CN102993288A

CN102993288A - 一种半夏凝集素蛋白的提取方法

Info

Publication number: CN102993288A
Application number: CN2012103402089A
Authority: CN
Inventors: 薛建平; 杜圣艳; 赵伟; 盛玮; 李进步; 历雪英
Original assignee: ANHUI HUAIBEI PESTICIDE FACTORY
Current assignee: ANHUI HUAIBEI PESTICIDE FACTORY
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明公开了一种半夏凝集素蛋白的提取方法，将绞碎的宿半夏块茎加入到半夏蛋白提取剂中，4℃左右的低温下高速离心，所得去杂后的半夏总蛋白加入饱和度为20%-90%的硫酸铵溶液中去，充分的混匀沉淀后，将其置于低温高速离心机中6000rad·min^-1左右离心20min左右，后将得到的蛋白质溶液超滤，透析，过葡聚糖凝胶柱，分离纯化得到半夏凝集素蛋白，冷冻真空干燥得半夏凝集素蛋白粉末。本发明经过大量的实验研究，获得了高效提取半夏蛋白的工艺技术，应用于制造环保的安全的价格低廉的半夏蛋白添加产品。

Description

一种半夏凝集素蛋白的提取方法

技术领域

本发明涉及分离纯化半夏蛋白技术领域，确切地说是一种半夏凝集素蛋白的提取方法。

背景技术

半夏为天南星科植物，半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的块茎是一种重要的中药材。植物半夏为广布物种，在我国大部分地区及朝鲜半岛和日本均有分布，以长江流域为最多。半夏入药首载于《神农本草经》，1990年版的《中国药典》收载为唯一的半夏类药材植物。据统计，在558种中药处方中，半夏使用频率居第22位。半夏主要含有淀粉(占75%左右)、半夏蛋白、生物碱、β-谷甾醇、多糖、氨基酸、挥发油及无机元素等多种化学成分。其药理作用有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结；外用可治急性乳腺炎、急慢性化脓中耳炎等。近年来研究发现，半夏还具有抗肿瘤、抗生育、降血脂、护肝和治疗冠心病等多种重要作用。半夏的化学成分有半夏蛋白、生物碱、半夏淀粉、甾醇类、氨基酸、挥发油、芳香族成分、有机酸类、黄酮类、鞣质以及多种微量元素等，其中，半夏蛋白是半夏的主要药效成分之一。其药理作用有润燥化痰，降逆止呕，消痞散节等功效。近年来研究发现，半夏还具有抗肿瘤、抗生育、降血脂、护肝和治疗冠心病等多种重要作用。

半夏凝集素蛋白(pinellin)是一种从半夏属块茎中分离纯化出来的植物蛋白，它是一种植物凝集素，能与甘露糖专一性结合，具有凝血、抗肿瘤、抗生育、杀虫等重要的药理作用，以及半夏蛋白的基因工程已成为近年来研究的热点。半夏蛋白在半夏众多的化学成分中具有明显的生物活性，是半夏抗肿瘤和抗生育等药理作用的主要有效成分。

现今已经报道了多种半夏凝集素蛋白的提取方法，但提取率较低。以前研究的半夏蛋白提取剂主要是稀盐缓冲液，还有丙酮等有机溶剂。由于稀盐缓冲液提取半夏蛋白的得率不高；同时有机溶剂提取法有毒，且通过此法提取的半夏凝集素蛋白易失去活性，对以后进一步应用带来困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种半夏凝集素蛋白的提取工艺，利用该方法可以获得纯度较高的、浓度较大的专一性的半夏凝集素蛋白，节省材料，提高提取效率。

上述目的通过以下方案实现：

一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）称取一定量的宿半夏块茎，洗净并将其绞碎；

（2）将绞碎的宿半夏块茎加入到半夏蛋白提取剂中， 4℃左右的低温下高速离心，得去杂后的半夏总蛋白溶液，所述的半夏蛋白提取剂是由下述重量百分比的原料混匀而得：氯化钠0.05-5.0，甲酸0.10- 5.0，水余量；

（3）将步骤（2）所得去杂后的半夏总蛋白加入饱和度为20-90%的硫酸铵溶液中去，充分的混匀沉淀后，将其置于低温高速离心机中6000 rad·min^-1左右离心20min左右，后将得到的蛋白质溶液超滤；

