JP2012255710A

JP2012255710A - スクリーニング方法

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Publication number: JP2012255710A
Application number: JP2011128652A
Authority: JP
Inventors: Tomonori Motokawa; 智紀本川; Masatomo Ito; 政知伊藤
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc
Current assignee: Pola Orbis Holdings Inc
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2011-06-08
Publication date: 2012-12-27
Anticipated expiration: 2031-06-08
Also published as: JP5806859B2

Abstract

【課題】本発明は、優れた美白作用の発見と、かかる美白作用を精度よく、効率的に評価し得る方法を確立することを課題とする。
【解決手段】アドレノメジュリン（ADM：Adrenomedullin）結合受容体を介するシグナル伝達系（ADMシグナル伝達系）への不活性化作用を指標とすることにより、優れた美白成分を精度よく、かつ簡便に選択することが出来る。さらにかかる成分を含有した組成物は、優れた色素沈着予防又は改善作用を発揮する。
【選択図】図１

Description

本発明は、化粧料等に好適な、新規な作用機序に基づくメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法、当該メラニン産生抑制剤を含有する美白用組成物、並びにその美白用組成物の設計方法に関するものである。尚、本発明の説明において、化粧料との用語は、医薬部外品を含むものとして定義する。

表皮に存在する色素細胞（メラノサイト）のメラニン産生が著しく亢進された皮膚症状としては、メラニン産生が一時的に亢進した日焼け等の色素沈着症状のほか、過剰又は慢性的なメラニン産生亢進により生じるしみ、そばかす、くすみ等の色素沈着異常が挙げられる。この様な色素沈着症状は、肌の美観の悪化、加齢の兆候として認識され、他人の見た目の印象に大きな影響を与えるため、肌に関するアンケート調査等を実施した場合には、必ず上位に位置付けられる肌トラブルである。

これまでの色素沈着症状の発生・症状進行等の機序に関するに研究により、メラノサイトのメラニン産生は、皮膚刺激により産生される様々な情報伝達物質、サイトカイン等の生理活性物質により調節されていることが明らかにされている。さらに、前記の研究成果を基に多様な色素沈着予防又は改善作用を有する成分（美白剤）が創出され、化粧料等への応用が図られている。この様な美白剤としては、チロシナーゼ酵素に対する阻害作用を有するレゾルシン誘導体、アルブチン及びハイドロキノン誘導体、チロシナーゼ活性発現に必須な銅イオンをキレートするエラグ酸及びコウジ酸、α−MSH（MSH：Melanocyte stimulating hormone）阻害作用を有するマメ科クララ（苦参）より得られる植物抽出物（例えば、特許文献１を参照）、メラノサイトのデンドライド伸長抑制作用を有するスイカズラ科スイカズラより得られる植物抽出物（例えば、特許文献２を参照）、エンドセリン−１産生抑制作用を有するハヤトウリ果実抽出物（例えば、特許文献３を参照）等の美白剤が知られている。しかしながら、化粧料等に配合されている従来の美白剤には、一定の色素沈着予防又は改善効果は認められるものの、使用者が望む高い美白効果、持続性が十分に得られているとは言い難い。これは、メラニン産生機構が依然として十分に解明されておらず、既知の作用機序に基づいた美白作用だけでは、その効果が十分でないためであると考えられる。更に、既存の美白剤には、安全性又は安定性に課題を有するものも存在した。

