CN101612184B - 多舌飞蓬提取物、含该提取物的组合物及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及多舌飞蓬提取物、含该提取物的组合物及制备方法和用途。本发明提供了一种由全新的提取方法制备而得的多舌飞蓬提取物，其药用效果明确，标示性成分含量高。该提取方法为：将多舌飞蓬药材以水、甲醇水溶液或乙醇水溶液为提取溶剂进行提取，提取液调pH值后过大孔树脂洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，即得本发明提取物。该提取物为所含各个活性成分协同起效的组合物，它不同于活性单体，它的药效也不同于各个活性成分药效的简单相加，该提取物药用效果明确，可用于预防或治疗心脑血管疾病、糖尿病并发症或炎症，制备方法简单，成本低廉，为临床应用提供了一种新的选择。

Description

多舌飞蓬提取物、含该提取物的组合物及制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种多舌飞蓬提取物及其制备方法和用途。

背景技术

多舌飞蓬[Erigeron multiradiatus(Lindl)Benth.]为菊科飞蓬属多年生草本植物，主要分布于我国西藏、四川西部和云南西北部高原地区，资源丰富，在藏医药中以全草入药，其藏药名为“美多罗米”，在藏医药中过去多用于跌打损伤、风湿疼痛、牙痛、胃痛、感冒等症，具有发表散寒、消炎止痛、活血化淤等功效。

关于多舌飞蓬的药用成分、提取方法资源、化学成分、定性定量分析、药效、毒性的相关研究很多，如，多舌飞蓬的生药学研究[中草药，第35卷第3期2004年3月]公开了药材采用甲醇水(1比1)超声提取，并对该提取液进行定性定量分析。飞蓬属多种植物的化学成分含量研究[药物分析杂志，2005，25(1)]公开了药材采用80％乙醇水浴提取，并对该提取液进行定性定量分析。多舌飞蓬黄酮成分的研究[中草药，1998年第29卷第12期]公开了多舌飞蓬全草用95％乙醇回流提取6次，得浸膏，用热水溶解，水溶液冷却后依次用氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩分别得到了氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物，经柱层析从上述提取物中分离得到化合物芹菜素、灯盏甲素、槲皮素等，并进行了定性分析。多舌飞蓬化学成分的研究[中草药，1999年第30卷第8期]公开了全草粉碎后用丙酮水(6比4)浸提，滤液合并后，回收丙酮，浓缩物用石油醚萃取除去脂溶性杂质后继续用EtOAc萃取，蒸干溶剂后得EtOAc部分，残余物用n-BuOH萃取得到n-BuOH部分，n-BuOH部分和EtOAc部分上MCl gelCHP20P柱脱色，用甲醇洗脱得到甲醇部分，上硅胶柱层析，用MEOH-CHCl₃洗脱灯盏乙素。

天然植物因其提取工艺不同，会导致提取物在成分、成分含量、药效上有极大区别，故需要发明人做出创造性劳动以确定其提取工艺及提取物的药效等内容。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种多舌飞蓬提取物，它是由全新的提取方法制备而得的，所得提取物药用效果明确，标示性成分含量高。

本发明提取物中灯盏甲素的含量为6.7～24.8％，灯盏乙素的含量为7.6～26.4％；它是以水、甲醇水溶液或乙醇水溶液为提取溶剂进行提取，提取液调pH值至3～5后通过大孔树脂吸附柱洗脱，水清洗后采用20～70％的乙醇，以0.5～2.5BV/hr的流速洗脱，洗脱液浓缩，干燥而得的干膏。

具体制备方法可采用如下方式：

A、取多舌飞蓬药材，粉碎成粗粉，用8～16倍量的水、甲醇水溶液或乙醇水溶液提取，合并提取液；

B、提取液调pH值至3～5后通过大孔树脂吸附柱洗脱，先用1～5BV(BV表示柱体积)的水，以0.5～2.5BV/hr的流速洗涤吸附柱，弃水洗液，之后采用20～70％的乙醇，以0.5～2.5BV/hr的流速洗涤所述吸附柱，收集该乙醇洗脱液，浓缩，干燥，干膏得率为2.8～7.2％。

本发明的有益效果为：

1、本发明多舌飞蓬提取物中总黄酮的含量可达20～90％，其中含有芹菜素、槲皮素、木犀草素、灯盏甲素、异槲皮苷、灯盏乙素、汉黄芩素的一种或者多种。该制备方法能有效地富集灯盏甲素和灯盏乙素，去除了无药理作用的杂质成分。

2、本发明多舌飞蓬提取物为所含各个活性成分协同起效的组合物，它不同于活性单体，它的药效也不同于各个活性成分药效的简单相加，药用效果明确，可用于预防或治疗心脑血管疾病、糖尿病并发症或炎症。药理实验表明，本发明多舌飞蓬提取物具有抑制小鼠血栓形成，大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用，其对应的疾病为脑血栓、脑出血及其后遗症、缺血性中风、冠心病、心绞痛，对糖尿病并发症有较好的治疗作用，对炎症(如类风湿性关节炎)有抑制作用。

