CN102018766A - 一种植物提取物、其提取方法和用途及含有这种提取物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种植物提取物，所述提取物由植物叶中提取，其中总亚氨基糖类成分重量比为5～40％，总氨基酸类成分，重量比20～70％；优选为总亚氨基糖类成分重量比为8～30％，总氨基酸类成分，重量比30～60％。所述的植物是下列的一种或多种：桑、鲁桑、黑桑或鸡桑；其中最优选桑。所述植物提取物用于减少黑色素生成、治疗色素沉着类疾病，或者用于血糖控制；所述色素沉着类疾病优选为雀斑、黄褐斑、妊娠纹、老年斑或黑色素瘤。

Description

一种植物提取物、其提取方法和用途及含有这种提取物的组合物
技术领域
本发明涉及植物的提取领域，具体的说，涉及一种植物提取物、其提取方法和用途及含有这种提取物的组合物。
背景技术
黑色素(melanin)是决定人体肤色的最重要因素，它在表皮基底层黑色素细胞中的黑色素体中生物合成。正常生理状态下，皮肤中的黑色素可以保护皮肤免受紫外线伤害。当外部侵害、激素失调、老化或其它因素造成黑色素合成代谢机制障碍时，易使表皮基底层的黑色素增多，部分或全身皮肤色泽加深，引起雀斑、黄褐斑、妊娠纹、老年斑、黑色素瘤等色素沉着类皮肤病，影响了人的容貌，有时甚至对患者的心理健康造成影响。再加上诸多追求皮肤白皙的爱美人士对美白化妆品的需求，使得美白祛斑剂的市场需求量一直很大。
简要地说，黑色素的生物合成主要包括下列步骤：
Figure B200910307065XD0000011
其中，酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)是黑色素生物合成过程中的关键酶，它是一种含铜离子的糖蛋白，主要催化酪氨酸转化为多巴，再转化为多巴胺的反应，它是减少皮肤黑色素沉着的重要靶标，在美白祛斑研究领域被频繁使用。
目前以酪氨酸酶为靶标的手段主要是抑制酪氨酸酶的生成和活性，从而相应地减少黑色素的产生。目前市场上以抑制酪氨酸酶活性的产品较为多见。代表性的产品主要有对苯二酚(氢醌)及其衍生物、曲酸及其衍生物、熊果苷等。对苯二酚及其衍生物可以完全抑制酪氨酸酶活性，但对黑色素细胞具有刺激性和细胞毒性，长期使用或与光会引起外源性色斑，现已禁止在护肤品中使用。曲酸具有很高稳定性，能够通过鳌合铜离子、降低酪氨酸酶活性，祛斑效果明显，但长期使用曲酸可能导致细胞毒化，引起皮肤病变。日本研究更显示，曲酸可能引发肝癌。(Tamotsu Takizawa，Toshio Imai，Jun-ichi Onose，Makoto Ueda，Toru Tamura，Kunitoshi Mitsumori，Keisuke Izumi and Masao Hirose.Enhancement of Hepatocarcinogenesis by Kojic Acid in Rat Two-Stage Models after Initiation with N-bis(2-hydroxypropyl)nitrosamine or N-diethylnitrosamine.Toxicological Sciences 200481(1)：43-49.)。熊果苷被认为副作用很低的美白祛斑剂，但具有高度的光敏感性，产品中往往要添加大量防晒剂，容易对皮肤造成负担，加快皮肤老化。这些缺陷都对他们在美白祛斑市场上的广泛应用造成一定的不利影响。
如前所述，酪氨酸酶是一种带糖链的蛋白，现代生化研究发现，在其生成、成熟过程中，其原始糖链必须经过一系列修饰后，新生酪氨酸酶才能转化为成熟酪氨酸酶，并发挥其正常的生物学功效。而α-葡萄糖苷酶I、II是糖链修饰过程中的关键酶。其中，α-葡萄糖苷酶I主要切去原始糖链最外端的α1，2连接的葡萄糖残基；α-葡萄糖苷酶II则是分两步切去剩下的两个α1，3连接的葡萄糖残基(Mehta A，Zitzmann N，Rudd PM，Block TM，Dwek RA.α-Glucosidase inhibitors as potential broad based anti-viral agents，FEBS Letters，1998，430(1)：17-22)。当α-葡萄糖苷酶I、II受到抑制时，糖蛋白上的糖链修饰受阻，无法产生成熟的酪氨酸酶，活性大大下降甚至丧失，黑色素的形成量也就相应地大幅减少了。(Hiroyuki Takahashi，Peter G.parsons，Rapid and reversible inhibition of tyrosinase activity by glucosidase inhibitors in human melanoma cells，the Journal of Investigative dermatology，1992，98(4)：481-487.)。由此可见，通过抑制α-葡萄糖苷酶I、II来减少成熟的酪氨酸酶的生成，从而减少黑色素的生成，达到减少皮肤色素沉着的目的，将是一条很有希望的新型美白祛斑途径。
桑叶(Folium Mori，Mulberry Leaf)为桑属植物桑(Morus alba)、鲁桑(Morus alba var multicaulis)、黑桑(Morus nigra)、鸡桑(Morus australis)等的树叶，在亚洲尤其是我国有着悠久的药用历史。近年来，植物化学工作者从桑叶中分离到一些亚氨基糖类(imino sugar)成分，如1-脱氧野尻霉素(DNJ)，fagomine，N-methyl-DNJ等。这些亚氨基糖成分的化学结构与普通单糖相似，多数是一些多羟基的五元、六元杂环类化合物，二者最大的区别是亚氨基糖的杂环上的杂原子是氮原子(N)，而普通单糖则是氧原子(O)。这些桑叶亚氨基糖成分多数都具有较好的α葡萄糖苷酶I、II抑制活性，尤以DNJ活性最强。深入的药理实验也证实，DNJ与黑色素细胞作用，能抑制酪氨酸酶的成熟，减少黑色素生成。(Genji Imokawa，Analysis of Carbohydrate PropertiesEssential for Melanogenesis in Tyrosinases of Cultured Malignant Melanoma Cells by Differential Carbohydrate Processing Inhibition，the Journal of Investigative dermatology，1990，95(1)：39-49；JuYoung Park，hyunjung Choi，Jae Sung hwang，Junoh Kim，Ih-Seop Chang，Enhanced depigmenting effects of N-glycosylation inhibitors delivered by pH-sensitive liposomes into HM3KO melanoma cells，Journal of Cosmetic Science，2008，59：139-150.)。而本专利发明人的酶学实验发现，使用本发明所提供的含桑叶总亚氨基糖的桑叶提取物，具有比单用DNJ更强α葡萄糖苷酶I、II抑制活性。这就能够在达到相同抑制效果的情况下，大为降低DNJ单体的使用浓度，从而降低了药物可能存在的不良反应的发生率，提高了产品的安全性。同时，由于本发明桑叶提取物的制造成本远低于DNJ单体的生产成本，大大降低了皮肤色素沉着的治疗费用。由此可见，本发明产品无论在效果，还是在价格成本上都有着比DNJ等单体化合物更多的优势。
