CN109553672B - 一种温郁金凝集素粗品、纯品、pgrp菌株混合物的制备方法及温郁金肥料 - Google Patents

一种温郁金凝集素粗品、纯品、pgrp菌株混合物的制备方法及温郁金肥料 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种温郁金凝集素粗品、纯品、PGRP菌株混合物的制备方法及温郁金肥料，本发明依次通过打浆、酶解、脱脂、硫酸铵沉淀、透析、冷冻干燥得到活性较大的温郁金凝集素粗品，并通过温郁金凝集素与特异性PGRP菌株之间的凝集作用实现温郁金凝集素与特异性PGRP菌株的纯化，所得到的特异性PGRP菌株混合物可用于温郁金增产。本发明所提供的分离方法，所得到的温郁金凝集素粗品活性较大，通过温郁金凝集素粗品制备的温郁金特异性PGRP菌株混合物用于温郁金培育，可以使温郁金明显增产，制备过程简单，成本低，便于产业化生产。

Description

一种温郁金凝集素粗品、纯品、PGRP菌株混合物的制备方法及 温郁金肥料
技术领域
本发明涉及一种温郁金凝集素粗品、纯品、PGRP菌株混合物的制备方法及温郁金肥料。
背景技术
姜科植物温郁金(Curcuma wenyufin)是浙江省著名的药材，其中提取的郁金油具有抗病毒、抗肿瘤等作用⋯。受温度、光照等环境因素的限制，温郁金种植局限于温州地区。由于面积有限，农民长期在同一块地里连续种植，这种种植方式导致出现连作障碍，致使温郁金产量降低、品质变劣、繁殖能力变差、有效药用物质含量降低，造成严重的经济损失。
植物根际促生细菌(plant growth—promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根际的一类可促进植物生长、防治病害、增加作物产量的有益菌类，一般具有固氮、解磷、释钾、产生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一能力的特性。PGPR对土壤中有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物都有生防作用，可促进植物吸收利用矿物质营养，并可产生有益植物生长的代谢产物，从而促进植物的生长发育。
凝集素是含有一个或多个非催化的、可与单糖或多糖专一性结合一类蛋白质或多糖。植物与微生物之问的相互识别主要通过植物分泌的凝集素与微生物合成的胞外多糖、脂多糖、或荚膜多糖之间的特异性结合。
在已公开文献《温莪术根际亲和性高效促生菌的筛选和初步鉴定》（《中国农业科技导报》，2012,14（2）；121-127）中，在温莪术中成功分离得到凝集素，并研究了凝集素与温莪术PGRP菌株的凝集反应，得出结论，温郁金凝集素可作为工具分离纯化温莪术特异性PGRP菌株。但是在之前试验中，分离得到的凝集素极少，不利于生产上利用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种温郁金凝集素粗品、纯品、PGRP菌株混合物的制备方法及温郁金肥料。
本发明所采取的技术方案如下：一种温郁金凝集素粗品的分离方法，包括以下步骤：
（1）取新鲜的温郁金，切片，粉碎打浆，得到浆状原料，在0-8℃、8000 -10000 r/min下离心20-45 min，弃上清液，得第一次沉淀物；
（2）在pH为5.5~6.5的缓冲溶液中加入1~3%的复合酶溶液，所述复合酶溶液为纤维素酶:果胶酶=2-3:1，与第一次沉淀物以体积比5-7:1混合，混合后在常温下，低速搅拌4-6h，然后在0-8℃、2000 r/min下离心10-15 min，取上清液，然后在0-8℃、8000 -10000 r/min下离心20-45 min，弃上清液，得第二次沉淀物；通过酶解破坏温郁金的细胞壁，有助于温郁金凝集素的溶出；
（3）在第二次沉淀物中按1:1-2的体积比加入预冷石油醚，在0-8℃下，低速搅拌10-30min，抽滤，按1:0.5-1的体积比加入预冷丙酮，静置1-2min，抽滤，晾干，得第三次沉淀物；通过石油醚脱脂，提高温郁金凝集素粗品中凝集素的含量；
