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Diese
Offenbarung genießt
den Vorteil von
US-Provisional
Application Serial No. 60/541,235 , eingereicht am 04. Februar
2004.
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Zusammensetzungen aus den Extrakten
von Lycium barbarum als neuroprotektives Mittel gegen β-Amyloidpeptidneurotoxizität, welches
somit ihre Verwendung für
die Behandlung von Alzheimer-Krankheit (AD) und für das Verhindern
von neuronalem Verlust beim Altern gegen die Ansammlung von β-Amyloidpeptid
im Gehirn erlaubt. In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zum Erhalt von Zusammensetzungen mit Anti-β-Amyloidpeptidneurotoxizität aus Lycium
barbarum, und Zubereitungen, enthaltend besagte Zusammensetzungen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren
zur Verwendung von Stresskinasen (c-Jun N-terminale Kinase (JNK)
und doppelsträngige
RNA-abhängige
Proteinkinase (PKR)) als eine technologische Plattform zum Screenen
von neuroprotektiven Wirkstoffen in allen Arten von natürlichen
und synthetischen Chemikalien oder Zubereitungen gegen β-Amyloidpeptidneurotoxizität.
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Hintergrund der Erfindung
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Alzheimer-Krankheit
ist eine altersabhängige chronische
neurodegenerative Erkrankung. Die Hauptsymptome von Alzheimer-Krankheit
sind kognitive und Sprachbeeinträchtigungen
(Yankner, 1996; Ray et al., 1998; Bossy-Wetzel
et al., 2004). Da es sich um eine neurodegenerative Erkrankung
handelt, wird die gesamte Koordination der Patientenbewegungen problematisch.
Es ist vorausgesagt worden, dass mehr als 14 Millionen US-Bürger unter
dieser vernichtenden Krankheit leiden werden (gemäß der American
Health Assistant Foundation). Da alternde Populationen über die
nächsten
paar Jahrzehnte rasch zunehmen, wird das Auftreten dieser Krankheit sicher
ein großes
Gesundheitsproblem und eine Last für alle Regierungen dieser Welt
sein.
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Ein
Hauptproblem, das mit der Alzheimer-Krankheit assoziiert ist, ist
neuronaler Verlust. Das Absterben von Neuronen kann mediiert werden durch
neuronale Apoptose, granulovakuläre
Degeneration oder Synaptose (Stadelmann et al., 1999; Engidawork
et al., 2001; Su et al., 2001; Chang
et al., 2002a; Leroy et al., 2002; Scheff
und Price, 2003; Yu et al., 2004). Neuronale
Apoptose wird mediiert durch verschiedene streng regulierte biologische
Prozesse. Aktivierung von proapoptotischen Mechanismen ist in den
obigen drei Arten von Absterbensprozessen gefunden worden. Zum Beispiel
ist die Aktivierung von Caspase-3 und -8 in postmortem menschlichem AD-Gehirn
gefunden worden (Rohn et al., 2001; Su et
al., 2001; Scheff und Price, 2003). Unser
Labor an der Universität
von Hong Kong und andere Labore haben auch die Aktivierung von Caspase-3
und pro-apoptotischer Stresskinase, der doppelsträngigen RNA-abhängigen Proteinkinase
(PKR) in granulovakulären
degenerativen Neuronen in menschlichen postmortem-AD-Hirnschnitten
gefunden (Chang et al., 2002a). Daher ist die Bekämpfung der Absterbensprozesse
für Neuronen
im Zuge des Alterns, biologischem Stress oder Umweltgiften eine Hauptaufgabe
bei der Entwicklung von Behandlungen für Alzheimer-Krankheit.
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Die
pathologischen Merkmale der Alzheimer-Krankheit sind das Auftreten
von senilen Plaques und neurofibillären Ablagerungen (Alzheimer'sche Degenerationsfibrillen; "neurofibrillary tangles"). Akkumulation oder
sogenannte Ablagerungen von nicht löslichem β-Amyloid(Aβ)-Peptid ist die Hauptkomponente
in solchen senilen Plaques (Ray et al., 1998).
Daher ist es im allgemeinen angenommen worden, dass eine vermehrte
Produktion von unlöslichem
Aβ-Peptid
zu der Bildung von senilen Plaques beiträgt. Tatsächlich ist berichtet worden, dass
die Produktion von unlöslichem
Aβ-Peptid mit dem Alter
zunimmt. Hohe Spiegel von Aβ-Peptid
sind für
Neurone toxisch und führen
neuronaler Apoptose (Iversen et al., 1995; Saido,
2003; Bossy-Wetzel et al., 2004). Vermehrte
Aβ-Produktion
in mutierten menschlichen Amyloidvorläuferprotein (APP-, K670N/M671L-
und V717F-Mutation)
transgenen Mäusen,
und Injektion von Aβ in
alte Rhesus-Affen oder Primaten zeigt auch alzheimerartige Neuropathologie,
neuronalen Tod und korreliert mit Gedächtnisdefiziten. Außer in in-vivo-Tierversuchen
wurde auch in mehreren Laboratorien gezeigt, dass Aβ-Peptid neurotoxische
Effekte hat, die zu neuronaler Apoptose in vitro führen. Daher
wurde seit langem angenommen, dass Aβ-Peptid ein Haupttoxin in der Pathogenese
von Alzheimer-Krankheit
ist.
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Abgesehen
von der Bildung von senilen Plaques ist ein weiteres pathologisches
Merkmal die neurofibillären
Ablagerungen, von welchen angenommen wurde, dass sie mit der abnormalen
Phosphorylierung des Mikrotubulus-assoziierten Tauproteins zusammenhängen (Mandelkow
und Mandelkow, 1998). Viele Umweltgifte, einschließlich Aβ-Peptid sowie
Glutamat, können
eine Hyper-Phosphorylierung von Tauprotein auslösen (Sindou et al., 1994; Rapoport
et al., 2002). Abnormale Phosphorylierung des Tauproteins
kann zur Störung
des Cytoskeletts führen
und des weiteren eine Kaskade der neuronalen Apoptose auslösen (Billingsley
und Kincaid, 1997). Daher ist überlegt worden, dass abnormale
Tauproteinphosphorylierung ein Hauptfaktor ist, der zur Degeneration
von Neuronen beiträgt.
Jedoch haben kontroversielle Ergebnisse gezeigt, dass abnormale
Tauphosphorylierung auch in anderen Arten von neurodegenerativen
Erkrankungen auftreten kann ohne das Problem von Demenz. Außerdem kann
Aβ-Peptidneurotoxizität die Hyperphosphorylierung
von tau auslösen.
Daher wird erwartet, dass hohe Spiegel von Aβ-Peptiden zu Kaskaden von proapoptotischen
Signalwegen führen,
umfassend die abnormale Phosphorylierung von Tauprotein.
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Da
das Hauptsymptom bei Alzheimer-Erkrankung die kognitive Beeinträchtigung
ist, basieren beinahe alle, wenn nicht 100 der gegenwärtigen Behandlungen
der Alzheimer-Krankheit darauf, auf Anticholinesterase abzuzielen.
Bis zur dritten Generation von Anticholinesterase-Medikamenten sind
in der Klinik verwendet worden. Jedoch haben die meisten dieser
Medikamente Nebenwirkungen, die für die Patienten nicht tolerierbar
sein können.
Zusätzlich verlangsamen
diese Medikamente die kognitive Beeinträchtigung, sind jedoch nicht
dazu gedacht, Neurone zu schützen.
Wenn Neurone degenerieren, wird das Problem der kognitiven Beeinträchtigung
immer noch auftreten. Des weiteren ist es angesichts der zunehmenden
Population von alten Menschen in der Welt besser, Neurone zu schützen lange
bevor sie zur Apoptose bestimmt sind. Daher wird Neuroprotektion
zunehmend eine nützliche
und effektive therapeutische Strategie zur Verhinderung des neuronalen
Verlusts in der Alzheimer-Krankheit und dem Altern werden.
