CN111041007A - 一种超氧化物歧化酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种超氧化物歧化酶的制备方法，所述方法包括如下步骤：原料预处理，获得待处理原料，其中，所述原料中包含玉米；培养诱导，使原料中的玉米籽粒发芽，获得初处理原料；破碎溶解，将初处理原料破碎处理，然后用磷酸盐缓冲液溶解；色谱分离，将经破碎溶解处理的溶液进行色谱分离，获得SOD酶液。本发明所提供的超氧化物歧化酶制备方法，通过使玉米籽粒发芽，再进行后续溶解、色谱分离的处理，可以显著提高产品中SOD的得率。
Description
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体的，涉及一种超氧化物歧化酶的制备方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase，SOD)，分子量约为3.4万道尔顿，是生物体 内催化氧自由基发生歧化反应的重要酶，可以通过阻断自由基的链反应，达到清除自由基的 目的。据报道，SOD在抗衰老、抗疲劳、抗心血管系统疾病上具有较好的效果，是一个非常 有应用前景的酶制剂，同时也是近期生物化学领域研究的热点
同时，SOD是一种源于生命体的活性物质，广泛分布于动物、植物等生物体内，因此从 动物、植物中提取是目前获得SOD的重要手段。作为世界三大作物之一，玉米中的SOD含量也十分丰富，以玉米为生产原料，可以有效提高SOD产量。
然而目前以玉米为原料制备SOD还存在着工艺复杂、产品得率低等技术问题，影响此 工艺的大规模推广。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种超氧化物歧化酶的制备方法，以解决现有技术中的至少一项 技术问题。
具体的，本发明的第一方面，提供了一种超氧化物歧化酶的制备方法，所述方法包括如 下步骤：
原料预处理，获得待处理原料，其中，所述原料中包含玉米；
培养诱导，使原料中的玉米籽粒发芽，获得初处理原料；
破碎溶解，将初处理原料破碎处理，然后用磷酸盐缓冲液溶解；
色谱分离，将经破碎溶解处理的溶液进行色谱分离，获得SOD酶液。
采用上述技术方案，由于随着玉米籽粒发芽，SOD含量提高，通过使玉米籽粒发芽，再 进行后续溶解、色谱分离的处理，可以显著提高产品中SOD的得率。其中，所述玉米可以选用糯质型玉米和/或甜质型玉米，进一步的，所述玉米可以为华南地区出产。
优选地，所述原料预处理步骤中还包括：
清洗灭菌，采用50-100ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料30-60分钟。
优选地，所述培养诱导步骤为：将待处理原料在25-30℃中浸泡10-20h，在温度25-30℃， 相对湿度10-40RH％的条件下使玉米籽粒发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm。
优选地，所述培养诱导步骤中，还包括步骤：加入辅料，以获得初处理原料，所述初处 理原料中包括发芽的玉米籽粒90-100份，猪血0.5-2份，芦荟0.2-1份，大豆0.2-1份，刺梨0.5-2份。更优选地，所述初处理原料中包括发芽的玉米籽粒97份，猪血1份，芦荟0.5 份，大豆0.5份，刺梨1份。其中，所述猪血可以选自5-10岁的杜洛克猪、成华猪、大白 猪、松辽黑猪中的一种或几种；所述芦荟可以选自库拉索芦荟、上农大叶芦荟、中华芦荟中 的一种或几种；所述大豆可以选自黄大豆、青大豆、黑大豆中的一种或几种；所述刺梨可以 选自贵农一号、贵农二号、贵农七号中的一种或几种。
优选地，所述破碎溶解步骤为：将初处理原料加入pH7.5-8.0的55-65mM磷酸盐缓冲液， 并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的0.5-2.5 倍。在第一级浆料中加入1000-10000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初 处理原料重量的0.05-0.1％。30-40℃下处理30-60min，20-25℃静置1-2小时，过滤。
优选地，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在破碎溶解步骤后，还包括：
去除杂蛋白，将破碎溶解后的溶液加热到50-55℃维持20-30min，5000-6000r/min离心 15-25min，获得上清液。
更优选地，所述去除杂蛋白步骤中，还包括：将获得的上清液中加入硫酸铵至25-35％ 饱和度，充分溶解后，0-4℃冷藏静置3-5h，在0-4℃下，6000-8000r/min离心10-40min，获 得上清液；上清液中加硫酸铵至80-90％饱和度，0-4℃5000-15000rpm离心10-30min，去上 清，用pH7.5-8.0磷酸盐缓冲液溶解沉淀。
优选地，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在破碎溶解步骤后、去除杂蛋白前，还包括： 加入焦亚硫酸钠，加入量为溶液重量的0.02-0.1％。
优选地，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在去除杂蛋白步骤后，还包括：
超滤浓缩，将上一步获得的溶液先经20-30min，6000-8000r/min超滤预处理拦截分子量 大于2000kD的大分子和细胞碎片；然后经20-30min，6000-8000r/min截留分子量8kD的蛋 白分子，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，重复操作，直至浓缩到上样量的3-5％，获得 超滤浓缩液。
更优选地，所述超滤浓缩步骤中，还包括纳滤：将超滤浓缩液经30-60min， 6000-10000r/min的纳滤浓缩，截留分子量在15kD以上，直至浓缩到超滤浓缩液的10-25％。
