CN107674898A - 一种由维生素k2发酵液中提取蛋白质的方法 - Google Patents

一种由维生素k2发酵液中提取蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明以维生素K2发酵废液为原料生产低分子量的蛋白质，既减少了对资源的浪费，同时又很好的解决了发酵液对环境造成污染的问题，具有良好的应用前景。同时，本发明原料成本低，设备简单，操作方便，易于实现规模化生产，提高了产业附加值。

Description

一种由维生素K2发酵液中提取蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及一种由维生素K2发酵液中提取蛋白质的方法，尤其涉及菌丝体的收集破碎和蛋白质分离提取的生产技术。
背景技术
维生素K2是一种脂溶性维生素，具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，是人体中不可缺少的重要维生素之一。维生素K是一类具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物。天然存在的有维生素K1、K2，维生素K1广泛存在于绿色植物中，是食物中维生素K的重要来源；维生素K2主要由肠道细菌合成。人工合成的有维生素K3、K4、K5、K7等。在动物体内具有生物活性的是维生素K2，而维生素K1和维生素K3都要转化为维生素K2才能起作用。三种维生素K的形式都在肝中转化成维生素K2，并和胃肠微生物合成的维生素K2一起被吸收利用。维生素的每日需要量甚少(常以毫克或微克计)，如人每天约需VA0.8-1.7mg、VB11-2mg、VB21-2mg、泛酸3-5mg、VB62-3mg、VPP10-20mg、生物素0.2mg、叶酸0.4mg、VB121μg、VD0.01-0.02mg、VE14-24mg、VC60-100mg、维生素K2婴儿10-20μg及成人70-140μg.
然而由于许多食物中富含维生素K及肠道细菌能合成维生素K。健康成人和年长儿童一般不会因膳食供给不足发生维生素K缺乏。由于维生素K能迅速改善由于维生素K缺乏引起的出血，几十年来维生素K一直用于治疗出血的抗凝剂，似乎不作为人体内一种重要营养物被关注。近40年来，尤其近20年来，由于血清维生素K2及维生素K2缺乏诱导蛋白检测技术的突破，全球各地相继报道了众多的有关婴儿维生素K2缺乏引起出血的文章认为维生素K2缺乏是世界性婴儿出血疾病和死亡的重要原因。
维生素K2缺乏性出血按其发生时间分为：
(1)早发新生儿出血，发生在新生婴儿出生后24小时以内，
(2)典型新生儿出血，生后1-7天，
(3)迟发性出血，生后8天-12个月。
维生素K缺乏性出血可以发生在任何部位，早发性出血头部血肿较多，典型新生儿出血胃肠道出血较多，迟发性出血颅内出血较多。颅内出血是维生素K2缺乏症最严重的临床表现，是造成婴儿死亡和残疾的重要原因，颅内出血病死率高达15-50％。我们在国内七省调查病死率为30.3％。幸存者约有50％留有神经系统后遗症，造成儿童终生残疾。
传统的维生素K2—般采用化学合成法生产，但存在化学前体原料来源限制、化学反应产生大量异构体、副产物多、产率低、带来环境污染等问题，且合成的维生素K2，其异戊二烯侧链多是顺式结构，活性较低。而活性更高的天然维生素K2仅能通过微生物发酵法获得，因此，微生物发酵法越来越受到人们的欢迎，具有广阔的应用前景。能够合成维生素K2的微生物有黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)、分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)、诺卡氏菌属(Nocabacteriumsp.)、乳酸菌(lactobacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)等，其中纳豆芽孢杆菌因其生长速度快、易于培养、维生素K2含量高等优势，成为发酵生产维生素K2最主要的微生物，是目前进行工业化生产的理想菌种之一。
维生素K2在使用纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)发酵后会产生大量的菌丝体、蛋白质等副产物，如果超滤截留成分则粘度比较大，如果直接舍弃则浪费资源和污染环境。为了有效的利用资源，保护环境，有必要对维生素K2的发酵废液进行处理，提取其中有用物质，并降低其对环境的破坏。从这个意义上说，从维生素K2发酵液中提取蛋白质用作饲料蛋白具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种从维生素K2发酵液中提取蛋白质的方法，该方法可方便、快捷地将蛋白质从废液中提取出来，可将提取的蛋白质进一步作为生产饲料的原料。本发明的技术既减少了对资源的浪费，同时又很好的解决了发酵液对环境造成污染的问题，具有良好的应用前景。
本发明提供了一种从维生素K2发酵液中提取蛋白质的方法，步骤如下：
(1)将维生素K2发酵液用超滤膜进行超滤处理，将其中的菌丝体和蛋白质等大分子物质从废液中截留出来，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为3000道尔顿，进水压力1.1-1.2Mpa，超滤温度20℃，发酵液pH值6.4-7.2；
(2)将步骤(1)超滤所得的截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，得悬浊液，然后再用高压均质机将所得悬浊液进行破碎处理；水的加入体积与截留成分的体积比为1:2-1:6；超低温速冻温度为-60--40℃，速冻时间为15min；悬浊液通过高压均质机的压力为250Mpa，流速为130m/s；
(3)将步骤(2)的悬浊液的pH调至pH为5.5，加入蛋白复合酶A，酶解提取其中的蛋白质成分；所述蛋白复合酶A由羧肽酶B、胃蛋白酶组成，其组成为羧肽酶B：胃蛋白酶的质量比例为1：1.6-2.0，酶解温度为40℃，酶的用量为悬浊液质量的2％-3.5％，酶解时间为3h；
(4)将步骤(3)中水解后的液体再次用超滤膜进行超滤处理，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为1000道尔顿，进水压力1.5-1.7Mpa，超滤温度20℃；
(5)将步骤(4)的截留成分加入水后搅拌均匀，水的加入体积与截留成分的体积比为1:2-4，调节pH为7，再加入蛋白复合酶B，进一步酶解其中的蛋白质成分，所述蛋白复合酶B由链霉素蛋白酶、无花果蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K组成，其组成为链霉素蛋白酶：无花果蛋白酶：弹性蛋白酶：蛋白酶K的质量比例为1：1.4-1.6：1.2-1.5：1.3-1.8，酶解温度为37℃，酶的用量为悬浊液质量的0.8％-1.6％，酶解时间为4h；
