CN101297880B - 含根皮苷的活性提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种活性提取物，所述活性提取物是用5-95％的乙醇水溶液作为溶剂从蔷薇科及壳斗科植物中提取得到的，并且所述活性提取物中根皮苷的含量为30-99.5％；本发明还公开所述活性提取物的制备方法和其在制备治疗糖尿病肾病和肝水肿的药物中的用途。

Description

含根皮苷的活性提取物及其用途

技术领域

本发明涉及一种从蔷薇科及壳斗科植物中提取得到的主要含有根皮苷的活性提取物，该活性提取物用于制备治疗糖尿病肾病和肝水肿的药物组合物。

背景技术

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病常见而难治的微血管并发症，为糖尿病的主要死因。

糖尿病患者肾脏功能和结构病变的演变可分为以下五期：I期：以高肾小球滤过率(GFR越位150ml/min)和肾脏增大为特征。II期：无临床症状肾损害期，但出现肾小球基质膜增厚的结构损害。运动后可出现可逆性尿白蛋白排泄量(UAE)升高。III期：糖尿病肾病高危期，UAE持续升高(20-200μg/min)，GFR可恢复正常(130ml/min)，血压可升高但未到高血压水平，已有肾小球结节型和弥漫型病变以及小动脉玻璃样变，并已开始出现肾小球荒废。IV期：显性蛋白尿肾病期，出现进行性临床非选择性蛋白尿(UAE>200μg/ml或尿蛋白>0.5g/24h；GFR逐步下降，临床上可出现水肿，大量蛋白尿等肾病综合症的表现，高血压常与蛋白尿水平平行，组织学改变为肾小球硬化，属临床DN。V期：肾功能衰竭期，出现尿毒症的临床表现和组织学改变，为终末期DN。DN已成为终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)最主要的病因。

纵观DN药物治疗的资料，无论是降血糖，降压，单独或联合用药，都因其副作用之大而无法长期用药，而从天然植物中提取安全有效成分已成为近年来研究的热点。中国专利CN1086289，CN1440747，CN1748675，CN1899277报道，用中药大黄的提取物大黄酸在DN的动物模型上证实了其降低糖尿病大鼠尿蛋白排出量，减轻肾脏肥大，缩小肾小球面积及系膜区面积，降低肾小球TGFβ1及GLUT1mRNA的高表达，并可改善糖尿病大鼠的血脂代谢异常，有轻度降血糖作用等等。

根皮苷，其化学名为1-[2-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-4，6-二羟苯基]-3-(4-羟苯基)-1-丙酮，是一种存在多种植物中的二氢查耳酮类天然化合物。含有根皮苷的提取物工艺国内已进行了深入的研究。据文献报道，魏福祥等采用超临界CO₂制备含有根皮苷的提取物(食品研究与开发，27(7)：60-63，(2006))；张泽生等采用大孔吸附树脂制备含有根皮苷的提取物(食品研究与科学，27(9)：24-27，(2006))；金莹等采用超声制备含有根皮苷的提取物(工艺技术，26(12)：99-100，(2005))；艾志录等采用微波制备含有根皮苷的提取物(农业工程学报，22(6)：188-191，(2006))；另外中国专利CN1683382也报道了用大孔吸附树脂制备根皮苷。另具美国专利报道，根皮苷具有多种药理活性，具有治疗镰刀细胞贫血(美国专利US4665058)、预防或治疗肿瘤(美国专利US4684627)、预防或治疗分泌旺盛型粉刺，抑制黑色素细胞活性，保护皮肤(美国专利US6093408)、预防或治疗减肥，反应性低血糖，高血糖，糖毒和糖尿病(美国专利US6448232)、提高记忆力，预防或治疗II型糖尿病，寄生虫病，骨质疏松和延缓衰老(美国公开专利US2006189512)。

但是，到目前为止仍然没有一种工艺简便、成本低廉且适合于大规模生产的制备高含量根皮苷的提取方法，更没有一种适合于制备药物组合物的根皮苷含量高的活性提取物。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可用于制备治疗糖尿病肾病和肝水肿的药物组合物的根皮苷含量高的活性提取物。

