JP2648088B2

JP2648088B2 - うしけのり及びこすぢのりからのフィコエリトリンの調製方法

Info

Publication number: JP2648088B2
Application number: JP6074719A
Authority: JP
Inventors: 永棉江; 宏農周
Original assignee: NASHONARU SAIENSU KAUNSHIRU
Current assignee: NASHONARU SAIENSU KAUNSHIRU
Priority date: 1994-04-13
Filing date: 1994-04-13
Publication date: 1997-08-27
Anticipated expiration: 2012-08-27
Also published as: JPH07286112A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はうしけのり及びこすぢの
りからのフィコエリトリンの調製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物より得られる天然の顔料蛋白は食品
および飲料中に安全に使用できる。顔料は穏やかな加熱
下で安定であり、酸性または塩基性の溶液中で安定であ
る。従って、これらは着色剤として食品および化粧品中
に使用できる。さらに、顔料の純粋な形態は、免疫、臨
床、細胞生物学および生化学の研究における診断薬とし
て使用される抗体の蛍光標識に使用できる。

【０００３】フィコシアニンおよびフィコエリトリン
は、２種類の現在使用されている顔料蛋白であり、多く
の分野で利用されている。フィコシニアンの主要原料と
しては、スピルリナ属およびミクロキスチス属のような
容易に生育する藍藻類であり、藻類の培養方法およびそ
れよりフィコシアニンを調製する方法は多数開発されて
おり、フィコシアニンの供給は問題なく行なわれてい
る。しかしながら、フィコエルトリンの量はなお少な
く、入手可能な原料が少ないため、そしてフィコエリト
リンの商業的な製造のための加工処理が困難であるた
め、価格が高い。

【０００４】フィコエリトリンの大部分は紅藻類葉状
体、例えばあまのり属およびいぎす属から抽出されてお
り、槽培養で得られるちのりも属から抽出されるフィコ
エリトリンの量は僅かである。

【０００５】フィコエリトリンの原料として使用される
野生の紅藻類および培養あまのり属の量は増大している
が、その大部分はゲル含有量の高い糊状物質を含有して
おり、このため、それからフィコエリトリンを抽出する
ことは、特に乾燥藻類の場合に極めて困難である。更
に、野生の藻類の量および質は季節および気温により影
響される。これらの要因のため、野生および培養された
あまのり属からフィコエリトリンを製造することはより
困難になっている。

【０００６】単細胞の回収は通常労力集約的で時間を要
し、藻類の培養中に分泌される可溶性多糖類が細胞の回
収の障害となり、フィコエリトリンの抽出に影響するた
め、ちのりも属からのフィコエリトリンの抽出もまた困
難である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、経済的で、迅速で、効果的なフィコエリトリンの調
製方法を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】うしけのりおよびこすぢ
のりの世代交代において、その糸状体植物はゲルを含有
せず、そのため、何らかの制御された条件下に維持でき
ることが解った。本発明は、この発見を利用して糸状体
期のうしけのりおよびこすぢのりからフィコエリトリン
を調製するための方法を提供する。

【０００９】即ち、本発明の方法は、以下の段階：ａ）
うしけのり及びこすぢのりの成熟紅葉状体を準備するこ
と；ｂ）SWM-III培地中で上記葉状体を培養して胞子を
得ること；ｃ）温度、照度及び照明時間がそれぞれ15〜
25℃、1000ルクス(1x)〜4000ルクス(1x)および10:14〜1
6:8（照明：消灯）時間である条件下で胞子を培養して
糸状体を得ること；ｄ）糸状体を切断して断片とするこ
と、および、これを、培養糸状体が所望の量となるま
で、上記条件下でより大型の容器中で培養すること；
ｅ）培養糸状体を採取し、乾燥し、粉砕して粉末とする
こと；ｆ）水およびリン酸塩溶液よりなる群から選択さ
れる液体に粉末を添加してフィコエリトリンを含有する
溶液を得ること；および、ｇ）溶液からフィコエリトリ
ンを塩析させること、を包含する。

【００１０】

【実施例】以下、好ましい実施態様により本発明を詳述
する。

【００１１】本発明の方法によれば、成熟したうしけの
り又はこすぢのりの葉状体を海より採取し、滅菌海水で
洗浄する。短時間風乾した後、培地（SWM-III培地）に
投入する。数時間後、胞子がうしけのり又はこすぢのり
の葉状体から遊離する。遊離した胞子を最初の培地から
分離し、温度25℃、照度500〜10001x、照明／消灯時間1
0:14〜16:8の生育チャンバー内に入れる。胞子が発芽し
て分枝糸状体となった後、糸状体をSWM-III培地の入っ
たフラスコに移し、上記条件下でコロニーが形成するま
で培養する。次に糸状体コロニーを滅菌グラインダを用
いて切断して小断片とし、より広い空間、例えば槽に移
し、これにより更に生育させる。より広い空間に移した
後は、より多くの糸状体が発生する。糸状体コロニーを
再度切断して所望の量が得られるまでさらに生育させ
る。この場合、糸状体のコロニーをより大型の槽で培養
する際には、新鮮な空気（300ml／分）を槽に供給しな
ければならない。次に糸状体を回収し、100〜400メッシ
ュの網で濾過する。培地は回収し、再使用できる。

