CN103342755B - 枸杞多糖均一级份ⅳ及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枸杞多糖均一级份Ⅳ，它的重均分子量为23000道尔顿，它是以枸杞子为原料，先经加水煎煮，醇沉得到枸杞粗多糖，然后将枸杞粗多糖用大孔吸附树脂脱色与除杂蛋白，再上DEAE-52纤维素柱，依次用去离子水及0.05、0.10、0.5M氯化钠溶液洗脱，收集0.5M氯化钠溶液洗脱部分，浓缩后透析，干燥得到的。本发明还公开了它的制备方法以及在制备糖尿病糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗治疗药物中的应用。本发明疗效确切，与现有的枸杞多糖提取物和制剂相比，杂质更少，有效物质的含量更高，产品质量更加可控，潜在的安全性风险更少。本发明制备方法简单，生产周期短，成本低。<!--1-->

Description

枸杞多糖均一级份Ⅳ及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及枸杞多糖（Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP）均一级份Ⅳ及其制备方法和应用。

背景技术

二型糖尿病（T2DM）以胰岛素抵抗（IR）和胰岛β细胞功能进行性下降为特征。IR指肝脏、脂肪、骨骼肌等组织对循环中正常水平胰岛素的敏感性降低，是肥胖、高血压、血脂障碍、糖尿病和动脉粥样硬化等疾病的共同病理生理改变之一。

枸杞是茄科植物枸杞或宁夏枸杞的果实，其中LBP的含量在4～10%，是植物多糖中少有的一种水溶性酸性杂多糖蛋白。其单糖主要由阿拉伯糖（Ara），鼠李糖（Rha），木糖（Xyl），甘露糖（Man），半乳糖（Gal）和葡萄糖（Glc）等6种中性己糖和半乳糖醛酸组成，且以Ara，Gal和Glc含量较多。其多肽主要由组氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸、胱氨酸、谷氨酸和羟脯氨酸等18种氨基酸组成，其中羟脯氨酸含量最高。LBP中存在β-型糖苷键和α-构型吡喃糖和呋喃糖，以及Glycan-O-Ser糖肽结构。实验研究表明，LBP能明显降低高脂饲料喂养的大鼠，以及腹腔注射四氧嘧啶或链脲佐菌素诱导的T1DM模型动物的血糖及血脂水平。LBP还可以显著降低高脂饮食-低剂量STZ诱导的T2DM大鼠血糖与血脂水平，降低外周组织胰岛素抵抗，预防糖尿病肾病。LBP降血糖与改善胰岛素抵抗作用与其对胰岛β细胞功能损伤的保护作用，以及刺激骨骼肌细胞表面葡萄糖装运蛋白4（GLUT4）的表达、改善细胞内胰岛素信号传导有密切关系。但上述研究均是以LBP及其非主含量均一多糖为研究对象。本发明我们从枸杞中提取、制备了LBP主含量水溶性均一级份LBP-Ⅳ（重均分子量23000道尔顿），证明其对高脂高糖饮食-低剂量STZ诱导的T2DM大鼠血糖血脂水平有明显抑制作用，并阐明了其可能的作用机制。

发明内容

本发明的目的是提供枸杞多糖均一级份Ⅳ及其制备方法和应用。

枸杞多糖均一级份Ⅳ，它的重均分子量为23000道尔顿，它是以枸杞子为原料，先经加水煎煮，醇沉得到枸杞粗多糖，然后将枸杞粗多糖用非极性D101-I大孔吸附树脂脱色与除杂蛋白，再上DEAE-52纤维素柱，依次用去离子水及0.05、0.10、0.5M氯化钠溶液洗脱，收集0.5M氯化钠溶液洗脱部分，浓缩后透析，干燥得到的。