１９９３年にKitamura等により最初に報告されたアドレノメジュリン（ADM：Adrenomedullin）（例えば、非特許文献１を参照）は、１８５個のアミノ酸プレプロホルモンから連続的な酵素的分解及びアミド化反応を経由し生成される生理活性ペプチドであり、副腎髄質、心臓、血管、肺、脳、腎臓等の多くの組織に存在することが知られている。ADMは、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP：Calcitonin gene-related peptide）とG蛋白質共役型オーファン受容体のカルシトニン受容体様受容体（CRLR：Calcitonin−receptor−like receptor）を共有し、薬理学的な作用を発現することが報告されている。CRLRは、細胞膜１回貫通蛋白質の受容体活性化調節蛋白１（RAMP１：Receptor activity−modifying protein１）と複合体を形成することによりCGRP受容体を、またRAMP１と構造的に類似するRAMP２又はRAMP３と複合体を形成することにより２種類のADM結合受容体を形成することが報告されている。さらに、ADM結合受容体が関与する薬理学的な作用としては、血管拡張（例えば、非特許文献２を参照）、血管新生又は再生促進作用（例えば、非特許文献３を参照）、抗炎症作用等が報告されている。また、ADM及びADM関連ペプチドが有する薬理作用としては、抗菌又は抗真菌作用による擦り傷、皮疹又は皮膚損傷を治癒する作用（例えば、特許文献４を参照）が報告されている。前記の抗炎症作用、皮膚症状の
治癒作用等のADM及びADM関連ペプチドの作用は、何れもADM結合受容体を活性化する作用であり、ADM結合受容体の不活性化作用による薬理作用は、ほとんど知られていない。さらに、表皮ケラチノサイトより産生されるα−メラノサイト刺激ホルモン、エンドセリン−１、一酸化窒素、塩基性線維芽細胞増殖因子、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子等のサイトカインが、メラノサイトに存在する各々のシグナル伝達系を介しメラニン産生量を増加させることは知られているが、ケラチノサイトにより産生されたADMが、メラノサイトのADM結合受容体に係るシグナル伝達系を介しメラニン産生量を調節することは、発明者の知る限り報告されていない。

特開２００９−０６７８０４号公報特開２００３−０８１７４７号公報特開２００８−０９４７３７号公報特開２００７−１４５８５０号公報

Kitamura K. et. al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、１９２、５５３−５６０（１９９３） Shimosawa T. et. al.、J. Clin. Invest.、９６、１６７２（１９９５） Miyashita K. et. al.、FEBS Lett.、５４４、８６−９２（２００３）

本発明は、上記の様な状況を鑑みてなされたものであり、優れた美白成分の発見に繋がる技術を確立することを課題とする。特に、既知の作用機序に基づいた美白作用に着目するだけでは、優れた美白成分を発見することは困難であると考えられる。即ち、新たな作用機序に基づいた美白作用の発見と、かかる美白作用を評価し得る方法を確立することを課題とする。

本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ケラチノサイトにより産生されるADMが、色素細胞（メラノサイト）のADM結合受容体を介したシグナル伝達系（以下、ADMシグナル伝達系ともいう）を活性化し、メラニン産生量を増加させる事実を発見した。即ち、色素沈着症状に深く関与するメラノサイトのメラニン産生量は、ケラチノサイト等により産生されるADMにより、メラノサイトのADMシグナル伝達系を介し調整されることが明らかとなった。メラノサイトにおけるADMシグナル伝達系が、メラニン産生量の調節に関与することは、発明者らが知る限り、全く報告されていない。さらに、かかるメラニン産生機構が明らかとされていない以上、これを抑制する成分や方法についての検討も、積極的に行われてこなかったと言える。従って、ADMシグナル伝達系の活性化を抑制することができる成分は、新たな作用機序に基づいたメラニン産生抑制剤となり得る。

本発明者らは、さらに鋭意検討を重ね、ADMシグナル伝達系の活性化を抑制する成分を精度よく、効率的に評価し得る方法を確立した。さらにかかる方法によって評価し、選択した成分を含有した組成物が、色素沈着予防又は改善作用を発揮することを確認した。即ち本発明は、以下に示す通りである。
＜１＞アドレノメジュリン（ADM：Adrenomedullin）結合受容体を介するシグナル伝達系（ADMシグナル伝達系）への不活性化作用を指標とする、メラニン産生抑制剤のスク
リーニング方法。
＜２＞被験物質を細胞に添加することにより、前記被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する、＜１＞に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、前記被験物質の添加前及び／又は添加後にADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した場合、及び前記被験物質を添加せずにADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した場合のメラニン産生量、チロシナーゼの酵素活性、チロシナーゼ遺伝子発現量又はチロシナーゼ酵素蛋白質発現量、又はc-AMP産生量を比較して、前記ADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜３＞被験物質を細胞に添加することにより、前記被験物質のADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価する、＜１＞に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、前記被験物質を添加した場合、及び前記被験物質を添加しない場合のADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体親和性を比較して、前記ADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価する、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜４＞前記被験物質の添加前及び／又は添加後にADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する、＜３＞に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜５＞前記ADMシグナル伝達系の活性化因子の付与が、ADM添加である＜２＞又は＜４＞に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜６＞前記ADM結合受容体が、カルシトニン受容体様受容体（CRLR：Calcitonin receptor−like receptor）と、受容体活性化調節蛋白２又は３（RAMP２又は３：Receptor activity−modifying protein２又は３）より形成される受容体である、＜１＞〜＜５＞の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜７＞前記ADM結合受容体遺伝子発現量が、ADM結合受容体mRNA発現量である、＜３＞〜＜６＞の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜８＞前記ADM結合受容体mRNA発現量が、CRLRmRNA発現量、RAMP２mRNA発現量、及びRAMP３mRNA発現量のうち少なくとも１以上である、＜７＞に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜９＞メラノサイト単独培養、又はケラチノサイト及びメラノサイトの共培養系を使用する、＜１＞〜＜８＞の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
＜１０＞＜１＞〜＜９＞の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤を含有する、美白用組成物。
＜１１＞皮膚外用剤である、＜１０＞に記載の美白用組成物。
＜１２＞化粧料（但し、医薬部外品を含む）である、＜１０＞又は＜１１＞に記載の美白用組成物。
＜１３＞＜１＞〜＜９＞に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法によりメラニン産生抑制作用を有すると判別された成分を含有させる、美白組成物の設計方法。