优选地，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在超滤浓缩步骤前，还包括：
减压浓缩，在20-25℃下减压进行浓缩至原有溶液体积的1/8-1/20。
优选地，所述色谱分离的步骤为：采用阴离子交换层析(φ300*600mm)层析柱，用pH为7.4-7.7的2.4-2.6mM的磷酸缓冲液平衡至少3倍柱体积，采用含0.03-0.05mol/L氯化钠的2.4-2.6mM的磷酸盐缓冲液洗脱，收集270nm-285nm的阴离子柱洗脱样品。
更优选地，所述色谱分离的步骤还包括：将阴离子柱洗脱样品通过分子筛(φ 60*800mm)，收集活性峰部分，得分子筛洗脱样品。
优选地，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在色谱分离步骤后，还包括：
冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为：预冻温度-30℃至-20℃，预冻时间为1-2小时，升 华温度为25-30℃，解析温度为35℃，真空度为0.07-0.10MPa，真空冷冻干燥时间为15-18 小时，获得SOD冻干粉。
优选地，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在冷冻干燥步骤后，还包括脂质体修饰：
所述脂质体修饰包括步骤：
溶解SOD冻干粉，将SOD冻干粉溶解至乙醇、氯仿的混合溶液中，至SOD浓度 15-30mg/mL，得到SOD溶液，所述乙醇、氯仿混合溶液中各成分的比例为：乙醇：氯仿 ＝20:1-50:1；
脂质体混合，在SOD溶液中加入0.2-0.3％(m/V)胆固醇，搅拌30-60min，得到脂质体混合液；
旋转蒸发：在60-65℃，0.1-0.15MPa的条件下旋转蒸发去除脂质体混合液中的溶剂，得 到SOD产品。
更优选地，所述脂质体混合步骤中，还可以加入0.05-0.01％(m/V)乙腈。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本发明所提供的超氧化物歧化酶制备方法，通过使玉米籽粒发芽，再进行后续溶解、 色谱分离的处理，可以显著提高产品中SOD的得率。
2.本发明所提供的超氧化物歧化酶制备方法，通过在原料中加入猪血、芦荟、大豆、刺 梨等成分，可显著提高产品中SOD的得率。
3.本发明所提供的超氧化物歧化酶制备方法，通过在除杂蛋白步骤前加入除氧剂，可 有效减少制备中SOD的损失，提高终产物中SOD的含量。
4.本发明所提供的超氧化物歧化酶制备方法，通过在脂质体修饰步骤中加入适量乙腈， 可以有效提高SOD脂质体的活性包封率。
具体实施方式：
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅 仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术 人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发 明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除 非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或 多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
在本发明的实施例中，所提及的玉米选用糯质型玉米；所述猪血取自5-10岁的大白猪； 所述芦荟选用中华芦荟；所述大豆选用黄大豆；所述刺梨选用贵农一号。但本领域技术人员 应当了解，选用发明内容中所述的其他种类原料也可以达到同样的实验效果。
实验例1
本实验例考察初处理原料中，芦荟、大豆、猪血、刺梨对产物中SOD含量的影响。
其中，芦荟中含有多种黏多糖、脂肪酸、蒽醌类及黄酮类化合物、糖、活性酶等成分； 大豆中含有多种蛋白质、脂肪、维生素等成分；猪血中含有大豆中含有多种蛋白质、维生素 等成分；刺梨中含有SOD、多种蛋白质、维生素等成分。
方案a
将5kg玉米清洗灭菌，采用50ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料30分钟；
将待处理原料在25℃中浸泡12h，在温度30℃，相对湿度20RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，获得初处理原料；
将初处理原料加入pH7.8的60mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的2倍。在第一级浆料中加入50000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.06％。35℃下处理40min，25℃静置1.5小时；
将破碎溶解后的溶液加热到55℃维持20min，5000r/min离心15min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至30％饱和度，充分溶解后，4℃冷藏静置4h，在4℃下，6000r/min离心30min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至90％饱和度，4℃10000rpm离 心15min，去上清，用pH7.8磷酸盐缓冲液溶解沉淀；
将上一步获得的溶液先经20min，6000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分 子和细胞碎片；然后经20min，8000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐 和小分子杂蛋白，重复操作，直至浓缩到上样量的5％，获得待测溶液。
方案b
将5kg玉米清洗灭菌，采用50ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料30分钟；
