CN102653566A - 一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种硒化多糖的制备方法，尤其涉及一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法。该方法将黄芪多糖粗品在40～60℃酶解30～60min，沸水浴6～9min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上柱、将洗脱液蒸干后得黄芪多糖纯品；再将黄芪多糖纯品硒化，具体是将黄芪多糖纯品加入到脱水吡啶中，搅拌分散均匀；然后滴入氯化亚硒酰和丁二酸，充分搅拌后加入钠含量为6～15%的硝酸钠溶液，在常温下硒化反应12～20h得悬浊液A；然后在悬浊液A中加入硫酸，沉淀离心、透析，再用无水乙醇沉淀离心，真空冷冻，用四氯化碳干燥后得粉末状硒化黄芪多糖。本方法的黄芪多糖得率较高、硒化剂使用量较小、硒化反应时间较短、含硒量高、稳定性高、生物学效价高。
Description
技术领域
本发明涉及一种硒化多糖的制备方法，尤其涉及一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法。
背景技术
在过去的几十年中，抗生素作为饲料添加剂在畜禽疾病防治，提高动物生产性能方面起到了重要作用。但是，抗生素类添加剂长期使用，导致其产生抗药性和畜产品中的药物残留通过食物残留，通过事物食物链直接影响人类健康，而且会给人类的疾病防治带来困难。
黄芪不但是一味免疫增强剂及具有杀菌、抗病毒等药理作用的良药，而且是一味具有促生长、提高生产效率的畜禽饲料添加剂。
黄芪( Astragalus)是豆科植物中常用中草药，黄芪多糖(Astragalus Polysacharin，APS)是黄芪中最重要的天然有效成分，是黄芪药理作用中起决定性因素的一类大分子化合物，具有促进免疫器官功能和抗体生成，抗菌抗病毒和抗肿瘤，防哀老及抗辐射，双向调节血糖等作用。自1981年黄芪多糖被提取分离以来，研究报道不断增多，作用范围日益扩大，对黄芪多糖的研究引起了人们的极大关注。但是传统黄芪多糖的提取工艺得到多糖粗品的收率极低，加上提取成本很高，使得黄芪多糖的开发利用受到限制。
硒是动物必需的微量元素，而若干多糖又具有显著的生物活性，硒与黄芪多糖的结合，具有双重功效，可提高黄芪多糖的生物学功能，尤其可提高动物免疫功能。从天然黄芪等样品中提取出的多糖含硒量很低，通常<10 ug/g这样低的含硒量不能满足人们的要求。
CN1560088A公开了一种硒化葡甘聚糖的制备方法，在一种Se6+溶液中加入乙醇和盐酸，制成硒化反应液，然后加入葡甘聚糖，制成硒化葡甘聚糖，硒含量为125.4～197.3ug/g。
CN200910162003.4公开了一种有机法制备硒化多糖的方法，该方法是以蕨麻多糖或沙蒿多糖为原料，利用亚硒酸和氯化亚砜合成的一种硒化试剂，制备硒化多糖的一种方法。
然而以上专利制备硒多糖的硒化剂使用量较大、硒化反应时间较长、含硒量不高、生物学效价低。
CN101654486A公开了一种硒化黄芪多糖的制备方法，该方法将黄芪多糖加入到吡啶中，然后添加含硒试剂SeOC12反应一段时间，再用无水乙醇洗涤，沉淀离心，真空冷冻干燥，得到硒化黄芪多糖，产物中硒含量为15950ug/g。
然而该方法未涉及如何提取得率较高的黄芪多糖，并且制备的硒化黄芪多糖稳定性不高。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄芪多糖得率较高、硒化剂使用量较小、硒化反应时间较短、含硒量高、稳定性高、生物学效价高的硒化黄芪多糖的制备方法。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，包括以下步骤： 1）从黄芪粗粉中制备黄芪多糖提取液；
2）将步骤1）所得的黄芪多糖提取液进行分离得黄芪多糖粗品；
3）将步骤2）所得的黄芪多糖粗品纯化：采用中性蛋白酶将步骤2）所得的黄芪多糖粗品在40～60℃酶解30～60min，沸水浴6～9min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上柱、将洗脱液蒸干后得黄芪多糖纯品；
4）将步骤3）所得的黄芪多糖纯品硒化：