3、急性毒性实验结果表明：本发明多舌飞蓬提取物的毒性低，具有很好的用药安全性，这充分提示了多舌飞蓬提取物临床药用的安全性。

4、本发明多舌飞蓬提取物的制备方法简单，成本低廉。其中所采用的大孔树脂纯化方法简便、快捷、重现性好；所选用的大孔树脂吸附容量大，解吸率大，可反复使用；选用乙醇作为溶剂，价廉、无毒，且可以回收再利用。

由于具有以上优点，充分说明本发明制备方法适用于多舌飞蓬提取物的工业化生产，具有很大的适用性。

附图说明

图1灯盏甲素和灯盏乙素的吸附动力学曲线。

图2不同PH值对灯盏甲素和灯盏乙素的吸附影响。

图3不同的洗脱体积对灯盏甲素和灯盏乙素的解吸效果的影响。

图4泄漏点的测定结果。

图5不同浓度的乙醇对灯盏甲素和灯盏乙素的解吸效果。

具体实施方式

本发明提供了一种采用全新方法制备而得的多舌飞蓬提取物，其中灯盏甲素的含量为6.7～24.8％，灯盏乙素的含量为7.6～26.4％；它是以水、甲醇水溶液或乙醇水溶液为提取溶剂进行提取，提取液调pH值至3～5后通过大孔树脂吸附柱洗脱，水清洗后采用20～70％的乙醇，以0.5～2.5BV/hr的流速洗脱，洗脱液浓缩，干燥而得的干膏。

它可以采用如下方法制备而得：

A、取多舌飞蓬药材，粉碎成粗粉，用8～16倍量的水、甲醇水溶液或乙醇水溶液作为提取溶剂，如常用煎煮法、加热回流提取，渗漉法提取，索式提取法，连续逆流提取，超临界提取等，如采用回流提取时，回流提取2～4次，提取时间为每次0.5～3小时，合并提取液；

B、提取液调pH值至3～5后通过大孔树脂吸附柱洗脱，先用1～5BV的水，以0.5～2.5BV/hr的流速洗涤所述吸附柱，弃水洗液，之后采用20～70％的乙醇，以0.5～2.5BV/hr的流速洗涤所述吸附柱，收集该乙醇洗脱液，浓缩，干燥，干膏得率为2.8～7.2％，所得提取物中灯盏乙素的含量为7.6～26.4％，灯盏甲素的含量为6.7～24.8％。

所述的大孔吸附树脂通常为苯乙烯型共聚体的树脂，其结构为大孔网状结构，例如：D101大孔树脂，HPD系列大孔树脂及其它系列树脂等。

通过筛选试验优选，步骤A中用10倍量的浓度为40％乙醇水溶液回流提取，每次5小时。步骤B中的大孔吸附树脂为HPD100、HPD600、HPD450、D100、D101、D141、D160或AB-8大孔树脂中任意一种；上柱前调整提取液的pH值至4，先用水洗脱，弃水洗液，然后改用45～50％的乙醇约3倍体积洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩干燥即得。

该提取物通过药效试验证明，其药用效果明确，可用于预防或治疗心脑血管疾病(如脑血栓、脑出血及其后遗症、缺血性中风、冠心病或心绞痛等，糖尿病并发症(如糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病心脏病或糖尿病神经病变等或炎症(如类风湿关节炎)，且该制备方法简单，提取物收率高，质量标准可控，应用试剂低毒，成本低廉。

本发明提取物还可按照常规的制剂方法配制成可供给药的药剂形式，包括经口或胃肠外给药形式。在可供给药的形式中，应包含治疗有效量的多舌飞蓬提取物。所谓“治疗有效量”是指在该剂量下，本发明的提取物能够改善或者减轻疾病症状，或者能够抑制或阻断疾病的发展。

可供给药的药剂形式可以为片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、口服液体制剂、注射剂。这些可供给药的组合物还可以根据需要制备成缓控释制剂或靶向制剂。

口服给药的药剂形式可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液体制剂、固体分散体、脂质体制剂等。它们可以含有常规赋形剂如粘合剂糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄螧胶、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂如乳糖、蔗糖、淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；压片润滑剂如硬脂酸镁；崩解剂如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、交聚维酮、羟乙酸淀粉钠、微晶纤维素。

液体组合物(如口服液体组合物)可以制备为口服液、糖浆剂形式，或者将他们制备为干燥产物形式，在使用前用水或者其他适当的溶媒溶解。此类液体制剂可以含有常规的添加剂，悬浮剂如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、氰化可食用脂肪；乳化剂如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水溶性溶媒(可以包括食用油)如杏仁油、分馏椰子油或油性酯如甘油、丙二醇或乙醇的酯；防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨醇；并且如果需要可以含有常规的矫味剂或着色剂。

胃肠外组合物(如胃肠外给药组合物)可以含有所述活性化合物和无菌溶媒，根据使用的浓度，所述活性化合物可以悬浮于或溶解于该溶媒中。制备胃肠外给药的溶液时，可以将本发明的组合物溶于注射用水中，过滤除菌，然后灌装于适当的管制瓶或安瓿中并密封。最好将辅助剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓控溶剂溶于所述溶媒中。为增加稳定性，可以将该组合物灌装于管制瓶中后冷冻并真空去除水分。以基本相同的方法可以制备胃肠外悬浮液，但是所述活性化合物是悬浮于溶媒中而不是溶解于溶媒中，并且除菌不能通过过滤进行。可以将所述化合物暴露于环氧乙烷中灭菌，然后将其悬浮于无菌溶媒中，最好该化合物中含有表面活性剂或润湿剂以有助于活性组分的均匀分布。