将待处理原料在25℃中浸泡12h，在温度30℃，相对湿度20RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，加入猪血、芦荟、大豆，获得初处理原料，其中，发 芽的玉米籽粒90份、猪血0.5份，芦荟0.2份，大豆0.2份；
将初处理原料加入pH7.8的60mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的2倍。在第一级浆料中加入50000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.06％。35℃下处理40min，25℃静置1.5小时；
将破碎溶解后的溶液加热到55℃维持20min，5000r/min离心15min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至30％饱和度，充分溶解后，4℃冷藏静置4h，在4℃下，6000r/min离心30min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至90％饱和度，4℃10000rpm离心15min，去上清，用pH7.8磷酸盐缓冲液溶解沉淀；
将上一步获得的溶液先经20min，6000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分 子和细胞碎片；然后经20min，8000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐 和小分子杂蛋白，重复操作，直至浓缩到上样量的5％，获得待测溶液。
方案c
将5kg玉米清洗灭菌，采用50ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料30分钟；
将待处理原料在25℃中浸泡12h，在温度30℃，相对湿度20RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，加入刺梨，获得初处理原料，其中，发芽的玉米籽粒90份、刺梨0.5份；
将初处理原料加入pH7.8的60mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的2倍。在第一级浆料中加入50000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.06％。35℃下处理40min，25℃静置1.5小时；
将破碎溶解后的溶液加热到55℃维持20min，5000r/min离心15min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至30％饱和度，充分溶解后，4℃冷藏静置4h，在4℃下，6000r/min离心30min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至90％饱和度，4℃10000rpm离 心15min，去上清，用pH7.8磷酸盐缓冲液溶解沉淀；
将上一步获得的溶液先经20min，6000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分 子和细胞碎片；然后经20min，8000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐 和小分子杂蛋白，重复操作，直至浓缩到上样量的5％，获得待测溶液。
方案d
将5kg玉米清洗灭菌，采用50ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料30分钟；
将待处理原料在25℃中浸泡12h，在温度30℃，相对湿度20RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，加入猪血、芦荟、大豆、刺梨，获得初处理原料，其 中，发芽的玉米籽粒90份、猪血0.5份，芦荟0.2份，大豆0.2份，刺梨0.5份；
将初处理原料加入pH7.8的60mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的2倍。在第一级浆料中加入50000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.06％。35℃下处理40min，25℃静置1.5小时；
将破碎溶解后的溶液加热到55℃维持20min，5000r/min离心15min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至30％饱和度，充分溶解后，4℃冷藏静置4h，在4℃下，6000r/min离心30min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至90％饱和度，4℃10000rpm离 心15min，去上清，用pH7.8磷酸盐缓冲液溶解沉淀；
将上一步获得的溶液先经20min，6000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分 子和细胞碎片；然后经20min，8000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐 和小分子杂蛋白，重复操作，直至浓缩到上样量的5％，获得待测溶液。
将方案a-d中的待测溶液，通过氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)法测定SOD的 活性，检测结果如表1所示。
表1
| 组别 | SOD活性(U/ml) |
| 方案a | 560 |
| 方案b | 610 |
| 方案c | 562 |
| 方案d | 608 |
根据表1的结果，初处理原料中含有猪血、芦荟、大豆的组别(方案b、d)，在原料破碎溶解后SOD活性最高，且高于对照组(方案a)。这与申请人的预期有偏差，刺梨中所 含的SOD，并没有最终体现在产物的SOD活性中。
