KR100780056B1 - 인삼 사포닌 Rg2의 추출방법 및 그 추출물을 포함하는 의약조성물과 그 용도 - Google Patents

인삼 사포닌 Rg2의 추출방법 및 그 추출물을 포함하는 의약조성물과 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일종의 기업화 규모의 대량생산에 적용되는 인삼 사포닌 Rg2의 추출방법에 관한 것으로서, 그래디언트 염석법(gradient salting out)을 이용하여 종래의 실리카겔 크로마토그래피 방법을 대체함으로써 조작이 간편하고 인삼 사포닌 Rg2의 대량 생산이 가능한 방법이다.
또한, 본 발명은 인삼 사포닌 Rg2를 활성 성분으로 한 의약 조성물 및 이의 치매, 우울증 및 말초 순환 장애 등 관련 질병을 예방하고 치료하는 예방 및 치료제에 관한 것이다.

Description

인삼 사포닌 Rg2의 추출방법 및 그 추출물을 포함하는 의약 조성물과 그 용도{METHOD OF EXTRACTING GINSENGNOSIDE RG2, PHARMACEUTICAL COMPOSITION INCLUDING GINSENGNOSIDE RG2, AND USES THEREOF}
본 발명은 인삼 사포닌 Rg2의 추출방법과, 상기 화합물을 활성 성분으로 한 의약 조성물 및 이를 이용한 치매, 우울증 및 말초 순환 장애 등 관련 질병을 예방하고 치료하는 예방 및 치료제에 관한 것이다.
인삼에는 여러 종류의 인삼 사포닌이 함유되어 있는데, 현재 이미 밝혀진 성분은 30여종으로서, 그 중 인삼 사포닌 Rg2(Ginsengnoside Rg2)는 오래 전에 분리되어 명명된 프로토파낙사트리올 글로코사이드(Protopanaxatriol glycoside)에 속하는 물질이다.
종전 연구에 의하면 홍삼의 가공 과정 중, 인삼 사포닌 C-20 위치에 결합되어 있는 배당체 결합이 쉽게 가수분해됨과 동시에 수산기가 반평형을 일으켜 인삼 사포닌 C-20(S) 또는 C-20(R) 이성체를 형성한다는 것이 알려져 있으며, 일반적으로 홍삼에 혼합형 인삼 사포닌 Rg2 C-20(RS)이 수삼이나 백삼에 비해 월등히 많이 함유되어 있는 것으로 공개되어 있다.
그러나, 상기와 같은 인삼 사포닌 Rg2는 그 의학적 용도가 알려지지 않았기 때문에 이에 대한 추출 및 분리방법은 실험실 규모의 분리방법으로서, 유기용매로 인삼 총사포닌을 추출하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 방법 또는 고속 액체 크로마토그라피(HPLC) 방법으로 인삼 사포닌 Rg2를 분리하는 것이 통상적인 추출방법이었다.
먼저, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 공정은 인삼 총사포닌 추출물을 실리카겔 크로마토그래피 컬럼에 흡착시킨 후, 일정 비율로 혼합된 유기용매(클로로포름: 메틸알코올: 에틸아세테이트: 물)를 세척제로 이용하여 인삼 사포닌 Rg2를 분리해내는 방법을 말한다.
상기한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용한 방법의 주요 결점은 매 번 컬럼으로 부터 분리되는 양이 적고, 분리 속도도 매우 느리며, 또한 인체에 유독한 유기용제를 대량으로 사용하기 때문에 추후 별도의 분리공정을 필요로 함과 동시에 원가가 높아지고, 수득률이 낮으며 불안전하여 대규모 생산에 적합하지 않다는 것이다.
또한, 고속 액체 크로마토그라피(HPLC) 방법은 비록 고순도 인삼 사포닌 Rg2를 분리해 낼 수 있으나, 설비 및 작동비용이 높고, 역시 메틸알코올 또는 아세토니트릴(acetonitrile)과 같은 고가의 유기용매를 대량으로 사용하기 때문에 이에 따라 생산원가도 증가되는 문제점이 있었다. 결론적으로, 종래의 인삼 사포닌 Rg2 추출방법들은 대규모 생산에 적합하지 않아 가격이 비싸고 상품화시키기 어렵다는 것이다.
즉, 기업화 규모의 대량생산에 적합한 공정이라 함은 조작 및 공정이 간편하고, 실시가 용이하며, 수득률과 순도가 높고, 인체에 무해하면서도 안전한 조건을 갖추어야 하는 것이 바람직하나, 아직까지는 이에 대한 연구가 미비한 실정이다.
한편, 인삼 사포닌 Rg2의 의료용도에 관한 연구는 매우 드물어, 비록 본 발명자가 선출원한 중국 특허 ZL01102117.9인 "심뇌혈관 질병 약물 제조에 있어서 인삼 사포닌 Rg2 의 응용"에서 인삼 사포닌 Rg2의 의학적 용도를 제시한 바 있으나, 이는 심근허혈, 뇌허혈 및 쇼크성 질환 등과 같은 심 뇌 혈관 질환의 치료에만 국한되어 있다. 따라서, 인삼 사포닌 Rg2의 새로운 의학적 용도에 대하여 더욱 진일보한 연구가 요구되고 있다.
기술적 과제
본 발명의 목적 중 하나는 기업화 규모의 대량생산에 적합한 새로운 인삼 사포닌 Rg2의 추출방법을 제공하고자 하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 인삼 사포닌 Rg2를 함유하는 의약 조성물을 제공하고자 하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 인삼 사포닌 Rg2를 치매증, 우울증, 말초 순환장애 등 관련 질환을 예방 또는 치료하는 치료제를 제공하고자 하는데 있다.
기술적 해결방법
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 두릅나무과 인삼속 원료로부터 인삼 사포닌 Rg2 추출하는 방법에 있어서, 원료를 물에서 열수추출하고 농축하여 얻어진 농축액을 저급 알코올을 가하여 침전된 이물질을 제거한 다음, 남은 상등액을 탈색 처리하고 첨가된 저급 알코올을 회수한 후, 염석제를 투여하여 포화농도 하에 얻어진 침전물을 물에 재용해시키고 다시 그래디언트 염석법을 시행하여 각기 다른 염석제 농도마다 차등 침전물을 얻은 다음, 상기 침전물을 분석하여 인삼 사포닌 Rg2 집중부분과 비집중부분으로 구분하고, 이 중 인삼 사포닌 Rg2 집중부분만을 취하여 탈염제로 탈염 및 탈색하고 농축한 후 다시 저급 알코올로 정제하여 재결정화하는 것을 특징으로 하는 인삼 사포닌 Rg2 추출방법을 제공함으로서 달성된다.