本発明によれば、従来明らかとされていなかったADMシグナル伝達系の活性化に基づいたメラニン産生量の増加を抑制する新規なメラニン産生抑制剤を、精度よく、かつ簡便に選択することが出来る。また、かかるメラニン産生抑制剤を利用した美白用組成物、並びにその設計方法を提供することが出来る。

ADM添加によるメラノサイトのメラニン産生量及び細胞数に関する検討結果を示す図である。 ADM添加によるメラノサイトのRAMP２mRNA発現量変化に関する検討結果を示す図である。 ADM添加によるメラノサイトのRAMP３mRNA発現量変化に関する検討結果を示す図である。ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系における紫外線照射によるメラニン産生量の検討結果を示す図である。メラノサイトにおけるシソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物のRAMP２mRNA発現量変化に関する検討結果を示す図である。アルブチンのRAMP２mRNA発現量変化に関する検討結果を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。

＜本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法＞
本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法は、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系への不活性化作用を指標とするところに特徴を有する。
アドレノメジュリン（ADM：Adrenomedullin）は、アミノ酸プレプロホルモンより連続的な酵素的分解及びアミド化反応を経由し生成される生理活性ペプチドであり、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP：Calcitonin gene-related peptide）とG蛋白質共役型オーファン受容体に分類されるカルシトニン受容体様受容体（CRLR：Calcitonin−receptor−like receptor）を共有し、生物活性を発現する。CRLRは、それぞれ受容体活性化調節蛋白（RAMP１〜３）と複合体を形成することにより受容体として機能するが、RAMP１とともに形成される複合体は、CGRPに高い結合親和性を示し、CGRPに対する受容体として機能することが知られている。一方、CRLRとRAMP２又は３により形成される複合体は、ADMに対し高い親和性を示すADM結合受容体として機能することが知られている。

本発明における「ADM結合受容体」は、ADMが結合可能な受容体であれば特段限定されない。具体的には上述のCRLRとRAMP２又は３により形成される複合体が、好適なものとして例示出来る。

本発明において「ADM結合受容体を介するシグナル伝達系への不活性化作用」とは、ADM結合受容体に直接的又は間接的に働き掛けて、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を不活性化する作用を意味する。具体的にはADM産生量を減少させる作用、産生されたADMを減少させる作用、ADM結合受容体に作用しADM結合受容体を介するシグナル伝達系を阻害する作用（直接又は間接的なADM結合受容体拮抗作用）、ADM結合受容体蛋白質発現量を減少させる作用、ADM結合受容体遺伝子発現量を減少させる作用、c-AMP等の二次的情報伝達物質を減少させる作用、及びメラニン産生に深く関与する生物活性を不活性化させる作用等が挙げられる。