实验例2
申请人在实验中意外的发现，将破碎溶解后的溶液加入某种，或某些种化合物，可以提 高产物的SOD活性。
实验中选用的化合物为焦亚硫酸钠、叔丁基对羟基茴香醚、硫代氨基脲、维生素E，加 入量均为溶液重量0.05％。
方案e
将5kg玉米清洗灭菌，采用50ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料30分钟；
将待处理原料在25℃中浸泡12h，在温度30℃，相对湿度20RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，获得初处理原料；
将初处理原料加入pH7.8的60mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的2倍。在第一级浆料中加入50000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.06％。35℃下处理40min，25℃静置1.5小时；
加入待测化合物，加入量为溶液重量的0.05％；
将破碎溶解后的溶液加热到55℃维持20min，5000r/min离心15min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至30％饱和度，充分溶解后，4℃冷藏静置4h，在4℃下，6000r/min离心30min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至90％饱和度，4℃10000rpm离 心15min，去上清，用pH7.8磷酸盐缓冲液溶解沉淀；
将上一步获得的溶液先经20min，6000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分 子和细胞碎片；然后经20min，8000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐 和小分子杂蛋白，重复操作，直至浓缩到上样量的5％，获得待测溶液。
方案f
将5kg玉米清洗灭菌，采用50ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料30分钟；
将待处理原料在25℃中浸泡12h，在温度30℃，相对湿度20RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，加入猪血、芦荟、大豆，获得初处理原料，其中，发 芽的玉米籽粒90份、猪血0.5份，芦荟0.2份，大豆0.2份；
将初处理原料加入pH7.8的60mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的2倍。在第一级浆料中加入50000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.06％。35℃下处理40min，25℃静置1.5小时；
加入待测化合物，加入量为溶液重量的0.05％；
将破碎溶解后的溶液加热到55℃维持20min，5000r/min离心15min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至30％饱和度，充分溶解后，4℃冷藏静置4h，在4℃下，6000r/min离心30min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至90％饱和度，4℃10000rpm离 心15min，去上清，用pH7.8磷酸盐缓冲液溶解沉淀；
将上一步获得的溶液先经20min，6000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分 子和细胞碎片；然后经20min，8000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐 和小分子杂蛋白，重复操作，直至浓缩到上样量的5％，获得待测溶液。
方案g
将5kg玉米清洗灭菌，采用50ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料30分钟；
将待处理原料在25℃中浸泡12h，在温度30℃，相对湿度20RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，加入刺梨，获得初处理原料，其中，发芽的玉米籽粒90份、刺梨0.5份；
将初处理原料加入pH7.8的60mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的2倍。在第一级浆料中加入50000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.06％。35℃下处理40min，25℃静置1.5小时；
加入待测化合物，加入量为溶液重量的0.05％；
将破碎溶解后的溶液加热到55℃维持20min，5000r/min离心15min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至30％饱和度，充分溶解后，4℃冷藏静置4h，在4℃下，6000r/min离心30min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至90％饱和度，4℃10000rpm离 心15min，去上清，用pH7.8磷酸盐缓冲液溶解沉淀；
将上一步获得的溶液先经20min，6000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分 子和细胞碎片；然后经20min，8000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐 和小分子杂蛋白，重复操作，直至浓缩到上样量的5％，获得待测溶液。
方案h
将5kg玉米清洗灭菌，采用50ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料30分钟；