도 1은 인삼잎에서 분리된 인삼 사포닌 Rg2 조제품 HPLC 관련 그래프
도 2는 인삼잎에서 분리된 혼합형 인삼 사포닌 Rg2 HPLC 관련 그래프
도 3은 인삼잎에서 분리된 S형 인삼 사포닌 Rg2 HPLC 관련 그래프
도 4는 인삼잎에서 분리된 R형 인삼 사포닌 Rg2 HPLC 관련 그래프
도 5는 양삼잎에서 분리된 혼합형 인삼 사포닌 Rg2 HPLC 관련 그래프
도 6은 인삼열매에서 분리된 혼합형 인삼 사포닌 Rg2 HPLC 관련 그래프
발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하에서는 본 발명에 대하여 좀 더 상세하게 설명하기로 한다.
이미 알려진 바와 같이, 인삼 사포닌 Rg2는 그 분자식이 C42H72O13 이고, 분자량은 784이며, 그 구조식은 하기와 같다.
〈구조식1〉
Figure 112007026640065-pct00001
상기 구조식 1과 같은 인삼 사포닌 Rg2를 추출하는 본 발명은, 종래의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 방법 대신에 그래디언트 염석법(gradient salting out)을 이용함으로써, 조작이 간편하고 인삼 사포닌 Rg2의 기업적 규모의 대량생산에 적합하도록 하였다. 사용되는 염석제로는 염화나트륨, 염화칼슘, 황산나트륨, 아황산나트륨, 황산암모니움 및 그 외 독성이 없는 무기염 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물이 사용된다. 이러한 염석제는 저독성이며, 가격이 저렴하고 쉽게 얻을 수 있으며, 회수할 수 있어 재활용이 용이하다.
또한, 종래 고가의 유기용제 대신에 비교적 가격이 싼 저급 알코올로도 고순 도의 인삼 사포닌 Rg2를 동일하게 획득할 수 있을 뿐만 아니라 그래디언트 염석 과정에서 인삼 사포닌 Rg2 이 외에도 다른 인삼 총사포닌을 획득할 수 있다.
본 발명에서 추출하고자 하는 인삼 사포닌 Rg2는 두릅나무과 인삼속(Araliacease panax) 원료 중에서 추출할 수 있는 바, 상기 원료에 대하여 우선적으로 선택한 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
a. 두릅나무과 인삼속 원료를 16배량의 물에 넣고 3시간 동안 가열추출하는 과정을 3회 반복한다. 두릅나무과 인삼속 원료는 인삼(Panax ginseng)과 양삼(Panax quinquefoilius Linn.) 등 식물의 잎, 뿌리 또는 열매를 포함한다;
b. 상기와 같이 가열하여 얻어진 추출액을 농축하고, 그 3 ∼ 4배량에 해당하는 저급 알코올을 혼합한다. 상기 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 부탄올, 아밀알코올 중에서 일종 또는 둘 이상의 혼합물이다;
c. 상기 혼합액을 교반하여 이물질을 침전시키고 여과처리하여 얻어진 상등액을 탈색 처리한 다음 용매로 사용된 알코올을 회수한다;
d. 상기 용매가 제거된 용액에 염석제를 포화농도까지 첨가하고 8시간 동안 침전시켜 침전물을 얻고, 상기 침전물을 20배량의 물에 재용해시킨 후 다시 염석제를 첨가하면서 그래디언트 염석을 시행하여 각각의 다른 염석제 농도마다 생성된 침전물들을 분리하여 수거한다. 상기 염석제로는 전술한 염화나트륨, 염화칼습, 황산나트륨, 아황산나트륨, 황산암모니움, 이 외에도 독성이 없는 무기염 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 혼합물이 사용된다;
e. 상기 그래디언트 염석법에 의해 각기 다른 염석제 농도로 부터 얻어진 침전물들을 박층 크로마토그래피 분석을 실행하여 인삼사포닌 Rg2 집중부분과 인삼사포닌 Rg2 비집중부분으로 나누어 수집한다;
f. 상기 수집된 인삼사포닌 Rg2 집중부분만을 선택하여 탈염제로 탈염, 탈색한 다음 다시 농축한다. 상기 탈염제로는 음양이온교환수지 또는 흡착수지, 충전제 등이 사용되며, 이온교환수지를 사용시에는 인삼사포닌 Rg2 집중부분의 침전물을 그 10배량의 95％ 에탄올에 용해시키고 여과하여 얻어진 여과액을 1배의 증류수로 희석한 다음 탈염을 진행하고, 흡착수지를 사용시에는 인삼사포닌 Rg2 집중부분의 침전물을 그 20배량의 물에 용해시킨 다음 흡착수지에 통과시켜 무기물을 제거하고 50％ 에탄올로 세척하여 탈염을 진행한다;
g. 상기 탈염 및 농축된 인삼사포닌 Rg2 농축액에 에탄올 또는 메탄올 등과 같은 알코올을 투입하면서 50％ 이상의 농도에서 부터 석출되는 인삼사포닌 Rg2 조제품(crude product)을 획득한다;
h. 상기 인삼사포닌 Rg2 조제품을 다시 각기 다른 알코올의 농도하에서 용해도 차이에 따른 재결정을 시행하여 고순도의 각 구조형 인삼사포닌 Rg2를 수득한다. 예를 들어, 인삼사포닌 Rg2 조제품을 먼저 70％ 알코올에 용해시키고 상온에서 12시간 동안 방치하여 단일형 C-20(R) 인삼사포닌 Rg2를 석출시키고, 그 상등액을 취하 여 알코올의 농도를 80％로 조절하고 4℃에서 24시간 재결정하여 결정체를 석출한 다음 상기 결정체를 다시 90％ 알코올에 투입하고 80℃까지 가열하여 용해시킨 후 10℃에서 24시간 동안 방치하여 혼합 구조형 C-20(SR) 인삼사포닌 Rg2를 석출시키고, 그 상등액을 다시 -20℃에서 12시간동안 방치하여 단일형 C-20(S) 인삼사포닌 Rg2를 석출시킨다;
이와 같은 본 발명의 추출방법은 특수한 설비가 필요 없고, 조작이 간편하며, 순도와 수득률이 높고, 인체에 무해하면서도 안전하여 대규모 공업화 생산에 적합하다. 또한 본 방법은 잉여의 기타 인삼 총사포닌을 회수하는데 영향을 주지 않는 효과가 있다.
아울러, 본 발명은 전술한 추출방법에 의해 추출된 인삼사포닌 Rg2를 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 상기 의약 조성물은 어떤 한 가지 이성체 또는 혼합 이성체의 인삼사포닌 Rg2 1 ∼ 99중량％와; 의약적인 면에서 수용 가능한 담체 및 보조제 99 ∼ 1중량％로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는 상기 의약 조성물은 50％ 이상의 인삼사포닌 Rg2 를 활성 성분으로 함유하는 것이 좋다.