① 合成硒含量为1.5～3.8%的含硒试剂氯化亚硒酰（SeOC12）；
将黄芪多糖纯品加入到脱水吡啶中，搅拌分散均匀；然后滴入氯化亚硒酰和丁二酸，充分搅拌后加入钠含量为6～15%的硝酸钠溶液，在常温下硒化反应12～20h得悬浊液A，每千克所述黄芪多糖纯品的氯化亚硒酰用量为0.5～3L，每千克所述黄芪多糖纯品的吡啶用量为6～8L，每千克所述黄芪多糖纯品的丁二酸用量为0.3～0.5L；
③ 在悬浊液A中加入硫酸，搅拌6～9h，再用浓度为70～90%的无水乙醇沉淀离心2～5次；
④ 用水溶解沉淀后透析8～10h；
⑤ 再用无水乙醇沉淀离心，真空冷冻，用四氯化碳干燥后得粉末状硒化黄芪多糖。
本发明步骤3）中采用酶法脱除多糖中的蛋白可提高糖含量和黄芪多糖得率，步骤4中加入丁二酸作为硒化反应的催化剂可减少硒化剂用量，缩短硒化反应时间，加入硝酸钠作为硒化黄芪多糖的化学稳定剂，采用化学保护方式，减少硒活化功能，提高硒化黄芪多糖的稳定性；而本发明的含硒试剂与黄芪多糖在步骤4的各关联条件下可制得含硒量较高的硒化黄芪多糖，生物学效价更高。
作为本发明技术方案的一种优选，所述步骤1）为称取黄芪粗粉270.0g，用正丁醇溶剂按料液比1:6在100℃下浸渍浸提90min、连续浸提3次，抽滤得黄芪多糖提取液。
作为本发明技术方案的一种优选，所述步骤2）为加入5倍黄芪多糖提取液体积的、体积浓度为90%的乙醇进行沉淀分离，沉淀时间为4h，干燥得黄芪多糖粗品。
作为本发明技术方案的一种优选，所述步骤3）为采用中性蛋白酶将步骤2）所得的黄芪多糖粗品在40～60℃酶解30～60min，沸水浴6～9min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上AB-8大孔吸附树脂吸附，上柱流速为2ml/min，吸附12h，然后用30%乙醇洗脱，洗脱流速2ml/min，将洗脱液蒸干，得黄芪多糖纯品。
更优选地，所述步骤3）为采用中性蛋白酶将步骤2）所得的黄芪多糖粗品在55℃酶解40min，沸水浴8min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上AB-8大孔吸附树脂吸附，上柱流速为2ml/min，吸附12h，然后用30%乙醇洗脱，洗脱流速2ml/min，将洗脱液蒸干，得黄芪多糖纯品。
作为本发明技术方案的一种优选，所述步骤4）中的含硒试剂氯化亚硒酰的硒含量为3%。
作为本发明技术方案的一种优选，所述步骤4）的步骤②中的硒化反应时间为15～18h。
作为本发明技术方案的一种优选，所述步骤4）的步骤②中每千克黄芪多糖纯品的氯化亚硒酰硒化剂用量为1.2～2升。
作为本发明技术方案的一种优选，所述步骤4）的步骤④具体为用水溶解沉淀后透析8～10h。
更优选地，所述步骤4）的步骤④用水溶解沉淀后透析9h。
具体实施方式
实施例一
黄芪多糖的制备：称取1kg黄芪粗粉，用水作溶剂按料液比1:6在100℃下浸渍浸提90min、连续浸提3次，抽滤得黄芪多糖提取液5.2L；加入23L、90%的乙醇进行沉淀分离，沉淀时间为4h，干燥得黄芪多糖粗品450.6g。按照配制标准曲线的方法处理，在490nm处测定其吸光度。采用中性蛋白酶将黄芪多糖粗品在55℃酶解40min，沸水浴7min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上AB-8大孔吸附树脂吸附，上柱流速为2ml/min，吸附12h，然后用30%乙醇洗脱，洗脱流速2ml/min，将洗脱液蒸干，得黄芪多糖纯品350.5g。
用制得的黄芪多糖纯品制备硒化黄芪多糖：量取硒含量为1.5%的含硒试剂SeOC12175ml、丁二酸105ml，待用；将350.5g黄芪多糖纯品加入到2.1L脱水吡啶中，搅拌分散均匀；然后滴入配制好的SeOC12和丁二酸，充分搅拌后加入钠含量为6%的硝酸钠溶液，在常温下硒化反应12h得悬浊液A；在悬浊液A中加入35%的硫酸200ml，搅拌6h，再用浓度为70%的无水乙醇沉淀离心2次；用水溶解沉淀后透析8h；然后再用无水乙醇沉淀离心，真空冷冻，用四氯化碳干燥后得粉末状硒化黄芪多糖390.6g。
用荧光法测定最终产品硒化黄芪多糖中的含硒量，具体结果见表1。
实施例二