【００１２】次に、回収され濾過されたうしけのり又は
こすぢのりの糸状体を迅速に真空乾燥するかまたは温風
乾燥し、粉砕し、粉末とする。粉末をリン酸塩溶液また
は水に添加し、充分混合する。破片沈澱物は遠心分離に
より除去し、透明な赤色顔料溶液を得る。次に、硫酸ア
ンモニウムを添加して20%〜30%飽和溶液として不必要な
蛋白を除去し、その後、60%〜65%硫酸アンモニウム飽和
溶液で沈降させることにより、粗製のフィコエリトリン
が得られる。得られた粗製のフィコエリトリンは1.4〜
1.6の吸光度565nm値(OD565)/吸光度280nm値(OD280)を有
し、食品等級であり、化粧品用に使用できる顔料とな
る。

【００１３】粗製の沈澱フィコエリトリンはゲル濾過ク
ロマトグラフィーによりさらに精製できる。例えば、セ
ファデックスG200（登録商標）クロマトグラフィーで１
回精製した後、形成したフィコエリトリンのOD565/OD28
0比は3.3〜3.7に達する。濾過工程を反復することによ
り、フィコエリトリンのOD565/OD280比は5.1〜5.2に達
する。フィコエリトリンの純度はSDS電気泳動で試験し
た場合約99%である。これにより、本発明の方法で製造
されたフィコエリトリンは免疫検定用試薬として使用で
きることが解る。

【００１４】（実施例１）成熟したうしけのりの葉状体
を海より採取し、ブラシを用いながら滅菌海水で洗浄し
た。洗浄した葉状体は短時間の風乾の後、底部に数枚の
カバーガラスを備えたSWM-III培地の入ったペトリ皿に
入れた。うしけのりの葉状体から胞子が遊離し、カバー
ガラス上に脱落した後、遊離した胞子を担持したカバー
ガラスを同じ培地の入った新しいペトリ皿に移し、温
度、照度及び照明／消灯時間がそれぞれ20℃、20001xお
よび12:12である生育チャンバーに入れた。数日後、発
芽して分枝した糸状体が形成された。分枝した糸状体を
カバーガラスから外し、SWM-III培地の入ったフラスコ
に入れ、上記条件下で糸状体コロニーが形成するまで培
養した。コロニーを滅菌ブレンダーに入れ、より大型の
槽に移し、さらに生育させた。この大型の槽には、新鮮
な空気（300ml／分）を供給した。40日後、うしけのり
糸状体を回収して200メッシュの網で濾過した。乾燥し
たうしけのりの重量は接種糸状体の重量の31.4培であっ
た。

【００１５】（実施例２）うしけのりの生育条件を温度
20℃、照度20001xおよび照明／消灯時間14:10としたほ
かは、実施例１と同様の方法を反復した。40日間培養し
た後、乾燥うしけのり重量は接種糸状体の重量の30.8倍
であった。

【００１６】（実施例３）うしけのりの生育条件を温度
20℃、照度 40001x及び照明／消灯時間12:12としたほか
は、実施例１と同様の方法を反復した。40日間培養した
後、乾燥うしけのり重量は接種糸状体の重量の30.5倍で
あった。

【００１７】（実施例４）うしけのりの生育条件を温度
20℃、照度 40001x及び照明／消灯時間14:10としたほか
は、実施例１と同様の方法を反復した。40日間培養した
後、乾燥うしけのり重量は接種糸状体の重量の30.1倍で
あった。

【００１８】（実施例５）うしけのりの生育条件を温度
15℃、照度 20001x及び照明／消灯時間12:12としたほか
は、実施例１と同様の方法を反復した。40日間培養した
後、乾燥うしけのり重量は接種糸状体の重量の21.6倍で
あった。

【００１９】（実施例６）うしけのりの生育条件を温度
25℃、照度 20001x及び照明／消灯時間12:12としたほか
は、実施例１と同様の方法を反復した。40日間培養した
後、乾燥うしけのり重量は接種糸状体の重量の18.1倍で
あった。