将待处理原料在25℃中浸泡12h，在温度30℃，相对湿度20RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，加入猪血、芦荟、大豆、刺梨，获得初处理原料，其 中，发芽的玉米籽粒90份、猪血0.5份，芦荟0.2份，大豆0.2份，刺梨0.5份；
将初处理原料加入pH7.8的60mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的2倍。在第一级浆料中加入50000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.06％。35℃下处理40min，25℃静置1.5小时；
加入待测化合物，加入量为溶液重量的0.05％；
将破碎溶解后的溶液加热到55℃维持20min，5000r/min离心15min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至30％饱和度，充分溶解后，4℃冷藏静置4h，在4℃下，6000r/min离心30min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至90％饱和度，4℃10000rpm离 心15min，去上清，用pH7.8磷酸盐缓冲液溶解沉淀；
将上一步获得的溶液先经20min，6000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分 子和细胞碎片；然后经20min，8000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐 和小分子杂蛋白，重复操作，直至浓缩到上样量的5％，获得待测溶液。
将方案e-h中的待测溶液，通过氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)法测定SOD的 活性，检测结果如表2所示。
表2
对比表2与表1的结果，在破碎溶解步骤后、去除杂蛋白前，加入焦亚硫酸钠、叔丁基 对羟基茴香醚、维生素E，均在后续的溶液处理中能够起到一定的对SOD的保护作用，使SOD活性提高，其中焦亚硫酸钠、维生素E组中，SOD活性的增长量更大；而在上述的方案 h中，当在溶液加入焦亚硫酸钠时，产物的SOD活性显著增加，且明显超过其他组别，而此 种情况无论在方案f(加入猪血、芦荟、大豆组)还是方案g(刺梨组)，均未出现此种情 况。这说明初处理原料中的发芽的玉米籽粒、猪血、芦荟、大豆、刺梨，在破碎溶解之后的 组分，能够在焦亚硫酸钠的协同作用下，产生更大量的SOD，进而体现在最终的产物活性中。
实验例3
由于原料的变化，使得对产物SOD的修饰方法需要作出适应性的改进。
所述脂质体的修饰方法为：
溶解SOD冻干粉，将SOD冻干粉溶解至乙醇、氯仿的混合溶液中，至SOD浓度20mg/mL， 得到SOD溶液，所述乙醇、氯仿混合溶液中各成分的比例为：乙醇：氯仿＝20:1；
脂质体混合，在SOD溶液中加入0.2％(m/V)胆固醇，搅拌30min，得到脂质体混合液；
旋转蒸发：在60℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发去除脂质体混合液中的溶剂，得到SOD 产品。
采用邻苯三酚法(GB/T5009.171-2003)测定脂质体修饰前SOD活性。制备脂质体后， 加入正丙醇至3.0mL破乳，使类脂双分子层溶解从而释放出SOD，采用邻苯三酚法测定碎化 后SOD活性，并计算SOD脂质体的活性包封率；
活性包封率％＝碎化后SOD活性(U/mL)/包封前SOD活性(U/mL)。
但用此种方法获得的脂质体SOD，包封率仅为50-60％。
在实验中，申请人在对胆固醇进行预处理时发现，加入少量的有机溶剂，可以提高SOD 的包封率，实验结果如表3所示：
表3
根据表3获得的结果，在脂质体混合步骤中，也即加入胆固醇后，再加入0.05-0.01％ (m/V)乙腈，可以显著提高脂质体SOD的包封率，使SOD包封率达到80％左右，进而增强了脂质体对SOD的保护作用，为SOD的高效使用提供了基础。
实施例1
将5kg玉米清洗灭菌，采用50ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料30分钟，获得待处理 原料。
将待处理原料在25℃中浸泡10h，在温度25℃，相对湿度10RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，获得初处理原料。
将初处理原料加入pH7.5的55mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的0.5倍。在第一级浆料中加入1000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.05％。30℃下处理30min，20℃静置1小时，过滤。
将上一步获得的溶液加热到50℃维持20min，5000r/min离心15min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至25％饱和度，充分溶解后，0℃冷藏静置3h，在0℃下，6000r/min离心10min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至80％饱和度，0℃5000rpm离心10min，去上清，用pH7.5磷酸盐缓冲液溶解沉淀。
将上一步获得的溶液在20℃下减压进行浓缩至原有溶液体积的1/8；然后先经20min， 6000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分子和细胞碎片；然后经20min，6000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，重复操作，直 至浓缩到上样量的3％，获得超滤浓缩液；将超滤浓缩液经30min，6000r/min的纳滤浓缩， 截留分子量在15kD以上，直至浓缩到超滤浓缩液的10％。
