JP5806859B2 - スクリーニング方法 - Google Patents
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Description
治癒作用等のADM及びADM関連ペプチドの作用は、何れもADM結合受容体を活性化する作用であり、ADM結合受容体の不活性化作用による薬理作用は、ほとんど知られていない。さらに、表皮ケラチノサイトより産生されるα−メラノサイト刺激ホルモン、エンドセリン−1、一酸化窒素、塩基性線維芽細胞増殖因子、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子等のサイトカインが、メラノサイトに存在する各々のシグナル伝達系を介しメラニン産生量を増加させることは知られているが、ケラチノサイトにより産生されたADMが、メラノサイトのADM結合受容体に係るシグナル伝達系を介しメラニン産生量を調節することは、発明者の知る限り報告されていない。
<1> アドレノメジュリン(ADM:Adrenomedullin)結合受容体を介するシグナル伝達系(ADMシグナル伝達系)への不活性化作用を指標とする、メラニン産生抑制剤のスク
リーニング方法。
<2> 被験物質を細胞に添加することにより、前記被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する、<1>に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、前記被験物質の添加前及び/又は添加後にADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した場合、及び前記被験物質を添加せずにADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した場合のメラニン産生量、チロシナーゼの酵素活性、チロシナーゼ遺伝子発現量又はチロシナーゼ酵素蛋白質発現量、又はc-AMP産生量を比較して、前記ADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
<3> 被験物質を細胞に添加することにより、前記被験物質のADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価する、<1>に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、前記被験物質を添加した場合、及び前記被験物質を添加しない場合のADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体親和性を比較して、前記ADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価する、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
<4> 前記被験物質の添加前及び/又は添加後にADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する、<3>に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
<5> 前記ADMシグナル伝達系の活性化因子の付与が、ADM添加である<2>又は<4>に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
<6> 前記ADM結合受容体が、カルシトニン受容体様受容体(CRLR:Calcitonin receptor−like receptor)と、受容体活性化調節蛋白2又は3(RAMP2又は3:Receptor activity−modifying protein2又は3)より形成される受容体である、<1>〜<5>の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
<7> 前記ADM結合受容体遺伝子発現量が、ADM結合受容体mRNA発現量である、<3>〜<6>の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
<8> 前記ADM結合受容体mRNA発現量が、CRLRmRNA発現量、RAMP2mRNA発現量、及びRAMP3mRNA発現量のうち少なくとも1以上である、<7>に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
<9> メラノサイト単独培養、又はケラチノサイト及びメラノサイトの共培養系を使用する、<1>〜<8>の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
<10> <1>〜<9>の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤を含有する、美白用組成物。
<11>皮膚外用剤である、<10>に記載の美白用組成物。
<12> 化粧料(但し、医薬部外品を含む)である、<10>又は<11>に記載の美白用組成物。
<13> <1>〜<9>に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法によりメラニン産生抑制作用を有すると判別された成分を含有させる、美白組成物の設計方法。
本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法は、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系への不活性化作用を指標とするところに特徴を有する。