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Um
neuronale Apoptose zu verhindern, ist es wichtig, die molekularen
Mechanismen der neuronalen Apoptose aufzuklären. Unser und andere Labors haben
demonstriert, dass die Signifikanz von Stresskinasen wie c-Jun N-terminaler
Kinase (JNK) sowie doppelsträngige
RNA-abhängige
Proteinkinase (PKR) in Aβ-Peptidneurotoxizität, sowie
in der Pathogenese von Alzheimer-Krankheit (Chang et al., 2002b; Peel
und Breesen, 2003; Suen et al., 2003; Onuki
et al., 2004). Kultivierte Neuronen, die Aβ-Peptid ausgesetzt
wurden, zeigen eine rasche Zunahme in der Phosphorylierung von JNK
und PKR. Menschliche postmortem-Alzheimer-Krankheit-Gehirnschnitte
zeigen auch eine hohe Immunreaktivität von phosphorylierter PKR
und JNK (Zhu et al., 2001; Chang et al.,
2002a; Savage et al., 2002; Peel
und Bredesen, 2003; Onuki et al., 2004).
Daher haben wir erkannt, dass die Untersuchung ihrer Phosphorylierung
in Neuronen, welche Aβ-Peptid
ausgesetzt wurden, zwei wesentliche Marker für Neuronen, welche zur Apoptose
bestimmt sind, sein werden. In diesem Zusammenhang wird die Untersuchung
ihrer Phosphorylierung eine nützliche
Technologieplattform für Wirkstoff-Screening
sein, um zu untersuchen, ob Medikamente aus z.B. chinesischen oder
pflanzlichen Medikamenten neuroprotektiv gegenüber Aβ-Peptid wirken können.
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Um
die Langlebigkeit zu fördern
und die Degeneration zu verhindern, sollten verschiedene Strategien,
umfassend körperliche
Betätigung
und Kalorienrestriktion gleichzeitig entwickelt werden. Die tägliche Einnahme
von Antiaging-Supplementen
wie tonischer chinesischer Medizin ist eine gute Strategie, um die
Empfindlichkeit von Zellen gegenüber
Umweltgiftstoffen zu reduzieren. Unter verschiedener chinesischer
und orientalischer Medizin hat die trockene Frucht von Lycium barbarum
(auch bekannt als Fructus Lycii) seit langem seinen Ruf als Antiaging-Supplement
in der chinesischen Medizin verdient und ist eine der Hauptbestandteile
in Rezepturen von vielen traditionellen chinesischen Antiaging-medizinischen
Formulierungen (Lu et al., 1999; Wang et
al., 2002; Deng et al., 2003). Experimentell ist
gezeigt worden, dass Polysaccharidextrakte von Lycium barbarum die
Lebensspanne von männlichen Drosophila
melanogaster signifikant verlängern
können
(Xu et al., 2001). Zusätzlich kann es Hydroxylradikal-induzierte Lipidperoxidation
in der Leber von alten Mäusen
deutlich verringern. Des weiteren ist gezeigt worden, dass Polysaccharidextrakte
aus Lycium barbarum signifikant die CC14-ausgelöste Lebertoxizität reduzieren
können
(Kim et al., 1999). Sie können auch schützende Effekte
gegenüber
Hyperthermie-induzierter Schädigung
von kultiviertem Seminoferous-Epithel ausüben (Wang et al., 2002).
Auf Basis all dieser Beweise zusammengenommen, haben wir nun erkannt,
dass Polysaccharidextrakte aus Lycium barbarum schützende Auswirkungen
auf Neuronen gegenüber
Umwelttoxinen wie β-Amyloid(Aβ)-Peptiden
in AD ausüben.
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Die
vorliegenden Erfinder haben diese Erfindung zustande gebracht, indem
sie belegten, dass die besagten Zusammensetzungen aus wässrigen Extrakten
der Frucht von Lycium barbarum neuroprotektive Auswirkungen gegenüber Aβ-Peptidtoxizität zur Verfügung stellen.
Darüber
hinaus wird die Technologieplattform, die Phosphorylierung von JNK
und PKR zu verwenden, ein effektives Verfahren zum Screenen von
neuroprotektiven Wirkstoffen aus allen Arten von natürlichen
und synthetischen Chemikalien oder Zusammensetzungen gegenüber Aβ-Peptidneurotoxizität sein.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wurden die voranstehenden Ziele und Vorteile ohne weiteres erreicht.
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Gemäß der Erfindung
haben wir entdeckt, dass neue Zusammensetzungen, welche aus Lycium barbarum
extrahiert und gereinigt werden können, effektive Mittel zur
Inhibition von Aβ-Peptid-induziertem neuronalem
Zelltod sind. Wir haben des weiteren gemäß der vorliegenden Erfindung
entdeckt, dass die gereinigten Zusammensetzungen der Erfindung effektive
Mittel zum Schutz vor Aβ-Peptid-induziertem neuronalem
Zelltod sind. In noch weiterer Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung haben wir Verfahren entdeckt, um
neuroprotektive Zusammensetzungen aus Lycium barbarum zu erhalten;
zusätzlich
werden Zubereitungen zur Verfügung
gestellt, welche besagte Zusammensetzungen enthalten. In weiterer Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung haben wir Verfahren zur Reinigung
der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
aus Lycium barbarum entdeckt, sowie deren Charakterisierung.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt neue therapeutische Mittel aus den
Polysaccharidextrakten von Lycium barbarum zur Verfügung, um
neuronalen Tod und neuronale Apoptose in Aβ-Peptidneurotoxizität und Alzheimer-Krankheit zu
verhindern. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Technologie-Plattform zur Verfügung, unter
Verwendung von Western-Blotanalyse
von PKR und JNK, zum Screenen von Wirkstoffen, um neuroprotektive
Mittel gegen neuronalen Verlust in Alzheimer-Krankheit zu entwickeln.
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Wir
haben gezeigt, dass die vorliegenden Polysaccharidextrakte aus Lycium
barbarum Aβ-Peptid
ausgelöste
Freisetzungen von Lactatdehydrogenase (LDH), Caspase-3- und -2-Aktivierung, und
PKR- und JNK-Aktivierung verringern, durch Untersuchung der morphologischen
Veränderungen von
Neuronen. Diese Erfindung bestätigt,
dass Polysaccharidextrakte aus Lycium barbarum gute therapeutische
und neuroprotektive Mittel gegen Aβ-Peptidneurotoxizität und neuronalen
Tod in Alzheimer-Krankheit sein werden.
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Die
Entwicklung der vorliegenden Erfindung hat einen oder mehrere der
folgenden Schritte umfasst:
den Schritt, die Freisetzung von
Lactatdehydrogenase (LHD), welche als Index für Cytotoxizität dient,
aus Neuronen, welche Aβ-Peptid
ausgesetzt wurden und die mit den wässrigen oder basischen Extrakten
(LBA bzw. LBB) vorbehandelt wurden, mit einer unbehandelten Kontrolle
zu vergleichen;
den Schritt, die Aktivierung von Caspase-3-Aktivität, welche
als ein Anzeichen für
neuronale Apoptose in Neuronen, die Aβ-Peptid ausgesetzt wurden, und vorbehandelt
wurden mit den wässrigen
oder basischen Extrakten (LBA und LBB) mit der Kontrolle zu vergleichen;
den
Schritt, die Aktivierung von Caspase-2-Aktivität, welche als ein Marker für Aβ-Peptidneurotoxizität dient,
in Neuronen, welche Aβ-Peptid
ausgesetzt wurden und vorbehandelt wurden mit wässrigen oder basischen Extrakten
(LBA und LBB), mit der Kontrolle zu vergleichen;
den Schritt,
das therapeutische Fenster für
die neuroprotektiven Effekte von LBA und Lithiumchlorid in Aβ-Peptidneurotoxizität zu vergleichen;
den
Schritt des Beobachtens und Vergleichens der morphologischen Veränderungen
von Neuronen, welche Aβ-Peptid
ausgesetzt wurden und die vorbehandelt wurden mit LBA oder Heparin;
den
Schritt des Untersuchens der Aktivierung des JNK-Signalwegs in Neuronen, welche Aβ-Peptid ausgesetzt
wurden und mit LBA und LBB vorbehandelt wurden;
den Schritt
des Untersuchens der Aktivierung des PKR-Signalwegs in Neuronen, die Aβ-Peptid ausgesetzt
wurden und vorbehandelt wurden mit LBA und LBB;
den Schritt
des Isolierens und Reinigens von LBA und LBB in verschiedene Fraktionen;
den
Schritt des Vergleichens der neuroprotektiven Effekte von verschiedenen
fraktionierten Produkten aus LBA durch Untersuchen der Aβ-Peptid-ausgelösten Caspase-3-Aktivität;
den
Schritt des Beobachtens der morphologischen Veränderungen von Neuronen, die
Aβ-Peptid
und vorbehandelt wurden und vorbehandelt wurden mit den fraktionierten
Produkten aus LBA;
den Schritt des Untersuchens der Aktivierung
des PKR-Signalwegs
in Neuronen, die Aβ-Peptid
und fraktionierten Produkten aus LBA ausgesetzt wurden; und
den
Schritt des Untersuchens der neuroprotektiven Effekte von fraktionierten
Produkten aus LBB auf Neuronen, die Aβ-Peptid ausgesetzt wurden.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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1 zeigt
das Elutionsprofil der neuroprotektiven Präparation aus dem wässrigen
Extrakt von Lycium barbarum.