Figure B200910307065XD0000031
1-脱氧野尻霉素(DNJ)的结构式
虽然国内外已有研究人员尝试把桑属植物提取物应用于美白祛斑市场，但本发明与之相比，有着诸多独有的优势和鲜明的特征。已有的如专利号为ZL99123894.X的中国专利，使用由桑树属植物提取物、黄芩属植物提取物和水杨酸衍生物组成的组合物治疗皮肤色素沉着。该专利使用桑树的根提取物，其活性成分主要为桑酮(kuwanone)，但没有明确的提取物质量标准；申请号为347884的美国专利使用桑枝提取物做美白剂，活性成分为氧化白藜芦醇(oxyresveratrol)和桑皮苷A(mulberroside A)。与他们相比，本发明具有下列优势和特点：一，原材料优势：本发明以桑叶为原料，与上述专利中采用的桑树、桑枝等原料相比，具有再生性强，资源可持续利用性好，成本相对较低等优势；二，作用机理不同：上述专利产品通过竞争性抑制酪氨酸酶发挥作用，而本发明所使用的活性成分主要为桑叶总亚氨基糖，通过抑制α葡萄糖苷酶I而减少成熟酪氨酸酶的生成，进而减少黑色素的生成，其作用机理与现有的所有祛斑产品不同；三，物质基础不同：上述专利使用桑属植物中的为黄酮类(如kuwanones)、二苯乙烯类成分(如oxyresveratrol，mulberrosides)，而本发明使用的有效成分为亚氨基糖类，因此制备工艺所针对的成分不同；四，本发明制备工艺独特，在保证有效成分含量的前提下，充分改善了产品的物理性质，使其更适于在化妆品领域的应用。
本专利发明人的细胞实验也证实，本发明的桑叶提取物能有效降低黑色素细胞中黑色素含量，并且作用独特，间接抑制酪氨酸酶的活性，抑制黑色素生成的效果好于现有市场上的熊果苷等美白产品。另外，本发明桑叶提取物中含有大量的氨基酸成分，其中包括人体不能合成的8种必需氨基酸。而氨基酸是组成皮肤、维持皮肤湿润度和弹性的必要物质，缺少氨基酸会减弱皮肤的新陈代谢，让皮肤提早老化(Marty J.P.，NMF and cosmetology of cutaneous hydration，Annales de Dermatologie et de Vénéréologie，2002，129(1Pt 2)：131-136.)。因此本发明产品既具有美白祛斑的作用，又具有护肤的功效，值得将其进一步开发成美容美白产品。
此外，本发明产品中的一些桑叶亚氨基糖类成分，如DNJ，对胃肠道α-葡萄糖苷酶有较好抑制作用，对糖分的吸收有一定抑制作用(Asano N.，Glycosidase inhibitors：update and perspectives on practical use.Glycobiology，2003，13(10)：93R-104R.)；桑叶亚氨基糖中的1，4-dideoxy-1，4-imino-D-arabinitol(即D-AB1)被发现对肝糖原磷酸化酶有强抑制活性，它还能抑制体内肝糖原的裂解，有抗高血糖效应；本发明桑叶提取物中的一些氨基酸如精氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸均有较强的刺激胰岛素分泌的作用；因此，综合以上几方面功效，本发明产品也可以在抑制餐后血糖上升、调控人体血糖平衡方面展开应用，将其开发成具有血糖控制功能的药物或是健康产品。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种植物提取物，所述的提取物除了含有的活性物质比现有的桑属植物提取物更丰富外，与市场上其它产品相比，具有特征性的紫外吸收、更好的溶解性、较淡的颜色、特定的PH值范围和生物活性强度，从而保证其安全性和有效性，并保证其更容易在保健品和化妆品中使用。
本发明目的之二在于提供上述所述植物提取物的提取方法。
本发明目的之三在于提供上述植物提取物的用途。
本发明目的之四在于提供含有上述植物提取物的组合物。
为了实现上述发明目的，本发明采取如下技术方案：
一种植物提取物，所述提取物由桑属植物叶中提取，其中总亚氨基糖类成分重量比为5～40％，总氨基酸类成分重量比20～70％；优选为总亚氨基糖类成分重量比为8～30％，总氨基酸类成分重量比30～60％；更优选为总亚氨基糖类成分重量比为15～25％，总氨基酸类成分重量比40～50％。
根据前面所述的提取物，所述的桑属植物是下列的一种或多种：桑(Morus alba)、鲁桑(Morus alba var multicaulis)、黑桑(Morus nigra)和鸡桑(Morus australis)，最优选桑(Morus alba)。
根据前面所述的提取物，其总亚氨基糖类成分中含有占总提取物重量比1～20％的1-脱氧野尻霉素，优选2～10％，更优选为4～6％。
根据前面所述的提取物，所述提取物紫外扫描在218，263nm波长处有最大吸收；对α-葡萄糖苷酶I的IC50值为0～90μg/ml，优选为5～40μg/ml；颜色为浅黄色或近白色；易溶于水；用水配制成1％的溶液时，溶液pH值在5.5～6.5。
前面任意一项所述桑属植物提取物的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：
(1)浸提：将桑叶烘干，粉碎为粗粉，用5～18倍原料重量的浓度为0～40％的低级醇浸提1～5次；优选用10～13倍原料重量的浓度为20～30％的低级醇浸提；更优选用11倍原料重量的浓度为25％的低级醇浸提，得到提取液；
(2)阳离子交换树脂柱层析：将提取液过滤后，通过强酸性阳离子交换树脂柱，先用1～2倍柱体积的水洗脱，优选1.5倍柱体积的水，洗脱液弃去，再用2～8倍柱体积的浓度0.2～1N的氨水洗脱，优选用5倍柱体积浓度0.7N的氨水洗脱，流速为1～3倍柱体积/小时，优选为1.5倍柱体积/小时，收集pH 9.0～11.0区域的氨水洗脱部分；
(3)大孔吸附树脂柱层析：将收集的氨水洗脱液脱氨，调至pH中性后，通过大孔吸附树脂柱，提取液与大孔树脂柱体积比为20∶1～5∶1，优选为15∶1～10∶1，更优选为13∶1，收集流出液，浓缩，干燥，粉碎，过80目筛，即得本发明所述的植物提取物。
根据前面所述的提取方法，步骤(1)所述的低级醇为碳原子数为1～4的直链烷基醇，优选为乙醇或甲醇；所述浸提为回流下浸提1～3小时，优选为1～2小时，最优选为2小时。