本発明において「ADM結合受容体を介するシグナル伝達系への不活性化作用を指標とする」とは、即ちメラニン産生抑制剤として評価される被験物質のADMシグナル伝達系への不活性化作用に係る物理量を測定する工程を含み、かかる物理量を用いて被験物質のADMシグナル伝達系への不活性化作用を直接的又は間接的に評価する工程を含むことを意味する。ADMシグナル伝達系への不活性化作用に係る物理量とは、例えば「ADM産生量を減少させる作用」又は「産生されたADMを減少させる作用」等の場合にはADM量が、「ADM結合受容体拮抗作用」、「ADM結合受容体蛋白質発現量を減少させる作用」、又は「ADM結合受容体遺伝子発現量を減少させる作用」等の場合には遺伝子発現量、蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性等が、「c-AMP等の二次的情報伝達物質を減少させる作用」等の場合にはc-AMP等の二次的情報伝達物質量が該当する。また、ADMシグナル伝達系の不活性化作用によって生じていることが明らかな現象に係る物理量を測定する場合も、間接的にADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価していることになるため、これに含まれる。例えば、メラニン産生量、又はメラニン産生量に係るチロシナーゼの酵素活性、チロシナーゼ遺伝子発現量、チロシナーゼ酵素蛋白質発現量等を測定する場合がこれに該当する。

ADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価し得る物理量を測定する方法としては、ケラチノサイトやメラノサイト等の細胞を用いてADM量、ADM結合受容体親和性、遺伝子発現量、蛋白質発現量又は二次的情報伝達物質量等を測定する方法が好適なものとして例示出来るが、例えば「産生されたADMを減少させる作用」等の場合には、細胞を用いずに、ADMと被験物質を直接接触させて、ADMの分解又は変質等を測定する方法も例示できる。

「ADM結合受容体を介するシグナル伝達系への不活性化作用を指標」としてメラニン産生抑制剤をスクリーニングするとは、被験物質のADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価し、その評価結果に基づいて、被験物質をメラニン産生抑制剤として判定又は選択することを意味する。例えば、被験物質にADMシグナル伝達系への不活性化作用があると評価された場合には、当該被験物質にはメラニン産生抑制作用がある、即ちメラニン産生抑制剤となり得ると判定するほか、ADMシグナル伝達系への不活性化作用について事前に評価基準を設けておき、その基準を超えた場合、当該当該被験物質にはメラニン産生抑制作用があると判定する等もこれに含まれる。さらに、複数の被験物質についてADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価し、これらの作用を相対的に比較して、ADMシグナル伝達系への不活性化作用がより高い被験物質が、より優れたメラニン産生抑制剤であると判定することも、本発明のスクリーニングに含まれる。

対象となる被験物質は、純化合物、動植物由来の抽出物若しくはその分画精製物等の混合組成物等の何れであってもよく、植物由来の抽出物としては、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販（丸善製薬株式会社等）されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作を行う場合、植物部位は全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位のみを使用することもできるが、予めこれらを粉砕或いは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示出来る。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。

上述のように、ADMシグナル伝達系の活性化によって、細胞のメラニン産生量が増加することは従来知られていなかった。「ADM結合受容体を介するシグナル伝達系への不活性化作用」とは、かかるメラニン産生機構の進行を阻害する作用であり、新規な作用機序に基づいたメラニン産生抑制作用であるとも言える。本発明は、かかる新規なメラニン産生抑制作用を判別し得るスクリーニング方法であり、ADMシグナル伝達系への不活性化作用を指標とするものであれば特段限定されないが、以下に好適なスクリーニング方法を具体的に例示する。

１）メラニン産生量を測定するスクリーニング方法
以下に説明するスクリーニング方法は、本発明のうち、特にメラノサイト等の細胞に被験物質を添加して、細胞のメラニン産生量を測定することを特徴とするスクリーニング方法である。上述のように、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を活性化することによって、細胞のメラニン産生量は増加する。従って、ADMシグナル伝達系を活性化する条件を意図的に設定し（なるべくメラニン産生に影響するその他の因子を排除する）、その条件下における被験物質のメラニン産生に与える影響（メラニン産生抑制作用）を観測する
ことで、実質上被験物質のADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価することにもなる。即ち、本スクリーニング方法は、ADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する工程、及びメラニン産生量を測定する工程を含むことが重要となる。

本スクリーニング方法における具体的な工程を、以下に挙げる。
（i）評価に使用する細胞に、ADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する
（ii）被験物質を添加する（比較対照として被験物質を添加せずにADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した細胞も用意する）
（iii）被験物質の添加及び非添加の場合のメラニン産生量を測定する
（iv）測定したメラニン産生量を比較して、被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する
（v）測定したメラニン産生量、又は評価したメラニン産生抑制作用を、予め設定した基準に基づいて判定し、被験物質を判別する