采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(φ300*600mm)层析柱，用pH为7.4 的2.4mM的磷酸缓冲液平衡至少3倍柱体积，采用含0.03mol/L氯化钠的2.4mM的磷酸盐缓冲液洗脱，收集270nm-285nm的阴离子柱洗脱样品；将阴离子柱洗脱样品通过分子筛Sephadex G100(φ60*800mm)，收集活性峰部分，得分子筛洗脱样品。
冷冻干燥，预冻温度-30℃，预冻时间为1小时，升华温度为25℃，解析温度为30℃，真空度为0.07MPa，真空冷冻干燥时间为15小时，获得SOD冻干粉。
实施例2
将5kg玉米清洗灭菌，采用75ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料45分钟，获得待处理 原料。
将待处理原料在28℃中浸泡15h，在温度28℃，相对湿度20RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，获得初处理原料。
将初处理原料加入pH7.8的60mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的2倍。在第一级浆料中加入5000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.06％。35℃下处理45min，22℃静置1.5小时，过滤。
将上一步获得的溶液加热到52℃维持25min，5500r/min离心20min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至30％饱和度，充分溶解后，2℃冷藏静置4h，在2℃下，7000r/min离心20min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至85％饱和度，2℃10000rpm离心20min，去上清，用pH7.8磷酸盐缓冲液溶解沉淀。
将上一步获得的溶液在22℃下减压进行浓缩至原有溶液体积的1/10；然后先经25min， 7000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分子和细胞碎片；然后经25min，7000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，重复操作，直 至浓缩到上样量的4％，获得超滤浓缩液；将超滤浓缩液经45min，8000r/min的纳滤浓缩， 截留分子量在15kD以上，直至浓缩到超滤浓缩液的20％。
采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(φ300*600mm)层析柱，用pH为7.5 的2.5mM的磷酸缓冲液平衡至少3倍柱体积，采用含0.04mol/L氯化钠的2.5mM的磷酸盐缓冲液洗脱，收集270nm-285nm的阴离子柱洗脱样品；将阴离子柱洗脱样品通过分子筛Sephadex G100(φ60*800mm)，收集活性峰部分，得分子筛洗脱样品。
冷冻干燥，预冻温度-25℃，预冻时间为1.5小时，升华温度为28℃，解析温度为35℃， 真空度为0.08MPa，真空冷冻干燥时间为16小时，获得SOD冻干粉。
实施例3
将5kg玉米清洗灭菌，采用100ppm浓度的漂白粉水溶液处理原料60分钟，获得待处理原料。
将待处理原料在30℃中浸泡20h，在温度30℃，相对湿度40RH％的条件下使玉米籽粒 发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm，获得初处理原料。
将初处理原料加入pH-8.0的65mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量 比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的2.5倍。在第一级浆料中加入10000单位 的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.1％。40℃下处理60min， 25℃静置2小时，过滤。
将上一步获得的溶液加热到55℃维持30min，6000r/min离心25min，获得上清液；将 获得的上清液中加入硫酸铵至35％饱和度，充分溶解后，4℃冷藏静置5h，在4℃下，8000r/min离心40min，获得上清液；上清液中加硫酸铵至90％饱和度，4℃15000rpm离 心30min，去上清，用pH8.0磷酸盐缓冲液溶解沉淀。
将上一步获得的溶液在25℃下减压进行浓缩至原有溶液体积的1/20；然后先经30min， 8000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分子和细胞碎片；然后经30min，8000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，重复操作，直 至浓缩到上样量的5％，获得超滤浓缩液；将超滤浓缩液经60min，10000r/min的纳滤浓缩， 截留分子量在15kD以上，直至浓缩到超滤浓缩液的25％。
采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(φ300*600mm)层析柱，用pH为7.7 的2.6mM的磷酸缓冲液平衡至少3倍柱体积，采用含0.05mol/L氯化钠的2.6mM的磷酸盐缓冲液洗脱，收集270nm-285nm的阴离子柱洗脱样品；将阴离子柱洗脱样品通过分子筛Sephadex G100(φ60*800mm)，收集活性峰部分，得分子筛洗脱样品。
冷冻干燥，预冻温度-20℃，预冻时间为2小时，升华温度为30℃，解析温度为40℃，真空度为0.10MPa，真空冷冻干燥时间为18小时，获得SOD冻干粉。
实施例4