상기한 담체 및 보조제는 전분, 활석분, 당, 교미제, 덱스트린류, 의학용 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 식물유, 젤라틴 및 트윈 80(tween 80;Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate) 또는 기타 계면활성제로부터 선택할 수 있다.
좀 더 상세하게 설명하자면, 물과 같은 희석제 및 부형제; 전분, 서당 등과 같은 충전제와; 섬유소 파생물질, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone) 등과 같은 접합제; 글리세린과 같은 습윤제; 아가(agar), 탄산칼슘과 탄산수소나트륨과 같은 붕해제; 4가 암모니움(Quaternary Ammonium)화합물과 같은 흡수촉진제;
헥사데카놀(Hexadecanole)과 같은 표면활성제; 고령토 및 조점토와 같은 흡착 담체; 활석분, 칼슘스테아레이트(calsium stearate)와 마그네슘 및 폴리에틸렌 등과 같은 윤활제를 더 포함한다. 이외에도 구성물질로서 향미제, 감미제 등의 기타 보조제를 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 인삼사포닌 Rg2를 함유하는 의약조성물을 이용하여 한약 또는 양약에서 사용되는 주사제, 캡슐, 알약, 정제, 분무제, 내복액, 패치, 좌약, 마이크로캡슐 및 마이크로볼의 형태로 제조되는 것을 특징으로 한다.
좀 더 상세하게는, 상기한 의약 조성물은 분침제와 용액주사제 등과 같은 주사제; 당의정, 구함정, 필름코팅정 등과 같은 정제와; 보통 및 마이크로형 캡슐 등과 같은 캡슐제와; 분무제와; 항문이나 음도 좌약 등과 같은 좌약제와; 구점막 패치제와; 씹어먹는 알약과; 시럽제 및 기타 내복액 등으로 응용이 가능하다.
한편, 후술되는 실험예를 통하여 얻어진 연구결과, 본 발명으로 제조하여 얻어진 의약 조성물은 치매에 대한 치료 작용이 있었으며, 또한 항우울과 흥분중추 및 말초 순환의 개선작용도 갖추고 있음을 확인할 수 있었다.
의학상 치매라 함은 정신 신경기능성 장애 범주에 속하는 것으로서, 다시 말하면 뇌부 기질성 질병으로 인한 지능(지각, 기억, 사유, 추리와 판단, 감정 등)장애라고도 불리며, 그 발병원인은 신경 세포의 변성 또는 사멸에 있는 것으로 알려져 있다.
그러나, 지금까지 공지된 항치매 약물로는 신경전달물질 즉
아세틸콜린(acetylcholine)의 작용을 증강시켜 약간의 증상을 개선할 수는 있으나, 그 발병원인인 신경세포의 변성 및 사멸을 방지할 수는 없었다. 따라서 치매 초기에는 아세틸콜린성 신경세포가 손상될 뿐만 아니라, 글루타민산성 신경세포 역시 손상되기 때문에, 아세틸콜린의 활성을 증강시키는 것은 치매 초기의 환자에게 일시적인 효과만 얻을 수 있을 뿐이다.
한편, 글루타민산은 뇌에 가장 많이 존재하는 신경전달물질로서, 만약 글루타민산 활성제가 개발되면 그 효과는 아세틸콜린 활성제보다 더 우수할 것으로 예측하고 있으나, 다만 글루타민산 활성제 역시 신경세포의 손상을 막는 것이 아니고 신경세포의 손상이 일어난 후에 남아있는 신경세포간의 작용을 증진시키는 역할만을 수행하는 것으로, 만약 과량 투여 시에는 신경세포의 손상을 초래할 뿐만 아니라 세포사멸이 원인인 치매의 근본적인 치료방법이라고는 할 수 없다.
근래의 연구에서는 불용성 베타아밀로이드에 의한 신경세포 손상이 지능장애가 오는 근본원이라는 것을 더욱이 설명하고 있으며, 따라서 신경 전달 물질의 작용을 증진시키는 동시에 신경세포의 변성 및 사멸을 방지하는 것이 치매 치료의 관건이다.
또한, 우울증은 임상적으로 흔히 볼 수 있는 정신이상성 질병으로, 역시 정신장애성 감정종합증상이며, 그 발병원인은 정확히 밝혀지지 않고 있지만 뇌내 모노아민(mono amine)류 신경전달물질의 합성이 감소되는 것과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
이미 공지된 항우울증약인 이미프라민(imipramine)은 시냅스 간격(Synaptic cleft)의 노라드레날린(NA)과 5-하이드록시트립타민(5-HT)의 농도를 증가시키는 것이며, 약간의 모노아민 산화효소(Monoamine oxidase) 억제제 역시 뇌내의 모노아민류 신경전달물질을 증가시키고 있다.
현재, 우울증 동물 모델은 모노아민 전달물질 학설의 기초 위에 건립된 것으로, 따라서 뇌내의 모노아민류 신경전달물질을 조절하는 것이 정신이상성 질병 또는 정신장애를 치료하는 중요한 관건이 되고 있다.
이에, 본 발명의 추출방법으로 얻은 인삼사포닌 Rg2를 후술하는 동물 실험에 적용한 결과, 우수한 치매증 치료 작용을 나타내었으며, 불용성 β-아밀로이드 단백질 또는 다발성 뇌경색으로 인한 기억장애에 모두 현저한 개선 작용과, 뇌신경세포의 자멸을 조절할 수 있었고, 자멸관련 유전자 단백질의 발현을 억제하고, 신경 세포체의 소실 및 사멸을 방지하는 동시에 글루타민산과 흥분성 아미노산이 야기하는 상관 신경세포 손상을 억제할 수 있었다.
그 외의 동물 실험에서도 뇌내 모노아민류 신경전달물질을 현저히 증가시켜 현저한 항우울증 효과를 나타내고 있으며, 펜토바비탈 소디움(Pentobarbital Sodium)에 의한 수면 시간을 현저히 단축시켜 대뇌피질을 흥분시키는 작용을 갖추고 있는 것이 밝혀졌다.
이하에서는 본 발명을 하기한 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하기는 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예 만으로 한정되는 것은 아니다.