枸杞多糖均一级份Ⅳ的制备方法，包括以下步骤：

1）枸杞粗多糖的制备：以枸杞子为原料，加水煎煮提取，提取液浓缩后再加乙醇醇沉，取醇沉后的沉淀干燥，得到枸杞粗多糖；

2）脱色与除杂蛋白：将枸杞粗多糖加水制成重量浓度为0.8~5%的溶液，调节pH值至4~8，然后过非极性大孔吸附树脂脱色与除杂蛋白；

3）级份分离：将预处理好的DEAE-52纤维素湿法装柱、平衡，然后将步骤2）中经过脱色与脱杂蛋白处理的枸杞粗多糖上柱，依次用去离子水及0.05、0.10、0.5M氯化钠溶液洗脱，收集0.5M氯化钠溶液洗脱部分，浓缩后透析，干燥，得到重均分子量为23000道尔顿的枸杞多糖均一级份Ⅳ。

优选地，步骤1）中枸杞粗多糖的制备方法是：以枸杞子为原料，按枸杞子重量的10倍加水煎煮提取两次，提取液浓缩至生药浓度为1g/mL，然后加乙醇，使乙醇在提取液中的重量含量达到80%，醇沉，取醇沉后的沉淀干燥，得到枸杞粗多糖。此条件下枸杞粗多糖的得率最大，含量最高。

优选地，步骤2）中所述的大孔吸附树脂是非极性D101-I大孔吸附树脂。采用D101-I大孔吸附树脂脱色与除杂蛋白的效果最好。

进一步优选的方案是：步骤2）中脱色与除杂蛋白的方法是：将枸杞粗多糖加水制成重量浓度为1%的溶液，调节pH值至6，然后过大孔吸附树脂脱色与除杂蛋白，所述大孔吸附树脂与所述溶液的质量比为1：7，脱色与除杂蛋白的时间为3h。

本发明进一步研究了LBP-Ⅳ对高脂高糖饮食-低剂量STZ诱导的T2DM大鼠糖脂代谢的调控作用与可能机制。研究内容表明，LBP-Ⅳ用于糖尿病糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗治疗有明显疗效。

本发明疗效确切，与现有的枸杞多糖提取物和制剂相比，杂质更少，有效物质的含量更高，使得产品质量更加可控，潜在的安全性风险更少。本发明采用大孔树脂吸附的方法同时脱杂蛋白和脱色，与现有技术中通常采用的分步进行的方法相比不仅效果更好，而且方法更加简单，生产周期更短，成本更低。

附图说明

图1：Sevag法脱蛋白的蛋白脱除率和多糖损失率曲线图。

图2：三氯乙酸-Sevag法脱蛋白的蛋白脱除率和多糖损失率曲线图。

图3：D101-I大孔吸附树脂脱色中糖液浓度对脱色率、多糖损失率的影响曲线。

图4：D101-I大孔吸附树脂脱色中pH值对脱色率、多糖损失率的影响曲线。

图5：D101-I大孔吸附树脂脱色中脱色时间对脱色率、多糖损失率的影响曲线。

图6：D101-I大孔吸附树脂脱色中树脂用量对脱色率、多糖损失率的影响曲线。

图7：LBP在DEAE-52纤维素层析柱的洗脱曲线。

图8：多糖重均分子量测定的标准曲线。

图9：LBP-IV在SephadexG-100柱上的洗脱曲线。

图10：LBP和LBP-IV给药4周后的大鼠口服糖耐量(OGTT)试验的OGTT时间-血糖曲线。

图11：LBP和LBP-IV给药4周后的大鼠口服糖耐量(OGTT)试验的OGTT曲线下面积。

图12：LBP及LBP-IV对糖尿病大鼠FBG的影响。

图13：LBP及LBP-IV对糖尿病大鼠HbA1c的影响。

图14：LBP及LBP-IV对糖尿病大鼠血脂（TC）的影响。

图15：LBP及LBP-IV对糖尿病大鼠血脂（TG）的影响。

图16：LBP及LBP-IV对糖尿病大鼠血脂（HDL-C）的影响。

图17：LBP及LBP-IV对糖尿病大鼠血脂（LDL-C）的影响。

图18：LBP及LBP-IV对糖尿病大鼠肝脏SREBP-1cmRNA表达的影响。

图19：LBP及LBP-IV对糖尿病大鼠肝脏FASmRNA表达的影响。

图20：LBP及LBP-IV对糖尿病大鼠肝脏PEPCKmRNA表达的影响。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1LBP-Ⅳ的制备方法