アドレノメジュリン(ADM:Adrenomedullin)は、アミノ酸プレプロホルモンより連続的な酵素的分解及びアミド化反応を経由し生成される生理活性ペプチドであり、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP:Calcitonin gene-related peptide)とG蛋白質共役型オーファン受容体に分類されるカルシトニン受容体様受容体(CRLR:Calcitonin−receptor−like receptor)を共有し、生物活性を発現する。CRLRは、それぞれ受容体活性化調節蛋白(RAMP1〜3)と複合体を形成することにより受容体として機能するが、RAMP1とともに形成される複合体は、CGRPに高い結合親和性を示し、CGRPに対する受容体として機能することが知られている。一方、CRLRとRAMP2又は3により形成される複合体は、ADMに対し高い親和性を示すADM結合受容体として機能することが知られている。
抽出操作を行う場合、植物部位は全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位のみを使用することもできるが、予めこれらを粉砕或いは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、1,3−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される1種乃至は2種以上が好適なものとして例示出来る。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物1質量に対して、溶媒を1〜30質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び/又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
以下に説明するスクリーニング方法は、本発明のうち、特にメラノサイト等の細胞に被験物質を添加して、細胞のメラニン産生量を測定することを特徴とするスクリーニング方法である。上述のように、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を活性化することによって、細胞のメラニン産生量は増加する。従って、ADMシグナル伝達系を活性化する条件を意図的に設定し(なるべくメラニン産生に影響するその他の因子を排除する)、その条件下における被験物質のメラニン産生に与える影響(メラニン産生抑制作用)を観測する
ことで、実質上被験物質のADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価することにもなる。即ち、本スクリーニング方法は、ADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する工程、及びメラニン産生量を測定する工程を含むことが重要となる。
(i)評価に使用する細胞に、ADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する
(ii)被験物質を添加する(比較対照として被験物質を添加せずにADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した細胞も用意する)
(iii)被験物質の添加及び非添加の場合のメラニン産生量を測定する
(iv)測定したメラニン産生量を比較して、被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する
(v)測定したメラニン産生量、又は評価したメラニン産生抑制作用を、予め設定した基準に基づいて判定し、被験物質を判別する
この計算式によれば、ADMによって亢進したメラニン産生に対する被験物質の効果、メラニン産生抑制作用を好適に判断することが出来る。
また、ADMシグナル伝達系の活性化因子について上述したが、メラノサイトの単独培養を用いる場合はADM添加が、メラノサイト及びケラチノサイトの共培養を用いる場合は紫外線照射が好ましい。なお、これらの場合のADMシグナル伝達系の活性化も、上述のように被験物質添加前又は添加後の何れに行ってもよい。
以下に説明するスクリーニング方法は、本発明のうち、特にメラノサイト等の細胞に被験物質を添加して、ADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性を測定することを特徴とするスクリーニング方法である。
(i)評価に使用する細胞(活性化した状態又は活性化していない状態のいずれでもよい)に、被験物質を添加する(比較対照として被験物質を添加していない細胞も用意する)(ii)被験物質の添加及び非添加の場合のADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性を測定する
(iii)測定したADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性を比較して、被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する
(iv)評価したメラニン産生抑制作用を、予め設定した基準に基づいて判定し、被験物質を判別する
また、ADM結合受容体結合親和性は、例えば特開平11−169187号に記載の方法に従って測定することができる。
さらに、上記(ii)の工程において測定されたADM結合受容体遺伝子発現量又はADM結合受容体蛋白質発現量を直接用いて、スクリーニングを行ってもよく、上記(iii)の工程を必要としないものでもよい。