（4）在第三次沉淀物中按1:8-10的体积比加入PH为5.5-6.5的缓冲液，在0-8℃下，低速搅拌2-4h，在0-8℃、8000 -10000 r/min下离心20-45 min，弃沉淀物，按1:0.1-0.3的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在0-8℃下，低速搅拌1-2min，在0-8℃、2000-3000 r/min下离心2-4 min，弃沉淀物，按1：2.5-2.9的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在0-8℃下，低速搅拌3-5min，在0-8℃、8000 -10000 r/min下离心25-35min，得到第四次沉淀物；
（5）将第四次沉淀物溶于水中，置于透析袋中进行透析至透析液中无硫酸根，冷冻干燥得到温郁金凝集素粗品。
一种温郁金特异性PGRP菌株混合物培育纯化方法，包括以下步骤：
（1）采集温郁金根系土壤，置于液体培养基中，避光摇床培养，隔数天转接培养液至新鲜的液体培养基富集培养；
（2）将步骤（1）得到的富集培养液与如上所述的一种温郁金凝集素粗品的分离方法所得到的温郁金凝集素粗品以浓度0.1-0.2g/L混合，摇床反应1-2h，在0-8℃、1000-2500r/min下离心5-10min，得到沉淀物；
（3）在沉淀物中加入含有200mm乳糖的缓冲溶液，摇床反应1-2h，在0-8℃、3000-4000r/min下离心15-30min，沉淀为温郁金特异性PGRP菌株混合物。
一种温郁金凝集素纯品的提取方法，上述的温郁金特异性PGRP菌株混合物培育纯化方法，步骤（3）中离心得到的上清液，透析、冻干得到温郁金凝集素。
一种温郁金肥料，包括上述的温郁金特异性PGRP菌株混合物培育纯化方法得到的温郁金特异性PGRP菌株混合物或通过上述的温郁金特异性PGRP菌株混合物培育纯化方法得到的温郁金特异性PGRP菌株混合物所培养制备的生物制剂。
本发明的有益效果如下：本发明依次通过打浆、酶解、脱脂、硫酸铵沉淀、透析、冷冻干燥得到活性较大的温郁金凝集素粗品，并通过温郁金凝集素与特异性PGRP菌株之间的凝集作用实现温郁金凝集素与特异性PGRP菌株的纯化，所得到的特异性PGRP菌株混合物可用于温郁金增产。本发明所提供的分离方法，所得到的温郁金凝集素粗品活性较大，通过温郁金凝集素粗品制备的温郁金特异性PGRP菌株混合物用于温郁金培育，可以使温郁金明显增产，制备过程简单，成本低，便于产业化生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例一：
（1）取新鲜的温郁金1 kg，切片，粉碎打浆，得到浆状原料，在4℃、9500r/min下离心35 min，弃上清液，得第一次沉淀物；
（2）在pH为5.5~6.5的磷酸盐缓冲溶液中加入1~3%的复合酶溶液，所述复合酶溶液为纤维素酶:果胶酶=2.5:1，与第一次沉淀物以体积比6:1混合，混合后在常温下，低速搅拌5h，然后在4℃、2000 r/min下离心10 min，取上清液，然后在4℃、9500 r/min下离心35min，弃上清液，得第二次沉淀物；
（3）在第二次沉淀物中按1:1的体积比加入预冷石油醚，在4℃下，低速搅拌25min，抽滤，按1:0.7的体积比加入预冷丙酮，静置1-2min，抽滤，晾干，得第三次沉淀物；
（4）在第三次沉淀物中按1:9的体积比加入PH为5.5-6.5的磷酸盐缓冲液，在4℃下，低速搅拌3h，在4℃、9500 r/min下离心35 min，弃沉淀物，按1:0.2的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在4℃下，低速搅拌1-2min，在4℃、2000 r/min下离心3 min，弃沉淀物，按1：2.7的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在4℃下，低速搅拌4min，在4℃、9500 r/min下离心30 min，得到第四次沉淀物；
（5）将第四次沉淀物溶于水中，置于透析袋中进行透析至透析液中无硫酸根，冷冻干燥得到温郁金凝集素粗品98 g。
（6）取家兔新鲜血液加肝素钠(0．05％W／W)，2 000 r／min离心10 min，用4倍体积的0．01 mol/L PBS洗涤3次，然后将红细胞用0．0l mol/L PBS配成10％的血细胞悬液，再缓慢加入等体积的2．5％戊二醛，4cC下缓慢搅拌2 h。再用0．01 mol/L PBS洗涤3次，离心后配成2％血细胞悬液。测得温郁金凝集素粗品比活1019 .28HU/mg。