将新鲜采集的多舌飞蓬药材全植株晾干，粉碎成粗粉，用8～16倍量的水，回流提取2～4次，提取时间为每次0.5～3小时，合并提取液，浓缩至相对密度为1.35～1.40的稠膏，干燥粉碎即得，干膏得率为15～25％，所得提取物中灯盏甲素的含量1.5～4.7％，灯盏乙素的含量为2.8～5.3％。

将新鲜采集的多舌飞蓬药材全植株晾干，粉碎成粗粉，用含8～16倍量的甲醇或者乙醇的水溶液，回流提取2～4次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，该浓缩液做澄清处理，取上清液浓缩至相对密度为1.35～1.40的稠膏，干燥粉碎即得，干膏得率为15～25％，所得提取物中灯盏甲素的含量4.2～8.7％，灯盏乙素的含量为5.3～9.5％。

将按照上述两种制备方法得到的提取液调pH值至3～5后通过大孔树脂吸附柱洗脱，先用1～5BV的水，以0.5～2.5BV/hr的流速洗涤吸附柱，弃水洗液，之后采用20～70％的乙醇，以0.5～2.5BV/hr的流速洗涤所述吸附柱，收集该乙醇洗脱液，浓缩，干燥，干膏得率为2.8～7.2％，所得提取物中灯盏甲素的含量6.7～24.8％，灯盏乙素的含量为7.6～26.4％。

根据本发明多舌飞蓬提取物通过如下方法检测灯盏甲素和灯盏乙素的含量。

含量测定

对照品溶液的制备：分别取灯盏乙素、灯盏甲素对照品(自制，含量＞98％)，用60％甲醇溶解并定容于10ml容量瓶中。

供试品溶液的制备：取样品药材粉末(过40目筛)，精密称取约1.0克，装入锥形瓶，加甲醇水(1∶1)20ml，超声提取30min，倾出上清液于50ml容量瓶中，再加甲醇水(1∶1)20ml，超声提取30min，合并两次提取液，甲醇定容到刻度。

在以上条件下，分别取供试品溶液与对照品溶液10μl进样。

色谱条件为：乙腈acetonitile(A)，0.4％冰醋酸aqueous acetic acid(v/v，B)流速为1.0ml·min^-1，柱温为35℃，检测波长为335nm。

本发明提供了所述多舌飞蓬提取物的制备工艺，首次采用多舌飞蓬进行了提取、大孔吸附树脂制备工艺的研究，提供了一种多舌飞蓬的大孔树脂纯化方法，该纯化方法是将多舌飞蓬提取液经上大孔树脂柱、洗脱收集洗脱液、浓缩干燥，获得纯化的多舌飞蓬提取物，从而有效的富集了灯盏甲素和灯盏乙素，并去除了大量的杂质。

本发明多舌飞蓬提取物的制备方法筛选试验如下，通过如下筛选试验确定了满足提取物质量的提取工艺及相关参数，并确定了最佳工艺方案。

一、均匀设计法优选多舌飞蓬的提取工艺

1.1药材的处理

按中国药典药材取样方法，分别取多舌飞蓬药材粗粉5g，根据均匀设计法的条件进行回流提取。每个水平重复3次，取其平均值。

1.2实验方法——均匀设计法

选取溶剂浓度(乙醇30％～95％)、溶剂倍数(8～16)、提取时间(0.5～3小时)作为因素分析的三因素，分别设定为相应的9个水平，确定为提取工艺优化条件的范围，见表1。根据均匀设计表(u₉5)确定实验序列，见表2。

表1因素水平表

表2u₉ ⁵实验表及结果

表3因素间的相关系数

回归方程为 $\tilde{Y}=0.343-0.201A-0.000364B+0.000832C$

n＝8    R＝0.949    F＝15.172    S＝0.02    F_0.05，3，5＝5.41

方程高度显著，主要影响因素为浓度，回归系数为负，表明浸出率与浓度成负相关，即浓度越小，浸出率越高。溶剂倍数的回归系数为负，绝对值小于提取时间，表明提取时间对浸出率的影响大于溶剂倍数，溶剂倍数越小，提取时间越长越有利于提高浸出率。通过以上分析，明确了各因素之间的关系，可进行提取工艺的优化。结果见表4。

表4指标的优化预测值与实测值

结果表明：当乙醇浓度为0％时，预测值与实测值误差很大，而N0.1与N0.2优化预测值与实测值比较接近，说明优化结果可信。最后确定的工艺条件为：浓度40％、溶剂为10倍、提取时间3小时。

1.3大孔树脂型号的选择及其参数

经过文献研究，选择其中8种树脂AB-8、HPD100、HPD450、HPD600、D100、D101、D141、D160作为此次研究考查的对象，其物理学性质见表5。

