CN105412209A - 一种黄芪提取物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄芪提取物及其制备方法与应用。本发明通过将黄芪粉碎,加水浸泡,超声提取,过滤,取滤液;将滤液浓缩,加入乙醇提取3次,乙醇提取的浓度依次为50~55%、65~75%和90%以上。第三次乙醇提取过滤的滤液和滤渣分别处理,滤液除杂,得到黄芪皂苷提取液;滤渣除杂,得到得黄芪多糖提取液;将黄芪皂苷提取液和黄芪多糖提取液组合,得到黄芪提取物。该黄芪提取物保留了黄芪中皂苷及多糖的有效成分,可直接或与其他药物联用制备用于治疗心肌炎的药物。
Description
技术领域
本发明属于中医药领域,特别涉及一种黄芪提取物及其制备方法与应用。
背景技术
中药黄芪具有抗病毒、调节免疫、保护心肌的作用,是中医常用药,它对人体无毒副作用、来源充足,具备治疗病毒性疾病的基础,在临床上常用于治疗病毒性心肌炎,它可拮抗病毒感染心肌细胞对L型钙通道的激活,抑制内向钠钙交换电流,改善部分心电活动,清除氧自由基。
目前市售的黄芪注射液一般采用水提醇沉的方法制备,注射剂中有效成分为黄芪皂苷,不含黄芪多糖或含量极少,而黄芪多糖也是黄芪的有效成分,具有增强免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用;并且醇沉法制得的注射液稳定性较差,使其保存过程中易析出沉淀,影响使用。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种黄芪提取物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的黄芪提取物。
本发明的再一目的在于提供所述黄芪提取物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种黄芪提取物的制备方法,包括如下步骤:
(1)将黄芪粉碎,加水浸泡,超声提取,过滤,取滤液;将滤液浓缩,得到浓缩液;
(2)在浓缩液中加入乙醇提取,共3次,具体如下:
①在浓缩液中加入乙醇,乙醇的用量按最终得到的溶液中含醇量达到体积百分比50~55%计算;冷藏放置,过滤,弃去滤渣,将滤液减压回收乙醇至无醇味;
②在步骤①最终得到的滤液中加入乙醇,乙醇的用量按最终得到的溶液中含醇量达到体积百分比65~75%,冷藏放置,过滤,弃去滤渣,滤液减压回收乙醇至无醇味;
③在步骤②最终得到的滤液中加入乙醇,乙醇的用量按最终得到的溶液中含醇量达到体积百分比90%以上,冷藏放置,过滤,滤渣备用,滤液减压回收乙醇至无醇味并浓缩滤液至浸膏状,得到膏体;
(3)黄芪皂苷提取液的制备:
①在步骤(2)③得到的膏体中加入注射用水溶解稀释至0.5~1.5g/ml,冷藏放置,过滤,滤液减压浓缩;
②将浓缩液的pH值调节为4~5,加入适量3%(w/w)明胶溶液;静置后过滤,在得到的滤液中加入乙醇至含醇量为体积百分比75%,静置,过滤,减压回收乙醇后稀释,超滤;
③超滤得到的滤液再减压浓缩至5~6g/ml,得到黄芪皂苷提取液;
(4)将步骤(2)③得到的滤渣除杂,得到得黄芪多糖提取液;
(5)将步骤(3)得到的黄芪皂苷提取液和步骤(4)得到的黄芪多糖提取液组合,即为黄芪提取物。
步骤(1)的操作优选如下:将黄芪粉碎,加水浸泡,超声提取,过滤,取滤液;将得到的滤渣按前述步骤重复提取至少1次;将得到的滤液合并,浓缩,得到浓缩液。
所述的重复提取的次数优选为2次。
步骤(1)中所述的水的体积用量优选为相当于所述黄芪质量的10~15倍。
步骤(1)中所述的浸泡的时间优选为8~12h。
步骤(1)中所述的超声提取的条件优选为50~70℃下超声提取30~40min,超声提取的频率为40kHz。
步骤(1)中所述的浓缩的程度优选为浓缩至1~3g/ml(即1ml浓缩液相当于1~3g黄芪生药)。
