CN102505034B - 一种从玉米蛋白粉中制备活性多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从玉米蛋白粉中制备活性多肽的方法，以玉米蛋白粉为原料，首先进行脱脂处理，然后提取醇溶蛋白，再以醇溶蛋白为底物，利用蛋白酶解方法在优化条件下进行水解，水解产物经一系列分离纯化手段，获得了一类玉米来源的活性肽。本发明的方法涉及生产工艺简单，反应条件温和，对生产设备的要求低，适合工业化大生产。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，涉及一种从玉米蛋白粉中制备活性多肽的方法。
背景技术
生物活性肽指的是蛋白质经过降解得到的具有生物学活性的肽类物质，其分子结构复杂程度不一，可以简单到只有两个氨基酸组成的二肽，也可以是复杂的环形的大分子多肽，多肽具有蛋白质以及组成多肽的氨基酸都不一定具备的特殊的生理功能。而且，很多具有高生物活性的多肽并不一定全部是由必需氨基酸组成的，使得像玉米蛋白粉一样的氨基酸组成并不是十分理想的、必需氨基酸的组成并非十分全面的、通常被认为是非优质蛋白质的一些蛋白质资源的深加工、再利用提供了出路。因此，多肽的利用空间更为开阔，应用价值更高。
目前已经有大量的研究证实，生物活性肽具有多种生物活性功能，例如：调节免疫、降低血液中胆固醇的含量、抑制血栓的形成等等，生物活性肽已经成为了很多药物的天然来源。从食品蛋白或食品原料中提取制备生物活性肽成为生物活性肽制备的发展趋势，具有来源安全可靠、毒副作用小、成本低廉等优点，逐渐成为研究人员研究的热点，倍受青睐。随着经济的发展，人们的生活节奏日益加快，各种“富贵病”频频出现，大多数人正在处于或者曾经处于亚健康的状态，过大的生活压力使人们的生理功能紊乱，仅仅通过食物摄入所需的营养物质已经达不到人体的需要，并且强大的压力导致人体自身合成功能性多肽的能力大大减弱，因此大多数的人开始注重通过摄入外源性的肽来补充人体的正常的需要。
玉米蛋白粉亦称为玉米麸质粉，其含有的主要的化学成分是蛋白质，通常在70%以上。对玉米蛋白粉进行再利用，不但会产生很好的经济效益，而且适应节能减排、构建节约型社会的总体规划。玉米多肽的开发使玉米蛋白粉由不溶变为高度可溶的产品。此外，玉米多肽具有的降低人体疲劳感、清除体内自由基、解酒保肝、降血压等生理活性，使其极具开发前景，可以被广泛地应用于食品及相关领域。
目前，玉活性米多肽的研究总结起来还存在如下问题：（1）大多集中在高得率玉米肽所用蛋白酶的筛选上的研究，且一般均是采用单一酶对玉米蛋白粉进行水解；（2）玉米蛋白粉中残留了部分玉米油脂和大量色素，在生产过程中附着在设备上易发生堵塞；（3）玉米蛋白质构型空间较小、结构紧密，且有较强的疏水性，不利于蛋白酶对其进行水解。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目在于提供一种从玉米蛋白粉中制备活性多肽的方法。利用该方法制备的玉米活性多肽具有较强的抗疲劳作用，同时能提高老年人的学习和记忆能力。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，最终获得了如下技术方案：
一种从玉米蛋白粉中制备活性多肽的方法，包括如下步骤：
（1）取玉米蛋白粉，用12-16倍量的水洗，搅拌，1500rpm离心10min，反复水洗2～3次，收集沉淀，-45℃冷冻干燥玉米蛋白粉，粉碎后过100目筛，加入质量分数8%的NaHCO3溶液，固液比为1：8，放入恒温水浴振荡锅中，40℃振荡20min，5000rpm离心10min，得脱脂玉米蛋白粉；
（2）在脱脂玉米蛋白粉中加入占其重量0.2%的焦亚硫酸钠，再加入体积分数95%的乙醇，使固液比1：10，70～80℃水浴30min后，调节pH值至9.0，加水使乙醇体积分数为60%，萃取30min，3000 rpm离心5 min，取上清液，用质量分数1%氯化钠1：1盐析，静置12 h后，离心，收集沉淀，反复水洗2～3次，-45℃冷冻干燥，得玉米醇溶蛋白粉；