根据前面所述的提取方法，步骤(2)中提取液体积为阳离子交换树脂柱体积的2～20倍，优选为10～15倍，更优选为13倍；
根据前面所述的提取方法，步骤(3)中提取液流速为1～4倍柱体积/小时，优选为2倍柱体积/小时。
前面所述植物提取物的用途，前面所述植物提取物用于减少黑色素生成、治疗色素沉着类疾病，或者用于血糖控制；所述色素沉着类疾病优选为雀斑、黄褐斑、妊娠纹、老年斑或黑色素瘤。
当前面所述提取物在用于化妆品中减少黑色素生成时，推荐的使用剂量为最终产品的0.05％～2％，优选的使用剂量为0.1％～1％，更优选的剂量为0.2～0.5％。
当前面所述提取物在用于血糖控制时，根据提取物的活性成分浓度不同，推荐的使用剂量为25～600mg/次，每日3次；优选的使用剂量为100～300mg/次，每日3次；更优选的使用剂量为50～150mg/次，每日3次。
由于本发明提取物具有与其它市售美白成分完全不同的作用机理，因而本发明提取物在化妆品领域的应用，可通过单独添加到化妆品中或通过与其它美白成分结合，制备一种含有前面所述桑属植物提取物的组合物而完成。所述组合物中含有前面所述的桑属植物提取物和至少一种其他活性附加成分，所述的活性附加成分选自：维生素C及其衍生物、曲酸、熊果苷、Diacetylboldine、壬二酸、十八碳烯二酸、十一碳烯酰苯基丙氨酸(DEP-11)、甘草提取物、芦荟提取物、水田芥提取物、泡叶藻提取物、啤酒花提取物、谷胱甘肽、蜕皮激素或鞣花酸；所述维生素C衍生物优选为维他命磷脂酸镁；所述活性附加成分优选为维他命磷脂酸镁；所述植物提取物与活性附加成分的含量比值为10∶1～1∶1；优选为5∶1。
下面对本发明的技术方案详细阐述：
一种桑属植物提取物，所述提取物由桑属植物叶中提取，其中总亚氨基糖类成分重量比为5～40％，总氨基酸类成分，重量比20～70％；优选为总亚氨基糖类成分重量比为8～30％，总氨基酸类成分，重量比30～60％；更优选为总亚氨基糖类成分重量比为15～25％，总氨基酸类成分重量比40～50％。
在针对本发明桑叶提取物的药理实验中，发现该提取物能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制能力强于DNJ单体，在达到相近的抑制效果时所需的药物浓度约为DNJ单体的一半，这也在客观上提高了药物的使用安全性。在细胞试验中，本发明桑叶提取物对黑色素瘤细胞A375和B16的黑色素生成均有明显抑制作用，抑制能力强于现在市场上通用的美白产品熊果苷和维他命磷脂酸镁。在作用机理上本发明的桑叶提取物与它们有着本质差别，本发明的桑叶提取物主要是抑制成熟的有活性的酪氨酸酶的生成，熊果苷和维他命磷脂酸镁直接竞争性抑制酪氨酸酶活力。相比之下，本发明的桑叶提取物具有抑制能力更强，活性持续更长久的优势。由于作用机理不同，本发明提取物可以单独使用或与上述酪氨酸酶抑制剂联合使用达到更理想的抑制黑色素形成的效果。
其中，本发明优选所述的桑属植物是下列的一种或多种：桑(Morus alba)、鲁桑(Morus alba varmulticaulis)、黑桑(Morus nigra)和鸡桑(Morus australis)，最优选桑(Morus alba)。通过对一些常见桑属植物叶的化学成分分析后，本专利发明人发现，相对其他桑树植物叶而言，这几种桑叶都含有浓度相对较高的亚氨基糖类成分，其中尤以桑(Morus alba)的含量最高。
由于1-脱氧野尻霉素(DNJ)是桑叶总亚氨基糖中特有性成分，目前尚未在其他属植物中发现，同时也是含量最高的桑叶亚氨基糖，因此，本发明人将其作为本专利产品的一个具体的指标性化学成分。所以，本发明进一步优选所述总亚氨基糖类成分含有占总提取物重量比1～20％的1-脱氧野尻霉素(DNJ)，更优选2～10％，最优选为4～6％。通过对特征性化学成分含量的准确控制，可以有效地控制本产品质量，为稳定产品的疗效提供了一定的保证。
由于本产品为植物提取物，其成分较为复杂。本发明人注意到当植物原料的来源不同或生产工艺不同时，即使其中的标志性成分达到了含量测定的要求，但其生物活性却可能存在较大的差别，造成产品的实际治疗效果较差或引起安全性方面的问题，因此，在本发明人还对本产品从生理活性方面进行控制，保证产品能够达到预期的疗效和安全性。通过下述的特定检测方法，本发明的桑叶提取物要求达到对α-葡萄糖苷酶I的IC50值为0～90μg/ml。常见α-葡萄糖苷酶抑制剂如DNJ等的IC50值高于这一指标，这就充分保证了本发明桑叶提取物具有的很强的药理活性。进一步优选IC50值为5～40μg/ml。
IC50值检测方法如下：(1)测定不同浓度4-硝基苯酚，即pNP磷酸缓冲液在405nm处光密度OD值，绘制标准曲线；(2)不同浓度桑叶总亚氨基糖样品加入酶标板，空白组加pH值6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液；(3)加入α-葡萄糖苷酶I(EC232.604.7，来源于Bakers yeast，Sigma公司)，酶浓度用量可控制在1～2倍米氏常数km单位(U/ml)左右，37℃孵育15min；(4)加入底物4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷，即pNPG，要求底物浓度远大于酶浓度，一般选用底物的浓度为100km，在37℃，405nm处连续测定OD值，并代入标准曲线，求得对应产物量；(5)以时间为x轴，产物量为y轴，绘制反应进程曲线，求得反应初速度；(6)以抑制剂浓度为x轴，反应速度为y轴，绘制抑制剂浓度曲线，求得IC50。
同时本发明人为了使制备得到的提取物具有更完善的物理性质，更适合于使用到化妆品中去，通过对以下制备过程的优化，得到了一种具有更好的溶解性、较淡的颜色、特定的PH值的提取物，且该提取物具有与市售其它桑属植物提取物完全不同的紫外吸收光谱。
桑属植物提取物的提取方法可以参考现有技术的任何类似产品的提取方法，然而为了进一步提高所述桑属植物提取物的质量，本发明进一步提供了一种优选的提取方法，所述提取方法包括如下步骤：
(1)浸提：将桑叶烘干，粉碎为粗粉，用5～18倍原料重量的浓度为0～40％的低级醇浸提1～5次；优选用10～13倍原料重量的浓度为20～30％的低级醇浸提1～5次；更优选用11倍原料重量的浓度为25％的低级醇浸提1～5次，得到提取液。
其中优选所述的低级醇为碳原子数为1～4的直链烷基醇，更优选为乙醇或甲醇，综合考虑溶剂的毒性、成本以及可能的溶剂残留所带来的安全性方面的问题，所述的低级醇最优选乙醇；所述浸提为回流下浸提1～3小时，优选为1～2小时，最优选为2小时；
(2)阳离子交换树脂柱层析：将提取液过滤后，通过强酸性阳离子交换树脂柱，先用1～2倍柱体积的水洗脱，优选1.5倍柱体积的水，再用2～8倍柱体积的浓度0.2～1N的氨水洗脱，优选用5倍柱体积浓度0.7N的氨水洗脱，流速为1～3倍柱体积/小时，优选为1.5倍柱体积/小时，收集pH 9.0～11.0区域的氨水洗脱部分。