【００２０】（実施例７）うしけのりの生育条件を温度
25℃、照度 40001x及び照明／消灯時間14:10としたほか
は、実施例１と同様の方法を反復した。40日間培養した
後、乾燥うしけのり重量は接種糸状体の重量の15.6倍で
あった。

【００２１】（実施例８）うしけのりの生育条件を温度
30℃、照度 10001x及び照明／消灯時間10:14としたほか
は、実施例１と同様の方法を反復した。40日間培養した
後、乾燥うしけのり重量は接種糸状体の重量の19.3倍で
あった。

【００２２】（実施例９）うしけのりの生育条件を温度
30℃、照度 10001x及び照明／消灯時間16:8としたほか
は、実施例１と同様の方法を反復した。40日間培養した
後、乾燥うしけのり重量は接種糸状体の重量の14.3倍で
あった。

【００２３】（実施例１０）うしけのりの糸状体5gを採
取し、温風で急速に乾燥し、次に自動粉砕器で粉砕して
粉末2.4gとした。粉末および10mMリン酸カリウム溶液70
mlを充分混合した。次に混合物を４℃で10分間、6000rp
mで遠心分離することにより分離した。これにより透明
で赤色の顔料溶液が得られた。固体の硫酸アンモニウム
17gを溶液に添加して硫酸アンモニウムの20%飽和溶液を
形成し、不必要な蛋白を除去してより純度の高い顔料蛋
白溶液を得た。固体硫酸アンモニウム113gを顔料溶液に
添加して硫酸アンモニウムの65%溶液を形成し、次にこ
れを同条件で遠心分離してフィコエリトリン沈澱を得
た。次に沈澱したフィコエリトリンを10mMリン酸カリウ
ムで透析し、これにより、OD565/DO280 1:5の粗製フィ
コエリトリン溶液を得た。

【００２４】次に粗製のフィコエリトリンを、カラム長
120cmのセファデックスG200（登録商標）ゲル濾過クロ
マトグラフィーにより精製した。合計で各6mlの溶出液1
00管が得られた。565nmの吸光度から、35番〜37番の管
内の溶出液がフィコエリトリンを含有していることが解
った。このようにして得られたフィコエリトリン溶液は
吸光度比（OD比）3.5を有していた。精製を反復するこ
とにより、OD比5.1を有する最終的なフィコエリトリン
溶液が得られた。SDS電気泳動で分析した場合のフィコ
エリトリンの純度は99%であり、このフィコエリトリン
が免疫検定に使用できることが解った。

【００２５】（実施例１１）うしけのりの代わりにこす
ぢのりを用い、こすぢのりの生育条件を、温度20℃、照
度40001xおよび照明／消灯時間12:12としたほかは、実
施例１の方法を反復した。40日間培養した後、乾燥こす
ぢのりの重量は接種糸状体の重量の32.4倍であった。

【００２６】（実施例１２）こすぢのりの生育条件を温
度20℃、照度40001xおよび照明／消灯時間14:10とした
ほかは、実施例１１の方法を反復した。40日間培養後、
乾燥こすぢのりの重量は接種糸状体の重量の30.1倍であ
った。

【００２７】（実施例１３）こすぢのりの生育条件を温
度20℃、照度20001xおよび照明／消灯時間12:12とした
ほかは、実施例１１の方法を反復した。40日間培養後、
乾燥こすぢのりの重量は接種糸状体の重量の18.3倍であ
った。

【００２８】（実施例１４）こすぢのりの生育条件を温
度20℃、照度20001xおよび照明／消灯時間14:10とした
ほかは、実施例１１の方法を反復した。40日間培養後、
乾燥こすぢのりの重量は接種糸状体の重量の28.8倍であ
った。

【００２９】（実施例１５）こすぢのりの生育条件を温
度15℃、照度20001xおよび照明／消灯時間12:12とした
ほかは、実施例１１の方法を反復した。40日間培養後、
乾燥こすぢのりの重量は接種糸状体の重量の20.1倍であ
った。

【００３０】（実施例１６）こすぢのりの生育条件を温
度25℃、照度20001xおよび照明／消灯時間12:12とした
ほかは、実施例１１の方法を反復した。40日間培養後、
乾燥こすぢのりの重量は接種糸状体の重量の17.1倍であ
った。

【００３１】（実施例１７）こすぢのりの生育条件を温
度25℃、照度40001xおよび照明／消灯時間14:10とした
ほかは、実施例１１の方法を反復した。40日間培養後、
乾燥こすぢのりの重量は接種糸状体の重量の20.3倍であ
った。

【００３２】（実施例１８）こすぢのりの生育条件を温
度30℃、照度10001xおよび照明／消灯時間12:12とした
ほかは、実施例１１の方法を反復した。40日間培養した
後、乾燥こすぢのりの重量は接種糸状体の重量の14.0倍
であった。