〈실시예 1〉
-인삼잎으로 부터 인삼사포닌 Rg2 의 추출-
먼저, 100kg의 인삼잎을 16배량의 물에 넣고 3시간 동안 가열하여 끓인다. 상기 과정을 3회 반복하여 얻어진 액체를 모두 합하고 여과기에서 여과한 후, 상기 여과액을 농축기에서 대략 100kg이 될 때까지 농축하였다, 상기 농축액에 그 3배량에 해당하는 95％ 에탄올을 첨가하고 교반하여 이물질을 침전시킨 다음, 다시 여과처리하여 침전된 이물질을 제거하고, 분리된 상등액은 활성탄을 이용하여 탈색한 후 용매로 사용한 에탄올을 회수하였다.
상기 에탄올이 제거된 용액을 10배량의 물에 용해시킨 후, 고순도의 황산암모니움을 용액의 농도가 포화상태에 이르도록 첨가하고 8시간 동안 침전시켰다. 상기와 같이 얻어진 침전물을 취하여 20배량의 물에 재용해시킨 후, 다시 고순도의 황산암모니움을 연속적으로 투입하면서 그래디언트 염석법을 시행하여 용액내 황산암모니움의 농도가 5％, 10％, 15％, 20％, 30％될 때 마다 각각 석출된 침전물을 별도로 분리하여 수집하였다.
상기와 같이 각각 염석제의 농도에 따라 수집된 침전물들을 소량씩 취하고 박층 크로마토그래피 분석을 실행하여 인삼사포닌 Rg2 집중 부분(15％와 20％ 황산암모니움 농도시 침전물)과 그 외의 인삼사포닌 Rg2 비집중 부분(5%, 10％, 30％ 황산암모니움 농도시 침전물)으로 나눈 다음, 상기 인삼사포닌 Rg2 집중부분의 침전물만을 취하여 그 10배량의 95％ 에탄올에 용해시키고 여과하여 얻어진 여과액을 1배의 증류수로 희석하고 이온교환수지를 통하여 탈염 및 탈색한 후 1000㎖가 될 때까지 농축하였다.
이와 같은 농축액을 다시 95％의 에탄올에 첨가하면서 용액 내의 에탄올 농도가 50％ 이상이 되었을 때부터 결정체로 석출되는 인삼사포닌 Rg2 조제품(crude product)을 얻었으며, 상기와 같이 석출된 인삼사포닌 Rg2 조제품을 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 203㎚하에 그 순도를 측정하여 하기 표 1과 도 1에 나타내었다.
표 1
Figure 112007026640065-pct00002
상기 표 1과 도 1의 데이터와 같이, 인삼사포닌 Rg2 조제품의 순도는 보류시간(Retention time)이 18 ∼ 22 사이의 피크(Peak)인 20과 21에서 측정된 면적％ (Area％)을 합산한 결과 75.81％로 나타났다.
또한, 상기와 같이 얻어진 인삼사포닌 Rg2 조제품을 70％ 에탄올에 용해시키고 상온에서 12시간 동안 방치하여 단일형 C-20(R) 인삼사포닌 Rg2를 결정체로 석출시키고, 그 상등액을 취하여 에탄올의 농도를 80％로 조절하고 4℃에서 24시간 재결정하여 결정체를 석출한 다음 상기 결정체를 다시 90％ 에탄올에 투입하고 80℃까지 가열하여 용해시킨 후 10℃에서 24시간 동안 방치하여 혼합 구조형 C-20(SR) 인삼사포닌 Rg2를 결정체로 석출시키고, 그 상등액을 다시 -20℃에서 12시간 동안 방치하여 단일형 C-20(S) 인삼사포닌 Rg2를 결정체로 석출시켰다.
상기 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2 결정체를 최종 정제하고 감압여과한 후 상온에서 24시간동안 자연건조한 결과, 각각 단일 구조형 C-20(S)형 인삼사포닌 Rg2 20g과, 혼합 구조형 C-20(SR) 인삼사포닌Rg2 238g과, 단일 구조형 C-20(R)형 인삼사포닌 Rg2 30g을 차례로 획득하였다. 부가적으로 인삼사포닌 Rg2 비집중 부분에서는 인삼사포닌 2100g을 획득하였다.
상기와 같이 얻어진 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 각각 중량법(원료로 사용된 인삼잎 100kg에 대한 추출 분리된 인삼 사포닌 Rg2의 질량을 백분율로 나타냄)으로 측정한 결과 C-20(SR) 인삼 사포닌 Rg2 수득률은 0.24％이고, C-20(S)형 인삼사 포닌Rg2 수득률은 0.02％이었으며, C-20(R)형 인삼 사포닌 Rg2의 수득률은 0.03％이었다.
또한, 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 203㎚하에 그 순도를 측정하여 하기 표 2 내지 4와 도 2 내지 4에 나타내었다.
표 2
Figure 112007026640065-pct00003
Figure 112007026640065-pct00004
상기 표 2와 도 2의 데이터와 같이, 혼합 구조형 C-20(SR) 인삼 사포닌 Rg2의 순도는 보류시간(Retention time)이 18 ∼ 22 사이의 피크(Peak)인 25와 26에서 측정된 면적％(Area％)을 합산한 결과 96.80％로 나타났다.
표 3
Figure 112007026640065-pct00005
Figure 112007026640065-pct00006
상기 표 3과 도 3의 데이터와 같이, 단일 구조형 C-20(S) 인삼사포닌 Rg2의 순도는 보류시간(Retention time)이 18 ∼ 22 사이의 피크(Peak)인 20과 21에서 측정된 면적％(Area％)을 합산한 결과 75.25％로 나타났다.
표 4
Figure 112007026640065-pct00007
Figure 112007026640065-pct00008
상기 표 4와 도 4의 데이터와 같이, 단일 구조형 C-20(R) 인삼 사포닌 Rg2의 순도는 보류시간(Retention time)이 18 ∼ 22 사이의 피크(Peak)인 20과 21에서 측정된 면적％(Area％)을 합산한 결과 98.05％로 나타났다.
〈실시예 2〉
-양삼잎으로 부터 인삼사포닌 Rg2의 추출-
양삼잎 50kg을 원료로 하여 실시예 1과 동일한 방법으로 혼합구조형 C-20(SR) 인삼 사포닌 Rg2 75g을 획득하였으며, 실시예 1과 동일한 방법으로 수득률과 순도를 측정한 결과 수득률은 0.15％, 순도는 표 5와 도 5의 데이타와 같이 97.41％로 나타났다.
표 5
Figure 112007026640065-pct00009
Figure 112007026640065-pct00010
〈실시예 3〉
-인삼 열매로 부터 인삼사포닌 Rg2의 추출-
인삼열매 50kg를 취하여 소량의 물에 첨가한 후, 과육을 개어 씨를 제거한 다음 농축하여 시럽을 만들고, 상기 시럽으로 부터 실시예 1과 동일한 방법으로 혼합구조형 C-20(SR) 인삼 사포닌 Rg2 125g을 획득하였으며, 실시예 1과 동일한 방법으로 수득률과 순도를 측정한 결과 수득율은 0.25％이고, 순도는 표 6과 도 6의 데이타와 같이 98.55％로 나타났다.