本スクリーニング方法の場合は、メラニン産生量を直接測定するため、そのメラニン産生が特にADMシグナル伝達系に起因するものであることを定かにする条件が必要である。従って、上記（i）の工程、即ちADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する工程を含む。ADMシグナル伝達系の活性化因子の付与は、上記（ii）の工程における被験物質の添加前及び／又は添加後の何れであってもよいが、ADMシグナル伝達系を不活性化する作用発現機序を明確にする観点及びメラニン産生量の測定感度等の観点から、被験物質の添加前に行われることが好ましい。また、ADMシグナル伝達系の活性化因子は、ADMシグナル伝達系を活性化することができれば特段限定されないが、例えばADMの添加、紫外線の照射等が挙げられる。

上記（iii）の工程におけるメラニン産生量の測定は、メラニン産生量を測定することができる方法であれば特段限定されず、公知の方法を適宜用いることができる。さらにメラニン産生量との関係性が明らかにされている生理活性、例えば、メラニン産生の律速酵素であるチロシナーゼの酵素活性、チロシナーゼ遺伝子発現量、チロシナーゼ酵素蛋白質発現量等によって代替してもよい。

本スクリーニング方法の場合は、メラニン産生量を直接測定する、即ちメラニン産生抑制作用を直接観測することになるため、その測定値を用いて直接メラニン産生抑制剤を判別することもできる。従って、（iv）の工程を必ずしも必要とするものではないが、例えば「ADM添加時における被験物質の添加及び非添加のメラニン産生量の差」から「ADM非添加時における被験物質の添加及び非添加のメラニン産生量の差」を引き、それを「被験物質添加時におけるADM添加及び非添加時のメラニン産生量の差」で割って百分率とした、以下の［数１］の計算式を用いてメラニン産生抑制作用を算出してもよい。
この計算式によれば、ADMによって亢進したメラニン産生に対する被験物質の効果、メラニン産生抑制作用を好適に判断することが出来る。

また、メラニン産生抑制作用を算出するために用いる測定値も１種類に限定されず、メラニン産生量との関係性が明らかにされている複数種類の値を測定し、任意の処理方法によって算出してもよい。

上記（v）の工程の判定に用いる基準も特に限定されず、必要とするメラニン産生抑制作用に基づいて適宜設定することができる。例えば、上記［数１］の計算式で計算する場合、メラニン産生抑制剤として、その値は１０％以上が好ましく、２０％以上がさらに好ましい。かかる値を示すメラニン産生抑制剤を含有する組成物は、優れた色素沈着予防又は改善効果を発揮する。従って、判定に用いる基準も上記範囲に基づいて設定されることが好ましい。

本スクリーニング方法の評価に使用する細胞は、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を有し、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系の活性化によるメラニン産生量が測定可能な細胞であれば特段限定されないが、メラノサイトが好適なものとして例示出来る。また、スクリーニング系に使用可能な培養系としては、単独培養であっても共培養であってもよく、より具体的にはメラノサイトの単独培養系、メラノサイト及びケラチノサイトの共培養系が好適なものとして例示出来る。また、ADMシグナル伝達系を活性化する因子について上述しているが、メラノサイトの単独培養系では、ADMの直接添加が、メラノサイト及びケラチノサイトの共培養系では、紫外線の暴露等がより好ましい。

本スクリーニング方法には、通常の培養条件により培養した細胞を用いることも出来るし、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を活性化した細胞を用いることも出来る。本スクリーニング方法のメラニン産生量測定にいたる細胞培養条件においては、前記細胞を培養するための通常の培地を使用することも出来るが、通常の培地よりメラニン産生に影響を与える成長因子等を除くことが好ましい。これにより、かかる細胞におけるADM結合受容体を介さないメラニン産生変化の影響を減少させ、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系の活性化によるメラニン産生量変化を選択的、精度よく測定することが出来る。具体例を挙げれば、通常のメラノサイト培養は、市販のメラニン細胞基礎培地（Medium２５４、倉敷紡績株式会社）にメラニン細胞増殖添加剤（HMGS、倉敷紡績株式会社）を添加し使用するが、かかる細胞増殖促進剤の内、ウシ脳下垂体抽出液（BPE：Bovine Pituitary Extraction）、インスリンを除くことが好ましい。
また、ADMシグナル伝達系の活性化因子について上述したが、メラノサイトの単独培養を用いる場合はADM添加が、メラノサイト及びケラチノサイトの共培養を用いる場合は紫外線照射が好ましい。なお、これらの場合のADMシグナル伝達系の活性化も、上述のように被験物質添加前又は添加後の何れに行ってもよい。