在过滤后，还可以采取进一步的除杂措施，提高提取物活性，并使提取物颜色变浅。所述除杂方式可以为醇沉法，或是絮凝沉淀法，或是其他适宜于除去蛋白质、鞣质、桑叶多糖的方法。析出沉淀后用离心或是过滤法去除沉淀，留取上清液。除杂方式优选醇沉离心法：将提取液浓缩至约原体积1/4时，加入1～3倍95％乙醇，均匀搅拌半小时，静置8～12小时，于离心机上12000r/min离心15分钟，留取上清作下一步处理。
所采用的强酸性阳离子交换树脂填料可以是001×7(#732)型、也可以是有类似作用的其他阳离子交换树脂，如Amberlite IR-120型，Dowex-50型，Lewatit-100型，Zerolit225型，或是Diaion SK-1型等。优选为001×7(#732)型，该型树脂在我们的工艺筛选中能最集中地吸附活性成分，并且材料成本也比较经济。
其中优选提取液体积为阳离子交换树脂柱体积的2～20倍，更优选为10～15倍，最优选为13倍。在这一参数条件下，活性成分能充分被阳离子交换树脂有效吸附，能起到提高有效成分含量，增强药效的作用。
在氨水开始洗脱阳离子交换树脂时，pH值逐步上升，但通过对洗脱液的化学分析发现，pH 9～11区域的氨水洗脱部分活性最高，因此只对这一pH段的洗脱液进行收集。
(3)大孔吸附树脂柱层析：将收集的氨水洗脱液脱氨，调至pH中性后，通过大孔吸附树脂柱，提取液与大孔树脂柱体积比为20∶1～5∶1，优选为15∶1～10∶1，更优选为13∶1，收集流出液，浓缩，干燥，粉碎，过80目筛，即得本发明所述的桑叶提取物。
选用的大孔树脂可以是AB-8型，HP20型，S-8型，YWD03F4型。经过工艺筛选比较，以S-8型大孔吸附树脂的脱色效果最佳。因此，以S-8型为优选大孔树脂材料。
其中优选提取液流速为1～4倍柱体积/小时，更优选为2倍柱体积/小时。在上述操作参数条件下，有色杂质能有效地被大孔树脂吸附，从而起到良好的脱色效果。
通过上述工艺条件得到的桑叶提取物紫外扫描在218，263nm波长处有最大吸收，可与市场上现有的桑叶提取物的紫外吸收特征区分开。所得桑叶提取物颜色为浅黄色或近白色，而目前在美容领域的桑叶提取物基本上颜色都是棕黄或黄色，色泽较深，由它制成的美白产品也具有较深的颜色，外观不够理想。同时，得到的桑叶提取物水溶性好，这有利于药物在作用部位的分散，从而促进人体对它的吸收；而目前用于美白的桑叶提取物由于含有黄酮类(如kuwanones)、二苯乙烯类成分(如oxyresveratrol，mulberrosides)，水溶性相对较差，药物分散性一般，需要借助有机溶剂如低级醇来助溶，增加了皮肤负担。所得桑叶提取物用水配制成1％的溶液时，溶液pH值在5.5～6.5，呈弱酸性，这一pH条件与人体皮肤最外面的皮脂膜的pH值(4.5～6.5之间)接近，在制成皮肤用品时能减少有效成分对皮肤的刺激作用。
当前面所述提取物在用于化妆品中减少黑色素生成时，推荐的使用剂量为最终产品的0.05％～2％，优选的使用剂量为0.1％～1％，更优选的剂量为0.2～0.5％.
当前面所述提取物在用于血糖控制时，根据提取物的活性成分浓度不同，推荐的使用剂量为25～600mg/次，每日3次；优选的使用剂量为100～300mg/次，每日3次；更优选的使用剂量为50～150mg/次，每日3次。
在实际应用中，为更全面抑制色素沉着，按照现在本学科领域的“协同效应”美白祛斑理论，可从造成色素沉着各个环节对黑色素生成进行控制，可起到更好的抑制黑色素生成的效果。因此，本发明还提供一种含有前面所述桑属植物提取物的组合物，所述组合物中含有前面所述的桑属植物提取物和至少一种下述的其他附加成分，所述的附加成分为市场上已出现的美白产品，可选自：维生素C及其衍生物如维他命磷脂酸镁、曲酸、熊果苷、Diacetylboldine(二乙酰基波尔定碱)、壬二酸、十八碳烯二酸、十一碳烯酰苯基丙氨酸(DEP-11)、甘草提取物、芦荟提取物、水田芥(Nasturtium officinale)提取物、泡叶藻(Ascophyllum Nodosum)提取物、啤酒花(Humulus lupulus)提取物、谷胱甘肽、蜕皮激素或鞣花酸；优选与维他命磷脂酸镁组合使用。桑叶提取物与活性附加成分的含量比值为10∶1～1∶1；优选为5∶1。所述的组合物可以用于制备化妆品或者皮肤病药品。
根据本发明制备得到的桑属植物叶的提取物或含有它的其组合物，在用于制备化妆品或皮肤病药品时，可以加入药剂学上可以接受的各种常规的基质(水溶性基质如甘油、聚乙二醇、纤维素衍生物等；脂溶性基质如油脂、类脂、烃类等)，以及各种其他辅料如防腐剂(如尼泊金类、三氯叔丁醇、山梨酸类)、抗氧剂(亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、BHT等)、增稠剂(硬脂酸、蜂蜡、石蜡、月桂醇、羧甲基纤维素等)、乳化剂(三乙醇胺、单硬脂酸甘油脂、吐温类等)、防晒剂(甲氧基肉桂酸辛酯、二苯酮-3等)、保湿剂(如甘油、山梨醇、丙二醇等)、除臭剂、香料、颜料等。这些辅助剂的量为所涉及领域的常规用量。根据本发明制备得到的桑属植物叶的提取物在制备用于血糖控制的口服药物时，也同样可以加入各种常规口服药剂的辅料，如崩解剂(干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基纤维素、交联PVP等)、润滑剂(硬脂酸镁、滑石粉、苯甲酸钠、聚乙二醇4000等)、粘合剂(羧甲基纤维素钠)等。
通常地，按本发明制备得到的桑叶提取物或含有它的组合物，在用于制备化妆品或皮肤病药品时可以为以下形式之一：含水、含水-醇或含油溶液，含水或含油凝胶、微乳液、稀或稠乳液、疏松或致密粉末、在小球协助下的油在水相中的分散体，这些小球可以是聚合物毫微粒子如毫微球和毫微胶囊等，更好是离子型和/或非离子型的脂质囊泡。
根据本发明制备得到的桑叶提取物或含有它的组合物在用于制备化妆品或皮肤病药品时，可以制成具有相对的流动性并且其外观可以是霜剂、油膏、洗液、奶液、乳液、浆剂、糊剂、泡沫剂、气溶胶、无水固体制剂(如棒状物)。而将按本发明制备得到的桑属植物叶的提取物在制备用于血糖控制的口服药物时，可以制成片剂、胶囊、散剂等常用口服剂型。
在针对本发明桑叶提取物的药理实验中，发现该提取物能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制能力强于DNJ单体，在达到相近的抑制效果时所需的药物浓度约为DNJ单体的一半，这也在客观上提高了药物的使用安全性。在细胞试验中，本发明桑叶提取物对黑色素瘤细胞A375和B16的黑色素生成均有明显抑制作用，抑制能力强于现在市场上通用的美白产品熊果苷。在作用机理上本发明的桑叶提取物与熊果苷有着本质差别，本发明的桑叶提取物主要是抑制成熟的有活性的酪氨酸酶的生成，熊果苷直接竞争性抑制酪氨酸酶活力。相比之下，本发明的桑叶提取物具有抑制能力更强，活性持续更长久的优势。而在针对糖尿病小鼠模型的动物实验中，本发明桑叶提取物也有明显的降血糖作用。