以下に説明するスクリーニング方法は、本発明のうち、特にメラノサイト等の細胞に被験物質を添加して、細胞内情報伝達物質であるc-AMP産生量を測定することを特徴とするスクリーニング方法である。ADM結合受容体は、G−蛋白質共役型受容体であるため、その活性化度合いをc-AMP等の二次情報伝達物質産生量によっても把握することができる。c-AMP産生量は、ADM結合受容体以外の受容体にも影響されるため、ADMシグナル伝達系の活性
化に係るc-AMP産生を特異的に観測できる条件を設定することが必要である。即ち、本スクリーニング方法は、ADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する工程、及びc-AMPを測定する工程を含むことが重要となる。
(i)評価に使用する細胞に、ADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する
(ii)被験物質を添加する(比較対照として被験物質を添加せずにADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した細胞も用意する)
(iii)被験物質の添加及び非添加の場合のc-AMP産生量を測定する
(iv)測定したc-AMP産生量を比較して、被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する
(v)測定したc-AMP産生量、又は評価したc-AMP産生抑制作用を、予め設定した基準に基づいて判定し、被験物質を判別する
よりADM結合受容体を過剰発現させた細胞等も好適なものとして例示出来る。また、本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法には、通常の培養条件により培養した細胞を用いることも出来るし、ADM結合受容体を解するシグナル伝達系を活性化した細胞を用いることも出来る。かかる細胞の培養条件としては、単独培養であっても共培養であってもよく、特にメラノサイトの単独培養、メラノサイト及びケラチノサイト共培養系が好適に例示出来る。さらに、本スクリーニング法におけるADM結合受容体を介するシグナル伝達系の活性化要因としては、紫外線照射、ADM添加等が好ましく、特に、メラノサイトの単独培養におけるADM添加、メラノサイト及びケラチノサイトの共培養における紫外線照射が好適に例示出来る。前記ADM結合受容体を介するシグナル伝達系の活性化は、被験物質添加前又は添加後の何れに行ってもよい。
以下の手順に従い、AMD添加によるメラノサイトの産生量及び細胞数への影響を検討した。48穴プレートに正常ヒトメラノサイト(NHEM)(倉敷紡績株式会社)1.5×104(cells/well)の密度で播種し、播種24時間後、合成ADM(ペプチド研究所4278−s)を2(μM)になる様に添加し、さらに0.25(μCi/well)の[14C]−2−Thiouracilを添加した。CO2インキュベーターにて72時間培養後、Cell Counting Kit−8(株式会社 同仁研究所)を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター(アロカ株式会社)により[14C]−2−Thiouracilの取り込みを測定した。結果を図1に示す。図1において、縦軸は、メラニン産生量又は細胞数を表す。また、メラニン産生量又は細胞数は、ADM非添加群におけるメラニン産生量又は細胞数を100%とした場合の百分率で表示した。
以下の手順に従い、ADM添加によるメラノサイトのRAMP2mRNA、RAMP3mRNA発現量への影響を検討した。48穴プレートに、正常ヒトメラノサイト(NHEM)(倉敷紡績株式会社)1.5×104(cells/well)の密度で播種し、播種24時間後、合成ADM(ペプチド研究所、4278−s)を2(μM)となる様に添加し、CO2インキュベーターにて24時間培養し、Buffer RLT(QIAGEN社)により細胞を溶解し回収した。細胞回収後、RNeasy Mini Kit(QIAGEN社)を用いmRNAを抽出し、SuperScript VILO cDNA synthesis Kit(Invitrogen社)を用いcDNA(プライマー配列は、非公開)を合成し、QuantiTect Primer Assay(QIAGEN社)を用い、リアルタイムPCR法によりmRNA発現量を測定した。各遺伝子のmRNA発現量は、TBP(内在性コントロール、プライマー配列は、配列表に記載)のmRNA発現量を測定し、TBPのmRNA発現量との比率で算出した。結果を図2及び図3に示す。図2及び
図3において、縦軸は、RAMP2及びRAMP3mRNA発現量を表す。また、RAMP2及びRAMP3mRNA発現量は、ADM非添加群におけるRAMP2及びRAMP3mRNA発現量を100%とした場合の百分率で表示した。
以下の手順に従い、ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系における紫外線照射によるメラニン産生量変化を調べた。更に、ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系における紫外線照射により増加したメラニン産生量に対するADM産生遺伝子発現を特異的に阻害するsi−RNA添加の影響を調べた。
1)48穴プレートに、正常ヒトケラチノサイト(NHEK)(倉敷紡績株式会社)を、7.0×104(cells/well)の密度で、また、正常ヒトメラノサイト(NHEM)(倉敷紡績株式会社)を2.6×104(cells/well)の密度でHumedia−KG2培地(倉敷紡績株式会社)を用いて播種し、24時間培養した(UV非照射群)。
