用菌蛋白肽-锌螯合物。
步骤（3）中，所述液体螯合法的具体步骤如下：将食药用菌蛋白多肽复合物溶液和0.5-2mol/L醋酸锌溶液或硫酸锌溶液混合，搅拌均匀，调节pH为3.0-9.0，在30-80 ℃条件下持续反应1.0-2.0 h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入离心液3-5倍体积的75-95%（v/v）的乙醇，沉淀静置12-24h，离心去除上清液，获得食药用菌蛋白肽-锌螯合物；其中，醋酸锌溶液或硫酸锌溶液与食药用菌蛋白多肽复合物溶液的体积比为1:6-5:6。
本发明所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶。
一种如上所述的制备方法制得的食药用菌蛋白肽-锌螯合物。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1）本发明采用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食药用菌中的蛋白，提取率高；
2）通过控制食用菌蛋白酶解时间，得到具有高锌螯合活性的生物活性肽；
3）通过与无机物醋酸锌或硫酸锌中的锌进行螯合，制备有机的生物活性肽-锌螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和锌离子；为食药用菌的应用提供了一条新思路，为开发有机锌营养补充剂与功能性食品提供理论依据和技术支持。
具体实施方式
为充分公开本发明的制备方法，以下结合实施实例加以说明。但本发明不限于以下实施例。
实施例1
一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，具体步骤如下：
第一步：将灰树花超微粉碎，将粉碎后的灰树花与蒸馏水以1 g:20 mL的比例混合，利用2wt% NaOH溶液调节pH值至9.0，超声提取10 min，水浴提取60 min，温度60 ℃，提取后用纱布过滤，滤液为碱提的灰树花蛋白溶液，用盐酸调节碱提的灰树花蛋白溶液pH至3.0，进行蛋白沉淀，4000 r/min离心5 min得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得灰树花蛋白，其提取率达79.61%；
第二步：将灰树花蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达3.0%，用NaOH溶液将灰树花蛋白溶液pH调节到8.0，温度保持在50 ℃，加入3.0 %复合蛋白酶，水解60 min，灭酶，得到灰树花蛋白多肽复合物溶液；
第三步：将灰树花蛋白多肽复合物溶液按醋酸锌溶液与多肽复合物溶液体积比为1:6比例与1.0 mol/mL 醋酸锌溶液混合，搅拌均匀，调节pH6.0，在50 ℃条件下持续反应1.0h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入离心液4倍体积的 75%（v/v）的乙醇，沉淀静置12h，离心去除上清液，获得灰树花蛋白肽-锌螯合物；
第四步：将螯合物进行冷冻干燥。
采用EDTA 络合滴定法测定锌螯合率。
在万分之一天平上准确称量产品结晶100 mg于100 mL小烧杯中，加水50 mL，加入6 mol/L盐酸数滴。摇匀后于水浴上加热使之完全溶解，冷却后定容至l00 mL，从中吸取l0mL于三角瓶，平行3份，加入NH3-NH4Cl缓冲液(pHl0) l0 mL，铬黑T指示剂适量，然后用0.0lmol/LNa2EDTA液滴至蓝色；纪录消耗EDTA的毫升数并计算产物含锌量。
锌的螯合率(％)=螯合的锌元素含量／总的锌元素含量×100％
最终测定制备的灰树花蛋白肽-锌螯合物的螯合率为55.17%。
实施例2
一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，具体步骤如下：
第一步：将杏鲍菇超微粉碎，将粉碎后的杏鲍菇与蒸馏水以 1 g:60 mL的比例混合，利用1wt% NaOH调节pH至11.0，超声提取50 min，水浴提取120 min，温度100 ℃，提取后用纱布过滤，滤液为碱提的杏鲍菇蛋白溶液，用盐酸调节碱提的杏鲍菇蛋白溶液pH至3.0进行蛋白沉淀，离心得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得杏鲍菇蛋白，其提取率达83.74%；
第二步：将杏鲍菇蛋白溶解在水中使蛋白质量浓度达3.0%，调节pH至7.0，温度保持在40 ℃，加入3.0%复合蛋白酶，水解60 min，灭酶，得到杏鲍菇蛋白多肽复合物溶液；
第三步：将杏鲍菇蛋白多肽复合物溶液按醋酸锌溶液与多肽复合物溶液体积比为1:2比例与1.0 mol/mL醋酸锌溶液混合，搅拌均匀，调节pH6.0，在70 ℃条件下持续反应1.0 h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入离心液5倍体积的95%（v/v）乙醇，沉淀静置12 h，离心去除上清液，获得杏鲍菇蛋白肽-锌螯合物；