步骤(2)①中所述的冷藏放置的条件优选为于2~8℃放置至少15小时,优选为15~20h。
步骤(2)②中所述的冷藏放置的条件优选为于2~8℃放置至少24小时,优选为24~48h。
步骤(2)③中所述的乙醇的用量优选为按最终得到的溶液中含醇量达到体积百分比90~95%
步骤(2)③中所述的冷藏放置的条件优选为于2~8℃放置至少24小时,优选为24~48h。
步骤(3)①和③中所述的冷藏放置的条件优选为于2~8℃放置24h。
步骤(3)①中所述的浓缩的程度为浓缩至4~6g/ml。
步骤(3)②中所述稀释的程度优选为每毫升相当于黄芪生药1~2g。
步骤(3)②中所述的超滤为通过5kDa超滤膜进行超滤。
步骤(4)中所述的滤渣除杂的步骤优选如下:在滤渣中加入水溶解,调节pH为6.5~7.5,加入蛋白酶,蛋白酶的终浓度为质量体积比2~3%;在35~45℃下酶解3~5h,接着灭活,离心;在得到的上清液中加入相当于上清液4~6倍体积的无水乙醇,静置24h,过滤,弃去上清液;滤渣加水溶解,冷冻过夜,在室温融化,离心,弃去沉淀;将上清液的pH值调节为4~5,在65~75℃下水浴4~6h,冷却,调节pH值至7~7.5,静置10~12h,粗滤,再超滤,取滤液减压浓缩至浸膏状,得到黄芪多糖提取液。
所述的蛋白酶优选为中性蛋白酶,酶活力等于或大于10万u/g。
所述的灭活的条件优选为煮沸5~10min。
所述的离心的条件优选为4000rpm离心5~15min。
所述的超滤为通过50kDa超滤膜进行超滤。
一种黄芪提取物,通过上述制备方法得到,包括黄芪皂苷提取液和黄芪多糖提取液。
所述的黄芪提取物在制备用于治疗心肌炎的药物中的应用。
该黄芪提取物直接制备用于治疗心肌炎的药物或是与其他药物联合制备用于治疗心肌炎的药物。
该黄芪提取物直接制备用于治疗心肌炎的药物,是将黄芪皂苷提取液和黄芪多糖提取液混合即可。
所述用于治疗心肌炎的药物的剂型,包括注射液、片剂、丸剂。
一种用于治疗心肌炎的药物,包括黄芪提取物和牛磺酸。
所述用于治疗心肌炎的药物的制备方法,包含如下步骤:在上述黄芪皂苷提取液中加入牛磺酸,溶解,合并上述黄芪多糖提取液,用氢氧化钠溶液调节pH值至7~7.5,于2~8℃冷藏24~48h,过滤,稀释至适量浓度,再调节pH值至7~7.5,精滤,灌封,灭菌,得到用于治疗心肌炎的药物,即复方黄芪注射液。
所述的牛磺酸的加入量为每毫升相当于黄芪生药的量(g)的1~3%。
所述的稀释的浓度可根据实际使用情况而定,可稀释为小剂量型,每毫升相当于黄芪生药1~2g;也可稀释至滴注液,每毫升相当于黄芪生药0.08~0.16g。
所述的精滤为使用用孔径在0.22μm以下的微孔滤膜滤过实现。
所述的灭菌的条件应为在100℃下灭菌30~40min。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明提供的制备方法是通过浸制药物再超声提取,可提高黄芪中有效成分的溶出率;并且在醇沉过程中分三步醇沉,由于黄芪多糖中活性较高的为小分子量多糖,并且大分子物质会提高注射液的不安全性,因此前两步醇沉废渣弃去,可除去一部分蛋白质、大分子多糖等杂质;再保留第三步醇沉滤渣,利用蛋白酶及冷冻法除去剩余蛋白质杂质,并在酸性条件下水解降低多糖分子量,以便在超滤中提高多糖利用率,保留活性较高的小分子多糖,提高药效,同时克服传统一步醇沉提取多糖其杂质含量过高的缺点(一般纯度约50%左右),可提高纯度约30%~40%。此外,利用明胶出去黄芪皂苷中少量鞣质杂质。
(2)本发明提供的制备方法不仅可提高黄芪注射液的纯度,保持注射液在储存过程中的稳定性,克服传统简单的水提醇沉法杂质较多易析出沉淀的缺点,并且可直接制成小剂量注射液或滴注液,使用方便。
(3)本发明提供的治疗心肌炎药物保留了黄芪中皂苷及多糖的有效成分,并加入适量的牛磺酸,可提高治疗效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