黄芪多糖的制备：称取1kg黄芪粗粉，用正丁醇作溶剂按料液比1:6在100℃下浸渍浸提90min、连续浸提3次，抽滤得黄芪多糖提取液5.5L；加入27.5L、90%的乙醇进行沉淀分离，沉淀时间为4h，干燥得黄芪多糖粗品480.6g。按照配制标准曲线的方法处理，在490nm处测定其吸光度。采用中性蛋白酶将黄芪多糖粗品在40℃酶解60min，沸水浴9min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上AB-8大孔吸附树脂吸附，上柱流速为2ml/min，吸附12h，然后用30%乙醇洗脱，洗脱流速2ml/min，将洗脱液蒸干，得黄芪多糖纯品400.8g。
用制得的黄芪多糖纯品制备硒化黄芪多糖：量取硒含量为3.8%的含硒试剂SeOC121050ml、丁二酸175ml，待用；将400.8g黄芪多糖纯品加入到2.8L脱水吡啶中，搅拌分散均匀；然后滴入配制好的SeOC12和丁二酸，充分搅拌后加入钠含量为15%的硝酸钠溶液，在常温下硒化反应20h得悬浊液A；在悬浊液A中加入35%的硫酸400ml，搅拌9h，再用浓度为90%的无水乙醇沉淀离心5次；用水溶解沉淀后透析10h；然后再用无水乙醇沉淀离心，真空冷冻，用四氯化碳干燥后得粉末状硒化黄芪多糖435.2g。
实施例三
黄芪多糖的制备：称取1kg黄芪粗粉，用正丁醇作溶剂按料液比1:6在100℃下浸渍浸提90min、连续浸提3次，抽滤得黄芪多糖提取液5.5L；加入27.5L、90%的乙醇进行沉淀分离，沉淀时间为4h，干燥得黄芪多糖粗品480.6g。按照配制标准曲线的方法处理，在490nm处测定其吸光度。采用中性蛋白酶将黄芪多糖粗品在40℃酶解60min，沸水浴9min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上聚酰胺大孔吸附树脂吸附，上柱流速为1ml/min，吸附18h，然后用40%乙醇洗脱，洗脱流速1ml/min，将洗脱液蒸干，得黄芪多糖纯品328.6g。
用制得的黄芪多糖纯品制备硒化黄芪多糖的方法同实施例一，制得粉末状硒化黄芪多糖352.6g。
实施例四
黄芪多糖的制备：称取1kg黄芪粗粉，用正丁醇作溶剂按料液比1:6在100℃下浸渍浸提90min、连续浸提3次，抽滤得黄芪多糖提取液5.5L；加入27.5L、90%的乙醇进行沉淀分离，沉淀时间为4h，干燥得黄芪多糖粗品480.6g。按照配制标准曲线的方法处理，在490nm处测定其吸光度。采用中性蛋白酶将黄芪多糖粗品在55℃酶解40min，沸水浴8min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上AB-8大孔吸附树脂吸附，上柱流速为2ml/min，吸附12h，然后用30%乙醇洗脱，洗脱流速2ml/min，将洗脱液蒸干，得黄芪多糖纯品415g。
用制得的黄芪多糖纯品制备硒化黄芪多糖：量取硒含量为3%的含硒试剂SeOC12820ml、丁二酸160ml，待用；将415g黄芪多糖纯品加入到2.9L脱水吡啶中，搅拌分散均匀；然后滴入配制好的SeOC12和丁二酸，充分搅拌后加入钠含量为10%的硝酸钠溶液，在常温下硒化反应15h得悬浊液A；在悬浊液A中加入35%的硫酸400ml，搅拌8h，再用浓度为90%的无水乙醇沉淀离心3次；用水溶解沉淀后透析10h；然后再用无水乙醇沉淀离心，真空冷冻，用四氯化碳干燥后得粉末状硒化黄芪多糖460.4g。
实施例五
黄芪多糖的制备同实施例四。
用制得的黄芪多糖纯品制备硒化黄芪多糖同实施例四。不同的是硒化反应时间为18h，用水溶解沉淀后透析9h。
比较实施例一
同实施例一，不同的是黄芪多糖制备中步骤1料液比1:8，提取温度80℃，提取60min，提取2次。
比较实施例二
同实施例二，不同的是用制得的黄芪多糖纯品制备硒化黄芪多糖中含硒试剂SeOC12的硒含量为4%。
比较实施例三
同实施例三，不同的是用制得的黄芪多糖纯品制备硒化黄芪多糖中，步骤④透析4h。
比较实施例四
同实施例一，不同的是用制得的黄芪多糖纯品制备硒化黄芪多糖中，步骤⑤用氮气干燥。
比较实施例五
同实施例二，不同的是每千克所述黄芪多糖纯品的氯化亚硒酰用量为5L。
比较实施例六
同实施例三，不同的是每千克所述黄芪多糖纯品的吡啶用量为3L。
比较实施例七
同实施例四，不同的是每千克所述黄芪多糖纯品的丁二酸用量为0.1L。
比较实施例八