因此，本发明也涉及前面所述桑属植物叶的提取物的用途：用于减少黑色素生成、治疗色素沉着类疾病，或者用于血糖控制；所述色素沉着类疾病优选为雀斑、黄褐斑、妊娠纹、老年斑或黑色素瘤。
附图说明
图1实施例1所得产品的HPLC指纹图谱
仪器：Waters(美国)高效液相色谱仪w600-2420-717
色谱柱：旧shodex Asahipak NH2P-50E(250×4.65um)反方向用。
试剂：乙腈-水(含6.5mmol乙酸铵)
柱温：40℃
流速：1.0ml/min
W2420蒸发光检测器
增益：100；飘移管温度50℃；喷雾器加热级别：60(％)。
流动相：A：乙腈B：水(含6.5mmol乙酸铵)84∶16
上图为DNJ标准品HPLC图谱，下图为实施例1所得产品的HPLC指纹图谱。
图2实施例2所得产品的紫外吸收(UV)扫描图谱
仪器：UNICO UV-2100 Spectrophotometer
扫描波长区域：200～600nm
样品浓度：1mg/ml
图3市售产品的紫外吸收(UV)扫描图谱
仪器：UNICO UV-2100 Spectrophotometer
扫描波长区域：200～600nm
样品浓度：1mg/ml
图4表示减少皮肤色素沉着机理
具体实施方式
以下用实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，将有助于对本发明的技术方案的优点，效果有更进一步的了解，实施例不限定本发明的保护范围，本发明的保护范围由权利要求来决定。
实施例1：
取干燥桑叶100kg，粉碎。用相当于12倍生药量的30％乙醇回流提取3次，每次1h。提取液适当浓缩，过001×7型强酸阳离子树脂柱，柱体积为提取液的1/14。1.5倍柱体积水洗后，用5倍柱体积0.7N氨水洗脱，洗脱速度为1.5倍柱体积/小时，收集pH9～11区域的氨水洗脱液。适当浓缩脱氨，调pH为中性后，氨水洗脱液通过体积为洗脱液1/10的S-8大孔树脂柱，流速为2倍柱体积/小时，收集流出液，减压干燥，粉碎后通过80目筛，得浅黄色粉末1.4kg，其中含有DNJ 5.8％；总亚氨基糖含量为21％，总氨基酸含量为48％。
总亚氨基糖含量测定方法：(a)精密称取DNJ对照品适量，加水甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀。精密量取上述溶液1ml，置25ml量瓶中，加入0.4mol/L的硼酸氯化钾缓冲液(pH 8.5)1ml，再加入5mmol/l的FMOC-Cl无水乙腈溶液2ml，室温下超声处理20分钟，立即加0.5mol/l的甘氨酸2ml，加0.1％的醋酸溶液至刻度，摇匀，制备得对照品溶液。(b)取所得桑叶提取物0.3g，加适量水溶解后，通过已预处理好的聚酰胺树脂柱，用pH 3的盐酸溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收至约10ml时，通过已预处理好的阴离子交换树脂柱，用水洗脱，收集洗脱液，减压回收至约30ml时，转移至50ml量瓶中，并加水稀释刻度。精密量取上述溶液1ml，置25ml量瓶中，同对照品处理方式，得供试品溶液。(c)高效液相色谱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％醋酸溶液(30∶70)为流动相，30分钟后将流动相比例调整为乙腈-0.1％醋酸溶液(70∶30)冲柱10分钟，然后用原流动相平衡系统再进下一个样，色谱图记录时间为30分钟。检测波长为265nm。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
总氨基酸含量直接用氨基酸分析仪测定。
实施例2
取干燥桑叶100kg，粉碎。用相当于18倍生药量的水回流提取3次，每次1h。提取液过Dowex-50型强酸阳离子树脂柱，柱体积为提取液的1/20。用2倍柱体积水洗后，用8倍柱体积0.5N氨水洗脱，洗脱速度为3倍柱体积/小时，收集pH 9～11区域的氨水洗脱液。适当浓缩脱氨，调pH为中性后，氨水洗脱液通过体积为洗脱液1/20的HP20大孔树脂柱，流速为4倍柱体积/小时，收集流出液，减压干燥，粉碎后通过80目筛，得浅黄色粉末1.4kg，其中含有DNJ 4.3％；总亚氨基糖含量为19％，总氨基酸含量为40％。
实施例3：
取干燥桑叶20kg，粉碎。用相当于5倍生药量的40％乙醇回流提取3次，过滤，合并浓缩液，浓缩至10L左右，加入等体积乙醇，匀速搅拌半小时，静置过夜，12000r/min离心15分钟除去沉淀，适当浓缩回收乙醇，上清液通过001×7型性阳离子树脂柱，柱体积为上清液的1/3。分别用1倍柱体积的水和2倍柱体积2倍柱体积的1N氨水洗脱。流速为1倍柱体积/小时，收集pH9～11区域的氨水洗脱液。适当浓缩脱氨，调pH为中性后，氨水洗脱液通过体积为洗脱液1/13的S-8大孔树脂柱，流速为1倍柱体积/小时，收集流出液，减压干燥，粉碎后通过80目筛，得近白色粉末0.11kg，其中含有DNJ 9.1％；总亚氨基糖含量为29％，总氨基酸含量为32％。
实施例4
取干燥桑叶50kg，粉碎。用相当于12倍生药量的40％乙醇回流提取3次，过滤，合并浓缩液，加入助沉淀剂硫酸铝钾至pH为3，搅拌半小时，静置2小时离心除去沉淀，上清液调pH中性，通过001×7型性阳离子树脂，柱体积为上清夜的1/13，分别用2倍柱体积的水和8倍0.2N氨水洗脱，流速为1倍柱体积/小时，收集pH9～11区域的氨水洗脱液。适当浓缩脱氨，调pH为中性后，氨水洗脱液通过体积为洗脱液1/20的AB-8大孔树脂柱，流速为2倍柱体积/小时，收集流出液，减压干燥，粉碎后通过80目筛，得近白色粉末0.12kg，其中含有DNJ 18.6％；总亚氨基糖含量为39％，总氨基酸含量为21％。
实施例5：
取干燥桑叶50kg，粉碎。用相当于11倍生药量的25％乙醇回流提取4次，过滤，合并提取液，通过Amberlite IR-120(H+)型性阳离子树脂，柱体积为提取夜的1/15，分别用1.5倍体积的水和5倍体积的0.7N氨水洗脱。收集pH9～11区域的氨水洗脱液，流速为1.5倍柱体积/小时。适当浓缩脱氨，调pH为中性后，氨水洗脱液通过体积为洗脱液1/5的S-8大孔树脂柱，流速为1倍柱体积/小时，收集流出液，减压干燥，粉碎后通过80目筛，得浅黄色粉末0.46kg，其中含有DNJ 5.6％；总亚氨基糖含量为24％，总氨基酸含量为48％。
实施例6：
取干燥鲁桑叶5kg，粉碎。用11倍生药量的25％乙醇回流提取3次，过滤，滤液通过体积为滤液1/13的001×7阳离子交换树脂，分别用2倍柱体积的水和5倍柱体积的0.5N氨水洗脱。流速为1.5倍柱体积/小时，收集pH9～11区域的氨水洗脱液。适当浓缩脱氨，调pH为中性后，氨水洗脱液通过体积为洗脱液1/10的HP20大孔树脂柱，流速为4倍柱体积/小时，收集流出液，减压干燥，粉碎后通过80目筛，得浅黄色粉末48g；其中含有DNJ 2.1％；总亚氨基糖含量为8.3％，总氨基酸含量为65％。