实施例二：
（1）取新鲜的温郁金1 kg，切片，粉碎打浆，得到浆状原料，在4℃、8000r/min下离心40 min，弃上清液，得第一次沉淀物；
（2）在pH为5.5~6.5的磷酸盐缓冲溶液中加入1~3%的复合酶溶液，所述复合酶溶液为纤维素酶:果胶酶=2:1，与第一次沉淀物以体积比5:1混合，混合后在常温下，低速搅拌5.5h，然后在4℃、2000 r/min下离心10 min，取上清液，然后在4℃、8000r/min下离心40min，弃上清液，得第二次沉淀物；
（3）在第二次沉淀物中按1:2的体积比加入预冷石油醚，在4℃下，低速搅拌20min，抽滤，按1:0.7的体积比加入预冷丙酮，静置1-2min，抽滤，晾干，得第三次沉淀物；
（4）在第三次沉淀物中按1:10的体积比加入PH为5.5-6.5的磷酸盐缓冲液，在4℃下，低速搅拌3h，在4℃、8000r/min下离心40 min，弃沉淀物，按1:0.2的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在4℃下，低速搅拌1-2min，在4℃、2000 r/min下离心3 min，弃沉淀物，按1：2.7的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在4℃下，低速搅拌4min，在4℃、8000r/min下离心40 min，得到第四次沉淀物；
（5）将第四次沉淀物溶于水中，置于透析袋中进行透析至透析液中无硫酸根，冷冻干燥得到温郁金凝集素粗品127 g。
（6）取家兔新鲜血液加肝素钠(0．05％W／W)，2 000 r／min离心10 min，用4倍体积的0．01 mol/L PBS洗涤3次，然后将红细胞用0．0l mol/L PBS配成10％的血细胞悬液，再缓慢加入等体积的2．5％戊二醛，4cC下缓慢搅拌2 h。再用0．01 mol/L PBS洗涤3次，离心后配成2％血细胞悬液。测得温郁金凝集素粗品比活982.49 HU/mg。
实施例三：
（1）取新鲜的温郁金10kg，切片，粉碎打浆，得到浆状原料，在4℃、10000r/min下离心45 min，弃上清液，得第一次沉淀物；
（2）在pH为5.5~6.5的磷酸盐缓冲溶液中加入1~3%的复合酶溶液，所述复合酶溶液为纤维素酶:果胶酶=3:1，与第一次沉淀物以体积比7:1混合，混合后在常温下，低速搅拌5.5h，然后在4℃、2000 r/min下离心10 min，取上清液，然后在4℃、10000r/min下离心45min，弃上清液，得第二次沉淀物；
（3）在第二次沉淀物中按1:2的体积比加入预冷石油醚，在4℃下，低速搅拌20min，抽滤，按1:0.7的体积比加入预冷丙酮，静置1-2min，抽滤，晾干，得第三次沉淀物；
（4）在第三次沉淀物中按1:8.7的体积比加入PH为5.5-6.5的磷酸盐缓冲液，在4℃下，低速搅拌3h，在4℃、10000 r/min下离心45 min，弃沉淀物，按1:0.2的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在4℃下，低速搅拌1-2min，在4℃、2000 r/min下离心3 min，弃沉淀物，按1：2.7的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在4℃下，低速搅拌4min，在4℃、10000 r/min下离心45 min，得到第四次沉淀物；
（5）将第四次沉淀物溶于水中，置于透析袋中进行透析至透析液中无硫酸根，冷冻干燥得到温郁金凝集素粗品879 g。
（6）取家兔新鲜血液加肝素钠(0．05％W／W)，2 000 r／min离心10 min，用4倍体积的0．01 mol/L PBS洗涤3次，然后将红细胞用0．0l mol/L PBS配成10％的血细胞悬液，再缓慢加入等体积的2．5％戊二醛，4cC下缓慢搅拌2 h。再用0．01 mol/L PBS洗涤3次，离心后配成2％血细胞悬液。测得温郁金凝集素粗品比活1574 .01HU/mg。
实施例四—实施例十二：
（1）采集温郁金根系土壤，置于液体培养基中，室温下避光摇床培养，每隔7天后转接培养液至新鲜的液体培养基富集培养，连续富集4轮；