(6)将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液，离心在35℃下进行，转速为3000rpm，时间为1.5h；
(7)调节步骤(6)所述上清液的pH至3.0-3.5，使蛋白质絮凝沉降，沉降时间为15h，过滤，收集沉淀，干燥沉淀，得到蛋白粉，干燥采用喷雾干燥的方法，喷雾干燥进风温度为170℃，出风温度为90℃。
本发明具有的优点和积极效果：
本发明以维生素K2发酵废液为原料生产低分子量的蛋白质，既减少了对资源的浪费，同时又很好的解决了发酵液对环境造成污染的问题，具有良好的应用前景。同时，本发明利用均质机对维生素K2发酵菌丝体等成分进行了先速冻后破碎，且采用了两次超滤和酶解的方式，采用具有特定配比和组成的复合蛋白酶对废液中的蛋白质进行了提取，蛋白质的提取率高，分子量小，以此蛋白生产的饲料将更容易为动物吸收。另外，本发明原料成本低，设备简单，操作方便，易于实现规模化生产，减小了废液对环境的污染，提高了产业附加值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体工艺条件、物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。
下述实施例中，采用30wt％的盐酸溶液、30wt％的氢氧化钠溶液调节pH。
实施例1
(1)将维生素K2发酵液用超滤膜进行超滤处理，将其中的菌丝体和蛋白质等大分子物质从废液中截留出来，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为3000道尔顿，进水压力1.1Mpa，超滤温度20℃，发酵液pH值7.2；
(2)将步骤(1)超滤所得的截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，得悬浊液，然后再用高压均质机将所得悬浊液进行破碎处理；水的加入体积与截留成分的体积比为1:2；超低温速冻温度为-40℃，速冻时间为15min；悬浊液通过高压均质机的压力为250Mpa，流速为130m/s；
(3)将步骤(2)的悬浊液的pH调至pH为5.5，加入蛋白复合酶A，酶解提取其中的蛋白质成分；所述蛋白复合酶A由羧肽酶B、胃蛋白酶组成，其组成为羧肽酶B：胃蛋白酶的质量比例为1：1.6，酶解温度为40℃，酶的用量为悬浊液质量的2％，酶解时间为3h；
(4)将步骤(3)中水解后的液体再次用超滤膜进行超滤处理，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为1000道尔顿，进水压力1.7Mpa，超滤温度20℃；
(5)将步骤(4)的截留成分加入水后搅拌均匀，水的加入体积与截留成分的体积比为1:2，调节pH为7，再加入蛋白复合酶B，进一步酶解其中的蛋白质成分，所述蛋白复合酶B由链霉素蛋白酶、无花果蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K组成，其组成为链霉素蛋白酶：无花果蛋白酶：弹性蛋白酶：蛋白酶K的质量比例为1：1.6：1.2：1.8，酶解温度为37℃，酶的用量为悬浊液质量的1.6％，酶解时间为4h；
(6)将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液，离心在35℃下进行，转速为3000rpm，时间为1.5h；
(7)调节步骤(6)所述上清液的pH至3.5，使蛋白质絮凝沉降，沉降时间为15h，过滤，收集沉淀，干燥沉淀，得到蛋白粉，干燥采用喷雾干燥的方法，喷雾干燥进风温度为170℃，出风温度为90℃。
实施例2
(1)将维生素K2发酵液用超滤膜进行超滤处理，将其中的菌丝体和蛋白质等大分子物质从废液中截留出来，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为3000道尔顿，进水压力1.2Mpa，超滤温度20℃，发酵液pH值6.4；
(2)将步骤(1)超滤所得的截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，得悬浊液，然后再用高压均质机将所得悬浊液进行破碎处理；水的加入体积与截留成分的体积比为1:6；超低温速冻温度为-60℃，速冻时间为15min；悬浊液通过高压均质机的压力为250Mpa，流速为130m/s；
(3)将步骤(2)的悬浊液的pH调至pH为5.5，加入蛋白复合酶A，酶解提取其中的蛋白质成分；所述蛋白复合酶A由羧肽酶B、胃蛋白酶组成，其组成为羧肽酶B：胃蛋白酶的质量比例为1：2.0，酶解温度为40℃，酶的用量为悬浊液质量的3.5％，酶解时间为3h；
(4)将步骤(3)中水解后的液体再次用超滤膜进行超滤处理，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为1000道尔顿，进水压力1.Mpa，超滤温度20℃；
(5)将步骤(4)的截留成分加入水后搅拌均匀，水的加入体积与截留成分的体积比为1:4，调节pH为7，再加入蛋白复合酶B，进一步酶解其中的蛋白质成分，所述蛋白复合酶B由链霉素蛋白酶、无花果蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K组成，其组成为链霉素蛋白酶：无花果蛋白酶：弹性蛋白酶：蛋白酶K的质量比例为1：1.4：1.5：1.3，酶解温度为37℃，酶的用量为悬浊液质量的0.8％，酶解时间为4h；
(6)将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液，离心在35℃下进行，转速为3000rpm，时间为1.5h；
(7)调节步骤(6)所述上清液的pH至3.0，使蛋白质絮凝沉降，沉降时间为15h，过滤，收集沉淀，干燥沉淀，得到蛋白粉，干燥采用喷雾干燥的方法，喷雾干燥进风温度为170℃，出风温度为90℃。
实施例3
实施例1或2中所回收的蛋白质的质量检测，检测回收物中蛋白质的质量分布，结果见表1：
表1回收蛋白质的分子量分布
分子量(道尔顿) 实施例1(％) 实施例2(％)
大于5000 1.4 2.4
4000-5000 6.4 5.1
3000-4000 4.3 4.4
2000-3000 8.3 5.8
1000-2000 79.6 82.3
由上述质量检测的结果可以看出，使用本发明所述的提取方法所得到的蛋白质中，分子量处于1000-2000道尔顿的蛋白质的含量大于75％，将所述的蛋白质用作饲料之后，易被动物吸收，具有良好的效果。