与实施例1的操作步骤基本相同，区别在于，在玉米籽粒的芽长为1-2mm后，加入辅料，以获得初处理原料，所述初处理原料中包括发芽的玉米籽粒100份，猪血0.5份，芦荟0.2份，大豆0.2份，刺梨0.5份。
实施例5
与实施例2的操作步骤基本相同，区别在于，在玉米籽粒的芽长为1-2mm后，加入辅料，以获得初处理原料，所述初处理原料中包括发芽的玉米籽粒97份，猪血1份，芦荟0.5份，大豆0.5份，刺梨1份。
实施例6
与实施例3的操作步骤基本相同，区别在于，在玉米籽粒的芽长为1-2mm后，加入辅料，以获得初处理原料，所述初处理原料中包括发芽的玉米籽粒90份，猪血2份，芦荟1 份，大豆1份，刺梨2份。
实施例7
与实施例4的操作步骤基本相同，区别在于，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在破碎 溶解步骤后、去除杂蛋白前，还包括：加入焦亚硫酸钠，加入量为溶液重量的0.02％。
实施例8
与实施例5的操作步骤基本相同，区别在于，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在破碎 溶解步骤后、去除杂蛋白前，还包括：加入焦亚硫酸钠，加入量为溶液重量的0.05％。
实施例9
与实施例6的操作步骤基本相同，区别在于，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在破碎 溶解步骤后、去除杂蛋白前，还包括：加入焦亚硫酸钠，加入量为溶液重量的0.1％。
实施例10
与实施例7的操作步骤基本相同，区别在于，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在冷冻 干燥步骤后，还包括脂质体修饰：
所述脂质体修饰包括步骤：
溶解SOD冻干粉，将SOD冻干粉溶解至乙醇、氯仿的混合溶液中，至SOD浓度15mg/mL， 得到SOD溶液，所述乙醇、氯仿混合溶液中各成分的比例为：乙醇：氯仿＝20:1；
脂质体混合，在SOD溶液中加入0.2％(m/V)胆固醇，以及0.05％(m/V)的乙腈，搅拌30min，得到脂质体混合液；
旋转蒸发：在60℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发去除脂质体混合液中的溶剂，得到SOD 产品。
实施例11
与实施例8的操作步骤基本相同，区别在于，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在冷冻 干燥步骤后，还包括脂质体修饰：
所述脂质体修饰包括步骤：
溶解SOD冻干粉，将SOD冻干粉溶解至乙醇、氯仿的混合溶液中，至SOD浓度20mg/mL， 得到SOD溶液，所述乙醇、氯仿混合溶液中各成分的比例为：乙醇：氯仿＝40:1；
脂质体混合，在SOD溶液中加入0.25％(m/V)胆固醇，以及0.08％(m/V)的乙腈， 搅拌45min，得到脂质体混合液；
旋转蒸发：在62℃，0.12MPa的条件下旋转蒸发去除脂质体混合液中的溶剂，得到SOD 产品。
实施例12
与实施例9的操作步骤基本相同，区别在于，所述超氧化物歧化酶的制备方法，在冷冻 干燥步骤后，还包括脂质体修饰：
所述脂质体修饰包括步骤：
溶解SOD冻干粉，将SOD冻干粉溶解至乙醇、氯仿的混合溶液中，至SOD浓度30mg/mL， 得到SOD溶液，所述乙醇、氯仿混合溶液中各成分的比例为：乙醇：氯仿＝50:1；
脂质体混合，在SOD溶液中加入0.3％(m/V)胆固醇，以及0.1％(m/V)的乙腈，搅 拌60min，得到脂质体混合液；
旋转蒸发：在65℃，0.15MPa的条件下旋转蒸发去除脂质体混合液中的溶剂，得到SOD 产品。
对比例1
与实施例8的操作步骤基本相同，区别在于，所述初处理原料由发芽的玉米籽粒97份， 猪血1份，芦荟0.5份，大豆0.5份组成。
对比例2
与实施例8的操作步骤基本相同，区别在于，所述初处理原料中包括发芽的玉米籽粒 97份，刺梨1份组成。
对比例3
与实施例8的操作步骤基本相同，区别在于，将焦亚硫酸钠替换为维生素E。
对比例4
与实施例11的操作步骤基本相同，区别在于，不进行去除杂蛋白及加入焦亚硫酸钠的 步骤。
实施例13
对实施例1-12、对比例1-4的SOD产品进行实验，测量SOD活性及需氧菌总数，其中SOD活性采用超微弱化学发光(ultra-weak chemiluminescence，UCL)法检测，需氧菌总数采用中国药典2015年版第四部1105章节的方法进行检测，检测结果如表4所示。
表4
| 组别 | 需氧菌总数(CFU/g) | SOD活性(U/g) |
| 实施例1 | 669 | 4209 |
| 实施例2 | 707 | 4221 |
| 实施例3 | 694 | 4230 |
| 实施例4 | 710 | 4390 |
| 实施例5 | 680 | 4366 |
| 实施例6 | 662 | 4301 |
| 实施例7 | 706 | 5002 |
| 实施例8 | 669 | 5035 |
| 实施例9 | 688 | 5015 |
| 实施例10 | 691 | 4998 |
| 实施例11 | 705 | 5032 |
| 实施例12 | 690 | 5024 |
| 对比例1 | 743 | 4298 |
| 对比例2 | 761 | 4286 |
| 对比例3 | 751 | 4375 |
| 对比例4 | 780 | 3680 |