（3）在干燥玉米醇溶蛋白粉中加水使固液比1：12，放入50～60℃恒温水浴振荡锅中，按干燥玉米醇溶蛋白粉重量的4%加入预先在50℃保温的木瓜蛋白酶，维持pH=7，水解80～100min，然后用质量分数10%的NaOH溶液调pH=8，按干燥玉米醇溶蛋白粉重量的7%加入预先在50℃保温的Alcalase蛋白酶，通过滴加0.5M的NaOH溶液维持pH=8，水解240-280min，快速升温至95℃、10～15min，水解液冷却到常温后，调pH=7，15000rpm/min、15min离心，取上清液，得粗制玉米肽液；
（4）粗制玉米肽液经滤纸过滤，再经纸浆过滤，然后依次经过10K、5K和2K超滤膜包，最后将最终滤液在-45℃真空冷冻干燥，得玉米活性多肽。
通过动物试验研究发现，利用上述方法制备的玉米活性多肽在提高衰老小鼠模型的学习和记忆能力方面具有显著的作用。因此，本发明的第二个目的在于提供一种产品新用途，即利用上述方法制备的玉米活性多肽在制备促进学习和记忆能力的保健品或药品中的应用。
与现有技术相比，本发明涉及的从玉米蛋白粉中制备活性多肽的方法具有如下优点和显著的进步：
（1）生产工艺简单，反应条件温和，对生产设备的要求低，适合工业化大生产。
（2）利用该方法制备的玉米活性多肽具有较强的抗疲劳作用，同时能提高老年人的学习和记忆能力。
具体实施方式
以下是本发明制备玉米活性多肽的具体制备例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1 玉米活性多肽的制备
（1）取玉米蛋白粉，经检测，其各种化学成分的含量为：8%水分、71%蛋白质，13%淀粉、6%脂肪、1%纤维、1%灰分。用15倍量的水洗玉米蛋白粉，搅拌，1500rpm离心10min，再用15倍量的水洗，搅拌，反复水洗共3次，收集沉淀，-45℃冷冻干燥玉米蛋白粉，粉碎后过100目筛，加入质量分数8%的NaHCO3溶液，固液比为1：8，放入恒温水浴振荡锅中，40℃振荡20min，5000rpm离心10min，得脱脂玉米蛋白粉；
（2）在脱脂玉米蛋白粉中加入占其重量0.2%的焦亚硫酸钠，再加入体积分数95%的乙醇，使固液比1：10，70℃水浴30min后，用质量分数10%的NaOH溶液调节pH值至9.0，加水使乙醇体积分数为60%，萃取30min，3000 rpm离心5 min，取上清液，用质量分数1%氯化钠1：1盐析，静置12 h后，离心，收集沉淀，用12倍量的水反复水洗2次，-45℃冷冻干燥，得玉米醇溶蛋白粉；
（3）在干燥玉米醇溶蛋白粉中加水使固液比1：12，放入55℃恒温水浴振荡锅中，按干燥玉米醇溶蛋白粉重量的4%加入预先在50℃保温的木瓜蛋白酶，维持pH=7，水解80min，然后用质量分数10%的NaOH溶液调pH=8，按干燥玉米醇溶蛋白粉重量的7%加入预先在50℃保温的Alcalase蛋白酶，酶解反应开始，在此过程中pH为下降，通过滴加0.5M的NaOH溶液维持pH=8，水解250min，快速升温至95℃、15min，使酶灭活，反应终止，水解液冷却到常温后，调pH=7，15000rpm/min、15min离心，取上清液，得粗制玉米肽液；
（4）粗制玉米肽液经滤纸过滤，以除去沉淀物质，再经纸浆过滤，以除去部分的油脂和色素，然后依次经过10K、5K和2K超滤膜包，最后将最终滤液在-45℃真空冷冻干燥，得玉米活性多肽。
实施例2 玉米活性多肽小鼠游泳耐力试验研究
六周龄健康小鼠(体重22g-25g，雌雄各半)购回后适应性喂养l周后，在水深约3Ocm的静水中进行小鼠游泳训练，水温在(25士1)℃，游泳训练3天，剔除不会游泳的小鼠后随机分为以下两组：对照组、试验组，每组15只。在试验期内，每日上午九点灌胃一次（试验组灌胃本发明实施例1制备的玉米活性多肽），连续灌胃15天。
为了保证小鼠完全摄取预定玉米活性多肽，采用灌胃饲喂方法见表1。
表1各组小鼠饲喂方式
| 组别 | 日粮 | 灌胃物 | 灌胃剂量 |
| 对照组 | 基础日粮 | 生理盐水 | 30ml/kg体重 |
| 试验组 | 基础日粮 | 玉米活性肽 | 1.0g/kg体重 |
试验至第16天时，试验组及对照组的小鼠尾部捆绑重量为体重的5%的铅丝，放入水温(25士1)℃、水深约30cm的水槽中游泳，记录小鼠从入水至运动疲劳发生时的游泳时间，小鼠头部没入水面以下10秒不再上浮判定为疲劳。记录疲劳时间，统计结果急见表2。
对小鼠为期15天的灌胃玉米活性多肽后，负重游泳试验证实，与对照组相比，试验组小鼠力竭游泳时间延长了103.3分钟，具有极显著差异 (P＜0.01)，由此可见，本发明制备的玉米活性多肽有优异的抗疲劳作用。