表5大孔树脂的的物理学性质

大孔树脂的吸湿量检测：经过预处理的大孔树脂精密称定重量后，放在70℃的恒温烘箱中，干燥，再次精密称定重量，测定其吸湿量，其结果如下表6：

表6不同大孔树脂的吸湿量

上样液的制备：多舌飞蓬样品500g，粉碎后，采用水提取3次，每次1小时，浓缩至800ml，置冰箱中备用。

采用静态吸附法，通过测定吸附残液中的灯盏甲素和灯盏乙素含量计算静态吸附容量以筛选合适树脂。量取预处理过的8种型号的湿大孔树脂(相当于干重2g)，置50ml锥形瓶中，分别加入药材提取液10ml(灯盏甲素0.81mg·ml^-1，灯盏乙素1.18mg·ml^-1)，在室温振摇6小时，滤过，用蒸馏水40ml洗涤树脂，洗涤液与滤液合并，并定容至50ml测定吸附残液中的指标成分含量，分别计算静态吸附容量。将吸附后树脂过滤，加入50ml 95％乙醇振荡解吸24h，测定解吸液中各成分的质量浓度。计算吸附量(mg/g)和解吸率(％)。吸附量＝(吸附前溶液的质量浓度-吸附后质量浓度)×溶液体积/树脂湿重；解析率＝解吸液质量浓度/(吸附前溶液质量浓度-吸附后质量浓度)×100％，结果见表7。

表7不同种大孔树脂的吸附容量和解析率结果

从表7可见，不同类型的大孔吸附树脂对2个指标成分的静态吸附效果有较大的差异，根据吸附和解吸附的能力，D141大孔树脂的吸附量是最大的，解析率较高，因此选择D141树脂进一步考察。

动态吸附等温曲线：分别取药材提取液0.5ml、1ml、2.5ml、5ml、10ml加蒸馏水配制成10ml溶液，加入到2g D141型大孔树脂柱上，以2～4BV·h^-1的流速重吸附2次，收集吸附残液，测定吸附残液中的指标成分含量，计算2种指标的动态吸附容量。

试验中发现药液质量浓度越大，溶液颜色越深，药液上柱时越易结块阻塞树脂柱筛板，且吸附的杂质含量也逐渐增大，这也可能使树脂的使用次数降低。对于灯盏甲素和灯盏乙素而言，吸附容量随初始的浓度增加而增加，但增加到一定程度后吸附含量就不随药液的质量浓度的增加而增加了，因此当药材提取液5ml级灯盏乙素质量浓度为5.9mg·ml^-1时，吸附到达吸附终点，如图1。

药液pH值考察：取药材提取液5ml(灯盏甲素0.81mg·ml^-1，灯盏乙素1.18mg·ml^-1)，用1mol·L^-1的HCl或1mol·L^-1的NaOH调pH分别为2，4，6，8，10，12，加入到1gD141树脂型大孔树脂锥形瓶中，振摇吸附6h，计算2种指标的静态吸附容量。结果见图2。从图2可以看出药液pH值对D141树脂的吸附容量有一定的影响，pH值不同，其对灯盏甲素和灯盏乙素的吸附容量也不同，当药液pH值为4时，灯盏甲素和灯盏乙素的吸附容量最高。由此选择药液pH值为4时作为上样溶液的pH值。

动态洗脱实验：将预处理好的D141树脂装入1.2×10cm色谱柱中，柱床体积为30ml，将药材提取液10ml(灯盏甲素0.81mg·ml^-1，灯盏乙素1.18mg·ml^-1)注入树脂，控制流速为2BV·h^-1，用70％乙醇洗脱，分别每隔20ml收集流出液，测定各有效成分的含量，绘制动态洗脱曲线，如图3。从图3可以看出随着洗脱液的增加，其对灯盏甲素和灯盏乙素的洗脱含量液逐渐增加，但当洗脱液体积达到100ml时，灯盏甲素和灯盏乙素的洗脱含量不在随洗脱液体积增加而增加，因此选择洗脱液的体积为100ml，为3倍柱体积即达到洗脱终点。

泄漏点实验：将预处理好的D141树脂装入1.2×10cm色谱柱中，柱床体积为30ml，加入药材提取液(灯盏甲素0.81mg·ml^-1，灯盏乙素1.18mg·ml^-1)注入树脂，控制流速为2BV·h^-1，按照文献，流出液中目的产物的质量浓度达到进样质量浓度的10％时，即为吸附终点，达到吸附终点时的流出液体积定义为泄漏点，如图4。从图4可以看出随着药材提取液体积的增加，流出液中灯盏甲素和灯盏乙素的质量浓度液逐渐增加，由泄漏点定义可知当药液体积达35ml时，即上样溶液中灯盏乙素的含量41.4mg时，吸附到达终点，泄漏曲线呈直线上升，再继续上样，样品将毫无保留的流出树脂柱。