实施例7：
取干燥黑桑叶5kg，粉碎。用8倍生药量的80％乙醇回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩至6L左右，加入2倍体积乙醇，匀速搅拌半小时，静置过夜，12000r/min离心15分钟除去沉淀，适当浓缩回收乙醇，加入适量絮凝剂硫酸铝，静置沉淀后离心，上清液通过体积为上清液1/10的001×7阳离子交换树脂，1倍柱体积的水洗后再用4倍柱体积德0.5N的氨水洗脱，流速为3倍柱体积/小时，收集pH9～11区域的氨水洗脱液。适当浓缩脱氨，调pH为中性后，氨水洗脱液通过体积为洗脱液1/15的HP20大孔树脂柱，流速为4倍柱体积/小时，收集流出液，减压干燥，粉碎后通过80目筛，得近白色粉末40g；其中含有DNJ 3.9％；总亚氨基糖含量为15％，总氨基酸含量为58％。
实施例8：
取干燥鸡桑5kg，粉碎。用8倍生药量的80％乙醇回流提取3次，过滤，提取液通过体积为提取液1/10的Amberlite IR-120(H+)型性阳离子树脂，分别用1.5倍柱体积的水和5倍柱体积0.7N氨水洗脱。流速为1.5倍柱体积/小时，收集pH9～11区域的氨水洗脱液。适当浓缩脱氨，调pH为中性后，氨水洗脱液通过体积为洗脱液1/13的AB-8大孔树脂柱，流速为2倍柱体积/小时，收集流出液，减压干燥，粉碎后通过80目筛，得浅黄色粉末42kg，其中含有DNJ 1.4％；总亚氨基糖含量为5.2％，总氨基酸含量为68％。
实施例9：
取干燥桑叶50kg，粉碎。用相当于10倍生药量的30％乙醇回流提取1次，过滤，合并提取液，通过Amberlite IR-120(H+)型性阳离子树脂，柱体积为提取夜的1/13，分别用1.5倍体积的水和7倍体积的0.7N氨水洗脱。收集pH9～11区域的氨水洗脱液，流速为2倍柱体积/小时。适当浓缩脱氨，调pH为中性后，氨水洗脱液通过体积为洗脱液1/15的AB-8大孔树脂柱，流速为1倍柱体积/小时，收集流出液，减压干燥，粉碎后通过80目筛，得浅黄色粉末0.5kg，其中含有DNJ 4.2％；总亚氨基糖含量为22％，总氨基酸含量为46％。
实施例10
取硬脂酸8份，硬脂酸单甘油酯5份，液体石蜡3份，鲸蜡8份，蜂蜡1份，硅油5份，混合加热至75℃。三乙醇胺0.7份，甘油5份，尼泊金甲酯0.05份，加热至75℃，两基质混合，加入实施例1中所得桑叶提取物3重量份，混匀后加水至100ml，冷却滴入香精适量，即得本产品的美白霜制剂。
实施例11
取甘油7重量份，丙二醇4份，30％NaOH 0.2份，山梨酸钾0.1份，加蒸馏水至100ml形成水相。另取硬脂酸10份，硬脂酸丁醇酯8份，硬脂酸单甘油酯1份，十八醇3份，混合加热熔化。水相加热至95℃，在等温下将油相缓缓加入水相，不断搅拌，在温度约45℃加入实施例4中所得桑叶提取物2份，维他命磷脂酸镁0.4份，滴入香精适量，搅至冷却为止，使两相均匀混合，得本产品的膏剂制剂。
实施例12
取甘油7重量份，丙二醇4份，30％NaOH 0.2份，山梨酸钾0.1份，加蒸馏水至100ml形成水相。另取硬脂酸10份，硬脂酸丁醇酯8份，硬脂酸单甘油酯1份，十八醇3份，混合加热熔化。水相加热至95℃，在等温下将油相缓缓加入水相，不断搅拌，在温度约60℃加入实施例1中所得桑叶提取物2份，十一碳烯酰苯基丙氨酸(DEP-11)0.2份，滴入香精适量，搅至冷却为止，使两相均匀混合，得本产品的膏剂制剂。
实施例13
取实施例5中所得桑叶提取物0.4重量份，加入尼泊金乙酯0.1份、亚硫酸氢钠0.5份、乙二胺四醋酸二钠0.1份、甘油9份，加蒸馏水至100ml，得本产品的洗剂制剂。
实施例14
取实施例1中所得的桑叶提取物5kg、淀粉1.8kg、微晶纤维素1.5kg、交联PVP 0.45kg、CSM-Na 0.55kg、硬酯酸镁、微粉硅胶适量，混匀，压片得20000片，每片约0.5g。
实施例15
取实施例3中所得的桑叶提取物1.0kg，淀粉适量，装入10000个2号胶囊中，每个胶囊含有100mg桑叶提取物。
实施例16
取实施例3中所得的桑叶提取物2.0kg，加入维生素C 0.5kg，柠檬酸1.0kg，碳酸氢钠0.8kg，甘露醇0.08kg，适量香精、PVP、PEG 6000、矫味剂、粘合剂，制成泡腾颗粒。
通过下面的试验说明本发明中药提取物的活性。
试验例1：本发明桑叶提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性测试
1.目的：了解本发明桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。
2.试剂和仪器：
(1)实施例1中所得桑叶提取物；
(2)1-脱氧野尻霉素(DNJ)标准品；
(3)α-葡萄糖苷酶(type I：from Bakers yeast，EC232.604.7)，用pH值6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液配制0.42U/ml；
(4)4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，用0.1mol/L磷酸缓冲液配制成5mmol/L(pNPG)；
(5)4-硝基苯酚(pNP)，用pH值6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液配制成200μmol/L pNP；
(6)Multiskan Ascent酶标仪(美国Thermo Electron公司)。
3.实验方法
3.1.绘制标准曲线
将200μmol/L PNP用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释成100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L。从200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0μmol/L浓度中各取200μl在405nm处测定OD值(光密度)。绘制标准曲线。
3.2.样品测定
将各浓度的药液按每孔80μl加入酶标板，空白加80μl磷酸缓冲液。
每个反应孔加30μl的0.42U/ml酶，在桌面上振荡30s，在37℃孵育15min，底物也放入培养箱15min，同时打开酶标仪，温度设置为37℃，测定方式设置为kinetic，时间间隔10s，测定次数13次(即2分钟)。
每孔加90μl底物(5mmol/L的PNPG)后在桌面上振荡30s，放入酶标仪，按START，在酶标仪37℃，405nm处连续测定OD值。
以PNP浓度为X轴，OD值为Y轴，绘制标准曲线。将空白和各个浓度的药液不同时间内测得OD值代入标准曲线，可得对应产物量。