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2 zeigt
das Elutionsprofil der neuroprotektiven Präparation aus dem basischen
wässrigen Extrakt
von Lycium barbarum.
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3A bis 3D zeigen
zusammen das GC-Profil der neuroprotektiven Präparation aus den wässrigen
Extrakten von Lycium barbarum. So zeigt 3A das
GC-Profil eines wässrigen
Extrakts (LBA; siehe Beispiel 1); 3B zeigt
das GC-Profil von LBA-A0, 3C zeigt
das GC-Profil von LBA-A1 und 3D zeigt
das GC-Profil von LBA-A2 (siehe Beispiel 2).
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4A bis 4D zeigen
zusammen die GC-Analyse der neuroprotektiven Präparation aus den basischen
wässrigen
Extrakten von lycium barbarum. So zeigt 4A das
GC-Profil eines basischen wässrigen
Extrakts (LBB; siehe Beispiel 1); 4B zeigt
das GC-Profil von LBB-BO, 4C zeigt
das GC-Profil von LBB-B1 und 4D zeigt das
GC-Profil von LBB-B2
(siehe Beispiel 2).
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5 zeigt
die Cytotoxizitätsanalyse
durch den LDH-Aktivitätsassay.
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6 zeigt
die Aktivität
von Caspase-3.
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7 zeigt
die Aktivität
von Caspase-2.
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8 zeigt
die Cytotoxizitätsanalyse
durch den LDH-Aktivitätsassay
in neuronalen Zellkulturen nach Behandlung mit Aβ-Peptid oder LBB (0,1 bis 500 μg/ml).
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9 zeigt
Caspase-3-Aktivität
nach Behandlung mit Aβ-Peptid oder LBB.
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10 zeigt
die Aktivität
von Caspase-2.
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11 zeigt
den Vergleich der neuroprotektiven Effekte von LBA und LiCl.
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12 zeigt den Vergleich der neuroprotektiven
Effekte von LBA, LBB und Heparin auf die neuronale Morphologie.
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13 zeigt
die Western-Blot-Analyse von JNK und c-Jun in Neuronen, behandelt
mit LBA und LBB.
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14 zeigt
den Vergleich von neuroprotektiven Effekten zwischen dem spezifischen
JNK-Inhibitor SP 600125 und LBA.
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15 zeigt
die Western-Blot-Analyse von PKR und eIF2α bei den neuroprotektiven Effekten von
LBA und LBB.
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16 zeigt
die Effekte von verschiedenen fraktionierten Produkten aus LBA auf
Aβ-Peptidneurotoxizität durch
Untersuchen der Caspase-3-Aktivität.
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17 zeigt die neuroprotektiven Effekte von
LBA-A2 gegen Aβ-Peptid-Neurotoxizität in Bezug
auf neuronale Morphologie.
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18 zeigt
die Western-Blot-Analyse von LBA-A2.
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19 zeigt
die neuroprotektiven Effekte von fraktionierten Produkten (LBB-B1)
aus LBB auf Aβ-Peptid-Neurotoxizität durch
Untersuchung der Caspase-3-Aktivität.
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20 zeigt
die neuroprotektiven Effekte von fraktionierten Produkten (LBB-B2)
aus LBB auf Aβ-Peptidneurotoxizität durch
Untersuchung der Caspase-3-Aktivität.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden Zusammensetzungen in im wesentlichen gereinigter Form
zur Verfügung
gestellt, gekennzeichnet durch:
- (1) wasserlösliche polyanionische
Polysaccharid-enthaltende Extrakte, umfassend Arabinose, Galactose,
Glucose, Xylose, Rhamnose, Mannose, Glucuron- und Galacturonsäure, wie
durch Gaschromatographie analysiert,
- (2) geeignet, Aβ-Amyloid-induzierten
neuronalen Zelltod zu inhibieren;
- (3) mit im wesentlichen geringer oder fehlender in vivo-Toxizität bei topischer
Anwendung mit einer Konzentration von etwa 0,1 bis 500 μg/ml bei
einem Säugetier;
und
- (4) im wesentlichen keine ethanollöslichen Bestandteile enthaltend.
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung können des weiteren gekennzeichnet
werden als
- (5) eine Molekülmasse von weniger als 500
kDa aufweisend;
- (6) stabil gegenüber
einer Temperatur im Bereich von etwa 95 bis 100°C für 4 Stunden;
- (7) im wesentlichen unlöslich
in Methanol, Ethanol, Butanol, Aceton und Chloroform;
- (8) mit einem elementaren Gehalt von etwa 35,5 bis 39,6 % Kohlenstoff,
etwa 5,4 bis 5,5 % Wasserstoff, etwa 2,7 bis 5,5 % Stickstoff und
etwa 0,9 bis 3,0 % Schwefel;
- (9) enthaltend 15 bis 84 Gew.-% Kohlenhydrat, ausgedrückt als
Glucuron und Galacturonsäuren;
- (10) enthaltend 8 bis 93 Gew.-% Uronsäure, ausgedrückt als
Galacturonsäure;
und
- (11) enthaltend 0 bis 8 Gew.-% Uronsäure, ausgedrückt als
Glucuronsäure;
- (12) effektiv bei der Inhibition von Aβ-Amyloid-induziertem neuronalen
Zelltod.
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Die
neuen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch
verschiedene Verfahren der Extraktion und Reinigung hergestellt
werden. Solche Verfahren umfassen jene in den Beispielen der vorliegenden
Beschreibung beschriebenen. Kurz gesagt, wird die trockene Frucht
in Ethanol oder einen anderen niedrigen Alkohol eingeweicht, welcher
dann durch Erhitzen entfernt wird, und im wesentlichen alle alkohollöslichen
Anteile mit sich nimmt. Der Rückstand
wird zu einem Pulver zerkleinert und mit Wasser extrahiert, was
in einer wässrigen
Lösung
resultiert (welche falls erwünscht,
gefriergetrocknet werden kann) und einem zweiten Rückstand.
Ein Extrakt der Erfindung (LBA) kann erreicht werden durch Hinzufügen von
Ethanol zu der wässrigen
Lösung,
um ein Präzipitat
zu bilden, welches optional weiter mit Butanol und/oder Methanol extrahiert
wird. Ein zweites Extrakt der Erfindung (LBB) kann erreicht werden
durch Kombinieren des zweiten Rückstands
mit einer wässrigen
Base, wie, z.B. Natriumhydroxid, resultierend in einer basischen wässrigen
Lösung,
welche dialysiert und konzentriert werden kann, gefolgt vom Hinzufügen von
Ethanol zu der wässrigen
Lösung,
um ein Präzipitat
zu bilden, welches optional weiter mit Methanol extrahiert wird. Beide
Extrakte können
fraktioniert werden durch Säulenchromatographie
unter Verwendung eines Gradienten einer wässriger Base als Elutionsmittel.