洗脱乙醇浓度的考察：用药材提取液10ml将树脂吸附好，先用10BV的蒸馏水以2～4BV·h^-1的流速洗脱，再用3BV的25％、35％、45％、55％、65％、95％乙醇洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的指标成分含量。结果见图5。由图5可以看出随着乙醇体积分数的增加，D141树脂对灯盏甲素和灯盏乙素的洗脱率逐渐增大。不同浓度的乙醇溶液用于解吸附作用测试，以便于选择合适的解吸附溶液。随着乙醇浓度的增加，灯盏甲素和灯盏乙素的解吸附相应地增加，在乙醇浓度为45～50％时，达到峰值，然后随着乙醇浓度的增加而变化不大。由此选择45～50％的乙醇溶液作为洗脱液浓度。

实验结果：根据以上工艺筛选实验，发明人筛选了8种大孔树脂，得到了D141为最佳大孔树脂，其吸附洗脱的最佳条件为，上样量为每克生药约1g树脂，上样液pH值为4，先用水洗脱，然后改用45～50％的乙醇约3倍体积洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩干燥即得。

以下为本发明多舌飞蓬提取物的制备

实施例1从多舌飞蓬中提取的多舌飞蓬提取物

取多舌飞蓬药材50kg，加入40％乙醇500kg，回流提取1.5小时，滤过，滤渣续加40％乙醇500kg再回流1.5小时，滤过，滤渣再加入40％乙醇500kg再回流1.5小时，合并提取液，减压回收溶剂，温度40～65℃，浓缩至无醇味，将浓缩液加入约3倍体积的水，静置，调pH值至4，上样于预处理好的D141大孔吸附树脂，上样后先用3BV纯水冲洗，水溶液弃出，改用3BV的70％乙醇洗脱，洗脱液流速为1.5BV/hr，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，冷冻干燥，即得。总黄酮的含量为74.8％，灯盏乙素的含量为14.5％，灯盏甲素的含量12.7％。取干膏20g，加入适量的生理盐水溶解，制成1000ml，分装成每支1ml，灭菌，检验，包装即得。每次1支，一天1次。

实施例2从多舌飞蓬中提取多舌飞蓬提取物

取多舌飞蓬药材50kg，加入40％乙醇500kg，回流提取1.5小时，滤过，滤渣续加40％乙醇500kg再回流1小时，滤过，滤渣再加入40％乙醇400kg再回流1小时，合并提取液，减压回收溶剂，温度40～65℃，浓缩至无醇味，将浓缩液加入约3倍体积的水，静置，加入适量的中药澄清剂，离心去除沉淀，取上清液调pH值至4，上样于预处理好的D141大孔吸附树脂，上样后先用3BV纯水冲洗，水溶液弃出，改用3BV的70％乙醇洗脱，洗脱液流速为1.5BV/hr，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，喷雾干燥，即得。总黄酮的含量为85.8％，灯盏乙素的含量为18.5％，灯盏甲素的含量16.7％，取干膏20g，加入适量的生理盐水溶解，制成1000ml，分装成每支1ml，灭菌，检验，包装即得。每次1支，一天1次。

实施例3从多舌飞蓬中提取多舌飞蓬提取物

取多舌飞蓬药材50kg，加入水500kg，煎煮1.5小时，滤过，滤渣续加水500kg再煎煮1.5小时，滤过，滤渣再加入水500kg再煎煮1.5小时，合并提取液，减压回收溶剂，温度40～80℃，浓缩至稠膏，将浓缩液加入约3倍体积的水，静置，调pH值至4，上样于预先处理好的D141大孔吸附树脂，上样后先用5BV纯水冲洗，水溶液弃出，改用3BV的70％乙醇洗脱，洗脱液流速为1～1.5BV/hr，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，冷冻干燥，即得。总黄酮的含量为64.5％，灯盏乙素的含量9.3％。

取干膏20g，加入淀粉、CMC-Na，制粒，压制成1000片即得。每次服用1片，一日3次。

取干膏20g，加入适量辅料，装胶囊即得，每次服用粒，一日3次。

实施例4从多舌飞蓬中提取多舌飞蓬提取物

取多舌飞蓬药材50kg，加入40％甲醇500kg，回流提取1.5小时，滤过，滤渣续加40％甲醇500kg再回流1小时，滤过，滤渣再加入40％甲醇400kg再回流1小时，合并提取液，减压回收溶剂，温度40～65℃，浓缩至无醇味，将浓缩液加入约3倍体积的水，静置，取上清液，调pH值至4，上样于预处理好的D141大孔吸附树脂，上样后先用3BV纯水冲洗，水溶液弃出，改用3BV的70％乙醇洗脱，洗脱液流速为1.5BV/hr，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，冷冻干燥，即得。总黄酮的含量为75.8％，灯盏乙素的含量为15.5％，灯盏甲素的含量12.7％，取干膏20g，加入适量的生理盐水溶解，制成1000ml，分装成每支1ml，灭菌，检验，包装即得。每次1支，一天1次。

多舌飞蓬提取物的抗脑缺血药效学实验

1.实验材料

1.1实验样品

本发明多舌飞蓬提取物：从多舌飞蓬中提取的多舌飞蓬提取物(按照实施例1工艺方法制备，总黄酮含量大于50％)，以下均简称为EE。

灯盏花素片(主要含灯盏乙素)：每片20mg，批号050401，由云南玉溪药业有限公司生产。

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及Ca²⁺-ATPase试剂盒，为南京建成生物制品研究所提供。