표 6
Figure 112007026640065-pct00011
Figure 112007026640065-pct00012
이하에서는 실시예 1 내지 3에 의해 추출된 인삼 사포닌 Rg2 를 이용하여 치매의 치료효과를 비롯한 항우울과 흥분 중추 및 말초 순환의 개선작용에 대한 실험을 실시하였다.
〈실험예 1〉
-베타아밀로이드(Aβ1-40)성 치매증에 대한 인삼 사포닌Rg2의 치료효과-
실험은 알츠하이머 치매(AD) 모델을 채택하였다. 흰쥐(Rat) 70마리를 각 10마리씩 모두 7그룹으로 나누고, 클로랄하이드레이트(chloral hydrate)로 마취시킨 다음, 가시술 그룹 이외에 나머지 그룹에는 해마 CA1 구역 내에 베타아밀로이드(Aβ1-40) 4㎍과 이보테닉산(Ibotenic acid; IBA) 1㎍을 주사하여 치매모델을 만들었다. 이 때 가시술 그룹에는 베타아밀로이드 및 이보테닉산 대신에 동일한 양의 생리식염수를 주입하였다.
상기 치매모델 그룹을 다시 생리식염수가 투여되는 대조군과 인삼 사포닌 Rg2가 투여되는 실험군 및 의학적 치매치료제인 니모디핀(nimodipine)이 투여되는 비교군으로 나누고, 각각 하기 표 7에 기재된 투여제량에 따라 매일 1차례씩 총 7일간 정맥내주사(intravenous injection)하였다. 이 때 실험군에 투여되는 시약물은 단일 이성체인 C-20(S) 인삼 사포닌 Rg2와 C-20(R) 인삼 사포닌 Rg2 및 혼합형인 C-20(SR) 인삼 사포닌 Rg2(이하 표에서는 각각 S, R, SR로 약칭함)이다.
이와 같이 각각 시약물을 투여한지 6일째에 Y형 전자미로 검측을 실시하여 흰쥐의 학습 기억능력을 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 먼저, 흰쥐가 연속적으로9/10차례 정확하게 반응할 때 필요한 자극회수를 학습차수로 하고, 24시간이 지난 그 이튿날 연속적으로 9/10차례 정확히 반응할 때 필요한 자극회수를 기억차수로 재기록하여 그 결과로 그룹 간(t)의 검측을 진행하여 하기 표 7에 나타내었다.
표 7
Figure 112007026640065-pct00013
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 뇌내에 베타아밀로이드(Aβ1-40)과 이보테닉산(IBA)을 주사한 흰쥐의 학습 기억능력 검측 결과 전형적인 베타아밀로이드성 치매증상을 갖는 대조군과 비교하여 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 투여한 실험군은 그 학습 기억능력이 현저하게 개선됨을 알 수 있었다.
또한, 상기와 같이 학습 기억능력을 검측하고 24시간 후에 해마 CA1 구역의 주사한 부위 전후를 연속적으로 잘라 니슬(Nissl)염색, HE 염색, 면역조직과 원위치 세포의 사멸에 대한 화학 검측을 진행하여 해마 신경원 세포대의 변형, 괴사, 세포 소실의 정도, 세포 사멸 수, Bax/Bc1-2와 C-fos 유전자 발현 정도를 관찰하여 하기 표 8 내지 표 11에 나타내었다.
표 8
Figure 112007026640065-pct00014
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 니슬 염색 결과 뇌내에 Aβ1-40과 IBA를 주사하면 대조군과 같이 광범위한 신경 세포체의 유실을 초래하였으나, 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 투여한 실험군에서는 신경 세포체 유실에 대한 뚜렷한 억제효과가 나타남을 알 수 있었다.
표 9
Figure 112007026640065-pct00015
상기 표 9에 나타난 바와 같이, 원위세포자멸(TUNEL) 검측 결과 해마 내에 A β1-40과 IBA를 주사하면 대조군과 같이 신경세포의 사멸이 유발되나, 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 투여한 실험군에서는 신경 세포체 사멸수가 현저하게 경감됨을 확인할 수 있었다.
표 10
Figure 112007026640065-pct00016
Figure 112007026640065-pct00017
표 11
Figure 112007026640065-pct00018
상기 표 10과 표 11에 나타난 바와 같이, 사멸촉진 조절자(Bax) 및 사멸억제 조절자(Bc1-2), 전사조절인자(C-fos)의 발현 결과 베타아밀로이드(Aβ1-40)성 치매증상을 갖는 대조군에서는 Bax의 발현은 증가되었고 Bc1-2의 발현은 저하되었으나, 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 투여한 실험군에서는 Bax의 발현은 저하되고 Bc1-2 및 C-fos의 발현은 증진됨을 알 수 있었다. 이는 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2가 이상 Bax와 Bc1-2의 유전자 발현에 대하여 조절 작용이 있음을 설명해주는 것이다.
또한, HE 염색 결과 가시술 그룹의 해마 신경 세포체(neurone) 손상이 적었으며, 침도 주위에 경미한 손상이 있고, 소량의 그리아 세포(gliocyte)가 침윤되었을 뿐 추체 세포대는 완전하였으며 손실이 없었다.
한편, 베타아밀로이드성 치매증상을 보이는 대조군은 대량의 그리아 세포 침 윤과, 현저한 해마 신경 세포체의 소실이 있었으며, 소실 부위는 주사점 부근의 CA1으로 부터 원거리 구역까지 확장되어 매우 긴 추체 과립세포대가 소실되었음이 관찰되었으며, 고배율 현미경으로는 신경원 세포막 파열, 세포 위축, 세포핵 축소, 사멸 소체가 분명하게 관찰되었다.
반면, 각 구조형 인삼사포닌 Rg2가 투여된 실험군은 국부적인 그리아 세포의 침윤되지 않고, 추체 세포대와 과립 세포대의 혼란함, 희박해짐, 세포대 소실 등이 눈에 띄지 않았으며, 고배율 현미경으로는 세포막이 완전하여 사멸 소체는 CA1보다 먼 부위에 매우 드물게 혹은 매우 경미하게 나타났고 병리학적 변화도 아주 경미하게 나타났다.