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In
einem weiteren Ansatz kann die Zusammensetzung z.B. erhalten werden
aus Zellen der trockenen Lycium barbarum-Frucht durch Reinigen der Zusammensetzung
der Erfindung durch Kontaktieren eines Extrakts aus Lycium barbarum
mit einem Anionenaustauschermaterial, welches selektiv negativ gebundene
Materialien bindet, und Gewinnen der Zusammensetzung der Erfindung
von dem Anionenaustauschermaterial.
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Die
vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf pharmazeutische Zubereitungen
geignet für
die Inhibition von Aβ-Peptid-induziertem
neuronalen Zelltod davon, welche eine effektive Menge der Zusammensetzung
der Erfindung enthalten, mit oder ohne einem geeigneten pharmazeutisch
annehmbaren Träger
dafür.
Jeder kompatible Träger
kann verwendet werden, welcher geeignet ist für die Verabreichungsart, die
verwendet wird. Solche Formulierungen umfassen feste Verabreichungsformen,
wie Tabletten, Kapseln, Kapseln aus Stärkemasse ("Cachets"), Pellets, Pillen, Pulver oder Granulat,
topische Verabreichungsformen, wie Lösungen, Pulver, flüssige Emulsionen,
flüssige
Suspensionen, halbfeste Formen, Salben, Pasten, "Reams", Gele oder Gelees und Schaum, und parenterale
Verabreichungsformen, umfassend Lösungen, Suspensionen, Emulsionen
oder trockene Pulver. Die Mittel und Verfahren zur Verabreichung
sind dem Fachmann bekannt, und der Fachmann kann sich zur Anleitung auf
verschiedene pharmakologische Referenzen beziehen. Einige Beispiele
sind "Modern Pharmaceutics", Banker & Rhodes, Marcel
Dekker, Inc., 1979 und "Goodman & Gilman's Pharmaceutical
Basis of Therapeutics",
MacMillan Publishing Co. Geeignete Dosiermengen können durch
den Fachmann ohne weiteres bestimmt werden.
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Die
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung liegt beim Verabreichung
vorzugsweise in einer gereinigten Form vor. Wenn die Zusammensetzungen
der Erfindung durch Extraktion aus Lycium barbarum erhalten werden,
ist es wünschenswert, das
lösliche
Extrakt von (Rest-)Feststoffen durch geeignete Mittel zu trennen
(z.B. Filtration, Zentrifugation oder andere geeignete Trennungsverfahren). Trennung
von Feststoffen kann ein oder mehrere Male während des Extraktionsverfahrens
durchgeführt
werden. Die Nützlichkeit
der Zusammensetzungen der Erfindung als therapeutische Mittel wird durch
höhere
Reinigung verstärkt.
Höhere
Dosierungen können
nötig sein,
wenn weniger reine Formen des Extrakts verwendet werden.
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung sind vorzugsweise im wesentlichen
frei von Schwermetallen, kontaminierenden Pflanzenmaterialien, kontaminierenden
Mikroorganismen, Oxalsäure
oder Vorläufern
von Oxalsäure
oder irgendwelchen anderen Kontaminanten, welche in einer Zubereitung
vorhanden sein können,
welche aus Pflanzenmaterial abgeleitet werden kann.
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Obwohl
die Isolierung der Zusammensetzungen der Erfindung aus der Frucht
von Lycium barbarum gegenwärtig
das praktischste Verfahren zum Erhalt solchen Materials darstellt,
zieht die gegenwärtige
Erfindung auch in Betracht, solche Materialien aus anderen Quellen
zu erhalten, wie anderen Pflanzen, welche gewinnbare Mengen der
Zusammensetzungen mit den hierin beschriebenen Eigenschaften enthalten.
Andere Pflanzen, die in Betracht gezogen werden, umfassen Arten
innerhalb der Familie der Solanaceae, zu der Lycium gehört. Es ist
auch möglich,
dass Zusammensetzungen der Erfindung erhalten werden können durch
in vitro Kultivieren von Pflanzenzellen, wie Lycium barbarum-Zellen,
und Extrahieren der aktiven Inhaltsstoffe aus den Zellen oder Gewinnen
der aktiven Inhaltsstoffe aus dem Zellkulturmedium.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Extrakt" die aktiven Inhaltsstoffe, isoliert
aus der Frucht oder anderen Teilen von Lycium barbarum oder anderen
natürlichen
Quellen, umfassend aber nicht beschränkt auf alle Varietäten, Arten,
Hybride oder Genera der Pflanze, unabhängig von der genauen Struktur
der aktiven Inhaltsstoffe, von dem Verfahren der Zubereitung oder
Verfahren der Isolierung. Der Begriff "Extrakt" soll auch Salze, Komplexe und/oder
Derivate des Extrakts umfassen, welche die oben beschriebenen biologischen
Eigenschaften oder therapeutische Indikation besitzen. Der Begriff "Extrakt" soll auch synthetische
oder biologisch hergestellte Analoge oder Homologe mit den gleichen oder ähnlichen
Eigenschaften umfassen, welche die gleichen oder ähnliche
biologische Effekte der vorliegenden Erfindung ergeben.
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Die
hierin zur Verwendung gedachte gereinigte Zusammensetzung umfasst
gereinigte Extraktfraktionen mit dem hierin beschriebenen Eigenschaften
von jedweder Pflanze oder Art, vorzugsweise Lycium barbarum, in
natürlicher
oder varianter Form, und von jeder Quelle, ob natürlich, synthetisch
oder rekombinant. Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst sind
Analoge und Homologe der oben beschriebenen gereinigten Zusammensetzungen.
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Die
vorliegende Erfindung zieht auch die Verwendung von synthetischen
Präparationen
mit den Eigenschaften der Zusammensetzungen der Erfindung in Erwägung. Solche
synthetischen Präparationen
können
hergestellt werden auf Basis der chemischen Struktur und/oder funktionalen
Eigenschaften der oben beschriebenen Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung. Ebenfalls in Erwägung
gezogen werden Analoge und Homologe der chemischen Struktur der
Zusammensetzung der Erfindung, welche die funktionalen Eigenschaften
von Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden
Erfindung haben.
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Wie
hierin verwendet, umfasst der Bezug auf "Analoge und Homologe" der Zusammensetzung der Erfindung Verbindungen,
welche in ihrer Struktur von Zusammensetzungen der Erfindung abweichen,
um so wenig wie das Hinzufügen
und/oder Ersetzen und/oder Entfernen von einem oder mehreren Resten
davon. Solche Verbindungen haben jedoch immer im wesentlichen die
gleiche Aktivität
wie Zusammensetzungen der Erfindung. Somit bezeichnet "Analoge" Verbindungen mit
derselben Grundstruktur wie Zusammensetzungen der Erfindung, die
sich jedoch in einem oder mehreren Resten unterscheiden; "Homologe" bezieht sich auf
Verbindungen, welche sich von Verbindungen der Erfindung unterscheiden durch
das Hinzufügen
und/oder Entfernen und/oder Ersetzen einer begrenzten Anzahl von
Resten.
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Auf
Basis der hierin präsentierten
in vitro-Daten wird erwartet, dass eine Konzentration von etwa 0,1
bis 500 μg/ml
der Zusammensetzung der Erfindung (siehe Beispiel 7–12) effektiv
für die
topische Anwendung ist zum Verhindern von Aβ-induziertem neuronalen Zelltod.
Geeignete Mengen für
andere Verabreichungsformen können
vom Fachmann ohne weiteres bestimmt werden unter Verwendung von Standard-Routine-Verfahren.
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele sind nur illustrativ und sollen den Umfang der
Erfindung nicht limitieren, wie er durch die beiliegenden Ansprüche definiert
ist. Es wird für
den Fachmann offensichtlich sein, dass verschiedene Modifikationen
und Variationen in den Verfahren der vorliegenden Erfindung gemacht
werden können,
ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. So soll die
vorliegende Erfindung Modifikationen und Variationen dieser Erfindung
umfassen, vorausgesetzt, dass sie in den Bereich der beigefügten Ansprüche fallen
und deren Äquivalente.