1.2实验动物

大鼠、小鼠：购于四川大学华西动物中心。

2.实验方案

2.1多舌飞蓬提取物对小鼠脑缺血的影响

2.1.1多舌飞蓬提取物对小鼠体内血栓形成的影响

雄性小鼠120只，体重28±2g，随机分成6组。灯盏花片组每只灌胃给药60mg/kg，多舌飞蓬组高、中、低3个剂量分别每只灌胃给药多舌飞蓬提取物80mg/kg、40mg/kg、20mg/kg，每天1次，连续7天，正常对照组和模型组均给予等量生理盐水。末次给药30分钟后，除正常对照外各组小鼠尾静脉注射胶原蛋白与盐酸肾上腺素混合的血栓诱导剂0.1ml/l0g体重，随即观察15分钟内偏瘫恢复的小鼠只数，计算保护率(保护率＝偏瘫恢复小鼠只数/实验动物数×100)，进行卡方比较。结果多舌飞蓬提取物高、中、低三个剂量组均能明显抑制小鼠体内血栓形成，多舌飞蓬提取物高、中剂量组与灯盏花素片对小鼠体内血栓形成的保护率相近，见表8。

表8多舌飞蓬提职物对小鼠体内血栓形成的影响

注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01

2.1.2多舌飞蓬提取物对脑缺血再灌小鼠行为学变化的影响

雄性小鼠120只，体重22±2g，采用双侧颈总动脉夹闭合并取血降压再灌注的方法建立小鼠脑缺血再灌损伤模型。实验鼠术前12h禁食，自由饮水。4％水合氯醛(0.1ml/10g体质量)腹腔注射麻醉后，仰卧固定于鼠解剖板，颈正中剃毛，以碘酒和75％酒精做皮肤常规消毒，沿前后方向正中线纵向剪开颈部皮肤约0.5cm，钝性分离组织和肌肉，暴露并分离出双侧颈总动脉，下穿丝线备用。分离颈总静脉。于颈总静脉处插管(预先肝素内浸泡)抽血降压(约为小鼠总血量的30％)。无创性微动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min。记时结束，松开动脉夹，并回输血液，拔出导管，缝合伤口。放回笼中室温(25±0.5)℃饲养。假手术组的麻醉及手术过程与模型组相同，但不阻断血流，不放血。随机分为假手术组、模型组、灯盏花素片防治组和多舌飞蓬提取物防治组，灯盏花片组每只灌胃给药60mg/kg，多舌飞蓬组高、中、低3个剂量分别每只灌胃给药多舌飞蓬提取物80mg/kg、40mg/kg、20mg/kg，每天1次，连续7天，假手术组、模型组灌胃给予生理盐水，末次给药30分钟后，检测各组小鼠自发活动次数的变化。与假手术组比较，模型组小鼠自发活动数减少，而灯盏花素片，EE中剂量组，EE高剂量组均可以不同程度恢复小鼠自发活动次数，EE低剂量组作用不明显。

表9小鼠自发活动次数(x±s)

注：与模型组比较，*P＜0.05，*9*p＜0.01

2.2多舌飞蓬提取物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

本实验通过线栓法复制大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型，观察缺血再灌注后大鼠神经功能障碍，测定脑梗死范围、脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量，进而观察多舌飞蓬提取物对脑缺血损伤的保护作用

模型制作方法：

大鼠分组及局灶性脑缺血再灌注损伤模型的复制取雄性大鼠60只，随机分为6组，每组10只，即多舌飞蓬提取物高剂量(80mg/kg)、中剂量(40mg/kg)、低剂量(20mg/kg)组，灯盏花素片(60mg/kg)组，模型组及假手术组。其中假手术组及模型组均给予多舌飞蓬提取物中剂量组所含等量溶液。各组动物手术前均连续给药7d，每天1次，于第7d给药后1h采用线栓法。将直径为0.26mm、头端灼烧膨大且光圆的尼龙线经颈外动脉插入颈内动脉入大脑中动脉分支处，进线深度均距颈内、颈外动脉分叉(18±2)mm处，阻断左侧大脑中动脉血流2h，拔出尼龙线予以再灌注24h，假手术组只手术分离，不插线。

2.2.1多舌飞蓬提取物对大鼠大脑中动脉阻断后神经功能的影响各组大鼠于缺血再灌注1h后进行神经功能评分，无功能障碍者为0分，右前肢不能完全伸直为1分，向右旋转为2分，向右侧倾倒为3分，不能行走或昏迷为4分，结果见表10：与假手术组比较，模型组出现明显的神经功能障碍；与模型组比较，多舌飞蓬提取物高、中剂量组及灯盏花素片组神经功能评分均显著降低，差异有显著性(P＜0.01)。

表10多舌飞蓬提职物对大鼠脑缺血神经功能的影响(n＝8，x±s)

与假手术组比较，##P＜0.01与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.2.2多舌飞蓬提取物对脑缺血再灌注大鼠脑梗死面积的影响