결론적으로, 베타아밀로이드(Aβ1-40)과 이보테닉산(IBA) 혼합액을 흰쥐(Rat) 뇌내 해마구역 내에 주사하여 AD 행위와 병리학적 변화가 생긴 치매모델에 대하여, 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2는 항치매 치료약물인 니모디핀과 같이 AD 큰쥐의 학습과 기억능력을 현저하게 개선시켜줄 수 있으며, 신경 세포체 유실을 방지하고, 뇌내 C-fos와 bc1-2의 발현을 증가시키는 반면, bax의 발현은 억제시키게 된다. 이로써 신경 세포체를 보호하고 신경세포의 사멸을 방지하게 되는 것이다.
〈실험예 2〉
-다발경색성 치매증에 대한 인삼 사포닌 Rg2의 치료효과-
본 실험에서는 다발경색성치매증(Multiple Infarct Dementia; MID) 모델을 채택하였다. 흰쥐(Rat) 56마리를 각 8마리씩 총 7그룹으로 나누고, 10％의 클로랄 하이드레이트 마취 하에 가시술 그룹 이외에 나머지 그룹에는 각각 복합혈전유도제 0.13㎖/100g을 경동맥 내에 주입한 후, 해부 구조를 복귀시켜 층따라 피부를 봉합한 치매모델을 만들었다. 이 때 가시술 그룹에는 복합혈전유도제 대신에 동일한 양의 생리식염수만을 주입하였다.
상기 치매모델 그룹을 다시 생리식염수가 투여되는 대조군과 인삼 사포닌 Rg2가 투여되는 실험군 및 의학적 치매치료제인 니모디핀(nimodipine)이 투여되는 비교군으로 나누고, 각각 하기 표 12에 기재된 투여제량에 따라 매일 1차례씩 총 7일간 정맥내주사(intravenous injection)하였다. 이 때 실험군에 투여되는 시약물은 단일 이성체인 C-20(S) 인삼 사포닌 Rg2와 C-20(R) 인삼 사포닌 Rg2 및 혼합형인 C-20(SR) 인삼 사포닌 Rg2(이하 실험에서는 각각 S, R, SR로 약칭함)이다.
이와 같이 각각 시약물을 투여한지 6일째에 실험예 1과 동일한 방법으로 흰쥐의 학습 기억능력을 측정하여 하기 표 12에 나타내었다.
표 12
Figure 112007026640065-pct00019
상기 표 12에 나타난 바와 같이, 학습 기억능력 검측결과 전형적인 다발경색성치매증(MID) 치매증상을 보이는 대조군에서는 학습차수와 기억차수가 증가되고 있으나, 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 투여한 실험군에서는 각 학습차수와 기억차수가 현저하게 감소함을 확인할 수 있었으며, 이는 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2가 다발경색성치매증에 현저한 개선작용이 있음을 밝히는 것이다.
또한, 상기와 같이 학습 기억능력을 측정하고 24시간 후, 흰쥐의 두부를 해부하여 뇌의 부리그마(bregma)를 각각 앞과 뒤로 2×5mm를 절단하고 4％의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시킨 후 파라핀으로 덮고, 파라핀 절편기로 두께 7㎛ 크기의 절편을 만든 다음, 상기 절편을 취하여 각각 니슬 염색하여 면역그룹의 CPU 구역 내 Glutamate(Glu)와 사멸촉진 조절자(Bax), 세포소멸 유도체인 Caspase-3, 단백질 분해효소인 CalpainⅡ 양성 신경 세포체에 대한 화학 검측을 진 행하여 그 결과를 하기 표 13과 14에 각각 나타내었다.
표 13
Figure 112007026640065-pct00020
Figure 112007026640065-pct00021
표 14
Figure 112007026640065-pct00022
상기 표 13과 표 14에 나타난 바와 같이, 면역그룹에 대한 화학검측 결과 전 형적인 MID 치매증상을 갖는 대조군과 비교하여 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 투여한 실험군의 흰쥐는 CPU 구역의 Glu, Bax, Caspase-3, CalpainⅡ 양성 신경원 발현수가 모두 현저히 감소됨을 확인할 수 있었으며, 이는 상기 이상 유전자 발현에 대하여 조절 작용이 있음을 알 수 있다.
결론적으로, 복합혈전유도제를 흰쥐(Rat)에 주사하여 MID의 행위와 병리학적 변화가 생긴 치매모델에 대하여, 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2는 항치매 치료제인 니모디핀과 같이 학습과 기억능력을 현저하게 개선시켜 줄 수 있으며, 그 작용은 단백질 사멸과 관련된 Glu, CalpainⅡ, Caspase-3, Bax의 발현 저하와 관련이 있음을 확인할 수 있었다.
〈실험예 3〉
-PC12세포 손상 후 MTT 대사에 대한 인삼 사포닌 Rg2의 치료효과-
105개/㎖의 밀도를 갖는 PC12 배양세포를 96공 플레이트에 각 구멍마다 100㎕씩 접종하고, PC12세포가 벽에 부착되길 기다린 후, 상기 구멍을 총 여섯그룹으로 나누고 각 그룹마다 6공씩 할당하였다.
상기 그룹 중에 무처리군에는 무혈청 배지를 첨가하고, 대조군에는 글루타민산이 함유된 무혈청 배지 1mmol/ℓ와 동등 체적의 20％의 1.2 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하며, 실험군에는 글루타민산이 함유된 무혈청 배지 1mmol/ℓ와 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2 0.1mmol/ℓ를, 비교군에는 인삼 사포닌 Rg2 대신에 니모디핀 5pmol을 첨가한 다음 지속적으로 37℃에서 20시간 동안 증식시켰다.
상기 각 그룹의 구멍에 MTT(5g/ℓ) 20㎕을 첨가하여 37℃에서 계속 4시간 동안 증식시킨 후 원배지를 흡출해내고, 각 구멍에 0.1㎖의 디메틸 설폭사이드(DMSO;Dimethyl Sulfoxide)를 첨가하여 적색 과립을 용해시킨 후, 효소 표식 검측기로 490㎚ 부위의 광밀도(OD)를 측정하여 그룹 간 (t)검측을 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다.
표 15
Figure 112007026640065-pct00023
상기 표 15에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 MTT 대사가 현저히 저하되어 있으며, 이는 글루타민산이 부분적인 PC12세포를 손상시킨 것임을 확인할 수 있었다. 그 반면에, 상기 대조군과 비교하여 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2 및 니모디핀이 투여된 실험군 및 비교군에서는 모두 PC12세포의 MTT 대사가 현저히 증가됨을 확인할 수 있었으며, 이는 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2는 모두 글루타민산이 PC12세포에 미치는 손상을 억제할 수 있음을 설명해 주는 것이다.
〈실험예 4〉
-우울증에 대한 인삼 사포닌 Rg2의 치료효과-
우울증의 일반적인 모델은 약물 또는 스트레스성 자극법을 채택하나, 본 실험에서는 허혈/재관류(ischemia/reperfusion)법을 채택하여 뇌조직의 NE, DA, 5-HT 함량을 낮춰 우울증 모델을 채택하였다.