本发明的目的之二是提供一种适合于大规模生产的制备高含量根皮苷的方法，该方法简便易行、不污染环境，而且成本低廉。

本发明的目的之三是提供一种含高含量根皮苷的活性提取物的药物组合物。

本发明的目的之四是提供一种将根皮苷提取物的新用途，即用于制备治疗糖尿病肾病和肝水肿的药物，该药物用于治疗糖尿病肾病和肝水肿。

因此本发明提供了一种活性提取物，其中根皮苷的含量占该提取物重量的30-99.5％，优选为50-99.5％，特别优选为70-99.5％。在本发明的一个特别优选实例中，本发明方法制备的活性提取物为一晶体，其X-衍射图谱在衍射角为2θ时，具有下述特征峰：7.600，d＝11.623，I/I₀＝73；15.200，d＝5.824，I/I₀＝99。

本发明的高含量根皮苷的活性提取物是用5-95％的乙醇水溶液作为溶剂从蔷薇科或壳斗科植物中提取得到的。

所述蔷薇科植物包括绣线菊亚科，苹果亚科，蔷薇亚科，李亚科植物。

绣线菊亚科植物优选绣线菊属(Spiraea)、鲜卑花属(Sibiraea)、假升麻属(棣棠升麻属)(Aruncus)、珍珠梅属(Sorbaria)、风箱果属(Physocarpus)、绣线梅属(Neillia)、野珠兰属(米空木属)(Stephanandra)、白鹃梅属(Exochorda)。

苹果亚科植物优选牛筋条属(Dichotomanthus)、栒子属(Cotoneaster)、大棘属(Pyracantha)、山楂属(Crataegus)、小石积属(Osteomeles)、红果树属(Stranvaesia)、石楠属(Photinia)、枇杷属(Eriobo-trya)、石斑木属(Rhaphiolepis)、花楸属(Sorbus)、榅桲属(Cydonia)、移属(Docynia)、木瓜属(Chaenomeles)、梨属(Pyrus)、苹果属(Malus)、唐棣属(Amelanchier)。

蔷薇亚科植物优选蔷薇属、绵刺属(三瓣蔷薇属)(Potaninia)、龙芽草属、马蹄黄属(黄总花草属)(Spenceria)、羽衣草属(斗篷草属)(Alchemilla)、地榆属、棣棠属(Kerria)、鸡麻属(Rhodotypos)、蚊子草属(合叶子属)(Filipendula)、悬钩子属(树梅属)、仙女木属(多瓣木属)(Dryas)、路边青属(水杨梅属)(Geum)、无尾果属(Coluria)、林石草属(Waldsteinia)、草莓属、蛇莓属(Duchesnea)、委陵菜属(金露梅属)(Potentilla)、山莓草属(五蕊莓属)(Sibbaldia)、地蔷薇属(Chamaerhodos)和近年在华北新发现的太行花属(Taihangia)。

李亚科植物优选扁核木属(Prinsepia)、臀果木属(Pygeum)、臭樱属(假稠李属)(Maddenia)、李属(Prunus)、桃属(Amygdalus)、杏属(Armeniaca)、樱桃属(Cerasus)、稠李属(Padus)、桂楧属(Laurocerasus)。

所述壳斗科植物包括水青冈属(Fagus)，栗属(Castanea)，锥属(Castanopsis)，柯属(Lithocarpus)，栎属(Quercus)，青冈亚属(Cyclobalanopsis)，三棱栎属(Trigonobalanus)。

本发明所述的蔷薇科植物特别优选苹果、梨、桃、樱桃。

本发明所述的壳斗科植物特别优选Lithocarpus polystachyus，Lithocarpus litseifolius，Lithocarpus lithoserfolins，Lithocarpuslithoseifolius和Lithocarpus pachyphyllus等植物。

本发明含高含量根皮苷的活性提取物可以从所述植物的地下部分或地上部分提取，包括叶、嫩枝、树皮、树根和果实。但是优选从新鲜的叶子和未成熟的果实中分离，新鲜的叶子优选在生长周期的早期收集。

本发明的活性提取物中根皮苷的含量为30-99.5％，除了根皮苷外，提取物中还可以含有其它的多酚，包括但不限于其中一种或多种成分如对苯二酚、间苯三酚、阿魏酸、咖啡酸、香豆酸、槲皮素、儿茶素、表儿茶素、原花青素、绿原酸、二氢查耳酮、黄酮醇。