1.LBP的提取

LBP的提取流程为：枸杞子→提取→提取液→减压浓缩→乙醇沉淀→冷冻干燥→粗多糖。由于LBP的提取工艺较为成熟，本发明借鉴了文献方法，采用热水浸提法提取枸杞多糖。具体如下：

向枸杞子中加10倍水，100℃浸提两次，合并浸提液减压浓缩至生药浓度为1g/mL（50℃测）；然后在浓缩后的提取液中加入95%的乙醇使得乙醇含量达到80%（重量）。静置醇沉过夜后，通过抽滤、冷冻干燥等步骤得到枸杞粗多糖。采用苯酚-硫酸法测定枸杞粗多糖中多糖含量（%）[=3.17C×D/W]，式中C是枸杞多糖样品以葡萄糖计的含量，W为枸杞子的重量，D是枸杞多糖的稀释因素，3.17是枸杞多糖与葡萄糖之间的换算系数。

1kg枸杞子通过浸提→醇沉→冷冻干燥得到枸杞多糖固形物62.4g，通过硫酸苯酚法测定并计算得其多糖含量为72.5%，则枸杞多糖的提取得率为4.5%。

2.LBP-Ⅳ的制备

2．1枸杞粗多糖脱蛋白工艺

LBP是糖蛋白，但在提取物中仍会有一些杂蛋白存在。脱蛋白的目的是为了除去枸杞粗多糖中游离的杂蛋白。本发明以蛋白脱除率、多糖损失率为指标，对比研究了Sevag法，三氯乙酸-Sevag联合法，及大孔吸附树脂法三种脱蛋白方法的效果。

（1）Sevag法：在粗多糖溶液中按5:1的体积比加入三氯甲烷，然后加入1/5三氯甲烷体积的正丁醇，磁力搅拌器高速搅拌20min，5000r/min离心20min。重复数次，直到无蛋白沉淀为止。弃下层有机相和蛋白沉淀，分别收集离心液并浓缩。经过6次Sevag法脱蛋白，蛋白脱除率在30%左右，多糖损失率也在30%左右（图1）。

（2）三氯乙酸-Sevag法：先在粗多糖溶液中加入一定体积的40%的三氯乙酸，使其终浓度为4%，混匀后于4℃冰箱静置过夜。次日，离心去沉淀（4℃，5000r/min，20min），上清液再用上述sevag法脱蛋白，重复数次，直到无蛋白沉淀为止。弃下层有机相和蛋白沉淀，分别收集离心液并浓缩。经过7次三氯乙酸-Sevag法脱蛋白，蛋白脱除率在25%左右，多糖损失率在40%左右（图2）。

上述两种脱蛋白方法多糖损失率高，且操作过程繁琐、费时，不适合用于枸杞多糖的脱蛋白处理。

2．2枸杞粗多糖脱色工艺

提取的枸杞粗多糖为红棕色或者褐色粉末，含色素杂质，在367nm处有吸光峰。本发明以脱色率、多糖损失率和蛋白损失率为指标，对比研究了活性炭及大孔吸附树脂对枸杞多糖的脱色效果。

（1）活性炭脱色法：精密称量5g枸杞粗多糖充分溶解后，定容100mL，精密量取2g活性炭加入糖液中于60℃下超声1h，5000r/min离心糖液后，用0.45μm滤膜过滤得糖液，重复三次。结果表明。采用活性炭对枸杞多糖溶液进行脱色，脱色率为97.2±5.6%，多糖损失率为69.0±1.3%，蛋白损失率为83.4±4.2%。虽然此法脱色效果很好，但多糖损失率太高，不适合用于枸杞多糖的脱色处理。

（2）大孔树脂静态脱色法：取经预处理后的各种型号的树脂（表1）2.0g于锥形瓶中，加入10mL枸杞多糖提取液，室温震荡（转速120rpm）1h后取出，测定吸附前后溶液中色素、多糖和蛋白的浓度，筛选脱色率相对较高、多糖损失率相对较低的大孔树脂用于后续脱色工艺研究。

