CN103173423A - 从玉米中高产率提取超氧化物歧化酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，包括玉米浆液——加入铜盐后分离——膜过滤——有机液沉淀——干燥——溶解——层析——冷冻干燥等步骤。本发明方法采用铜盐可提高约20%的超氧化物歧化酶活性，而铜盐带来的铜离子危害，可在后续采用膜过滤以及多次有机液沉淀——干燥的方法来将其除去。并且本发明利用超氧化物歧化酶与大部分杂质（杂蛋白、核酸和可溶性淀粉）完全溶于水的时间差，采用多次沉淀——干燥——溶解的组合步骤去除SOD中大部分杂质，提高其纯度。

Description

从玉米中高产率提取超氧化物歧化酶的方法

技术领域

本发明涉及一种从植物中提取生物活性物的方法，特别涉及一种从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法。

背景技术

超氧化物歧化酶（以下可采用英文简称：SOD）是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，作为超氧阴离子自由基的专一清除剂，在疾病的治疗、食品、化妆品、农业等方面具有广泛的应用。但目前超氧化物歧化酶的生产主要来源于动物血液和肝脏。虽然动物血液中提取SOD时，可用简单的工艺获得SOD纯品，但是在提取过程中可能不可避免地使血液中的一些病毒带入SOD产品中而产生人畜交叉感染的情况。1996年起，欧盟就明令禁止血液制品应用于人类疾病的治疗，因此从植物中提取SOD是临床研究的大势所趋。但从植物中获取SOD时，因组织相对于动物原料成分更复杂，一方面较难用常规的工艺获得高纯度的SOD，另一面某些可获得高纯度SOD的工艺则工业化难度较高。

发明内容

本发明旨在提供一种可从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，在可获得高纯度超氧化物歧化酶的同时，工业化实现也较容易。本发明通过以下方案实现：

一种从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，包括以下步骤：

第一步：将玉米进行预处理得到玉米浆液。一般的预处理工艺方法为：漂洗植物——浸泡——沥干水分——加水磨浆等常规步骤。

第二步：在上述玉米浆液中加入水溶性铜盐，保持pH值7～9，之后经固液分离，得到超氧化物歧化酶原液。水溶性铜盐一般可采用：硫酸铜、氯化铜、硝酸铜等无机铜盐，也可采用乙酸铜等有机铜盐。

为了便于工业化，一般采用氨水调节pH值。

第三步：将第二步所得的超氧化物歧化酶原液再经两级以上的膜过滤，依次去除分子量>12万和分子量<1万的杂质，得到超氧化物歧化酶浓缩液。

为进一步提高超氧化物歧化酶的纯度，在所述的第三步之后，再进行如下步骤，向超氧化物歧化酶浓缩液中加入可与水互溶的有机物液体经分离得到沉淀物，干燥后，再加水使沉淀物溶解；之后重复下述步骤若干次：向溶液中加入可与水互溶的有机物液体——分离得到沉淀物——干燥——加水溶解沉淀物；在进行最后一次时，分离得到的沉淀物经干燥后不再加水溶解，得到超氧化物歧化酶粗产品。所述的这种可与水互溶的有机物液体一般采用丙酮、无水乙醇、甲醇等。

为进一步提高超氧化物歧化酶的纯度，从而获得纯品，则将上述步骤得到的超氧化物歧化酶粗产品再次溶于水，取清液进行三次以上的柱层析，得到超氧化物歧化酶酶液，酶液经冷冻干燥得超氧化物歧化酶干粉。

所述三次以上的柱层析优选采用至少三种不同层析材料的层析柱效果为佳，依据层析顺序先后三种不同层析材料再进一步优选大孔树脂、纤维素和Sephadex G-75。

考虑工业化应用的便利，上述的膜过滤优选至少包含陶瓷膜过滤和超滤膜两级，陶瓷膜过滤去除分子量大于12万的大分子杂质，超滤膜浓缩则除去分子量小于1万的小分子杂质。

与现有的提取方法相比，本发明具有以下优点：

1、本发明方法中，向玉米浆液中加入适量水溶性铜盐可以提高单位质量浆液中超氧化物歧化酶的活性。这是因为玉米在生长过程中因铜离子获取的局限性，一部分SOD原蛋白因缺乏铜离子而不显示活性，故在原浆处理过程中加入适量的铜盐可以催化激活超氧化物歧化酶的活性，从而提高约20%的SOD活性。

2、本发明方法，为降低由于引入铜盐带来的铜离子危害，还在后续采用膜过滤以及多次有机液沉淀——干燥的方法来将其除去。

3、本发明方法中，采用多次水溶解——有机液沉淀——干燥步骤，一方面可有效除去残余铜离子，另一方面我们还可以利用SOD与大部分杂质（杂蛋白、核酸和可溶性淀粉）完全溶于水的时间差，有效去除SOD中大部分杂质。

4、本发明方法中，调节超氧化物歧化酶原液的pH至7～9，以改变SOD酶活性部位有关基因的解离状态，使酶分子上活性基团的解离状态最适于酶与底物的结合，而使活性释放出来，提高了SOD的产率。另外，超氧化物歧化酶原液的pH在7～9时，酶稳定性最好。过高或过低的pH会改变酶的活性中心构象，甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。而调节pH值的氨水可以在后续浓缩过程中除去，不会对产品造成任何污染。