第四步：将螯合物进行冷冻干燥。
采用EDTA 络合滴定法测定锌螯合率。
在万分之一天平上准确称量产品结晶100 mg于100 mL小烧杯中，加水50 mL，加入6 mol/L盐酸数滴。摇匀后于水浴上加热使之完全溶解，冷却后定容至l00 mL，从中吸取l0mL于三角瓶，平行3份，加入NH3-NH4Cl缓冲液(pHl0)l0 mL，铬黑T指示剂适量，然后用0.0lmol/LNa2EDTA液滴至蓝色；纪录消耗EDTA的毫升数并计算产物含锌量。
锌的螯合率(％)=螯合的锌元素含量／总的锌元素含量×100％
最终测定制备的杏鲍菇蛋白肽-锌螯合物的螯合率为61.11%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (9)
1.一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）蛋白提取：利用碱溶酸沉法或硫酸铵沉降法提取食药用菌蛋白；
（2）酶解：采用蛋白酶对食药用菌蛋白进行有限酶解，制得食药用菌蛋白多肽复合物溶液；
（3）多肽-锌螯合物制备：利用固体高温混合法或者液体螯合法将步骤（2）的食药用菌蛋白多肽复合物溶液制成食药用菌蛋白肽-锌螯合物；
（4）对食药用菌蛋白肽-锌螯合物进行冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，其特征在于：所述食药用菌包括：香菇、黑木耳、平菇、蟹味菇、茶树菇、茯苓、桑黄、草菇、金针菇、杏鲍菇、银耳、竹荪、灵芝、灰树花 和猴头菇等食药用菌中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述碱溶酸沉法的具体步骤如下：首先将食药用菌进行超微粉碎，将粉碎后的食药用菌与蒸馏水以1 g:20-60 mL的比例混合，利用0.5wt%-2wt%的NaOH或KOH溶液调节pH至9.0-11.0，先超声提取10-50 min，再在50-100℃水浴提取60-120 min，提取后过滤，取滤液；滤液为碱提的食药用菌蛋白溶液，用盐酸调节碱提的食用菌蛋白溶液pH至2.5-4.0进行蛋白沉淀，3000-5000 r/min离心5-10 min得沉淀蛋白，水洗至中性再次离心，将沉淀冷冻干燥即得食药用菌蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述硫酸铵沉降法的具体步骤如下：首先将食药用菌超微粉碎，将粉碎后的食药用菌与蒸馏水以1 g:20-60mL的比例混合，逐步加入固体硫酸铵使硫酸铵的饱和度达40-60wt%，3000-5000 r/min离心5-10 min得食药用菌蛋白沉淀，利用透析法脱盐后冷冻干燥得食药用菌蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述有限酶解的具体步骤如下：将食药用菌蛋白溶解在水中使蛋白的质量浓度达1.0-5.0%，调节pH至7.0-11.0，温度保持在40-60 ℃，加入1.0-5.0 wt%的蛋白酶，水解30-90 min，灭酶，得到食用菌蛋白多肽复合物溶液。
6.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，其特征在于步骤（3）中，所述固体高温混合法的具体步骤如下：将食药用菌蛋白多肽复合物溶液冻干制得冻干粉；将醋酸锌粉末或硫酸锌粉末和食药用菌蛋白肽冻干粉按照质量比1:6-5:6混合，300-500℃加热1-3h制得食药用菌蛋白肽-锌螯合物。
7.根据权利要求1所述的一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，其特征在于步骤（3）中，所述液体螯合法的具体步骤如下：将食药用菌蛋白多肽复合物溶液和0.5-2mol/L醋酸锌溶液或硫酸锌溶液混合，搅拌均匀，调节pH为3.0-9.0，在30-80 ℃条件下持续反应1.0-2.0 h，反应后冷却，离心分离去除杂质，加入离心液3-5倍体积的75-95%（v/v）的乙醇，沉淀静置12-24h，离心去除上清液，获得食药用菌蛋白肽-锌螯合物；其中，醋酸锌溶液或硫酸锌溶液与食药用菌蛋白多肽复合物溶液的体积比为1:6-5:6。
8.根据权利要求1或5所述的一种食药用菌蛋白肽-锌螯合物的制备方法，其特征在于：所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶或复合蛋白酶。
9.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的食药用菌蛋白肽-锌螯合物。
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