【００３３】（実施例１９）培養物質としてうしけのり
の代わりにこすぢのりを用い、こすぢのりの生育条件
を、温度30℃、照度10001xおよび照明／消灯時間10:14
としたほかは、実施例１１の方法を反復した。40日間培
養した後、乾燥こすぢのりの重量は始めの分枝胞子体糸
状体の重量の14.1倍であった。

【００３４】（実施例２０）こすぢのりの生育条件を温
度30℃、照度10001xおよび照明／消灯時間16:8としたほ
かは、実施例１１の方法を反復した。40日間培養した
後、乾燥こすぢのりの重量は接種糸状体の重量の13.3倍
であった。

【００３５】（実施例２１）原料としてうしけのりの代
わりにこすぢのりを用いたほかは実施例１０の方法を反
復した。45番〜59番の管のフィコエリトリン溶液を回収
した。得られたフィコエリトリンのOD565/OD280は5.2で
あり、SDS-PAGE（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法）で分析した純度は99%であった。

【００３６】

【発明の効果】本発明の方法は、以下に示すような利点
を有することは明らかである。１．以前に開発されたあまのり属又はいぎす属の葉状体
からのフィコエリトリンの抽出方法とは異なり、本発明
の方法は加熱操作またはゲル除去操作を必要としない。
乾燥、粉砕、溶解、次いでゲル濾過分離を必要とするの
みである。２．本発明では培養された糸状体の回収は網を用いるこ
とにより簡便に実施できるが、単細胞藻類のちのりも属
回収方法はこれと異なり、ゲル多糖類が分泌されるため
回収及び精製において困難な点が生じる。３．うしけのり又はこすぢのりの採集後の培地は回収し
てその後の接種のために用いることができ、別の藻類培
養方法で生じるような廃棄物を低減できる。４．塩析過程から得られるゲル様フィコエリトリンは安
定化された形態であり、このため、直接保存したり、透
析後に凍結乾燥することができる。５．フィコエリトリン製造のための原料として培養され
たうしけのり及びこすぢのりは、培養条件の一貫性によ
り、より均一な信頼できる安定な生成物を提供できる。６．フィコシアニンおよびアロフィコシアニンの混合物
はフィコエリトリンの精製のためのゲル濾過を介して得
ることが出来る。次に、混合物をDEAE-セファセルイオ
ン交換クロマトグラフィー及び塩化ナトリウム勾配溶離
により純粋なフィコシアニンおよびアロフィコシアニン
に分離できる。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】紅藻類から粗製のゲル型フィコエリトリ
ン濃縮物を調整するための方法であって、下記段階：ａ）うしけのり及びこすぢのりの配偶体よりなる群から
選択される成熟紅藻類葉状体を準備すること；ｂ）SWM-III培地中で上記紅藻類を培養して胞子を回収
すること；ｃ）温度、照度及び一日当り照明時間がそれぞれ15〜25
℃、1000〜4000ルクス(lx)および10〜16時間である条件
下で、上記胞子を培養して糸状体を発芽させること；ｄ）上記糸状体を破壊して微細な断片とすること、及
び、これを培養糸状体が所望の量となるまで、上記条件
下でより大型の槽中で培養すること；ｅ）上記培養糸状体を採取し、乾燥し、粉砕して粉末と
すること；ｆ）水及びリン酸塩溶液よりなる群から選択される液体
に上記粉末を添加してフィコエリトリンを含有する透明
赤色顔料蛋白溶液を得ること；及び、ｇ）上記した透明赤色顔料蛋白溶液からゲル型フィコエ
リトリン濃縮物を塩析させること、を含むゲル型フィコエリトリン濃縮物の調製方法。
【請求項２】上記ゲル型フィコエリトリン濃縮物を透
析し、ゲル濾過によりフィコエリトリンを精製する段階
をさらに有する請求項１記載の方法。
【請求項３】上記SWM-III培地が無機SWM-III培地であ
る請求項１記載の方法。
【請求項４】段階ｃ）の培養条件が温度20℃、照度20
00ルクス(lx)および一日当りの照明時間１２時間である
請求項１記載の方法。
【請求項５】段階ｅ）において、うしけのりの糸状体
の乾燥を真空下に行なう請求項１記載の方法。
【請求項６】段階ｅ）において、うしけのりの糸状体
の乾燥を温風を使用して行なう請求項１記載の方法。
【請求項７】段階ｅ）において、培養された紅藻類糸
状体を200メッシュの網を用いて回収する請求項１記載
の方法。
【請求項８】段階ｇ）において、20%〜30%硫酸アンモ
ニウム及び60%〜65%硫酸アンモニウムを用いてフィコエ
リトリンを塩析させる請求項１記載の方法。