2)si−RNA溶液を、Hs ADM 6 FlexiTube siRNA(QIAGEN社、プライマー配列CGGGACGTGCACGGTGCAGAA)si−RNA溶液添加24時間、48時間後に東芝FL20S・E-30/DMRランプで65mJ/cm2の紫外線(UV−B)を照射した(UV照射+si-RNA添加群)。その後14C-thiouracilを0.25μCi/well添加した。
4)比較対照群として、紫外線照射を行い、si−RNAを添加しない群(UV照射群)を設定した。
5)さらに48時間培養後Cell Counting Kit-8(株式会社 同仁化学研究所)を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター(アロカ株式会社)により14Cの取り込みを測定した。メラニン量は、UV照射群から回収した細胞の放射線量を100%とした場合の、UV非照射群又はUV照射+si−RNA添加群から回収した細胞の放射線量の百分率として算出した。即ち、各細胞内に取り込まれた放射線量が小さい程、メラニン量が小さいと判断することが出来る。結果を図4に示す。
上述した本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法によって、メラニン産生抑制効果に優れるメラニン産生抑制剤を選択することができるが、本スクリーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤を用い調製された美白用組成物、及び本スクリーニング方法を利用して美白用組成物を設計する方法も本発明である。
本発明の美白用組成物及び美白用組成物の設計方法は、上述したスクリーニング方法によって選択されたメラニン産生抑制剤を用いるものであれば、その他の構成については特に限定されず、公知の調製方法を適宜用いることができる。
また、美白用組成物に含有させるメラニン産生抑制剤の種類も1種類に限定されず、2種類以上を含有させてもよい。
属マジョラムより得られる植物抽出物、アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシより得られる植物抽出物は、丸善製薬株式会社より購入した植物抽出物を使用した。シソ科ハナハッカ属マジョラムは、エジプト、地中海沿岸を原産地とする多年草であり、香辛料、精油等に使用されている。また、前記の精油や植物抽出物には、沈静、抗不安作用等が存することが知られている。アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシは、欧州、中央アジアを原産地とする多年草であり、日本各地の水中や湿地に自生する。別名クレソンとも呼ばれ、食用として用いられる。シナノキ科シナノキ属シナノキは、日本を原産地とする落葉高木であり、本州に自生する。街路樹などに見られるシナノキの樹皮は、繊維が強くロープの材料などに使用される。
以下の手順に従い、メラニン産生抑制剤のスクリーニング操作を行った。
48穴プレートに正常ヒトメラノサイト(NHEM)(倉敷紡績株式会社)1.5×104(cells/well)の密度で播種し、播種24時間後、合成ADM(ペプチド研究所4278−s)を最終濃度2μMになる様に添加し、さらに被験物質を培地中に最終濃度1%となる様に添加した。さらに0.25(μCi/well)の[14C]−2−Thiouracilを添加した。CO2インキュベーターにて72時間培養後、Cell Counting Kit−8(株式会社 同仁研究所)を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター(アロカ株式会社)により[14C]−2−Thiouracilの取り込みを測定した。メラニンが合成された場合、Thiouracilが取り込まれ、放射活性が増加するため、放射活性の測定で合成されたメラニン量の比較が可能となる。尚、比較対照のために、ADM非添加群、被験物質非添加群でも同様な処理を行い、ADM(+)被験物質(−)群、ADM(+)被験物質(+)群、ADM(−)被験物質(+)群、ADM(−)被験物質(−)群のメラニン産生量を検出した。これらの各群のメラニン産生量データを用い、以下の[数4]の計算式を用いて、被験物質のメラニン産生抑制作用を算出した。
以下の手順に従い、メラニン産生抑制剤のスクリーニング操作を行った。尚、本スクリーニング法に使用した被験物質は、シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物であり、丸善製薬株式会社より購入した市販の植物抽出物である。
48穴プレートに正常ヒトメラノサイト(NHEM)(倉敷紡績株式会社)1.5×104(cells/well)の密度で播種し、播種24時間後、合成ADM(ペプチド研究所、4278
−s)を最終濃度2μMとなる様添加、被験物質を培地中に最終濃度1%となる様に添加しCO2インキュベーターにて24時間培養し、Buffer RLT(QIAGEN社)により細胞を溶解し回収した。細胞回収後、RNeasy Mini Kit(QIAGEN社)を用いmRNAを抽出し、SuperScript
VILO cDNA synthesis Kit(Invitrogen社)を用いcDNA(プライマー配列は、非公開)を合成し、QuantiTect Primer Assay(QIAGEN社)を用い、リアルタイムPCR法によりRAMP2mRNA発現量を測定した。また、ADM結合受容体を介する作用を有さない美白剤のアルブチン10μg/mL(シグマ株式会社)について、同様の操作によりRAMP2mRNA発現量を測定した。RAMP2mRNA発現量は、TBP(内在性コントロール、プライマー配列は、配列表に記載)のmRNA発現量を測定し、TBPのmRNA発現量との比率で算出した。結果を図5及び図6に示す。図5及び図6において、縦軸はRAMP2mRNA発現量を表す。また、各々サンプルのRAMP2mRNA発現量は、ADM及び被験物質非添加群のRAMP2mRNA発現量を100%とした場合の百分率で表示した。