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Beispiel 1
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Extraktion der Zusammensetzung
der Erfindung aus Lycium barbarum
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Die
getrocknete Frucht von lycium barbarum (10 kg) wurde in 95 Ethanol
(10 l) für
120 Stunden eingeweicht. Der resultierende Rückstand wurde filtriert, getrocknet
und in kleine Teile mit einem Mixer gemahlen. Destilliertes Wasser
(50 l) wurde hinzugefügt
und die Suspension wurde bei 95 bis 100°C für 3 Stunden gesimmert. Das
Extrakt wurde in ein sauberes Gefäß dekantiert und das Lycium
barbarum wurde weitere 2 mal in destilliertem Wasser unter den gleichen
Bedingungen extrahiert. Die Extrakte wurden durch ein Baumwolltuch
gegossen, um unlösliche
Materialien zu entfernen (Rückstand).
Das Volumen der geklärten
Extrakte wurde durch einen Rotationsverdampfer auf etwa 20 Liter
reduziert. Das kondensierte Extrakt wurde gefriergetrocknet. Eine
Gesamtmenge von 1800 g eines dunkelbraunen getrockneten Pulvers
wurde erhalten.
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Die
neuroprotektive Komponente in dem resultierenden wässrigen
Extrakt wurde durch Ethanol präzipitiert.
Um dies zu erreichen, wurden 1800 g des gefriergetrockneten wässrigen
Extrakts in 20 Liter Wasser aufgelöst, und Ethanol wurde zu einer
Endkonzentration von 90 Vol.-% zugefügt. Nachdem die Mischung bei
4°C für 24 Stunden
stehen gelassen worden war, wurde das Präzipitat durch Filtration durch
Baumwolle erhalten und mit 2 × 1,5
l Butanol gewaschen, gefolgt von 2 × 1,5 l Methanol. Dies ergab
nach dem Gefriertrocknen 1000 g eines dunkelbraunen Pulvers, im
weiteren als LBA bezeichnet.
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Der
Rückstand
wurde weiter mit 5 % Natriumhydroxid-Lösung (15 l) für 24 Stunden
inkubiert. Die resultierenden basischen Extrakte wurden durch ein
Baumwolltuch gegossen, um unlösliche
Materialien zu entfernen. Das Volumen der basischen Extrakte wurde
ausgiebig dialysiert (Molekulargewicht cutoff 3000–5000 Da)
für 60
Stunden mit laufendem Wasser. Das Volumen des Dialysats wurde auf
etwa 8 l durch einen Rotationsverdampfer reduziert. Die neuroprotektive
Komponente in dem resultierenden basischen wässrigen Extrakt wurde durch
Ethanol präzipitiert.
So wurde Ethanol zu dem Dialysat bis zu einer Endkonzentration von
90 Vol.-% hinzugefügt. Die
Mischung wurde 24 Stunden stehen gelassen, und das Präzipitat
wurde durch Filtration durch Baumwolle erhalten und mit 2 × 1,5 l
Methanol gewaschen. Dies ergab 75 g eines trockenen braunen Pulvers,
im weiteren als LBB bezeichnet.
-
Beispiel 2
-
Reinigung von Extraktfraktionen durch
Säulenchromatographie
-
Die
neuroprotektive Komponente des wässrigen
Extrakts wurde weiter gereinigt durch Gelfiltrationssäulenchromatographie.
Eine wässrige
Lösung von
LBA (2 g in 3 ml) wurde auf eine DEAE-Sepharose Fast Flow-Säule (100 × 2,6 cm)
aufgetragen und zunächst
mit destilliertem Wasser eluiert, gefolgt von 0,2 und 0,4 M wässriger
Natriumhydroxid-Lösung (Gradientenelution).
Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt und die Menge von Kohlenhydraten
in den gesammelten Fraktionen wurde durch einen Phenol-Schwefelsäure-Assay
unter Verwendung von Wasser als Standard überwacht (siehe 1).
Diese getrennten Fraktionen wurden durch einen Rotationsverdampfer
konzentriert (etwa 10 ml) und ausgiebig dialysiert (Molekulargewicht
cutoff 3000–5000 Da)
unter laufendem Wasser für
60 Stunden, gefolgt von Gefriertrocknen, um drei Fraktionen zu ergeben, im
weiteren bezeichnet als LBA-A0, LBA-A1 und LBA-A2.
-
Die
neuroprotektive Komponente des basischen wässrigen Extrakts wurde weiter
gereinigt durch eine ähnliche
Methode. So wurde eine wässrige
Lösung
von LBB (2 g in 5 ml) auf eine DEAE Sepharose Fast Flow-Säule (100 × 2,6 cm)
aufgetragen und zunächst
mit destilliertem Wasser eluiert, gefolgt von 0,2 M und 0,4 M wässriger
Natriumhydroxid-Lösung
(Gradientenelution), um drei Fraktionen zu ergeben, im weiteren
bezeichnet als LBB-B0, LBB-B1 und LBB-B2 (siehe 2).
-
Beispiel 3
-
Chemische Natur der neuroprotektiven
Verbindung von Lycium barbarum
-
Die
chemische Natur der neuroprotektiven Fraktionen des wässrigen
Extrakts und des basischen wässrigen
Extrakts wurde durch verschiedene chemische Tests untersucht. Die
Analyse der Glycosylzusammensetzungen wurde durchgeführt durch kombinierte
Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) der Per-O-trimethylsilyl(TMS)-Derivate
der Monosaccharidmethylglycoside, hergestellt aus der Probe durch
saure Methanolyse. Um dies zu erreichen, wurden zunächst Methylglycoside
hergestellt aus einem Teil jeder trockenen Probe durch Methanolyse
in 1 M HCl in Methanol bei 80°C
(18–22
h), gefolgt von Re-N-Acetylierung mit Pyridin und Essigsäureanhydrid
in Methanol. Die Proben wurden dann per-O-trimethylsilyiert durch Behandlung mit
Tri-Sil bei 80°C (30
min). Die Ergebnisse bestätigten,
dass die neuroprotektive wässrige
Extraktfraktion aus Lycium barbarum unterschiedlich ist zu der basischen wässrigen
Extraktfraktion (siehe 3 und 4).
-
Des
weiteren können
Mittel der Elementar-, Infrarot-, NMR- und andere spektroskopische analytische
Mittel eingesetzt werden, um die aktive Verbindung zu charakterisieren.
-
Beispiel 4
-
Reduktion der β-Amyloidpeptid-induzierten Freisetzung
von Lactatdehydrogenase (LDH) aus Neuronen durch den wässrigen
Extrakt LBA
-
Um
die Effekte des wässrigen
Extrakts LBA aus Lycium barbarum auf Aβ-Peptid-induzierte Neurotoxizität zu untersuchen,
wurden Neuronen mit LBA vorbehandelt (im Bereich von 0,1 μg/ml bis
500 μg/ml)
für 1 Stunde,
gefolgt von einer 24-stündigen Behandlung
mit Aβ25-35-Peptid (25 μM). Für die Cytotoxizitätsanalyse
wurde die extrazelluläre
Konzentration von LDH gemessen. 5 zeigt
den Prozentsatz der gesamten LDH-Freisetzung in den verschiedenen
Behandlungsgruppen, ausgedrückt
als Mittelwert ± SE
aus zumindest drei unabhängigen
Experimenten. Für
die Kontrollgruppe war die Freisetzung von LDH, welche den natürlichen
neuronalen Tod darstellt, 24,7 ± 0,45 % der gesamten LDH-Freisetzung.
Neurone, welche Aβ-Peptid
ausgesetzt waren, erhöhten
die Freisetzung von LDH auf 38,0 ± 0,92 %. Verschiedene Konzentrationen
von LBA konnten die LDH-Freisetzung nach der Aβ-Peptidinkubation signifikant
reduzieren (***p < 0,001
durch one-way ANOVA, Student-Newman-Keuls-Verfahren). Die Ergebnisse
zeigen, dass LBA cytoprotektive Effekte gegenüber Aβ-Peptidtoxizität aufwies.