（2）将步骤（1）得到的富集培养液与上述实施例所得到的温郁金凝集素粗品混合根据表1中的条件进行混合，摇床反应1-2h，在0-8℃、1000-2500r/min下离心5-10min，得到沉淀物；
（3）在沉淀物中加入含有200mm乳糖的缓冲溶液，摇床反应1-2h，在0-8℃、3000-4000r/min下离心15-30min，沉淀为温郁金特异性PGRP菌株混合物，上清液透析、冻干得到温郁金凝集素。
（4）在温州医学院沙洲温郁金GAP基地生产田里选取土壤理化性质趋于一致的生产田设置实验小区21个，面积12m2(3 m×4 m，株行距：40 cm×100 cm。每小区种36株)，随机排列，3次重复。空白对照为按照GAP规定进行的生产田。将温郁金特异性PGRP菌株混合物施与温郁金根系土壤中。
（5）将步骤（3）离心得到的上清液通过透析、冻干得到温郁金凝集素。所设置条件、增产结果以及所得到的温郁金凝集素比活如表1所示。
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Claims (4)

1.一种温郁金凝集素粗品的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
取新鲜的温郁金，切片，粉碎打浆，得到浆状原料，在0-8℃、8000 -10000r/min下离心20-45 min，弃上清液，得第一次沉淀物；
在pH为5.5~6.5的缓冲溶液中加入1~3%的复合酶溶液，所述复合酶溶液为纤维素酶:果胶酶=2-3:1，与第一次沉淀物以体积比5-7:1混合，混合后在常温下，低速搅拌4-6h，然后在0-8℃、2000 r/min下离心10-15 min，取上清液，然后在0-8℃、8000 -10000 r/min下离心20-45 min，弃上清液，得第二次沉淀物；
在第二次沉淀物中按1:1-2的体积比加入预冷石油醚，在0-8℃下，低速搅拌10-30min，抽滤，按1:0.5-1的体积比加入预冷丙酮，静置1-2min，抽滤，晾干，得第三次沉淀物；
在第三次沉淀物中按1:8-10的体积比加入PH为5.5-6.5的缓冲液，在0-8℃下，低速搅拌2-4h，在0-8℃、8000-10000 r/min下离心20-45 min，弃沉淀物，按1:0.1-0.3的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在0-8℃下，低速搅拌1-2min，在0-8℃、2000-3000 r/min下离心2-4 min，弃沉淀物，按1：2.5-2.9的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在0-8℃下，低速搅拌3-5min，在0-8℃、8000 -10000 r/min下离心25-35min，得到第四次沉淀物；
将第四次沉淀物溶于水中，置于透析袋中进行透析至透析液中无硫酸根，冷冻干燥得到温郁金凝集素粗品。
2.一种温郁金特异性PGRP菌株混合物培育纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采集温郁金根系土壤，置于液体培养基中，避光摇床培养，隔数天转接培养液至新鲜的液体培养基富集培养；
（2）将步骤（1）得到的富集培养液与权利要求1所述的一种温郁金凝集素粗品的分离方法所得到的温郁金凝集素粗品以浓度0.1-0.2g/L混合，摇床反应1-2h，在0-8℃、1000-2500r/min下离心5-10min，得到沉淀物；
（3）在沉淀物中加入含有200mm乳糖的缓冲溶液，摇床反应1-2h，在0-8℃、3000-4000r/min下离心15-30min，沉淀为温郁金特异性PGRP菌株混合物。
3.一种温郁金凝集素纯品的提取方法，其特征在于：权利要求2所述的温郁金特异性PGRP菌株混合物培育纯化方法中，步骤（3）中离心得到的上清液，透析、冻干得到温郁金凝集素。
4.一种温郁金肥料，其特征在于，包括权利要求2所述的温郁金特异性PGRP菌株混合物培育纯化方法得到的温郁金特异性PGRP菌株混合物或通过上述的温郁金特异性PGRP菌株混合物培育纯化方法得到的温郁金特异性PGRP菌株混合物所培养制备的生物制剂。
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