本发明的另一方面，是提供了一种适合于大规模生产高含量根皮苷的方法，该方法简便易行、不污染环境，而且成本低廉。

在本发明方法的优选实例中，是将植物原料用5-95％乙醇水溶液提取后，得到的粗提物再用聚酰胺吸附树脂进行进一步的分离纯化。本发明方法中所用的聚酰胺的粒径为10～200目，粗提物与大孔树脂的重量比为1：1～50，层析柱的直径与高的比为1：2～30。特别优选的是：聚酰胺的粒径为10～100目，根皮苷粗提物与大孔树脂的重量比为1：5～40，层析柱的直径与高的比为1：5～20。

本发明方法中，根皮苷粗提物通过聚酰胺进一步分离后可得到无色或淡黄色的根皮苷针状结晶体。该结晶体包括用含0-50％乙醇水溶液重结晶得到的含两分子结晶水的根皮苷结晶体和用无水有机溶剂重结晶得到的不含结晶水的根皮苷结晶体。

本发明还提供了一种药物组合物，其包括本发明的治疗有效量的活性提取物和可药用载体。优选本发明的药物组合物含有根皮苷含量为50-99.5％的活性提取物，特别优选本发明的药物组合物含有根皮苷含量为70-99.5％的活性提取物。

本发明的药物组合物可制备成各种适于口服给药或肠胃外给药的药物制剂。

口服给药的药物制剂包括片剂、缓释片、锭剂、水溶液或油混悬液、分散粉剂或粒剂、乳液、滴丸、硬或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。

肠胃外给药的药物制剂包括静脉、肌内、腹膜、皮下、直肠和局部给药途径。

用于口服给药的本发明药物制剂可依据本领域用于制备口服药物组合物的任何已知方法制得，并且这样的组合物，除了含有本发明的活性提取物和可药用载体外，还可包含一种或多种选自下列的物质：甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以提供药学美观和适口的制剂。

片剂含有活性组分以及与其混合的适于制备片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂。这些赋形剂可以是：惰性稀释剂如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂例如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉或藻酸；粘合剂例如淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯树胶；和润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。

本发明的口服制剂还可以以硬明胶胶囊提供，其中活性组分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙和高岭土混合，或以软明胶胶囊提供，其中活性成分与水溶性载体例如聚乙二醇或油性介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

本发明的分散粉剂和粒剂，适于使用时通过加入水来制备水混悬液。它提供了与分散剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性组分。

本发明的糖浆剂和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖配制。这样的制剂还可包含缓冲剂、防腐剂、矫味剂和着色剂以及抗氧剂。

本发明的药物制剂可以是无菌注射水溶液的形式。可使用的载体或溶剂包括水、林格溶液、氯化钠和/或葡萄糖注射液。

当把本发明的药物组合物和药物制剂对人体给药时，日剂量通常由处方医师决定，并且剂量一般随个体患者的年龄、体重、性别和反应以及患者症状的严重程度而变。通常，成人每天给药剂量为1-500mg活性提取物/kg体重，优选为每天15.5-155mg活性提取物/kg体重。

本发明的研究表明：根皮苷提取物具有保护肾脏和肝细胞的作用，对体重也有一定程度的减轻作用。

因此，本发明的再一方面是提供了一种根皮苷活性提取物的新用途，即用于制备预防和治疗治疗糖尿病肾病、肝水肿，尤其是药物性肝水肿的药物。

本发明进行了根皮苷提取物治疗糖尿病肾病、肝水肿的药效学研究。

(一)：动物模型的建立

本药物用在经左肾切除+高脂高糖饲料诱导+STZ选择性破坏胰腺β细胞造成糖尿病及单侧肾脏失代偿导致的大鼠糖尿病肾病模型经灌胃给药一个月。给药观察期间，每周称体重并计进食量。在结束试验前每只动物均上代谢笼收集24h尿液，测24h尿蛋白总量；并取血测相关血生化指标，包括血糖，尿素氮，总胆红素(Total Bilirubin)，谷丙转胺酶(SGPT)，总胆固醇，甘油三酯，HDL-C，尿酸及电解质；并且处死动物后取肾脏，肝脏，心脏，测其重量，计算脏器/体重指数；制作石蜡切片。

(二)：药效学实验及其结果

1.体重的变化：

假手术组动物在整个实验过程中，在体重300g以内时每周体重增长约为15-20克；体重达300克后每周体重约增长10克左右。如附图2所见，模型组在左肾切除术后一周，体重显著性下降(p<0.001>；在给予高脂饲料后的2周时模型组动物体重增重率一度显著超过了假手术组的动物(p<0.01)；直至STZ肌肉注射后一周体重再度下降，但此后因出现了糖尿病大鼠的三多一少症状，进食量比假手术对照组增加了0.3-1.6倍(数据未显示)，但体重的增重率一直下降(p<0.001)。给药后模型组的体重的增重率也仍然处于负增长状态。