各组大鼠再灌注24h后，开颅取脑，取梗死侧脑组织在冰浴上(4℃以下)冠状切成5片，迅速将脑片置于TTC染液中(5ml染液中含有4g/L的TTC及1mol/L K2HPO40.1ml)，37℃避光保存。经染色后非缺血区呈玫瑰红色，梗死区呈白色，将白色组织仔细挖下称质量，以梗死区脑质量与总切片脑质量的百分比作为梗死范围，结果见表11：与假手术组比较，模型组梗死百分比显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，多舌飞蓬提取物高、中剂量组及灯盏花素片组脑梗死范围均显著缩小，差异有显著性(P＜0.01)。

表11多舌飞蓬提职物对缺血再灌注大鼠脑梗死范围的影响(n＝8，x±s)

与假手术组比较，##P＜0.01，与模型组比较**P＜0.01。

2.2.3多舌飞蓬提取物对脑缺血再灌注大鼠脑组织SOD、GSH Px活性及MDA含量的影响

各组大鼠于再灌注24h后，取缺血侧同一部位脑组织用9.0g/L冰氯化钠溶液制成0.1g/ml脑组织匀浆，将匀浆以3000r/min，离心10min，取上清液，按试剂盒说明书测定SOD、GSH Px活性(大鼠脑匀浆中每克蛋白质中活性)及MDA含量(大鼠脑匀浆中每克蛋白质中含量)，结果见表12：与假手术组比较，模型组SOD、GSH-Px的活性明显降低，MDA含量显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，多舌飞蓬提取物高、低剂量组及灯盏花素片组SOD活性显著升高，差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)；多舌飞蓬提取物中、低剂量组及灯盏花素片组GSH Px活性显著升高，而MDA含量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

表12多舌飞蓬提取物对脑缺血再灌注大鼠脑组织SOD、GSH Px活性及MDA含量的影响

与假手术组比较，##P＜0.01，与模型组比较**P＜0.01。

2.3多舌飞蓬提取物抗糖尿病并发症

Wistar大鼠，雄性，体重220-250g，实验过程中自由饮水。用pH4.2，0.1nmol/L柠檬酸盐缓冲液配制链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)溶液，浓度为10mg/ml。大鼠禁食12小时后，链脲佐菌素溶液50mg/kg一次性腹腔注射。7天后，眼眶静眶取血测血糖，将随机血糖≥16.7nmol/L者选为糖尿病模型鼠。

选链脲佐菌素性糖尿病大鼠，按血糖值均衡随机分为5组，糖尿病模型组和空白对照组按10ml/kg灌胃给予常水；给药组分别为100、200、400mg/kg灌胃给予多舌飞蓬提取物；阳性药组按20mg/kg给予二甲双孤。

表13多舌飞蓬提取物对糖尿病大鼠体重的影响

与正常组对照比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

由表13可见给予链脲佐菌素造型后糖尿病大鼠体重显著低于正常对照组随着病程的延长，模型组大鼠体重呈现持续下降趋势(P＜0.01)，给与多舌飞蓬提取物高、中、低剂量治疗后，糖尿病大鼠体重恢复较快，但是仍然显著低于正常对照组(P＜0.01)。

表14多舌飞蓬提取物对糖尿病大鼠进食量、饮水量、排尿量及排便量的影响

与正常组对照比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

由表14可见，糖尿病大鼠进食量、饮水量、尿量及排便量均较正常对照组有显著的增加(P＜0.01)，呈现糖尿病的“三多一少”症状。给与多舌飞蓬提取物高、中、低剂量治疗三个月后，糖尿病大鼠“三多一少”的症状得到了显著的改善，高剂量可以显著的降低糖尿病大鼠进食量、饮水量、尿量及排便量(P＜0.01)。中剂量和低剂量均等显著的降低糖尿病大鼠的排便量(P＜0.01)，可改善糖尿病大鼠进食量、饮水量、尿量。

表15多舌飞蓬提取物对糖尿病大鼠血糖的影响

与正常组对照比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

由表15可见，糖尿病大鼠较正常对照组空腹血糖值显著升高(P＜0.01)，给多舌飞蓬提取物高、中、低剂量治疗后，糖尿病大鼠空腹血糖显著降低，且降糖作用平稳，持久。

表16多舌飞蓬提职物对糖尿病大鼠血清糖化蛋白(GSP)的影响

与正常组对照比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

由表16可见(P＜001)给多舌飞蓬提取物高、中、低剂量治疗后，糖尿病大鼠糖化血清蛋白含量明显降低(P＜0.01)，提示多舌飞蓬提取物能够很好的控制血糖的波动，且能够很好的抑制血清蛋白的非酶糖化反应。

表17多舌飞蓬提职物对糖尿病大鼠肾指数的影响

与正常组对照比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

由表17可见，病程三个月后，糖尿病大鼠肾指数较正常组显著升高(P＜0.01)，给予多舌飞蓬提取物高、中、低剂量治疗三个月后，给药各组大鼠的肾指数较搪尿病大鼠明显降低(P＜0.01)，并且多舌飞蓬提取物给药组呈现一定的量效关系。

表18多舌飞蓬提取物对糖尿病大鼠血清尿素氮(BUN)的影响

与正常组对照比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

由表18可见，糖尿病大鼠血清中尿素氮的含量较正常对照组有显著的升高(＜P0.01)。给予多舌飞蓬提取物高、中、低剂量治疗后，高、中剂量和二甲双胍组血清中尿素氮的含量有了显著的降低(P＜0.01)。