Claims (3)

1.一种从维生素K2发酵液中提取蛋白质的方法，其特征在于：该方法以维生素K2发酵废液为原料，对维生素K2发酵菌丝体等成分进行了先速冻后破碎，且采用了两次超滤和酶解的方式，采用具有特定配比和组成的复合蛋白酶对废液中的蛋白质进行了提取。
2.根据权利要求1所述的从维生素K2发酵液中提取蛋白质的方法，其具体的步骤如下：
(1)将维生素K2发酵液用超滤膜进行超滤处理，将其中的菌丝体和蛋白质等大分子物质从废液中截留出来，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为3000道尔顿，进水压力1.1-1.2Mpa，超滤温度20℃，发酵液pH值6.4-7.2；
(2)将步骤(1)超滤所得的截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，得悬浊液，然后再用高压均质机将所得悬浊液进行破碎处理；水的加入体积与截留成分的体积比为1:2-1:6；超低温速冻温度为-60--40℃，速冻时间为15min；悬浊液通过高压均质机的压力为250Mpa，流速为130m/s；
(3)将步骤(2)的悬浊液的pH调至pH为5.5，加入蛋白复合酶A，酶解提取其中的蛋白质成分；所述蛋白复合酶A由羧肽酶B、胃蛋白酶组成，其组成为羧肽酶B：胃蛋白酶的质量比例为1：1.6-2.0，酶解温度为40℃，酶的用量为悬浊液质量的2％-3.5％，酶解时间为3h；
(4)将步骤(3)中水解后的液体再次用超滤膜进行超滤处理，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为1000道尔顿，进水压力1.5-1.7Mpa，超滤温度20℃；
(5)将步骤(4)的截留成分加入水后搅拌均匀，水的加入体积与截留成分的体积比为1:2-4，调节pH为7，再加入蛋白复合酶B，进一步酶解其中的蛋白质成分，所述蛋白复合酶B由链霉素蛋白酶、无花果蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K组成，其组成为链霉素蛋白酶：无花果蛋白酶：弹性蛋白酶：蛋白酶K的质量比例为1：1.4-1.6：1.2-1.5：1.3-1.8，酶解温度为37℃，酶的用量为悬浊液质量的0.8％-1.6％，酶解时间为4h；
(6)将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液，离心在35℃下进行，转速为3000rpm，时间为1.5h；
(7)调节步骤(6)所述上清液的pH至3.0-3.5，使蛋白质絮凝沉降，沉降时间为15h，过滤，收集沉淀，干燥沉淀，得到蛋白粉，干燥采用喷雾干燥的方法，喷雾干燥进风温度为170℃，出风温度为90℃。
3.根据权利要求1或2所述的从维生素K2发酵液中提取蛋白质的方法，其中采用30wt％的盐酸溶液、30wt％的氢氧化钠溶液来调节pH。
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