表15种大孔树脂静态吸附的脱色、脱蛋白与多糖结果

根据上表结果，非极性的D101-I和D101树脂和弱极性DS401树脂对枸杞多糖液脱色效果较好，其脱色率分别为66.6%，61.1%，61.6%，说明枸杞多糖中的色素分子多数是非极性或弱极性分子。选用D101-I树脂为最适脱色树脂，进一步考察粗多糖溶液pH值（4,5,6,7,8），粗多糖溶液浓度（1%，2%，3%，4%，5%），糖液与树脂用量比例（1/5,1/10,1/15,1/20）及脱色时间（1h，2h，4h，6h，7h，8h，9h，10h）四个因素，对脱色率、多糖损失率和蛋白损失率的影响。结果见图3、4、5、6。

根据上述静态吸附试验结果，最佳脱色与脱杂蛋白的条件为：多糖浓度1%，pH值4-8，树脂与糖液比例1：7，室温脱色3h。在上述条件下，脱色率为85.4±4.7%，多糖损失率为12.3±0.9%，蛋白损失率为40.5±2.3%。D101-I大孔树脂对枸杞多糖的蛋白去除率为40.5%，而多糖损失率却仅12.3%，说明D101-I大孔树脂对枸杞粗多糖不仅具有较好的脱色效果，而且还能在多糖低损失的情况下，有效去除枸杞粗多糖中的杂蛋白。相比分步脱色脱蛋白方法，本发明不仅操作简便快速，而且多糖损失率低，脱色脱杂蛋白效果好。

2．3枸杞多糖的DEAE分离

称取经预处理好的DEAE-52纤维素湿法装柱、平衡。称量50mg经上述脱色与脱杂蛋白的LBP溶于50mL去离子水中，上柱，依次用去离子水及0.05、0.10、0.5M氯化钠洗脱，洗脱液速度5mL/min。用苯酚-硫酸法检测多糖流出，以洗脱管数为横坐标，吸光值为纵坐标做洗脱曲线，收集含糖部分，并依次命名为LBP-I、LBP-II、LBP-III及LBP-IV。分别合并各洗脱液，浓缩后于去离子水中透析24小时，真空冷冻干燥得LBP-I、LBP-II、LBP-III及LBP-IV干品，各均一级份占LBP总量的百分含量分别为8.9%，17.2%，14.4%和55.6%。LBP在DEAE-52纤维素柱(2×10cm)上的洗脱曲线见图7。洗脱液依次为水、0.05、0.10和0.5MNaCl溶液，流速2mL/min,每管收集洗脱液体积为10mL。

3、LBP-IV的分子量测定

采用凝胶分子渗透层析法测定LBP-IV的分子量。称取10gSephadexG-100用去离子水充分溶胀，自然沉降法装柱。LBP-IV的上样量为4mg(2mg/mL水溶液)，去离子水为流动相，洗脱速度0.5mL/min。用蓝色葡聚糖（Mw=200万）测定柱外水体积V0，再将0.2%（w/v）葡聚糖标准品T10、T40、T70、T100（相对分子质量分为1万、4万、7万、10万）水溶液顺序依次上样，上样体积为2mL，苯酚-硫酸法测定各自的洗脱体积（Ve），计算Ve/V0见表2。以Ve/V0对标准品Mw对数值进行线性回归，得回归方程：lgMw=-1.798X+6.793，R²=0.9999，Mw的线性范围为分子量10000-100000。

表2Dextran标准多糖在SephadexG-100柱的洗脱体积

样品	Ve/V0	logM	分子量（×104）
				蓝色葡聚糖		6.3	200
Dextran T100	1	5	10
				Dextran T70	1.08	4.85	7
Dextran T40	1.21	4.60	4
				Dextran T10	1.55	5.68	1