-
Beispiel 5
-
Reduktion von β-Amyloidpeptid-ausgelöster Aktivierung
von Caspase-3, einem allgemeinen Apoptosemarker, in Neuronen durch
die wässrigen
Extrakte LBA
-
Caspase-3
ist seit langem als Zeiger für
neuronale Apoptose angesehen worden. Daher wurde ein kolorimetrischer
Caspase-3-Aktivitätsassay durchgeführt bei
den in 5 angegebenen Konzentrationen und neuronale Apoptose
wurde bestimmt durch den kolorimetrischen Caspase-3-Aktivitätsassay
durch Messen der Absorption (bei 405 nm) des gelben von dem Substrat
abgespalteten Produkts (pNA). Ergebnisse sind ausgedrückt als
Mittelwert ± SE
aus zumindest drei unabhängigen
Experimenten (***p < 0,001
gegenüber
der Gruppe, behandelt mit Aβ-Peptid
allein, durch Einweg-ANOVA, Tukey-Test). Wie in 6 gezeigt,
zeigten Neuronen, die Aβ-Peptid
ausgesetzt wurden, eine zweifache Zunahme in Caspase-3-Aktivität. Jedoch
verringerten Neuronen, welche verschiedenen Konzentrationen von
LBA ausgesetzt wurden (0,1–500 μg/ml) signifikant
die Aktivierung von Caspase-3, welche durch Aβ-Peptid ausgelöst wurde.
LBA bei 100 μg/ml
zeigte die besten neuroprotektiven Effekte, da es Caspase-3-Aktivität reduzieren
konnte von 2,13-fach auf 1,14-fach im Vergleich zu der Aβ-Peptidbehandelten
Gruppe. Neuronen, die im wässrigen
Extrakt LBA per se ausgesetzt wurden, zeigten keine signifikante
Zunahme in Caspase-3-Aktivität.
-
Beispiel 6
-
Reduktion von β-Amyloidpeptid-ausgelöster Aktivierung
von Caspase-2 in Neuronen durch die wässrigen Extrakte LBA
-
Caspase-2
ist ein wichtiger Zeiger für
neuronale Apoptose in Folge von Aβ-Amyloidpeptidneurotoxizität. Es ist
berichtet worden, dass Aβ-Peptid
die Aktivierung von Caspase-2 auslöst. Es ist auch vorgeschlagen
worden, dass die Rolle von Caspase- 2 in Aβ-Peptidneurotoxizität wichtiger
ist als jene von Caspase-3. Daher verwendeten wir ein kolorimetrisches
Verfahren, um Caspase-2-Aktivität
zu bestimmen. Für
Caspase-2-Aktivität war der
Trend ähnlich zu
jenem von Caspase-3. Neuronen, die Aβ-Peptid ausgesetzt wurden, lösten eine
1,6-fache Zunahme an
Caspase-2-Aktivität
aus. LBA bei 100 und 500 μg/ml
inhibierte signifikant die Aβ-Peptid-ausgelöste Aktivierung
von Caspase-2 von 1,70-fach auf 1,10-fach bzw. 1,26-fach (siehe 7;
*p < 0,05 gegenüber der
Gruppe, die nur mit Aβ-Peptid
behandelt wurde, durch one-way ANOVA, Student-Newman-Keuls-Verfahren).
-
Beispiel 7
-
Reduktion von β-Amyloidpeptid-induzierter Freisetzung
von Lactatdehydrogenase (LDH) aus Neuronen durch das basische Extrakt
LBB
-
Die
Effekte des basischen Extrakts LBB aus Lycium barbarum auf Aβ-Peptid-induzierte
Neurotoxizität
wurden ebenfalls untersucht unter Verwendung des gleichen Ansatzes
wie für
LBA. Für
die Cytotoxizitätsanalyse
wurde die extrazelluläre
Konzentration von LDH gemessen. 8 zeigt
den Prozentsatz der Gesamt-LDH-Freisetzung der verschiedenen Behandlungsgruppen.
Neuronen, die bei verschiedenen Konzentrationen (0,1 bis 500 μg/ml) mit LBB
vorbehandelt wurden, verringerten die LDH-Freisetzung, ausgelöst durch
Aβ-Peptid, signifikant.
Die Ergebnisse, ausgedrückt
als Mittelwert ± SE
aus zumindest drei unabhängigen
Experimenten (***p < 0,001
gegenüber
der Gruppe, behandelt mit Aβ-Peptid
allein, durch one-way ANOVA, Student-Newman-Keuls-Verfahren) zeigten,
dass LBB protektive Effekte gegenüber Aβ-Peptidinduzierter Cytotoxizität ausübte.
-
Beispiel 8
-
Reduktion von β-Amyloidpeptid-ausgelöster Aktivierung
von Caspase-3 in Neuronen durch die basischen Extrakte LBB
-
Caspase-3
ist ein allgemeiner Apoptosemarker. Zur Analyse von Apoptose wurde
der kolorimetrische Caspase-3-Aktivitätsassay (bei 405 nm) durchgeführt. LBB
bei geringen Konzentrationen (0,1, 1 und 10 μg/ml) und bei 500 μg/ml verringerte
signifikant die Aβ-Peptid-stimulierte
Caspase-3-Aktivität
auf das nur 1,3- bis 1,5-fache der Kontrolle (siehe 9;
*p < 0,001 versus
die Gruppe, behandelt mit Aβ-Peptid
allein, durch one-way ANOVA, Tukey-Test). Jedoch veränderte es
die Aβ-Peptidtoxizität bei 100 μg/ml nicht.
Die Ergebnisse legen nahe, dass LBB biphasische neuroprotektive
Effekte auslöst,
um die Aktivierung von Caspase-3 zu verringern.
-
Beispiel 9
-
Reduktion von β-Amyloidpeptid-ausgelöster Aktivierung
von Caspase-2 in Neuronen durch das wässrige Extrakt LBA
-
Caspase-2
ist ein wichtiger Zeiger für
neuronale Apoptose für β-Amyloidpeptidneurotoxizität. Für Caspase-2-Aktivität war der
Trend ähnlich
wie jener für
Caspase-3. Wir verwendeten auch ein kolorimetrisches Verfahren zur
Bestimmung von Caspase-2-Aktivität.
Außer
bei 100 μg/ml
war LBB in der Lage, die Aβ-Peptid-induzierte
Caspase-2-Aktivität signifikant
zu verringern auf das etwa 1,0- bis 1,3-fache der Kontrolle (10,
*p < 0,05 vs. die
Gruppe, behandelt mit Aβ-Peptid
allein, durch one-way ANOVA, Student-Newman-Keuls-Verfahren). LBB
in einer Konzentration von 1 bis 500 μg/ml per se löste keine signifikante
Zunahme von Caspase-2-Aktivität
aus.
-
Beispiel 10
-
Vergleich des therapeutischen Fensters
für neuroprotektive
Effekte von LBA und Lithiumchlorid (LiCl)
-
Es
ist gezeigt worden, dass LiCl Neuronen gegenüber Aβ-Peptidtoxizität schützt. Es ist auch eine wohl
bekannte westliche Medizin zur Behandlung von manisch-depressiver
bipolarer Störung.