以下の手順に従い、本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤を含有する美白用組成物(皮膚外用剤)を作製した。即ち、表1の処方成分(A)に記載の各成分を合わせ、室温下に溶解した。一方、処方成分(B)に記載された各成分を室温下に溶解し、これを前記(A)に記載された成分の混合物を加え可溶化し、本発明の美白用組成物(皮膚外用剤1)を得た。また、本発明のシソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物を水に置換した比較例1を作製した。
表3に示す処方に従い、健康食品1を作製した。即ち、処方成分を10重量部の水と共に転動相造粒(不二パウダル株式会社製「ニューマルメライザー」)し、打錠して錠剤状の健康食品を得た。尚、表中の数値の単位は、重量部を表す。本健康食品は、優れた色素沈着予防又は改善効果を示していた。
Claims (12)
- アドレノメジュリン(ADM:Adrenomedullin)結合受容体を介するシグナル伝達系(ADMシグナル伝達系)への不活性化作用を指標とする、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
- 被験物質を細胞に添加することにより、前記被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する、請求項1に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、
前記被験物質の添加前及び/又は添加後にADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した場合、及び前記被験物質を添加せずにADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した場合のメラニン産生量、チロシナーゼの酵素活性、チロシナーゼ遺伝子発現量、チロシナーゼ酵素蛋白質発現量、又はc−AMP産生量を比較して、前記ADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。 - 被験物質を細胞に添加することにより、前記被験物質のADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価する、請求項1に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、前記被験物質を添加した場合、及び前記被験物質を添加しない場合のADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性を比較して、前記ADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価する、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
- 前記被験物質の添加前及び/又は添加後にADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する、請求項3に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
- 前記ADMシグナル伝達系の活性化因子の付与が、ADM添加である請求項2又は4に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
- 前記ADM結合受容体が、カルシトニン受容体様受容体(CRLR:Calcitonin receptor−like receptor)と、受容体活性化調節蛋白2又は3(RAMP2又は3:Receptor activity−modifying protein2又は3)より形成される受容体である、請求項1〜5の何れか1項に記載の
メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。 - 前記ADM結合受容体遺伝子発現量が、ADM結合受容体mRNA発現量である、請求項3〜6の何れか1項に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
- 前記ADM結合受容体mRNA発現量が、CRLRmRNA発現量、RAMP2mRNA発現量、及びRAMP3mRNA発現量のうち少なくとも1以上である、請求項7に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
- メラノサイト単独培養、又はケラチノサイト及びメラノサイトの共培養系を使用する、請求項1〜8の何れか1項に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
- 請求項1〜9の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法を行う工程、及び前記工程によりメラニン産生抑制作用を有すると判別された成分を含有させることを含む、美白用組成物の設計方法。
- 前記美白用組成物が皮膚外用剤である、請求項10に記載の美白用組成物の設計方法。
- 前記美白用組成物が化粧料(但し、医薬部外品を含む)である、請求項10又は11に記載の美白用組成物の設計方法。
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