取黄芪饮片粉碎,加入相当于黄芪生药10倍体积的水,浸泡8h,在50℃下超声提取30min,超声频率为40kHz;过滤,重复2次,合并滤液,减压浓缩至2g/ml。加入乙醇沉淀除去杂质,分三次处理,第一次加入乙醇使含醇量达到体积百分比50%,冷藏放置15h,过滤,弃去滤渣,滤液减压回收乙醇至无醇味;第二次在滤液中加入乙醇使含醇量为65%,冷藏放置24h,过滤,弃去滤渣,滤液减压回收乙醇至无醇味;第三次在滤液加入乙醇使含醇量达90%,冷藏放置24h,过滤,滤渣备用;滤液减压回收乙醇至无醇味并浓缩滤液至浸膏状,加入注射用水溶解稀释至0.5g/ml,冷藏放置24h,过滤,再减压浓缩至4g/ml,调节pH值为5,加入体积百分比为1%的已配置好的明胶溶液,静置后过滤,滤液加入乙醇至含醇量达体积百分比的75%,静置,过滤,减压回收乙醇后稀释,用5kDa的超滤膜超滤,收集滤液,将其减压浓缩至5g/ml,冷藏24h,过滤,得到黄芪皂苷提取液。采用高效液相色谱法测试提取液中黄芪甲苷含量为1.25mg/ml,测定条件为采用C18柱,以乙腈:水=3:7为流动相,流速1ml/min。最后在提取液中加入牛磺酸,使其浓度达0.1g/ml,溶解。
将上述保留的滤渣加水溶解,调节pH为6.5,加入蛋白酶(中性蛋白酶,10万u/g,下同),终浓度为2%;在37℃下酶解3h后煮沸5min,4000r/min条件下离心10min,加入所得清液5倍体积的无水乙醇,沉淀,静置24h,过滤,滤渣加水溶解,冷冻过夜,在室温缓慢融化,4000r/min条件下离心弃去沉淀;调节pH为5,在65℃下水浴4h,冷却,调节pH至7.5,静置10h,粗滤,再用50kDa的超滤膜超滤,取滤液减压浓缩至浸膏状,制得黄芪多糖提取液。采用凝胶色谱法测得该黄芪多糖分子量多分布于25000~35000,占总糖的73%;并取适量提取液蒸发至干,用比色法测得其纯度为89%。
合并上述加入牛磺酸的黄芪皂苷提取液及黄芪多糖提取液,用氢氧化钠溶液调节pH至7.5,冷藏24h,过滤,稀释至2g/ml,再调节pH至7.5,用0.22μm的微孔滤膜精滤,灌封,100℃下灭菌30min,即得复方黄芪注射液。本品于室温条件下放置3年未见沉淀产生。
实施例2
取黄芪饮片粉碎,加入相当于黄芪生药12倍体积的水,浸泡10h,在65℃下超声提取35min,超声频率为40kHz;过滤,重复3次,合并滤液,减压浓缩至2.5g/ml;加入乙醇沉淀除去杂质,分三次处理,第一次加入乙醇使含醇量达到52%,冷藏放置18h,过滤,弃去滤渣,滤液减压回收乙醇至无醇味;第二次在滤液中加入乙醇使含醇量为70%,冷藏放置36h,过滤,弃去滤渣,滤液减压回收乙醇至无醇味;第三次在滤液加入乙醇使含醇量达95%,冷藏放置36h,过滤,滤渣备用;滤液减压回收乙醇至无醇味并浓缩滤液至浸膏状,加入注射用水溶解稀释至1g/ml,冷藏放置24h,过滤,再减压浓缩至5g/ml,调节pH为4.5,加入体积百分比为1.5%的已配置好的明胶溶液,静置后过滤,滤液加入乙醇至含醇量为75%,静置,过滤,减压回收乙醇后稀释,用5kDa的超滤膜超滤,收集滤液,将其减压浓缩至5.5g/ml,冷藏24h,过滤,得到黄芪皂苷提取液。采用高效液相色谱法测试提取液中黄芪甲苷含量为1.59mg/ml,测定条件为采用C18柱,以乙腈:水=3:7为流动相,流速1ml/min。最后在提取液中加入牛磺酸,使其浓度达0.15g/ml,溶解。
将上述保留的滤渣加水溶解,调节pH为7.0,加入蛋白酶,蛋白酶的终浓度为2.5%;在40℃下酶解4h后煮沸8min,4000r/min条件下离心10min,加入所得清液5倍体积的无水乙醇,静置24h,过滤,滤渣加水溶解,冷冻过夜,在室温缓慢融化,4000r/min条件下离心弃去沉淀;调节ph为4.5,在70℃下水浴5h,冷却,调节pH至7.5,静置10h,粗滤,再用50kDa的超滤膜超滤,取滤液减压浓缩至浸膏状,制得黄芪多糖提取液。采用凝胶色谱法测得该黄芪多糖分子量多分布于20000~30000,占总糖的68%;并取适量提取液蒸发至干,用比色法测得其纯度为92%。