（4）再将超滤后的蛋白质溶液透析；

（5）将透析过的蛋白质溶液过葡聚糖凝胶柱，分离纯化得到半夏凝集素蛋白，冷冻真空干燥得半夏凝集素蛋白粉末。

所述的一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：所述的半夏块茎泥与半夏蛋白提取剂的料液比为1:12-18。

所述的一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：所述的硫酸铵溶液的饱和度为50-70%。

所述的一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：所述的半夏蛋白提取剂的pH为0-5，料液比为1/10-1/50。

所述的一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：所述的葡聚糖凝胶柱的规格为G10-G200。

本发明的创新点在于发明了一种新的半夏凝集素蛋白提取剂，应用于高浓度的半夏凝集素蛋白提取，节省材料，增加提取效率。

本发明是经过大量的实验研究，确定影响半夏凝集素蛋白提取的几种因素，如：蛋白质提取液的选择、料液比的配比、提取条件的设定，以及后续的半夏凝集素蛋白的分离纯化方法的选择。

本发明采用正交试验设计，提高了半夏凝集素蛋白的提取率，通过大量的实验确定其最佳提取工艺参数。

本发明所述的产物是半夏总蛋白和专一性的半夏凝集素蛋白，最终是经过冷冻真空干燥获得的半夏凝集素蛋白粉末。

本发明所述的半夏凝集素蛋白最终是应用于制成半夏植物源农药，或者是添加到含有半夏药用成分的半夏药剂中。

本发明所述的是以宿半夏为原材料制备纯度较高的、浓度较大的半夏凝集素蛋白的方法。主要步骤分为：第一步：利用半夏块茎材料高效获得半夏总蛋白。第二步：将半夏总蛋白分离纯化得到专一性的半夏凝集素蛋白。

获得了一种新型的且能够高效提取半夏蛋白的提取剂，此种提取剂主要是将不同浓度的氯化钠以及不同浓度的甲酸进行配比组合而成，这种提取剂能大大提高半夏凝集素蛋白的得率，且操作步骤简单快捷。同时，在后续的半夏蛋白纯化过程中，我们采用的是将半夏总蛋白液过葡聚糖凝胶层析柱，此法得到的半夏蛋白纯度高。以上这种新型的蛋白质提取工艺解决了半夏蛋白提取困难，提取率低等问题。具体的说是先将半夏块茎粉碎，再使用氯化钠甲酸提取剂提取半夏蛋白，后通过超滤、过凝胶柱分离纯化半夏总蛋白，获得纯度较高的、浓度较大的专一性的半夏凝集素蛋白，再经真空干燥得到其成品。

本发明研究确定了一种可以高效提取半夏凝集素蛋白的提取剂，通过设计正交试验L₉（3⁴）对氯化钠浓度、甲酸浓度、料液比三个因素进行了筛选和优化，探讨半夏凝集素蛋白提取最优条件和最佳提取时期。确定了最佳的提取剂最佳配比组合（氯化钠为0.05-5.0，甲酸为0.10- 5.0，水补充至100；pH为0-5。料液比为1/10-1/50）。

具体实施方式

实施例1主要步骤如下：

a).取2000g新鲜的洗净的半夏块茎，用高速组织粉碎机将其粉碎成泥状。

b).配制半夏总蛋白提取液：氯化钠为160 g，甲酸为120 mL，水补充至40 L。

c).将半夏块茎粉碎物添加到半夏提取剂中，不断地搅拌使其混合均匀。

d).将上述材料，放入低温冷冻12h～36h，后将其溶解使半夏细胞膜破裂，内含物都溶解出来。

e).解冻后，搅拌均匀，离心去杂质，剩上清液。

f).用饱和度为20%～90%的硫酸铵沉淀半夏蛋白，不同饱和度的蛋白沉淀分开收集储存。

g).将不同饱和度的硫酸铵蛋白质沉淀物，通过超滤（超滤膜透过分子量为1000～10000）将杂质分子去除，得到纯蛋白质溶液。

h).利用分光光度计在波长为280nm和260nm测量吸光值，根据公式测提取液中半夏蛋白的含量，总蛋白得率为2.86%。

i).将纯半夏蛋白溶液过葡聚糖凝胶柱（G10-G200），进行分离层析，得到专一性的半夏凝集素蛋白液。

j).将得到的半夏凝集素蛋白液冷冻真空干燥，得到其粉末。专一性的半夏凝集素蛋白得率为0.346%。

实施例2：主要步骤如下

b).提取液：氯化钠为120 g，甲酸为90 mL，水补充至20 L。

c).加入5 L的丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃，8000 rad·min^-1离心），备用，超滤后测其总蛋白得率为1.74%。 e).后过葡聚糖凝胶柱（G10-G200），得到纯半夏凝集素蛋白液。