2.病理切片结果显示

1)肾小球系膜区Masson染色结果(详见附图3)

光镜下经Masson染色的肾小球切片所见，模型组较正常对照组肾小球的系膜区有较弥漫的无细胞性的物质增多，并可见分叶现象；而给药组小剂量，大剂量的动物石蜡切片上肾小球毛细血管腔较模型组清晰，以大剂量更为明显。提示根皮苷有改善肾小球系膜区基质的增生作用。

2)肝细胞病理切片(详见附图4)

肝细胞HE染色400x显微镜下显示，由于造模剂STZ的肝细胞毒性作用所致模型对照组肝细胞形态较正常肝细胞有肿胀界限不清，而大剂量组却见较为清晰的细胞界限。肝细胞核见有2-3个核仁/细胞，可能与细胞代谢旺盛有关。给药组较阴性对照组动物转氨酶也有所降低的结果与病理切片结果吻合。

(三)药效学结果分析及初步结论

根皮苷有改善肾小球系膜区系膜基质增生，减轻药物性肝细胞水肿现象。给药组动物的血糖、血脂及24小时尿蛋白也有不同程度下降。据此，根皮苷有保护肾脏和肝细胞作用，对体重也有一定程度的减轻作用。

附图说明

图1为本发明提取物根皮苷结晶体的X衍射图。

图2为给药前后正常组与模型组大鼠体重对照图。

图3为给药前后正常组与模型组大鼠肾小球系膜区Masson染色的结果比较。

图4为给药前后正常组与模型组大鼠肝细胞病理切片的结果比较。

具体实施方式

下面的实施例仅仅用于进一步解释本发明，而不是对本发明范围的限制。

实施例1

将苹果榨汁废料加入8倍量浓度为70％的乙醇水溶液中，浸泡2小时后，加热至回流状态，并回流1小时，过滤；滤渣加入6倍量的70％乙醇水溶液加热至回流状态并回流1小时，过滤；重复此过程1次。合并过滤液，减压浓缩回收乙醇，得到根皮苷浸膏。

将30g根皮苷干浸膏放于100ml蒸馏水中，加热至80℃并不断搅拌使根皮苷完全溶解，趁热抽滤得到棕褐色澄清溶液，静置冷却至20～40℃，将该溶液加到100-200目聚酰胺首端，用蒸馏水洗脱除去部分水溶性杂质及色素后，用10％-40％的乙醇水溶液进行洗脱，薄层检测，收集末端洗脱液，浓缩过滤，滤液放置析晶，对析出的粗结晶用适量蒸馏水重结晶，得到10.0g纯度在99％以上的根皮苷结晶体。

m.p.110.0～111.5°；X-衍射图谱见附图1。

ESI-MS(m/z)：435[(M-1)⁺]及ESI-MS(m/z)：459[(M+Na)⁺]。

IR cm^-1：3374，1627，1610，1517，1197，835

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：2.79(2H，t，J＝7.4Hz)，3.29-3.42(8H，m)，4.94(1H，d，J＝7.4Hz)，4.58-5.27(4H，m)，5.94(1H，d，J＝2.3Hz)，6.14(1H，d，J＝2.3Hz)，6.65(2H，dt，J＝2.0，8.5Hz)，7.04(2H，d，J＝8.5Hz)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ：29.0，44.9，60.6，69.5，73.2，76.7，77.3，94.4，96.8，100.8，105.2，115.0(×2)，129.2(×2)，131.6，155.3，160.8，164.4，165.4，204.8。

X衍射图谱在衍射角(2θ)在7.600(d＝11.623，I/I₀＝73)，12.300(d＝7.190，I/I₀＝5)，15.200(d＝5.824，I/I₀＝99)，15.880(d＝5.576，I/I₀＝10)，19.600(d＝4.525，I/I₀＝20)，21.180(d＝4.191，I/I₀＝9)，22.880(d＝3.884，I/I₀＝24)，23.360(d＝3.805，I/I₀＝17)，38.900(d＝2.313，I/I₀＝8)处具有特征峰。