合并上述加入牛磺酸的黄芪皂苷提取液及黄芪多糖提取液,用氢氧化钠溶液调节pH至7.5,冷藏36h,过滤,稀释至2g/ml,再调节pH至7.5,用0.22μm的微孔滤膜精滤,灌封,100℃下灭菌35min,即得复方黄芪注射液。。本品于室温条件下放置3年未见沉淀产生。
实施例3
取黄芪饮片粉碎,加入相当于黄芪生药15倍体积的水,浸泡12h,在70℃下超声提取40min,超声频率为40kHz;过滤,重复3次,合并滤液,减压浓缩至3g/ml;加入乙醇沉淀除去杂质,分三次处理,第一次加入乙醇使含醇量达到55%,冷藏放置20h,过滤,弃去滤渣,滤液减压回收乙醇至无醇味;第二次在滤液中加入乙醇使含醇量为75%,冷藏放置48h,过滤,弃去滤渣,滤液减压回收乙醇至无醇味;第三次在滤液加入乙醇使含醇量达95%,冷藏放置48h,过滤,滤渣备用;滤液减压回收乙醇至无醇味并浓缩滤液至浸膏状,加入注射用水溶解稀释至1.5g/ml,冷藏放置24h,过滤,再减压浓缩至6g/ml,调节pH为5,加入体积百分比为2%的已配置好的明胶溶液,静置后过滤,滤液加入乙醇至含醇量为75%,静置,过滤,减压回收乙醇后稀释,用5kDa的超滤膜超滤,收集滤液,将其减压浓缩至6g/ml,冷藏24h,过滤,得到黄芪皂苷提取液。采用高效液相色谱法测试提取液中黄芪甲苷含量为1.95mg/ml,测定条件为采用C18柱,以乙腈:水=3:7为流动相,流速1ml/min。最后在提取液中加入牛磺酸,使其浓度达0.18g/ml,溶解。
将上述保留的滤渣加水溶解,调节pH为7.5,加入蛋白酶,蛋白酶的终浓度为3%,在43℃下酶解5h后煮沸10min,4000r/min条件下离心10min,加入所得清液6倍体积的无水乙醇,静置24h,过滤,滤渣加水溶解,冷冻过夜,在室温缓慢融化,4000r/min条件下离心弃去沉淀;调节pH为5,在75℃下水浴6h,冷却,调节pH至7.5,静置12h,粗滤,再用50kDa的超滤膜超滤,取滤液减压浓缩至浸膏状,制得黄芪多糖提取液。采用凝胶色谱法测得该黄芪多糖分子量多分布于20000~25000,占总糖的65%;并取适量提取液蒸发至干,用比色法测得其纯度为93%。
合并上述加入牛磺酸的黄芪皂苷提取液及黄芪多糖提取液,调节pH至7.5,冷藏48h,过滤,稀释至2g/ml,再调节ph至7.5,用0.22μm的微孔滤膜精滤,灌封,100℃下灭菌40min,即得复方黄芪注射液。。本品于室温条件下放置3年未见沉淀产生。
对比例1采用传统的水提醇沉方法提取
取黄芪饮片粉碎,加入相当于黄芪生药10倍体积的水,加热回流2次,每次2h,合并提取液;减压浓缩至粘稠状。加入乙醇,乙醇的终浓度为体积百分比90%,搅拌至沉淀完全析出,过滤,取滤液,保留滤渣。分别取滤液减压浓缩至2g/ml,加入氢氧化钠溶液调节pH值为7.5,放置过夜,得到黄芪皂苷提取液;滤渣溶解得黄芪多糖提取液。
采用高效液相色谱法测得到黄芪皂苷提取液中黄芪甲苷含量为0.7mg/ml;采用比色法测得黄芪多糖纯度为53%。经室温放置观察,提取液在2.5个月后出现沉淀。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种黄芪提取物的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将黄芪粉碎,加水浸泡,超声提取,过滤,取滤液;将滤液浓缩,得到浓缩液;
(2)在浓缩液中加入乙醇提取,共3次,具体如下:
①在浓缩液中加入乙醇,乙醇的用量按最终得到的溶液中含醇量达到体积百分比50~55%计算;冷藏放置,过滤,弃去滤渣,将滤液减压回收乙醇至无醇味;