同实施例五，不同的是黄芪多糖制备中未采用酶法脱除多糖中的蛋白，具体步骤为：直接将步骤2）所得的黄芪多糖粗品上AB-8大孔吸附树脂吸附，上柱流速为2ml/min，吸附12h，然后用30%乙醇洗脱，洗脱流速2ml/min，将洗脱液蒸干，得黄芪多糖纯品。
比较实施例九
同实施例五，不同的是用制得的黄芪多糖纯品制备硒化黄芪多糖中，未加入丁二酸和硝酸钠。
表1 各实施例的检测结果对比
从表1可以看出，按照本发明的优选条件制出的黄芪多糖得率最高（见实施例四和实施例五）；未加入丁二酸作催化剂和硝酸钠作稳定剂，硒化剂使用量较大，硒化反应时间长，硒化黄芪多糖产品的稳定性不高，产品硒含量低（见比较实施例九）。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，包括以下步骤：
1）从黄芪粗粉中制备黄芪多糖提取液；
2）将步骤1）所得的黄芪多糖提取液进行分离得黄芪多糖粗品；
3）将步骤2）所得的黄芪多糖粗品纯化：采用中性蛋白酶将步骤2）所得的黄芪多糖粗品在40～60℃酶解30～60min，沸水浴6～9min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上柱、将洗脱液蒸干后得黄芪多糖纯品；
4）将步骤3）所得的黄芪多糖纯品硒化：
① 合成硒含量为1.5～3.8%的含硒试剂氯化亚硒酰；
③ 在悬浊液A中加入硫酸，搅拌6～9h，再用浓度为70～90%的无水乙醇沉淀离心2～5次；
④ 用水溶解沉淀后透析8～10h；
⑤ 再用无水乙醇沉淀离心，真空冷冻，用四氯化碳干燥后得粉末状硒化黄芪多糖。
2.根据权利要求1所述的一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤1）为称取黄芪粗粉270.0g，用正丁醇溶剂按料液比1:6在100℃下浸渍浸提90min、连续浸提3次，抽滤得黄芪多糖提取液。
3.根据权利要求2所述的一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤2）为加入5倍黄芪多糖提取液体积的、体积浓度为90%的乙醇进行沉淀分离，沉淀时间为4h，干燥得黄芪多糖粗品。
4.根据权利要求3所述的一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤3）为采用中性蛋白酶将步骤2）所得的黄芪多糖粗品在40～60℃酶解30～60min，沸水浴6～9min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上AB-8大孔吸附树脂吸附，上柱流速为2ml/min，吸附12h，然后用30%乙醇洗脱，洗脱流速2ml/min，将洗脱液蒸干，得黄芪多糖纯品。
5.根据权利要求4所述的一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤3）为采用中性蛋白酶将步骤2）所得的黄芪多糖粗品在55℃酶解40min，沸水浴8min灭酶，冷却至室温后，离心，除去变性酶沉淀，然后上AB-8大孔吸附树脂吸附，上柱流速为2ml/min，吸附12h，然后用30%乙醇洗脱，洗脱流速2ml/min，将洗脱液蒸干，得黄芪多糖纯品。
6.根据权利要求1所述的一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤4）中的含硒试剂氯化亚硒酰的硒含量为3%。
7.根据权利要求1所述的一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤4）的步骤②中的硒化反应时间为15～18h。
8.根据权利要求7所述的一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤4）的步骤②中每千克黄芪多糖纯品的氯化亚硒酰硒化剂用量为1.2～2升。
9.根据权利要求8所述的一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤4）的步骤④为用水溶解沉淀后透析8～10h。
10.根据权利要求9所述的一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，其特征在于：所述步骤4）的步骤④用水溶解沉淀后透析9h。
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