5、本发明中的采用膜过滤先除去大于12万的悬浮物和不溶性杂质，得到澄清溶液；再去除分子量小于1万的杂质，从而达到浓缩与初步纯化的目的，得到单位活性较高的超氧化物歧化酶浓缩液。而优选的陶瓷膜则由于其耐用性较好，更适合工业应用。

具体实施方式

实施例1

一种从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，步骤如下：

第一步：取干玉米粒120Kg，洗净，用温水（30℃）浸泡24h后，取出沥干，得到湿玉米140Kg。将该玉米加180L水磨浆，得到含有超氧化物歧化酶的玉米浆液350L。

第二步：将上述玉米浆液加入24.5g无水硫酸铜后用氨水调节pH至7～9，通过压滤进行固液分离，得到超氧化物歧化酶活性为468U/mL的粗酶液210L。

第三步：将上步得到的超氧化物歧化酶粗酶液依次通过陶瓷膜过滤和超滤膜浓缩，陶瓷膜去除分子量>12万的杂质，超滤膜则去除分子量<1万的杂质，得到超氧化物歧化酶浓缩液，浓缩液中超氧化物歧化酶的活性为9691U/mL，体积为10L，活性保持率为98.6%。

实施例2

一种从玉米中高产率提取超氧化物歧化酶的方法，在实施例1的基础上，再进行以下步骤。

第四步：向第三步所得浓缩液加入丙酮，分离取沉淀物，再干燥沉淀物；之后再将干燥得到的沉淀物溶于水，再向溶液中加入丙酮，再分离取沉淀物，干燥沉淀物，得超氧化物歧化酶粗产品，其中超氧化物歧化酶活性保持率为90.3%。

实施例3

一种从玉米中高产率提取超氧化物歧化酶的方法，在实施例2的基础上，为进一步纯化，再进行以下步骤。

第五步：将第四步所得到的超氧化物歧化酶粗产品溶于水后离心，取清液，并依次通过：大孔树脂——DEAE-纤维素——Sephadex G-75层析柱，三级层析后即得到高纯度的超氧化物歧化酶酶液，其中超氧化物歧化酶活性保持率为

78.3%。上述酶液冷冻干燥后即可得到活性为6058U/mg的超氧化物歧化酶干粉。

实施例4

第一步：取干玉米粒200Kg，洗净，用温水浸泡24h后，取出沥干，得到湿玉米240Kg。将该玉米加300L水磨浆，得到含有超氧化物歧化酶的玉米浆液550L。

第二步：将该玉米浆液加入38.5g无水硫酸铜后用氨水调节pH至7～9，通过压滤进行固液分离，得到超氧化物歧化酶活性为505U/mL的粗酶液350L。

第三步：将上步所得的超氧化物歧化酶粗酶液依次先后通过陶瓷膜过滤和超滤膜浓缩，得到超氧化物歧化酶浓缩液活性为9800U/mL，体积为16.5L，超氧化物歧化酶活性保持率为98.0%。

第四步：向上步所得浓缩液加入无水乙醇，分离取沉淀物，再干燥沉淀物；之后再将干燥得到的沉淀物溶于水，再向溶液中加入无水乙醇，再分离取沉淀物，干燥沉淀物；重复沉淀物溶于水——加入无水乙醇——分离——干燥步骤三次，取经第三次处理的干燥后的沉淀物，得超氧化物歧化酶粗产品。

第五步：将上步所得超氧化物歧化酶粗产品再溶于水后离心，取上清液依次通过大孔树脂——DEAE-纤维素——Sephadex G-75层析柱，得到高纯度的超氧化物歧化酶酶液，其中超氧化物歧化酶活性保持率为77.5%。酶液再经冷冻干燥可得到活性为5960U/mg的超氧化物歧化酶干粉。

Claims (8)

1.一种从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：包括以下步骤，

第一步：将玉米进行预处理得到玉米浆液；

第二步：在玉米浆液中加入水溶性铜盐，保持pH值7～9，之后经固液分离，得到超氧化物歧化酶原液；

第三步：将第二步所得的超氧化物歧化酶原液再经两级以上的膜过滤，依次去除分子量>12万和分子量<1万的杂质，得到超氧化物歧化酶浓缩液。

2.如权利要求1所述的从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：在所述的第三步之后，再进行如下步骤，向超氧化物歧化酶浓缩液中加入可与水互溶的有机物液体经分离得到沉淀物，干燥后，再加水使沉淀物溶解；之后重复下述步骤若干次，向溶液中加入可与水互溶的有机物液体——分离得到沉淀物——干燥——加水溶解沉淀物；将最后一次分离得到的沉淀物干燥，得到超氧化物歧化酶粗产品。

3.如权利要求2所述的从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：将所述的超氧化物歧化酶粗产品再次溶于水，取清液进行三次以上的柱层析，得到超氧化物歧化酶酶液，酶液经冷冻干燥得超氧化物歧化酶干粉。

4.如权利要求3所述的从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所述三次以上的柱层析优选采用至少三种不同层析材料的层析柱。

5.如权利要求4所述的从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所述至少三种不同层析材料，依据层析顺序先后选择大孔树脂、纤维素和Sephadex G-75。

6.如权利要求1～5之一所述的从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所述的两级以上膜过滤优选至少包含陶瓷膜过滤和超滤膜两级。

7.如权利要求1～5之一所述的从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所述的第二步中优选采用氨水调节pH值。

8.如权利要求6所述的从玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所述的第二步中优选采用氨水调节pH值。