Wir haben die neuroprotektiven Effekte von LBA und LBB gegenüber Aβ-Peptid-induzierter
Apoptose gezeigt und der Zweck dieses Beispiels war es herauszufinden,
wie effektiv LBA in der Neuroprotektion ist durch Vergleich mit
dem bekannten neuroprotektiven Medikament, LiCl. Neuronen wurden
mit entweder LiCl (2 mM bis 20 mM) oder LBA (0,1 μg/ml bis
500 μg/ml) für 1 Stunde
vorbehandelt, und dann dem Aβ25-35-Peptid
(25 μM)
für 24
Stunden ausgesetzt. Caspase-3-Aktivitätsassay
wurde verwendet, um die Schutzwirkungen gegenüber Aβ-Peptidtoxizität zu bestimmen. 11 zeigt
die Caspase-3-Aktivität (ausgedrückt als
Toxizität,
berechnet als (s.a.von Aβ-/LBA-/SP-behandelten-s.a.Kontrolle)÷(s.a.Aβ-behandelt-s.a.Kontrolle); ausgedrückt als Mittelwert ± SE von
zumindest drei unabhängigen
Experimenten), nach LBA- und LiCl-Behandlung. Die Konzentrationseinheit
von LiCl wurde von mM zu μg/ml
umgewandelt für
den Zweck des Vergleichs mit LBA. LiCl war gegenüber Neuronen toxisch bei etwa
85 μg/ml
(2 mM). Die Toxizität nahm
ab, wenn die Konzentration von LiCl zunahm und erreichte seinen
geringsten Wert (8,5 %), wenn Lid bei 850 μg/ml (20 mM) verwendet wurde.
Dementsprechend konnte Lid effektiv die Aβ-Peptid-stimulierte Caspase-3-Aktivität reduzieren
im Bereich von 340 μg/ml
bis 850 μg/ml
(d.h. 8 mM bis 20 mM). LBA übte
Schutzwirkungen für
Neurone gegenüber Aβ-Peptidtoxizität aus von
sehr niedrigen Konzentrationen bis hohen Konzentrationen (0,1 μg/ml bis
500 μg/ml).
Die Toxizität
war signifikant erniedrigt auf 11,6 wenn LBA bei 100 μg/ml verwendet
wurde. Die Ergebnisse in 11 zeigen,
dass LBA ein größeres therapeutisches
Fenster aufweist als LiCl.
-
Beispiel 11
-
Vergleich der neuroprotektiven Effekte
von LBA, LBB und Heparin durch morphologische Untersuchungen von
Neuronen
-
Heparin
ist ein gut definiertes Glycoprotein, von welchem gezeigt wurde,
dass es Aβ-Peptidneurotoxizität verringert.
Da LBA und LBBG sowohl Kohlenhydrat als auch Aminosäure enthält, verwendeten wir
Heparin, um einen Vergleich ihrer Schutzeffekte durchzuführen. Neuronen
wurden vorinkubiert mit entweder Heparin (1 μM), LBA (100 μg/ml) oder
LBB (500 μg/ml)
für 1 Stunde,
gefolgt von 24-stündiger Behandlung
mit Aβ-Peptid (25 μM). Die Morphologie von
Neuronen nach den verschiedenen Behandlungen wird in 12 gezeigt, in welchen (A) Kontrolle, (B)
Aβ-Peptid
allein, (C) LBA (100 μg/ml),
(D) LBA (100 μg/ml)
+ Aβ, (E)
LBB (500 μg/ml),
(F) LBB (500 μg/ml)
+ Aβ, (G)
Heparin (1 μM)
und (H) Heparin (1 μM)
+ Aß,
darstellt. In der Kontrolle (A) waren Neuronen in einem guten Zustand,
ersichtlich an dem feinen Neuritennetzwerk und den runden Zellkörpern. In
B werden Neuronen, die mit Aβ-Peptid
für 24
Stunden behandelt wurden, apoptotisch, wie sich durch die Destruktion
des feinen Neuritennetzwerks zeigt. Wie in D und F gezeigt wird,
waren Neurone noch in einer guten Verfassung, was anzeigt, dass
die Vorbehandlung von Neuronen mit entweder LBA oder LBB die Aβ-Peptid-induzierte
Apoptose inhibierte. G und H waren Neuronen, die mit Heparin vorbehandelt wurden,
und dann mit oder ohne Exposition gegenüber Aβ-Peptid. Beide Bilder zeigen
verlängerte
Neuronen. Es ist offensichtlich, dass mit Heparin-behandelte Neuronen
einen großen
morphologischen Unterschied aufwiesen zu jenen behandelt mit LBA
oder LBB. Es ist bereits durch andere Laboratorien gezeigt worden,
dass Heparin bei Aβ-Peptidtoxizität neuroprotektive
Effekte aufweist. Wir haben ebenfalls gefunden, dass LBA und LBB
neuroprotektive Effekte gegen Aβ-Peptidtoxizität aufweisen.
Auf Basis der Morphologie von Neuronen ist der Modus der Neuroprotektion
von LBA und LBB etwas unterschiedlich zu jenem von Heparin.
-
Beispiel 12
-
Reduktion der β-Amyloidpeptid-ausgelösten Aktivierung
von Stresskinase, c-Jun N-terminale Kinase (JNK), durch das wässrige Extrakt
LBA
-
JNK
ist eine der Stresskinasen, die in vielen Arten von Stressantworten
an den Prozessen der neuronalen Apoptose beteiligt ist. Es ist auch
berichtet worden, dass JNK an der Aβ-Peptidneurotoxizität beteiligt
ist. Daher haben wir untersucht, wie ein wässriger Extrakt von Lycium
barbarum LBA den JNK-Kinase-Signalweg moduliert, durch Western-Blot-Analyse. Infolge
von Aβ-Peptid-Stimulation wird
JNK durch Phosphorylierung aktiviert. Aktivierte JNK phosphoryliert
weiter sein Substrat, c-Jun, welches wiederum auf downstream Effektoren
abzielt, was Apoptose verursacht. Neuronen wurden mit LBA vorbehandelt
(100 μg/ml),
LBB (10 μg/ml
und 500 μg/ml)
oder LiCl (2 mM und 8 mM) für
1 Stunde, gefolgt von einer 4-stündigen
oder 6-stündigen
Exposition gegenüber
Aβ25-35 Peptid (25 μM). Extrahierte Proteine wurden
der Western-Blot-Analyse
unterworfen (13), um das Niveau von Phospho-JNK, Phospho-c-Jun,
Gesamt-JNK, Gesamt c-Jun und β-Actin zu bestimmen. β-Actin wurde
als Kontrolle verwendet. Wie in 13 gezeigt,
waren die Niveaus von Phospho-JNK-1 durch Aβ-Peptid signifikant hochreguliert. Ähnliche
Effekte wurden ebenfalls beobachtet für Phospho-c-Jun-I und Phospho-c-Jun-II, welche
erhöht
waren, wenn Neurone Aβ-Peptid
allein ausgesetzt wurden. Vorbehandlung mit LBA bei 100 μg/ml reduzierte
die Niveaus dieser drei phosphorylierten Proteine deutlich (13).
Die Vorbehandlung mit LBB bei entweder niedrigen oder hohen Konzentrationen
reduzierte die Niveaus von Phospho-JNK-1 und Phospho-c-Jun-I jedoch
nicht. Die Proteinniveaus von Gesamt-JNK, Gesamt-c-Jun und β-Actin waren
unverändert,
selbst nach LBA- und LBB-Behandlung.
-
Beispiel 13
-
Vergleich des therapeutischen Fensters
für neuroprotektive
Effekte zwischen dem spezifischen JNK-Inhibitor SP 600125 und LBA
-
Western-Blot-Analyse-Ergebnisse
zeigten, dass LBA die Aktivierung des JNK-Signalwegs verringern
kann. Es ist berichtet worden, dass der spezifische Inhibitor von
JNK, SP600125 ebenfalls Neuronen gegenüber Aβ-Peptidtoxizität schützen kann.
Wir haben daher das therapeutische Fenster von SP600125 mit LBA
verglichen, um ihre Effektivität
in der Neuroprotektion zu untersuchen. Neuronen wurden mit entweder
SP600125 (5 μM
bis 20 μM)
oder LBA (0,1 μg/ml
bis 500 μg/ml)
für 1 Stunde
vorbehandelt und dann Aβ-Peptid
(25 μM)
für 16
Stunden ausgesetzt. Caspase-3-Aktivitätsassay wurde durchgeführt, um
ihre Schutzwirkungen gegenüber
Aβ-Peptidtoxizität zu untersuchen.
So wurde nach der Behandlung ein kolorimetrischer Caspase-3-Aktivitätsassay
durchgeführt,
um den Grad an Apoptose zu untersuchen. Caspase-3-Aktivität wurde
ausgedrückt als
% Toxizität.