在相同条件下测出LBP-IV的洗脱体积Ve，由标准曲线求得LBP-IV的相对重均分子量为23000。

LBP-IV在SephadexG-100柱(0.5×50cm)上的洗脱曲线见图9。洗脱液为水，流速0.5mL/min,每管收集洗脱液体积为2mL。

实施例2LBP-IV对糖尿病大鼠糖脂代谢的调控作用

1、实验动物与建模方法

SPF级Wistar大鼠（雄性，150-180g，购于湖北省武汉疾病预防控制中心）随机分为糖尿病建模组（喂饲高脂饲料：10%猪油、10%白糖、5%蛋黄粉、1%胆固醇、74%基础饲料）和正常对照组（喂饲基础饲料），分别用相应的饲料喂养6周。期间所有的大鼠均分笼饲养，饲养温度保持在20-25℃之间，相对湿度在40-70%之间，自由取食、进水，昼夜交替时间为12/12h。此阶段平均每三天清理鼠笼一次。六周后，隔夜禁食12小时后，模型组的大鼠按照40mg/kg体重的剂量一次性腹腔注射STZ柠檬酸钠缓冲溶液，正常对照组则注射等体积的柠檬酸缓冲溶液，于注射7d后取尾静脉血，测血糖值。随机血糖值≥16.7mmol/L，且伴有明显多饮、多尿、多食，且体质量下降的大鼠，确定为糖尿病造模成功，＜16.7mmol/L的大鼠弃之。此后所有大鼠均予以常规饲料喂养。正常对照组平均每三天清理鼠笼一次，糖尿病组则每天清理鼠笼一次。

2、动物分组与处理

在确定造模成功后，将糖尿病大鼠随机分为模型对照组，LBP组，LBP-IV高、中、低剂量组，并设正常对照组，每组8只。各组大鼠均自由饮水及进食。LBP和LBP-IV溶液用生理盐水配制。给药剂量如下：正常对照组和模型对照组按体重每日灌胃等量生理盐水，LBP治疗组每日按照100mg/kg体重灌胃LBP溶液，LBP-IV低、中、高剂量治疗组每日按照50、100、200mg/kg体重灌胃LBP-IV溶液。每日给药一次，连续给药4周。

3、血糖与血脂水平检测

给药4周后禁食12h。各组大鼠经眼眶取血，一部分于3000rpm离心10min取血清用于测定血清血糖、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量；另一部分全血抗凝待处理后用于测定糖化血红蛋白（HbA1c）含量。具体测定方法则按照各自试剂盒说明书要求，采用生化分析仪和分光光度计进行吸光度值检测。

4、糖耐量实验

给药4周后动物禁食16小时，自由饮水。之后测空腹血糖水平，再灌胃给予2g/kg体重的葡萄糖溶液，于0、30、60、90、120min时尾尖针刺取血，用血糖仪测定血糖。

5、实时荧光定量PCR实验

给药4周后动物脱颈椎处死取肝脏，并迅速取肝脏相同部分保存于液氮中。用Trizol提取肝组织总RNA，按照Invitrogen公司逆转录试剂盒说明书，将其反转录成cDNA，应用实时荧光定量PCR定量检测肝组织PEPCK，SREBP1-c，FASmRNA的表达水平。内参基因与目标基因PEPCK，SREBP1-c和FAS的引物序列与实时荧光定量PCR条件见表3。

表3大鼠肝脏目标基因和内参基因的引物序列与定量PCR条件

根据各平行复孔的扩增效率，选取16-25个循环的荧光信号，作为检测仪进行结果分析时的基线，读取各管的Ct值，取每三个平行复孔Ct值平均值。按下述公式计算ΔCt,ΔΔCt和相对表达量：ΔCt值=内参基因（36B4）Ct值-目的基因Ct值；ΔΔCt值=（实验组内参基因Ct值-实验组目的基因Ct值）-（对照组内参基因Ct值-对照组目的基因Ct值）；则目的基因/内参基因（影响倍数）=2^-ΔΔCt，结果以平均数±标准差表示。组间比较使用Student-Newman-Keuls多重比较以计算显著性差异，当p<0.05，则具有显著性差异，当p<0.01，则具有显著性差异。