实施例2

将苹果的嫩枝叶切成1～3cm的小段，加入10倍量的50％乙醇水溶液，浸泡30分钟后，加热至回流状态，并回流1小时，过滤；滤渣加入5倍量浓度为50％的乙醇水溶液加热至回流状态并回流1小时，过滤；此过程重复1次。合并过滤液，常压回收乙醇，浓缩得到根皮苷浸膏。

将30g根皮苷干浸膏放于100ml蒸馏水中，加热至80℃并不断搅拌使根皮苷完全溶解，趁热抽滤得到棕褐色澄清溶液，静置冷却至20～40℃，将该溶液加到聚酰胺首端，用蒸馏水洗脱除去部分水溶性杂质及色素后，用30％-40％的乙醇水溶液进行洗脱，薄层检测，收集末端洗脱液，浓缩过滤，滤液放置析晶，对析出的粗结晶用适量蒸馏水重结晶，得到13.2g纯度在99％以上的根皮苷结晶体。其理化数据同实施例1。

实施例3

按下列配方制得本发明的片剂：(所用含量均为重量百分含量)

含70％根皮苷的活性提取物                         54.5％

微晶纤维素                                       42.0％

PVP-k30                                          1.0％

硬脂酸镁                                         0.5％

羧甲基淀粉钠                                     2.0％

将根皮苷提取物、微晶纤维素、部分羧甲基淀粉钠混匀，加入PVP-k30的乙醇溶液制软材，经20目筛制粒，60℃鼓风干燥后整粒，加入羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁后混匀压片，即得。

实施例4

按下列配方制得本发明的胶囊剂：(所用含量均为重量百分含量)

含80％根皮苷的活性提取物                         50.0％

淀粉                                             47.5％

羧甲基淀粉钠                                     2.0％

硬脂酸镁                                         0.5％

将根皮苷提取物与淀粉混合均匀，加入8％淀粉浆制软材，经20目筛制粒，于60℃鼓风干燥后整粒，加入羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁后填充到空胶囊即得。

实施例5

按下列配方制得本发明的片剂：(所用含量均为重量百分含量)

根皮苷结晶体                                     30.0％

微晶纤维素                                       66.5％

PVP-k30                                          1.0％

硬脂酸镁                                         0.5％

羧甲基淀粉钠                                     2.0％

将根皮苷结晶体、微晶纤维素、部分羧甲基淀粉钠混匀，加入PVP-k30的乙醇溶液制软材，经20目筛制粒，60℃鼓风干燥后整粒，加入羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁后混匀压片，即得。

Claims (4)

1.一种根皮苷活性提取物的制备方法，其特征在于步骤为：

(1)将苹果榨汁废料加入8倍量浓度70％的乙醇水溶液中，浸泡2小时，加热至回流状态，并回流1小时，过滤；滤渣加入6倍量的70％乙醇水溶液加热至回流状态并回流1小时，过滤；重复此过程一次，合并过滤液，减压浓缩回收乙醇，得到根皮苷浸膏；

(2)将步骤(1)得到的浸膏置于蒸馏水中，加热至80℃并不断搅拌使根皮苷完全溶解，趁热抽滤得到棕褐色澄清溶液；

(3)将步骤(2)得到的滤液静置冷却至20-40℃，将该溶液加到100-200目聚酰胺首端，用蒸馏水洗脱除去部分水溶性杂质及色素后，用10-40％乙醇水溶液洗脱，薄层检测，收集末端洗脱液，浓缩过滤；

(4)将步骤(3)中浓缩过滤后的滤液放置析晶，对析出的粗结晶用适量蒸馏水重结晶，即得根皮苷结晶体；

所得根皮苷结晶体的X-衍射图谱在衍射角为2θ时，具有下述特征峰：7.600(d＝11.623，I/I₀＝73)，12.300(d＝7.190，I/I₀＝5)，15.200(d＝5.824，I/I₀＝99)，15.880(d＝5.576I/I₀＝10)，19.600(d＝4.525，I/I₀＝20)，21.180(d＝4.191，I/I₀＝9)，22.880(d＝3.884，I/I₀＝24)，23.360(d＝3.805，I/I₀＝17)，38.900(d＝2.313，I/I₀＝8)。

2.一种通过权利要求1的制备方法制备得到的活性提取物在制备治疗肝水肿的药物中的用途。

3.权利要2的用途，其特征在于其中所述的药物的给药剂量为每天1-500mg活性提取物/kg体重。

4.权利要求3的用途，其特征在于其中所述的药物的给药剂量为每天15.5-155mg活性提取物/kg体重。

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