Ergebnisse sind ausgedrückt
als Mittelwert ± SE
aus mindestens drei unabhängigen
Experimenten. % Toxizität
wird berechnet als: (s.a.von Aβ-/LBA-/SP-behandelten-s.a.Kontrolle)÷(s.aAβ-behandelt-s.a.Kontrolle). 14 zeigt
die Caspase-3-Aktivität (ausgedrückt als
% Toxizität)
nach SP600125 und LBA-Behandlung. Die Konzentrationseinheit von
SP600125 wurde von mM auf μg/ml
umgewandelt für
den Zweck des Vergleichs mit LBA. SP600125 verringerte die Toxizität auf 23,8
% bei 1,1 μg/ml
(5 μM).
Die Toxizität erreichte
jedoch 69,3 %, wenn SP600125 bei 4,4 μg/ml (20 μM) verwendet wurde. Die Toxizität war 100
%, wenn SP600125 bei mehr als 20 μM
verwendet wurde (Daten nicht gezeigt). SP600125 war effektiv von
1,1 μg/ml
bis 4,4 μg/ml,
der Bereich ist sehr eng, wenn verglichen mit dem von LBA.
-
Beispiel 14
-
Verringerung von β-Amyloidpeptid-ausgelöster Aktivierung
von STresskinase, doppelsträngige
RNA-abhängige
Proteinkinase (PKR), durch wässriges
Extrakt LBA
-
Die
Verringerung von β-Amyloidpeptid-ausgelöster Aktivierung
von Stresskinase, doppelsträngiger
RNA-abhängiger
Proteinkinase (PKR), durch wässriges
Extrakt LBA wurde untersucht und die Ergebnisse sind in 15 gezeigt.
-
Beispiel 15
-
Neuroprotektive Effekte eines
fraktionierten Produkts des wässrigen
Extrakts LBA gegen β-Amyloidpeptidneurotoxizität
-
Da
das wässrige
Extrakt LBA aus Lycium barbarum neuroprotektive Effekte gegenüber Aβ-Neurotoxizität aufweist,
führten
wir weitere Untersuchungen durch, was eine aktive Fraktion, die
verantwortlich ist für
die Neuroprotektion, darstellt. Wir trennten unterschiedliche Fraktionen
durch Ionenaustauschchromatographie. Aktivität von Caspase-3 diente als
ein Index für
neuronale Apoptose. Unter drei verschiedenen Fraktionen verringerte
nur die LBA-A2-Fraktion Aβ-Peptid-ausgelöste Caspase-3-Aktivität (16,
worin Resultate ausgedrückt sind
als Mittelwert ± SE
aus zumindest drei unabhängigen
Experimenten. *p < 0,001
vs. die Gruppe, behandelt mit Aβ-Peptid
allein, one-way ANOVA, Tukey-Test). Die Ergebnisse zeigen, dass
bei 0,4 M eluiertem Produkt aus Extrakt von Lycium barbarum die neuroprotektive
Komponente gegen Aβ-Peptidneurotoxizität enthält. Die
biochemische Analyse von Caspase-3-Aktivität wurde bestätigt durch
morphologische Untersuchung (17).
Nach Behandlung mit Aβ-Peptid
waren Neurite gebrochen und Neurone durchliefen Apoptose. Neurone,
die mit LBA-A2 vorbehandelt waren, behielten jedoch die Faszikulation von
Neuriten und die Integrität
von Neuronen.
-
Beispiel 16
-
Aktive Fraktion aus den LBA-Extrakten
von Lycium barbarum reduzieren die Aktivierung von Stresskinase-PKR-Signalweg
in Neuronen, ausgelöst
durch β-Amyloidpeptid
-
Da
Extrakte aus Lycium barbarum Aβ-ausgelöste Phosphorylierung
von PKR reduzieren, hatten wir durch Western-Blot-Analyse weiter
untersucht, ob die neuroprotektiven Effekte des fraktionierten Produkts
LBA-A2 mediiert waren durch den PKR-Signalweg. Wie in unseren früheren Ergebnissen
gezeigt, haben Neurone, die Aβ-Peptid
ausgesetzt werden, eine deutliche Zunahme von PKR sowie eIF2α-Phosphorylierung.
Während
die Vorbehandlung mit 10 μg/ml
LBA-A2 die Phosphorylierung von PKR in Neuronen verstärkte, reduzierte
LBA-A2 bei 100 und 500 μg/ml
die Phosphorylierung von PKR deutlich 4 Stunden nach Behandlung
mit Aβ-Peptid
(18). Neuronen wurden vorbehandelt mit LBA-A2 bei
10, 100 oder 500 μg/ml
für 1 Stunde
vor Behandlung mit Aβ-Peptid
(25 μM)
für 4 Stunden.
Protein wurde extrahiert für
Western-Blot-Analyse von phosphoryliertem PKR und eIF2α. Die Proteinniveaus
von Gesamt-normaler PKR, eIF2α und β-Actin blieben
nach der Behandlung unverändert.
-
Beispiel 17
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Neuroprotektive Effekte von
fraktioniertem Produkt aus wässrigem
Extrakt LBB gegen β-Amyloidpeptidneurotoxizität
-
Für die Analyse
der Apoptose diente die Aktivität
von Caspase-3 als ein Indikator für neuronale Apoptose. Primäre kultivierte
Neurone, die mit LBB-B1 bei entweder 10 oder 100 μg/ml vorbehandelt
worden waren, zeigten eine signifikant verringerte Aβ-Peptidneurotoxizität (19).
LBB-B1 per se war nicht neurotoxisch. Ähnlich zu LBB-B1 zeigte auch
die Vorbehandlung mit LBB-B2 signifikante neuroprotektive Effekte gegenüber Aβ-Neurotoxizität (20).
100 μg/ml übten eine
beinahe 100%ige neuroprotektive Wirkung aus (20). Wiederum zeigte
LBB-B2 per se keine Neurotoxizität.
-
Industrielle Anwendbarkeit
-
In
den zuvor genannten Beispielen zeigten wir, dass sowohl wässrige als
auch basische Extrakte (LBA und LBB) aus Lycium barbarum und die
fraktionierten Produkte von LBA und LBB, LBA-A2, LBB-B1 und LBB-B2
exzellente therapeutische Mittel für das Verhindern von neuronalem
Verlust durch β-Amyloidpeptidneurotoxizität sowie
in Alzheimer-Krankheit darstellen. Mit der Methodologie, die wir
für das
Aufklären
der molekularen Mechanismen der Neuroprotektion verwendeten, ist
gezeigt worden, dass die Analyse der Stresskinasen wie JNK und PKR-Signalweg
durch Western-Blot-Analyse als eine technologische Plattform dienen,
um neuroprotektive Wirkstoffe zu screenen für die Verwendung im Zusammenhang mit
der Alzheimer-Krankheit. Die Methodologie, die wir für die Isolierung
und Auftrennung von neuroprotektiven Mitteln verwendeten, zeigte,
dass die Isolierverfahren als eine technologische Plattform dienen können, um
das Screenen und Herstellen von neuroprotektiven Mitteln aus chinesischer
und pflanzlicher Medizin zu unterstützen.
-
Zitate:
-
Die
vollständige
Zitierung der oben angegebenen Zitate, welche durch Verweis hierin
mit aufgenommen werden, sind:
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-
ZUSAMMENFASSUNG
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Extrakte
von lycium barbarum dienen als ein neuroprotektives Mittel gegen β-Amyloidpeptidneurotoxizität, was somit
ihre Verwendung für
die Behandlung von Alzheimer-Krankheit (AD) ermöglicht und für die Verhinderung
von neuronalem Verlust beim Altern gegen die Akkumulation von β-Amyloidpeptid
im Gehirn. Stresskinasen (c-Jun N-terminale Kinase und Doppelstrang-RNA-abhängige Proteinkinase) werden
als eine Technologieplattform zum Screenen von neuroprotektiven
Wirkstoffen verwendet.