흰쥐(Rat) 48마리를 각각 8마리씩 모두 6그룹으로 나누고, 10％의 클로랄하이드레이트로 마취시킨 상태에서 가시술 그룹을 제외한 그 외 다른 그룹에 대하여 각각의 흰쥐마다 좌측 경외동맥으로부터 나일론선을 경내동맥으로 집어넣고 대뇌 중동맥(MCA)을 막은 다음, 혈류 차단 시작부터 시간을 재어 30분이 경과한 후, 나일론선을 뽑고 재관류를 시켜 우울증 모델을 만들었다.
상기 우울증 모델 중에 대조군에는 7.5mg·kg-1의 용매를, 실험군에는 하기 표 16에 기재된 투여제량에 따라 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 매일 1차례 연속 5일 동안 정맥내주사하였다.
상기와 같이 각각 시약물을 투여한지 48시간 후에 실험예 1과 동일한 방법으로 흰쥐에 대하여 학습 기억능력을 측정하여 하기 표 16에 나타내었다.
표 16
Figure 112007026640065-pct00024
또한, 상기와 같이 학습 기억능력을 측정하고 6일이 경과한 후 흰쥐의 두부를 해부하여 뇌를 적출하고 고르게 유체가 되도록 한 다음, 뇌조직의 신경전달물질인 Norpinephrine(NE), Dopamine(DA), 5-Hydroxytryptamine(5-HT)의 함량을 측정하여 그룹 간의 (t) 검측을 진행하였으며, 그 결과를 하기 표 17에 나타내었다.
표 17
Figure 112007026640065-pct00025
Figure 112007026640065-pct00026
상기 표 16과 표 17에 나타난 바와 같이, 대조군의 학습 기억능력과 뇌내 NE, DA의 함량이 현저히 저하된 반면, 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 투여한 실험군에서는 모두 학습 기억능력과 NE, DA와 5-HT 함량이 현저히 증가되었음 보여주고 있다.
이는 모노아민류의 이론에 따르면, 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2는 우울증 또는 중추신경 흥분/억제 혼란성 질병에 현저한 개선작용이 있음을 확인할 수 있다.
〈실험예 5〉
-펜토바비탈 소디움(Pentobarbital Sodium) 수면 시간에 대한 인삼 사포닌 Rg2의 치료효과-
수컷 작은쥐(mouse) 38마리를 취하여 표 18에 기재된 바와 같이 세 그룹으로 나누고, 실험군에는 혼합형 인삼 사포닌 Rg2를 각각 10, 20mg·kg-1씩 정맥 내에 투여한 후, 동시에 50mg·kg-1의 펜토바비탈 소디움(Pentobarbital Sodium)을 다시 정맥내 주사하였으며, 그 반면에 대조군에는 인삼 사포닌 Rg2 대신에 20％의 1.2 폴리 에틸렌 글리콜 10mg·kg-1을 정맥내 주사한 다음, 번정반사 소실을 지표로하여 각 그룹에 속한 작은쥐의 수면 시간을 기록하고 그룹 간 (t)검측을 진행하였으며, 그 결과를 하기 표 18에 나타내었다.
표 18
Figure 112007026640065-pct00027
상기 표 18에 나타난 바와 같이, 혼합형태의 인삼 사포닌 Rg2를 투여한 실험군에서는 대조군에 비하여 모두 펜토바비탈 소디움에 의한 작은쥐(mouse)의 수면시간을 현저히 단축시켜주고 있으며, 이는 인삼 사포닌 Rg2가 중추신경계통에 흥분 작용이 있음을 설명해 주는 것이다.
〈실험예 6〉
-귓바퀴 말초순환 장애에 대한 인삼 사포닌 Rg2의 치료효과-
수컷 작은쥐(mousc) 68마리를 표 19와 같이 6그룹으로 나누고, 우레탄(urethane)으로 마취시킨 후, 귓바퀴를 현미경 아래에서 한 가닥의 미정맥(V)과 미동맥(A)을 찾아 각각 그 혈관의 직경을 측정하고, 그 유동 형태를 관찰 기록하였다.
상기 그룹들에 대하여 대조군에는 식염수를, 비교군에는 홍삼과 맥문동이 혼합되고 생약이 0.2g/㎖가 함유된 삼맥주사제를, 실험군에는 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2를 각각 하기 표 19에 기재된 투여제량에 따라 정맥내 주사하고 5분이 경과된 후, 다시 아드레날린 0.01mg·kg-1을 투여한 다음 매 시간마다의 혈관 직경, 유동 형태 및 혈관망 교점 수를 측정하였다.
상기 측정 결과를 토대로 아드레날린의 전, 후 변화를 백분율로 계산하여 그룹 간 (t)검측을 진행하였으며, 그 결과를 하기 표 19, 표 20 및 표 21에 나타내었다.
표 19
Figure 112007026640065-pct00028
표 20
Figure 112007026640065-pct00029
표 21
Figure 112007026640065-pct00030
Figure 112007026640065-pct00031
상기 표 19 내지 21에 나타난 바와 같이, 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2가 투여된 실험군에서는 대조군에 비교하여 아드레날린에 의해 작은쥐(mouse) 귓바퀴의 미동맥 및 미정맥 혈관 직경이 축소되는 현상과 혈관망 교점 수가 감소되는 현상을 현저히 억제시켜주고 있음을 보여주고 있다.
또한, 삼맥주사된 비교군과 비교하여도 시간이 경과됨에 따라 각 혈관의 직경이 축소됨과 혈관망 교점수가 감소되는 정도가 훨씬 줄어들고 있다. 특히, 그 중에서도 미정맥 혈관 직경이 축소되는 것을 억제하는 작용이 미동맥에서 보다 훨씬 강하게 나타났다.
〈실험예 7〉
-토끼 귀 관류량에 대한 인삼 사포닌 Rg2의 치료효과-
큰귀 흰토끼 33마리를 하기 표 22와 같이 4그룹으로 나누고, 펜토바비탈 소디움의 마취하에 귀뿌리 동맥을 박리시키고 튜브를 삽입한 후, Locke 용액으로 잔류혈액을 세척하고, 토끼귀를 절단한 후 관류를 진행하였다.
상기 그룹들에 대하여 대조군에는 식염수를, 비교군에는 홍삼과 맥문동이 혼합되고 생약이 0.2g/㎖가 함유된 삼맥주사제를, 실험군에는 혼합형 인삼 사포닌 Rg2를 각각 하기 표 22에 기재된 투여제량에 따라 튜브를 통해 투여하고, 각 시약물의 투약 전과 투약 후 3분 간격으로 관류 점적수 변화값을 말초혈관 확장정도로 표시하여 그룹 간 (t)검측을 진행하였으며, 그 결과를 하기 표 22에 나타내었다.