对空白和各个浓度的药液，分别以时间为X轴，产物量为Y轴，建立反应进程曲线，直线部分的斜率就是反应速度。
以药液浓度为X轴，反应速度为Y轴，建立样品浓度曲线，由此可得IC50。抑制剂活性(U/μg)＝(0.5×每孔酶活性)/(IC50×每孔样品体积)＝(0.5×0.42×0.03)/(IC50×0.08)＝0.07875/IC50
4.结果和讨论
实验结果显示，实施例1所得的桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的IC50为34μg/ml，DNJ的IC50为70μg/ml。说明实施例1所得的桑叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性远远强于DNJ。同时，由于实施例1所得的桑叶提取物中DNJ的含量为3.5％，大大降低了由于单个化学品剂量过大可能引起的不良反应。
实验例2本发明桑叶提取物、熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用
1.目的：了解各实验样品对黑素瘤B16细胞内酪氨酸酶活力的影响和作用机理。
2.试剂和仪器：
(1)实施例2中所得桑叶提取物；
(2)DNJ标准品；
(3)熊果苷标准品；
(4)多巴溶液(1mg/ml，用pH6.8磷酸缓冲液配制，现用现配)
(5)WIP细胞裂解液；
(6)细胞培养板(24孔，96孔)；
(7)光学显微镜；
(8)离心机；
(9)酶标仪。
3.试验方法
试验(一)观察样品和细胞作用几天后对酪氨酸酶活力的影响
3.1待B16细胞生长至融合状态，胰蛋白酶消化收集细胞，调整细胞悬液浓度，分于24孔板，平行做三孔，每孔1ml，5×104/mL，12小时后，待细胞贴壁后加入含药物的培养液，分别继续培养4天，中间换药一次。药物浓度分别为40、80、120、160、200μg/ml。
3.2收集细胞到离心管，1000rpm，10min离心，注射器吸掉上清，用PBS洗涤2次，离心，吸掉上清。每管加入裂解液250μl，4℃放置30分钟，每5分钟涡旋一次，12000rpm，5min离心，取上清40μl加入到96孔板，平行做3孔。
3.3将120μl磷酸缓冲液加入到96孔板，37℃预温20分钟后，加入溶液40μl，37℃反应90分钟，每十分钟测一次OD值(495nm)，计算酶反应初速度，得出加入抑制剂后酶的相对活力。
试验(二)观察样品与酪氨酸酶直接作用对其活力的影响
同时另取正常细胞，进行正常培养，不加药物。按步骤3.2裂解，释放出酶后，取60μl加到96孔板，加入60μl不同浓度样品，37℃放置1h，加入80μl多巴。再按按步骤3.3处理，计算实验结果。
4.结果和讨论
由实验结果知，DNJ和本发明桑叶提取物样品与B16细胞细胞一起培养4天后，其酪氨酸酶活力下降，在200μg/ml的样品浓度时，酶活力约为对照组的60％多，而熊果苷组的酪氨酸酶活力几乎没有变化；而在对酪氨酸酶的直接抑制试验中，熊果苷200μg/ml时酪氨酸酶活力约为对照组的80％，而DNJ和桑叶提取物组的酪氨酸酶活力与对照组相比变化不大。这充分说明了这几类成分抗色素沉着的作用机理：DNJ和桑叶提取物为间接作用于酪氨酸酶，而熊果苷则是直接抑制酪氨酸酶。并且桑叶提取物的抑制效果要强于熊果苷。
实验例3本发明桑叶提取物对黑色素细胞中黑色素含量的影响
1.目的：了解样品对黑素瘤B16细胞内黑色素含量的影响，检验样品活性。
2.试剂和仪器：
(1)实施例1中所得桑叶提取物；
(2)DNJ标准品；
(3)熊果苷标准品；
(4)维他命磷脂酸镁；
(5)WIP细胞裂解液；
(6)光学显微镜；
(7)细胞培养板(24孔，96孔)；
(8)离心机；
(9)酶标仪。
3.试验方法
3.1收集处于生长对数期的黑素瘤B16细胞，调整细胞悬液至适当浓度，分于24孔板，培养12～14小时，使细胞贴壁。
3.2加入用培养基稀释不同浓度的样品1ml/孔(不同浓度样品液设置4个重复值)，继续培养2天，再次换样品稀释液，继续培养2天。
3.3第4天时，收集细胞，并用PBS反复洗涤2次，加入250μl WIP细胞裂解液，冰浴裂解细胞，每5分钟涡旋一次，共4～5次。
3.412000r/min，4℃，离心10min，去除上清，用400μl 1N NaOH溶解沉淀，80℃水浴1h。
3.5酶标仪405nm处测定OD值，计算相对含量。
4.结果和讨论
在200ppm浓度时，实施例1中所得桑叶提取物能使B16细胞中黑色素黑色素含量下降近50％，DNJ标准品的效果与桑叶提取物接近，而熊果苷能使黑色素含量下降约30％，维他命磷脂酸镁使黑色素含量下降约40％。以上结果说明，实施例1中所得桑叶提取物能有效地抑制黑色素的生成，效果强于现在市面上通用的美白成分熊果苷、维他命磷脂酸镁。
实验例4本发明桑叶提取物对黑色素细胞生长活力的影响
1.目的：观察样品对B16黑色素细胞的细胞毒性，对样品的安全性作出初步评价。
2.试剂和仪器：
(1)实施例1中所得桑叶提取物；
(2)DNJ标准品；
(3)MTT(噻唑蓝)；
(4)24孔细胞培养板；
(5)Multiskan Ascent酶标仪。
3.试验方法
1.收集对数期B16黑色素细胞，调整细胞悬液浓度104/ml，分于96孔板，每孔100μl，培养6～24小时，使贴壁。
2.不同时间加入实施例1中所得桑叶提取物样品、DNJ溶液各20μl，继续培养，样品浓度分别为药物浓度分别为40、80、120、160、200μg/ml，培养时间分别为0，24，48，72小时。(48小时后换药一次)。
3.将96孔板1500rpm离心，用1ml注射器小心吸去上清，加入含50μl2mg/ml的MTT(PBS配制，过滤灭菌)到培养基，37℃培养4小时。
4.将96孔板1500rpm离心，用1ml注射器小心吸去培养液，用200μl DMSO溶解蓝紫色结晶，轻轻摇动10分钟。
5.酶标仪540nm处测定OD值
4.结果和讨论
在72小时的观察期内，本发明的桑叶提取物样品和DNJ在0～200ppm范围内对B16细胞生长没有抑制作用，说明了本产品具有较高的安全性。
实验例5本发明桑叶提取物对db/db糖尿病小鼠血糖的影响
1.目的：观察样品能否对db/db糖尿病小鼠的高血糖状态有改善作用。
2.试剂和仪器：
(1)实施例1中所得桑叶提取物；
(2)生理盐水；
(3)DNJ标准品；
(4)C57BL/Ksj db/db小鼠；
(5)强生One Touch Ultra血糖仪，code 9血糖试纸。
3.试验方法
实验选用4周龄的db/db小鼠，体重在20～25gZ间，雌雄各半，随机分为三组，每组5只。阴性对照组以生理盐水灌胃，两组治疗组分别以实施例1中所得桑叶提取物20mg/(kg·d)和DNJ20mg/(kg·d)灌胃。实验期间，小鼠在层流柜中饲养，自由进食、进水，保持垫料干燥，12h交替照明。定期监测随机血糖，观察8周。对结果进行统计学处理。
4.结果和讨论