6、实验结果

1）糖耐量（OGTT）实验

糖尿病大鼠在空腹、30、60、90、120min的血糖水平和其曲线下面积（AUC）均显著高于正常对照组（p＜0.01）。经过LBP及LBP-IV各剂量治疗后，糖尿病大鼠血糖水平和其AUC均明显降低（p＜0.01），表明LBP及LBP-IV能改善高脂饮食-低剂量STZ糖尿病模型大鼠的糖耐量，且相同剂量的LBP及LBP-IV对糖尿病大鼠葡萄糖耐量的作用结果基本相当。见图10和图11，图11中，数据用平均值±SD（n=8）表示。#p＜0.05或##p＜0.01：与正常对照组比较；*p＜0.05或**p＜0.01：与模型对照组比较。

2）对空腹血糖（FBG）和糖化血红蛋白（HbA1c）的影响

模型对照组大鼠FBG和HbA1c水平均显著高于正常对照组（p＜0.01）。经过LBP及不同剂量LBP-IV治疗后，糖尿病大鼠的血糖及糖化血红蛋白水平明显降低（p＜0.01或p＜0.05）。相同剂量的LBP与LBP-IV对糖尿病大鼠FBG和HbA1c的影响无显著差异。结果见图12和图13，数据用平均值±SD（n=8）表示。#p＜0.05或##p＜0.01：与正常对照组比较；*p＜0.05或**p＜0.01：与模型对照组比较。

3）对血脂水平的影响

模型对照组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均显著高于正常对照组（p＜0.01）。除LBP-IV低剂量组TC及各剂量LBP与LBP-IV血清HDL-C水平与模型组相比无显著性差异外，各给药组TG、TC、LDL-C水平均显著低于糖尿病模型组（p＜0.01）。此外，LBP-IV与LBP同剂量组相比，对血脂水平的影响均无明显差异。结果见图14~17，数据用平均值±SD（n=8）表示。#p＜0.05或##p＜0.01：与正常对照组比较；*p＜0.05或**p＜0.01：与模型对照组比较。

4）对肝脏PEPCK、SREBP-1c及FASmRNA表达水平的影响

模型对照组大鼠肝脏中PEPCK,SREBP-1c及FASmRNA的表达水平均显著高于正常对照组（p＜0.01）。经LBP和LBP-IV高、中、低剂量治疗后，糖尿病大鼠肝脏中PEPCK,SREBP-1c及FASmRNA表达明显受到抑制（p＜0.01），且LBP组上述基因mRNA的表达水平显著低于正常对照（p＜0.01）。此外，实验结果还表明，LBP对上述基因mRNA表达的抑制作用强于同剂量LBP-IV的抑制作用（p＜0.01）。结果见图18~20，数据用平均值±SD（n=8）表示。#p＜0.05或##p＜0.01：与正常对照组比较；*p＜0.05或**p＜0.01：与模型对照组比较；&p＜0.05或&&p＜0.01：同剂量LBP-IV与LBP比较。

Claims (1)

1.枸杞多糖均一级份Ⅳ的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)枸杞粗多糖的制备：以枸杞子为原料，按枸杞子重量的10倍加水煎煮提取两次，提取液浓缩至生药浓度为1g/mL，然后加乙醇，使乙醇在提取液中的重量含量达到80％，醇沉，取醇沉后的沉淀干燥，得到枸杞粗多糖；

2)脱色与除杂蛋白：将枸杞粗多糖加水制成重量浓度为1％的溶液，调节pH值至6，然后过D101-I大孔吸附树脂脱色与除杂蛋白，所述大孔吸附树脂与所述溶液的质量比为1：7，脱色与除杂蛋白的时间为3h；

3)级份分离：将预处理好的DEAE-52纤维素湿法装柱、平衡，然后将步骤2)中经过脱色与脱杂蛋白处理的枸杞粗多糖上柱，依次用去离子水及0.05、0.10、0.5M氯化钠溶液洗脱，收集0.5M氯化钠溶液洗脱部分，浓缩后透析，干燥，得到重均分子量为23000道尔顿的枸杞多糖均一级份Ⅳ。