표 22
Figure 112007026640065-pct00032
Figure 112007026640065-pct00033
상기 표 22에 나타난 바와 같이, 혼합 구조형 인삼 사포닌 Rg2가 투여된 실험군에서는 투약후 비교군에 비하여 관류 점적수가 현저히 증가되고 있음을 보여주고 있으며, 이는 말초혈관에 대하여 확장 작용이 있음을 설명하는 것이다.
상술한 바와 같이 본 발명의 인삼 사포닌 Rg2 추출방법은그래디언트 염석법을 이용하여 종래의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 분리법을 대체함으로써, 조작이 간편하고 쉬워 기업적 규모의 대량생산에 적합하고, 고가의 혼합 유기용제 대신에 비교적 저가의 저급 알캔 알코올을 사용하여도 고순도의 완제품을 추출해낼 수 있어, 원가가 저렴하고, 인체에 무해하면서도 안전할 뿐만 아니라 잔여물질로 부터 기타의 인삼 사포닌을 회수하는 데에도 영향을 주지 않는 효과를 가져온다.
또한, 본 발명은 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2가 불용성 β-아밀로이드 단백질 및 다발성 뇌경색으로 인한 치매 동물의 기억 장애에 현저한 개선작용이 있으며, 또한 뇌신경세포의 사멸/항사멸과 관련된 유전자 단백질의 발현을 조절할 수 있고, 신경원의 소실 및 사멸을 방지하고, 아울러 글루타민산이 PC12세포에 손상을 억제하는 효과를 가져옴을 밝히고 있다.
또한, 본 발명은 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2가 뇌결혈 재관류 큰쥐(Rat) 뇌내 NE, 5-HT, DA 등 모노아민류 신경전달물질을 현저히 증가시키고, 모노아민 학설에 따라 인삼 사포닌 Rg2가 분명한 항우울증 작용을 가지고 있음을 확인하였으며, 이밖에도 인삼 사포닌 Rg2가 펜토바비톨 소디움에 의한 수면 시간을 현저히 단축시키는 효과가 있으며, 이는 인삼 사포닌 Rg2가 대뇌피질에 대하여 흥분 작용을 일으킴을 설명해 준다.
또한, 본 발명은 각 구조형 인삼 사포닌 Rg2가 작은쥐(mouse) 귓바퀴 말초순 환 장애에 현저한 개선 작용을 하며, 아울러 토끼귀 관류량을 증가시키는 효과가 있으며, 이는 말초혈관에 대하여 확장 작용이 있음을 설명해 준다.

Claims (16)

  1. 두릅나무과 인삼속 원료로 부터 인삼 사포닌 Rg2 추출하는 방법에 있어서, 원료를 물에서 열수추출하고 농축하여 얻어진 농축액에 메틸알코올, 에틸알코올, 이소프로필알코올, 아밀알코올 중에서 선택된 알코올류를 가하여 침전된 이물질을 제거한 다음, 남은 상등액을 탈색 처리하고 첨가된 알코올류를 회수한 후, 염석제를 투여하여 포화농도 하에 얻어진 침전물을 물에 재용해시키고 다시 그래디언트 염석법을 시행하여 각기 다른 염석제 농도마다 차등 침전물을 얻은 다음, 상기 침전물을 분석하여 인삼 사포닌 Rg2 집중부분과 비집중부분으로 구분하고, 이 중 인삼 사포닌 Rg2 집중부분만을 취하여 탈염제로 탈염 및 탈색하고 농축한 후 다시 메틸알코올, 에틸알코올, 이소프로필알코올, 아밀알코올 중에서 선택된 알코올류로 정제하여 재결정화하는 것을 특징으로 하는 인삼 사포닌 Rg2 추출방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 원료는 두릅나무과 인삼속 식물 인삼잎, 양삼잎, 인삼열매 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 인삼 사포닌 Rg2의 추출방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 열수추출은 두릅나무과 인삼속 원료를 그 16배량의 물에 넣고 3시간 동안 가열추출하는 과정을 3회 반복하는 것을 특징으로 하는 인삼사포닌 Rg2의 추출방법.
  4. 삭제
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 염석제는 염화나트륨, 황산나트륨, 아황산나트륨, 황산암모니움, 기타 무독성 무기염 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 인삼사포닌 Rg2의 추출방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 침전물로부터 인삼 사포닌 Rg2 집중부분과 비집중부분을 구분하는 방법은 박층 크로마토그래피 분석을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 인삼사포닌 Rg2의 추출방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 탈염제는 음양이온교환수지 또는 흡착수지, 충전제 중에서 하나 선택된 것을 특징으로 하는 인삼사포닌 Rg2의 추출방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 재결정화 과정은 인삼사포닌 Rg2 농축액에 95％의 알코올을 투여하면서 용액내 알코올의 농도가 50％ 이상이 될 때부터 석출되는 결 정체를 획득하는 1차 석출과정과, 상기 결정체를 다시 각기 다른 알코올의 농도하에서 용해도 차이에 따른 재결정을 시행하여 각각의 결정체를 수득하는 2차 석출과정으로 이루어짐을 특징으로 하는 인삼사포닌 Rg2의 추출방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 2차 석출과정은 1차 석출된 결정체를 70％ 알코올에 용해시키고 상온에서 12시간 동안 방치하여 단일형 C-20(R) 인삼사포닌 Rg2를 석출시키고, 그 상등액을 취하여 알코올의 농도를 80％로 조절하고 4℃에서 24시간 재결정하여 결정체를 석출한 다음 상기 결정체를 다시 90％ 알코올에 투입하고 80℃까지 가열하여 용해시킨 후 10℃에서 24시간 동안 방치하여 혼합 구조형 C-20(SR) 인삼사포닌 Rg2를 석출시키고, 그 상등액을 다시 -20℃에서 12시간동안 방치하여 단일형 C-20(S) 인삼사포닌 Rg2를 석출시키는 것을 특징으로 하는 인삼사포닌 Rg2의 추출방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 청구항 1 내지 청구항 3, 청구항 5 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 추출방법에 의해 추출된 단일 또는 혼합 구조형 인삼사포닌 Rg2를 포함하는 의약 조성물을 알츠하이머(Alzheimer)형 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 치매 치료제.
  15. 삭제
  16. 청구항 1 내지 청구항 3, 청구항 5 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 추출방법에 의해 추출된 단일 또는 혼합 구조형 인삼사포닌 Rg2를 포함하는 의약 조성물을 말초순환 장애의 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 말초순환 장애 치료제.
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