在实验期间，灌胃实施例1中所得桑叶提取物、DNJ能使db/db小鼠的血糖水平低于对照组的血糖水平)，统计学上有显著性差异(P＜0.05)，同时服用桑叶提取物的组效果强于DNJ组。这一结果说明实施例1中所得桑叶提取物能有效地降低血糖，且具有比DNJ要好的效果，可以开发为血糖控制方面的健康产品或是药物。
试验例6本发明还列举了如下对比试验，以比较本发明所提供的植物提取物效果优于现有技术方法制备：
  对α-葡萄糖苷酶I的IC50(μg/ml)   亚氨基糖含量   颜色   水溶性
 1   34   21％   浅黄   易溶
 2   42   19％   浅黄   易溶
 3   21   29％   近白色   易溶
 4   240   2％   黄褐   一般
 5   180   5％   黄   可溶
 6   204   3％   棕绿   一般
 7   110   12％   棕绿   可溶
 8   150   6％   棕黄   一般
其中1～3为实施例1～3所提供的产品；
4为专利03139028.5方案所制备；
5为按照如下方法所制备：将桑叶粉碎过筛，80％左右的乙醇溶液按照6倍、4倍、4倍的顺序回流提取3次，每次1～2小时，合并提取液静置24小时，过滤，滤液浓缩，浓缩液用水提取5次，每次用量为桑叶重量的10倍，提取温度70～80℃，调节pH3～4，加入氯化钠使其浓度为3～5％，使用D101大孔树脂柱进行柱层析，柱高60cm左右，柱径3cm左右，先水洗脱至洗脱液澄清，再用30％～50％的乙醇洗脱，用量为5倍柱体积，流速20ml/min，收集洗脱液，浓缩，干燥即得。
6为按照如下方法所制备：将桑叶用50℃的浓度为50％～60％的乙醇溶液提取2次，每次为桑叶重量的10～12倍，提取液浓缩，浓缩液用D72大孔强酸型树脂柱吸附，先用乙醇洗脱，再用2％氨的乙醇水溶液(乙醇70％)洗脱，分别离心并浓缩吸附后的穿流液和乙醇、氨的乙醇水溶液的洗脱液，干燥后混合即得。
7为按照如下方法所制备：将桑叶粉碎，用10～15倍的80℃水热提取2次，提取液合并后调节pH为2～3，冷却至0℃至沉淀完全，过滤，滤液浓缩后过阳离子树脂柱，水洗脱，再将氨水加至50％乙醇水溶液中使氨水含量达50％，用此溶液洗脱至无色，洗脱液浓缩后干燥即得。
8为按照如下方法所制备：将桑叶粉碎，用30％乙醇回流提取3次，每次为桑叶重量的5倍，提取液合并后浓缩，加入乙醇静置沉淀，上清液浓缩后加水，过D101大孔树脂柱，先用3倍水洗脱，穿流液和水洗脱液合并，再用60％乙醇水溶液5倍洗脱，穿流液和水洗脱液的合并液调节pH为4后，过阳离子交换树脂，水洗脱至无色，再用0.5N氨水8倍洗脱，将乙醇水溶液洗脱液和氨水洗脱液分别浓缩干燥后合并即得。
“易溶”为1g样品能在不到1ml水中溶解；“可溶”为1g样品能在10～30ml水中溶解；“一般”为1g样品能在30～100ml水中溶解。以上结果说明本发明产品在活性、主要活性成分含量、色泽、水溶性等方面强于现有专利产品。
本发明其它实施例制备的产品也能够满足试验例1～4的结果，本发明不再列举。

Claims (10)

1.一种植物提取物，其特征在于，所述提取物由植物叶中提取，其中总亚氨基糖类成分重量比为5～40％，总氨基酸类成分重量比20～70％；优选为总亚氨基糖类成分重量比为8～30％，总氨基酸类成分重量比30～60％；更优选为总亚氨基糖类成分重量比为15～25％，总氨基酸类成分重量比40～50％。
2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述的植物是下列的一种或多种：桑、鲁桑、黑桑或鸡桑；其中最优选桑。
3.根据权利要求1～2所述的提取物，其特征在于，所述总亚氨基糖类成分含有占总提取物重量比为1～20％的1-脱氧野尻霉素，优选2～10％，更优选为4-6％。
4.根据权利要求1～3所述的提取物，其特征在于，所述提取物对α葡萄糖苷酶I的IC50值为0～90μg/ml，优选为5～40μg/ml；紫外扫描时，在218，263nm波长处有最大吸收；颜色为浅黄色或近白色；易溶于水；用水配制成1％的溶液时，溶液pH值在5.5～6.5。
5.权利要求1～4任意一项所述植物提取物的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括如下步骤：
(1)浸提：将桑叶烘干，粉碎为粗粉，用518倍原料重量的浓度为0～40％的低级醇浸提1～5次；优选用10～13倍原料重量的浓度为20～30％的低级醇浸提；更优选用11倍原料重量的浓度为25％的低级醇浸提，得到提取液；
(2)阳离子交换树脂柱层析：将提取液过滤后，通过强酸性阳离子交换树脂柱，先用1～2倍柱体积的水洗脱，优选1.5倍柱体积的水，洗脱液弃去，再用2～8倍柱体积的浓度0.2～1N的氨水洗脱，优选用5倍柱体积浓度0.7N的氨水洗脱，流速为1～3倍柱体积/小时，优选为1.5倍柱体积/小时，收集pH 9.0～11.0区域的氨水洗脱部分；
(3)大孔吸附树脂柱层析：将收集的氨水洗脱液脱氨，调至pH中性后，通过大孔吸附树脂柱，提取液与大孔树脂柱体积比为20∶1～5∶1，优选为15∶1～10∶1，更优选为13∶1，收集流出液，浓缩，干燥，粉碎，过80目筛，即得本发明所述的植物提取物。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述的低级醇为碳原子数为1～4的直链烷基醇，优选为乙醇或甲醇；所述浸提为回流下浸提1～3小时，优选为1～2小时，最优选为2小时。
7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中提取液体积为阳离子交换树脂柱体积的2～20倍，优选为10～15倍，更优选为13倍。
8.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中提取液流速为1～4倍柱体积/小时，优选为2倍柱体积/小时。
9.权利要求1所述植物提取物的用途，其特征在于，权利要求1所述植物提取物用于减少黑色素生成、治疗色素沉着类疾病，或者用于血糖控制；所述色素沉着类疾病优选为雀斑、黄褐斑、妊娠纹、老年斑或黑色素瘤。
10.一种含有权利要求1所述植物提取物的组合物，其特征在于，在用于减少黑色素生成、治疗色素沉着类疾病时，所述植物提取物还可以和至少一种活性附加成分组合使用，所述的活性附加成分选自：维生素C及其衍生物、曲酸、熊果苷、Diacetylboldine、壬二酸、十八碳烯二酸、十一碳烯酰苯基丙氨酸、甘草提取物、芦荟提取物、水田芥提取物、泡叶藻提取物、啤酒花提取物、谷胱甘肽、蜕皮激素或鞣花酸；所述维生素C衍生物优选为维他命磷脂酸镁；所述活性附加成分优选为维他命磷脂酸镁；所述植物提取物与活性附加成分的含量比值为10∶1～1∶1；优选为5∶1。
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