2.4多舌飞蓬提取物的抗炎镇痛实验研究

2.4.1醋酸诱导的扭体实验

取60只昆明种小鼠，雌雄各半，随机分为5个组，即对照组、EM低剂量组(100mg/kg)、EM中剂量组(200mg/kg)和EM高剂量组(400mg/kg)及阿司匹林10(mg/kg)，每组各为12只。每天灌胃给予各相应药物，正常对照组及模型对照组给与等量溶剂，连续3d。末次药后1小时小鼠腹腔注射0.6％醋酸0.1mL/10g，5分钟后观察15分钟内典型的扭体发生次数(伸展后肢、腹部收缩和扭曲身体)，记录扭体数，并以下式计算给药组的抑制率，结果见表19。

表19多舌飞蓬提职物对被醋酸引起小鼠扭体的影响

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2.4.2二甲苯诱导小鼠耳肿胀

昆明种小鼠，随机分成5组，每组6只，即对照组，阳性对照组(吲哚美辛片10mg/kg)，EM大、小剂量组(400mg/kg、200mg/kg)。以上各组分别按0.2ml/10g灌胃给予药液，对照组给予等量溶剂，每天1次，连续3天。末次给药后1h，以30μl二甲苯涂于小鼠右耳两面致炎，左耳不涂，致炎后60min处死小鼠。分别在左右耳同一部位用直径6mm的打孔器打下圆形耳片，在万分之一的天平上称重，以左右耳片重量差表示肿胀度。结果见表20。结果表明，EM显示了对小鼠耳肿胀的明显抑制作用，并且呈一定的剂量依赖性，其作用强度与吲哚美辛片的作用相似。

表20多舌飞蓬提职物对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀的影响(n＝6)

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

在上述药效学实验中，没有采用灯盏甲素和灯盏乙素直接混合进行药效学实验研究，是因为灯盏甲素目前无法大规模的生产，提取量极小，仅限于实验室作为结构鉴定用，因此采用本发明提取工艺能够达到纯化灯盏甲素和灯盏乙素的目的，并且所用的试剂设备廉价，提取效率高，提取物中包括灯盏甲素和灯盏乙素以及其他成分，其药效明显优于灯盏乙素。

通过上述试验说明，本发明多舌飞蓬提取物具有抑制小鼠血栓形成，大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用，其对应的疾病为脑血栓、脑出血及其后遗症、缺血性中风、冠心病、心绞痛，对糖尿病并发症有较好的治疗作用，对炎症(如类风湿性关节炎)有抑制作用。

Claims (10)

1.多舌飞蓬提取物，其特征在于：灯盏甲素的含量为6.7～24.8％，灯盏乙素的含量为7.6～26.4％；它是以水、甲醇水溶液或乙醇水溶液为提取溶剂进行提取，提取液调pH值至3～5后通过大孔树脂吸附柱洗脱，水清洗后采用20～70％的乙醇，以0.5～2.5BV/hr的流速洗脱，洗脱液浓缩，干燥而得的干膏。

2.多舌飞蓬提取物的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

A、取多舌飞蓬药材，粉碎成粗粉，用水、甲醇水溶液或乙醇水溶液提取，得提取液；

B、提取液调pH值至3～5后过大孔树脂吸附柱，水洗涤后，弃水洗液，采用20～70％的乙醇，以0.5～2.5BV/hr的流速洗脱，收集该乙醇洗脱液，浓缩，干燥即得；

多舌飞蓬提取物中灯盏甲素的含量为6.7～24.8％，灯盏乙素的含量为7.6～26.4％。

3.根据权利要求2所述的多舌飞蓬提取物的制备方法，其特征在于：步骤A中提取时采用回流提取，用8～16倍量的水、甲醇水溶液或乙醇水溶液回流提取2～4次，每次0.5～3小时，合并提取液。

4.根据权利要求2所述的多舌飞蓬提取物的制备方法，其特征在于：步骤A中提取时采用回流提取，用10倍量的浓度为40～50％乙醇水溶液回流提取2～4次，每次1.5小时。

5.根据权利要求2所述的多舌飞蓬提取物的制备方法，其特征在于：步骤B提取液过大孔树脂吸附后，先用1～5BV的水，以0.5～2.5BV/hr的流速洗涤，弃水洗液后再用乙醇水溶液洗脱。

6.根据权利要求2所述的多舌飞蓬提取物的制备方法，其特征在于：步骤B所述的大孔树脂为D100、D101、D141、HPD100、HPD600、HPD450或AB-8大孔树脂中任意一种。

7.根据权利要求2所述的多舌飞蓬提取物的制备方法，其特征在于：步骤B上柱前调整提取液的pH值至4。

8.根据权利要求2所述的多舌飞蓬提取物的制备方法，其特征在于：步骤B中水洗涤后，采用45～50％的乙醇洗脱。

9.权利要求1所述的多舌飞蓬提取物在制备预防或治疗心脑血管疾病、糖尿病并发症或炎症的药物中的用途。

10.以权利要求1所述的多舌飞蓬提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的药物组合物。

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