根据表4的结果，实施例1-12的需氧菌总数均小于1000CFU/g，符合SOD使用时的安全要求；同时，在产品SOD活性的检测中，实施例4-6的SOD活性略优于实施例1-3，说明 玉米籽粒、猪血、芦荟、大豆、刺梨的初处理原料组分有利于SOD的提取；实施例7-9的 SOD活性明显优于实施例4-6，说明在破碎溶解步骤后、去除杂蛋白前，加入焦亚硫酸钠可 以与各种原料协同促进SOD的稳定性或提高SOD的提取效率；实施例10-12的SOD活性与 实施例7-9没有显著差异，可能是由于脂质体的修饰主要增加的是SOD的稳定性而非生物 活性。对比例1、对比例2中，与实施例8相比，分别减少了初处理原料中的刺梨或猪血、 芦荟、大豆，但其SOD活性明显降低，证明了在实施例8的步骤中，各个组分均不可或缺， 且能产生协同作用；对比例3中，与实施例8相比，将焦亚硫酸钠替换为维生素E，但其SOD 活性明显降低，证明了在实施例8的步骤中，焦亚硫酸钠组分的重要性及不可替代性；对比 例4中，与实施例11相比，缺少了去除杂蛋白及加入焦亚硫酸钠的步骤，其产物的SOD活 性显著降低，只有实施例11产物中SOD活性的70左右，证明了制备步骤中去除杂蛋白对 SOD活性的正向影响。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些 实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理 可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被 限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的 范围。
Claims (10)
1.一种超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
原料预处理，获得待处理原料，其中，所述原料中包含玉米；
培养诱导，使原料中的玉米籽粒发芽，获得初处理原料；
破碎溶解，将初处理原料破碎处理，然后用磷酸盐缓冲液溶解；
色谱分离，将经破碎溶解处理的溶液进行色谱分离，获得SOD酶液。
2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述培养诱导步骤为：将待处理原料在25-30℃中浸泡10-20h，在温度25-30℃，相对湿度10-40RH％的条件下使玉米籽粒发芽，所述玉米籽粒的芽长1-2mm。
3.根据权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述培养诱导步骤中，还包括步骤：加入辅料，以获得初处理原料，所述初处理原料中包括发芽的玉米籽粒90-100份，猪血0.5-2份，芦荟0.2-1份，大豆0.2-1份，刺梨0.5-2份。
4.根据权利要求3所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述破碎溶解步骤为：将初处理原料加入pH7.5-8.0的55-65mM磷酸盐缓冲液，并打磨成第一级浆料，以体积重量比算，所述缓冲液的加入体积为初处理原料重量的0.5-2.5倍；在第一级浆料中加入1000-10000单位的纤维素酶，搅匀，所述纤维素酶的加入量为初处理原料重量的0.05-0.1％；30-40℃下处理30-60min，20-25℃静置1-2小时，过滤。
5.根据权利要求4所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述超氧化物歧化酶的制备方法，在破碎溶解步骤后，还包括：
去除杂蛋白，将破碎溶解后的溶液加热到50-55℃维持20-30min，5000-6000r/min离心15-25min，获得上清液。
6.根据权利要求5所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述超氧化物歧化酶的制备方法，在破碎溶解步骤后、去除杂蛋白前，还包括：加入焦亚硫酸钠，加入量为溶液重量的0.02-0.1％。
7.根据权利要求5或6所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述超氧化物歧化酶的制备方法，在去除杂蛋白步骤后，还包括：
超滤浓缩，将上一步获得的溶液先经20-30min，6000-8000r/min超滤预处理拦截分子量大于2000kD的大分子和细胞碎片；然后经20-30min，6000-8000r/min截留分子量8kD的蛋白分子，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，重复操作，直至浓缩到上样量的3-5％，获得超滤浓缩液。
8.根据权利要求7所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述色谱分离的步骤为：采用阴离子交换层析层析柱，所述层析柱的规格为φ300*600mm，用pH为7.4-7.7的2.4-2.6mM的磷酸缓冲液平衡至少3倍柱体积，采用含0.03-0.05mol/L氯化钠的2.4-2.6mM的磷酸盐缓冲液洗脱，收集270nm-285nm的阴离子柱洗脱样品。
9.根据权利要求8所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述超氧化物歧化酶的制备方法，在色谱分离步骤后，还包括：
冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为：预冻温度-30℃至-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为25-30℃，解析温度为35℃，真空度为0.07-0.10MPa，真空冷冻干燥时间为15-18小时，获得SOD冻干粉。
10.根据权利要求9所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：所述超氧化物歧化酶的制备方法，在冷冻干燥步骤后，还包括脂质体修饰：
所述脂质体修饰包括步骤：
溶解SOD冻干粉，将SOD冻干粉溶解至乙醇、氯仿的混合溶液中，至SOD浓度15-30mg/mL，得到SOD溶液，所述乙醇、氯仿混合溶液中各成分的比例为：乙醇：氯仿＝20:1-50:1；
脂质体混合，在SOD溶液中加入0.2-0.3％胆固醇，搅拌30-60min，得到脂质体混合液；
旋转蒸发：在60-65℃，0.1-0.15MPa的条件下旋转蒸发去除脂质体混合液中的溶剂，得到SOD产品。
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