f).将得到的半夏凝集素蛋白液真空干燥，得到其粉末。专一性的半夏凝集素蛋白得率为0.223%。

实施例3：主要步骤如下：

a).称取2000 g新鲜的半夏块茎，清水洗净后用滤纸将水吸干。用高速组织粉碎机将其粉碎成泥状。

b).将粉碎的半夏转置干净烧杯中，提取液为：氯化钠为200 g，甲酸为140 mL，水补充至30 L。

c).水浴搅拌抽提，再用布氏漏斗过滤。

d).取滤液5000 r·min^-1离心30min,得上清液。

e).上清液采用硫酸铵分段盐析，取硫酸铵的饱和度为40%-70%，称取适量的硫酸铵加入上清液中，搅拌充分。

f).进行8000 r·min^-1离心10min,然后弃去上清液，取沉淀。

g).将沉淀用少量的提取剂进行溶解，将所得蛋白质溶液超滤，去除小分子杂质。总蛋白得率为1.98%。

h).过葡聚糖凝胶柱（G10-G200），得纯化的半夏凝集素蛋白。

i).30 ℃减压浓缩，28 ℃真空干燥,得半夏凝集素蛋白粉末。专一性的半夏凝集素蛋白得率为0.263%。

实施例4：主要步骤如下：

a).称取3000g新鲜半夏块茎，洗净，去皮，绞碎。

b).氯化钠为180 g，甲酸为150 mL，水补充至40 L。

c).加固体硫酸铵至0.8饱和度，室温静置。

d).待盐析完全后，用布氏漏斗过滤。滤饼用离子交换水溶解，溶液以离子交换水透析，换水多次。总蛋白得率为2.49%。

e).待沉淀完全后取出离心(或过滤)，取一定量的上清液放置过夜。次日如有沉淀出现可离心除去。

f).将清液在28℃～30℃放置，24 h后溶液中开始出现闪光物质，一星期后结晶完全。

g).将所得结晶每克用0.1饱和度硫酸铵溶液25 mL溶解，以同浓度的硫酸铵溶液透析平衡，如有沉淀出现可弃去。清液以磷酸钠缓冲液(pH=6.8)透析，25℃～30℃放置，半夏蛋白晶体自上而下沿透析袋壁析出。

h).将其真空干燥得到专一性的半夏凝集素蛋白，得率为0.273%。

实施例5：主要步骤如下：

a).称取2000g新鲜的洗净的半夏块茎，将其用高速组织捣碎机将其打成泥状。

b).氯化钠为150 g，甲酸为110 mL，水补充至30 L 。

c).将其置于烧杯中放入水浴锅中加热到40 ℃-60 ℃，提取时间：60 min-90 min。

d).后将其6000 r·min^-1离心15 min。

e).此时并测其分别在280 nm和260 nm波长下测吸光度A值。总蛋白得率为3.09%

f).后将其用不同浓度的硫酸铵沉淀半夏蛋白。

g)将所得半夏总蛋白透析，最后利用温差结晶法得到半夏蛋白晶体。

h).过葡聚糖柱（G10-G200）分离纯化蛋白。

i).低温真空干燥的半夏凝集素蛋白粉末。专一性的半夏凝集素蛋白得率为0.336%。

Claims

1.一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）称取一定量的宿半夏块茎，洗净并将其绞碎；

（2）将绞碎的宿半夏块茎加入到半夏蛋白提取剂中， 4℃左右的低温下高速离心，得去杂后的半夏总蛋白溶液，所述的半夏蛋白提取剂是由下述重量份的原料混匀而得：氯化钠0.05-5.0，甲酸0.10- 5.0，水补充至100；

（4）再将超滤后的蛋白质溶液透析；

2.根据权利要求1所述的一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：所述的半夏块茎泥与半夏蛋白提取剂的料液比为1:12-18。

3.根据权利要求1所述的一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：所述的硫酸铵溶液的饱和度为50-70%。

4.根据权利要求1所述的一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：所述的硫酸铵溶液的饱和度为60%。

5.根据权利要求1所述的一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：所述的半夏蛋白提取剂的pH为0-5，料液比为1/10-1/50。

6.根据权利要求1所述的一种半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：所述的葡聚糖凝胶柱的规格为G10-G200。