②在步骤①最终得到的滤液中加入乙醇,乙醇的用量按最终得到的溶液中含醇量达到体积百分比65~75%,冷藏放置,过滤,弃去滤渣,滤液减压回收乙醇至无醇味;
③在步骤②最终得到的滤液中加入乙醇,乙醇的用量按最终得到的溶液中含醇量达到体积百分比90%以上,冷藏放置,过滤,滤渣备用,滤液减压回收乙醇至无醇味并浓缩滤液至浸膏状,得到膏体;
(3)黄芪皂苷提取液的制备:
①在步骤(2)③得到的膏体中加入注射用水溶解稀释至0.5~1.5g/ml,冷藏放置,过滤,滤液减压浓缩;
②将浓缩液的pH值调节为4~5,加入适量3%(w/w)明胶溶液;静置后过滤,在得到的滤液中加入乙醇至含醇量为体积百分比75%,静置,过滤,减压回收乙醇后稀释,超滤;
③超滤得到的滤液再减压浓缩至5~6g/ml,得到黄芪皂苷提取液;
(4)将步骤(2)③得到的滤渣除杂,得到得黄芪多糖提取液;
(5)将步骤(3)得到的黄芪皂苷提取液和步骤(4)得到的黄芪多糖提取液组合,即为黄芪提取物。
2.根据权利要求1所述黄芪提取物的制备方法,其特征在于:步骤(1)的操作如下:将黄芪粉碎,加水浸泡,超声提取,过滤,取滤液;将得到的滤渣按前述步骤重复提取至少1次;将得到的滤液合并,浓缩,得到浓缩液。
3.根据权利要求1或2所述黄芪提取物的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的水的体积用量为相当于所述黄芪质量的10~15倍;
步骤(1)中所述的浸泡的时间为8~12h;
步骤(1)中所述的超声提取的条件为60~70℃下超声提取30~40min,超声提取的频率为40kHz;
步骤(1)中所述的浓缩的程度为浓缩至1~3g/ml。
4.根据权利要求1所述黄芪提取物的制备方法,其特征在于:
步骤(2)①中所述的冷藏放置的条件为于2~8℃放置至少15小时;
步骤(2)②中所述的冷藏放置的条件为于2~8℃放置至少24小时;
步骤(2)③中所述的冷藏放置的条件为于2~8℃放置至少24小时。
5.根据权利要求1所述黄芪提取物的制备方法,其特征在于:
步骤(3)①和③中所述的冷藏放置的条件为于2~8℃放置24h;
步骤(3)①中所述的浓缩的程度为浓缩至4~6g/ml;
步骤(3)②中所述稀释的程度为每毫升相当于黄芪生药1~2g;
步骤(3)②中所述的超滤为通过5kDa超滤膜进行超滤。
6.根据权利要求1所述黄芪提取物的制备方法,其特征在于:
步骤(4)中所述的滤渣除杂的步骤如下:在滤渣中加入水溶解,调节pH为6.5~7.5,加入蛋白酶,蛋白酶的终浓度为质量体积比2~3%;在35~45℃下酶解3~5h,接着灭活,离心;在得到的上清液中加入相当于上清液4~6倍体积的无水乙醇,静置24h,过滤,弃去上清液;滤渣加水溶解,冷冻过夜,在室温融化,离心,弃去沉淀;将上清液的pH值调节为4~5,在65~75℃下水浴4~6h,冷却,调节pH值至7~7.5,静置10~12h,粗滤,再超滤,取滤液减压浓缩至浸膏状,得到黄芪多糖提取液。
7.一种黄芪提取物,其特征在于:通过权利要求1~6任一项制备方法得到,包括黄芪皂苷提取液和黄芪多糖提取液。
8.权利要求7所述的黄芪提取物在制备用于治疗心肌炎的药物中的应用。
9.一种用于治疗心肌炎的药物,其特征在于:包括牛磺酸和权利要求7所述的黄芪提取物。
10.权利要求9所述用于治疗心肌炎的药物的制备方法,其特征在于包含如下步骤:在权利要求7中所述的黄芪皂苷提取液中加入牛磺酸,溶解,合并权利要求7中所述的黄芪多糖提取液,用氢氧化钠溶液调节pH值至7~7.5,于2~8℃冷藏24~48h,过滤,稀释至适量浓度,再调节pH值至7~7.5,精滤,灌封,灭菌,得到用于治疗心肌炎的药物。
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