表2 玉米活性多肽对小鼠力竭游泳时间的影响(n=15，X±s)
| 组别 | 样本量 | 平均时间（min） |
| 对照组 | 15 | 59.4±11.3 |
| 试验组 | 15 | 162.7±25.6** |
与对照组比较, *P＜0.05，**P＜0.01。
实施例3 玉米活性多肽促进小鼠记忆试验研究
六周龄健康小鼠(体重22g-25g，雌雄各半)，将试验小鼠随机分成3 组，每组15只，即青年对照组、衰老模型组、活性肽处理组。其中，衰老模型组、活性肽处理组小鼠的颈背部皮下注射生理盐水稀释的0.8% D-半乳糖溶液0.5ml/20g(200mg/kg)，1 次/d，连续6 周，造成衰老模型，青年对照组皮下注射等量生理盐水，活性肽处理组在造模的同时每日上午九点灌胃一次本发明实施例1制备的玉米活性多肽，剂量为1.0g/kg体重，活性多肽以生理盐水稀释，连续6周，青年对照组和衰老模型组灌胃给予等体积生理盐水。
各组小鼠处理6 周后，进行水迷宫试验，迷宫是80cm×50cm×20cm 双层不透明有机玻璃箱，内设起始点、终点平台和四个盲端，平台附近为安全区。试验时迷宫水深12cm，水温保持(25±1)℃，迷宫周围一切空间标志在整个试验过程中保持不变。正式试验前一天，帮助每只小鼠在迷宫中熟悉水环境15min，如小鼠在60s 内未到达平台，可帮助式地将小鼠赶至平台，并使小鼠在平台上停留20s。第2 天开始正式试验。小鼠面向壁在起始点放入水中，记录小鼠放入水中到达终点平台时间(游全程时间)和进入盲端的次数(错误次数)，统计结果见表3。
根据试验结果可以看出，模型组与青年组相比，水迷宫试验游全程时间明显延长，错误次数显著增加；而活性肽处理组小鼠虽未达到青年组的水平，但较模型组这两项成绩均有显著改善，这说明本发明制备的玉米活性多肽能够提高衰老小鼠的学习和记忆能力。
表3 玉米活性多肽对小鼠水迷宫试验成绩的影响(n=15，X±s)
| 组别 | 样本量 | 游全程时间（s） | 错误次数 |
| 青年组 | 15 | 59.21±13.54 | 5.10±1.31 |
| 模型组 | 15 | 130.26±24.67** | 22.41±3.95** |
| 活性肽组 | 15 | 82.62±18.40# | 11.75±2.12## |
与青年组比较, *P＜0.05，**P＜0.01；
与模型组比较, #P＜0.05，##P＜0.01。
Claims (1)
1.玉米活性多肽在制备促进老年人群的学习和记忆能力的保健品或药品中的应用，所述的玉米活性多肽是按照如下步骤从玉米蛋白粉中制备而得：
（1）取玉米蛋白粉，用12-16倍量的水洗，搅拌，1500rpm离心10min，反复水洗2～3次，收集沉淀，-45℃冷冻干燥玉米蛋白粉，粉碎后过100目筛，加入质量分数8%的NaHCO3溶液，固液比为1：8，放入恒温水浴振荡锅中，40℃振荡20min，5000rpm离心10min，得脱脂玉米蛋白粉；
（2）在脱脂玉米蛋白粉中加入占其重量0.2%的焦亚硫酸钠，再加入体积分数95%的乙醇，使固液比1：10，70～80℃水浴30min后，调节pH值至9.0，加水使乙醇体积分数为60%，萃取30min，3000 rpm离心5 min，取上清液，用质量分数1%氯化钠1：1盐析，静置12 h后，离心，收集沉淀，反复水洗2～3次，-45℃冷冻干燥，得玉米醇溶蛋白粉；
（3）在干燥玉米醇溶蛋白粉中加水使固液比1：12，放入50～60℃恒温水浴振荡锅中，按干燥玉米醇溶蛋白粉重量的4%加入预先在50℃保温的木瓜蛋白酶，维持pH=7，水解80～100min，然后用质量分数10%的NaOH溶液调pH=8，按干燥玉米醇溶蛋白粉重量的7%加入预先在50℃保温的Alcalase蛋白酶，通过滴加0.5M的NaOH溶液维持pH=8，水解240-280min，快速升温至95℃、10～15min，水解液冷却到常温后，调pH=7，15000rpm/min、15min离心，取上清液，得粗制玉米肽液；
（4）粗制玉米肽液经滤纸过滤，再经纸浆过滤，然后依次经过10K、5K和2K超滤膜包，最后将最终滤液在-45℃真空冷冻干燥，得玉米活性多肽。
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