以上に記載したスクリーニング方法（メラニン産生量を測定するスクリーニング方法）のうち、特に実施例１に記載されている方法が好ましい。即ち、ADM添加によってADMシグナル伝達系を活性化したメラノサイトの単独培養系を用い、被験物質添加及び非添加時のメラニン産生量を測定し、［数４］の計算式を用いてメラニン産生抑制作用を算出する方法である。

２）ADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性を測定するスクリーニング方法
以下に説明するスクリーニング方法は、本発明のうち、特にメラノサイト等の細胞に被験物質を添加して、ADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性を測定することを特徴とするスクリーニング方法である。

本スクリーニング方法における具体的な工程を、以下に挙げる。
（i）評価に使用する細胞（活性化した状態又は活性化していない状態のいずれでもよい）に、被験物質を添加する（比較対照として被験物質を添加していない細胞も用意する）（ii）被験物質の添加及び非添加の場合のADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性を測定する
（iii）測定したADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性を比較して、被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する
（iv）評価したメラニン産生抑制作用を、予め設定した基準に基づいて判定し、被験物質を判別する

本スクリーニング方法の場合は、ADMシグナル伝達系の活性化に係るADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性を測定するため、上記の１）メラニン産生量を測定するスクリーニング方法とは異なり、必ずしもADMシグナル伝達系が活性化する条件を設定しなくてもよい。即ち、上記（i）の工程においては、ADMシグナル伝達系が活性化されていない細胞、或いはADMシグナル伝達系が活性化された細胞の何れを用いてもよく、さらに被験物質の添加後にADMシグナル伝達系の活性化因子を付与したものであってもよい。ADMシグナル伝達系を活性化する場合、その活性化因子は特段限定されないが、例えばADMの添加、紫外線の照射等が挙げられる。

上記（ii）の工程におけるADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性の測定は、被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価することができるものであれば特段限定されないが、ADM結合受容体遺伝子発現量を測定することがより好ましい。また、上述のように「ADM結合受容体」としては、CRLRと、RAMP２又は３とから形成される受容体が好ましく、ADM結合受容体遺伝子発現量としても、CRLR、RAMP２、RAMP３に係る遺伝子発現量を測定することがさらに好ましい。前記２種類のADM結合受容体にADMが結合することにより、シグナル伝達系が活性化され、メラニン産生が亢進するが、ADMシグナル伝達系の活性化により受容体発現量も増加する。CRLRと、RAPM２又は３との複合体形成によって、ADMと親和性の高い受容体が形成されるが、これら個々又は複数の遺伝子発現を同時に抑制できる作用は、効果的なADMシグナル伝達系の不活性化作用となり得る。即ち、遺伝子発現量として評価する上でも、これらの遺伝子発現量を測定することが特に好ましい。さらに、測定操作の簡便性、測定精度、再現性等から、ADM結合受容体mRNA発現量を測定することが特に好ましく、即ちCRLRmRNA発現量、RAPM２mRNA発現量、RAPM３mRNA発現量を測定することが特に好ましい。

ADM結合受容体遺伝子発現量を測定する方法は特段限定されないが、以下の方法が例示出来る。現在、遺伝子発現量を測定する方法には、mRNA発現量を測定可能なノーザンブロット法（northern blotting）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR：Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法、リアルタイムPCR（Real time PCR）法、更には、リアルタイムPCR（Real time PCR）とRT−PCRを組み合わせた測定方法等が存在する。本発明においては、測定感度及び測定の簡便性などの面より、リアルタイムPCR法によってADM結合受容体mRNA発現量を測定することが好ましい。尚、上述の遺伝子発現量測定は、被験物質の添加、並びにADM結合受容体を介するシグナル伝達系を活性化させる要因の影響を受けることなく精度よく、簡便に測定することが出来る。また、ADM結合受容体遺伝子発現量、取り分け、CRLRmRNA、RAMP２mRNA、RAMP３mRNA発現量は、市販の簡易測定キットを使用することにより簡便に行うことが出来る。例えば、QIAGEN社より販売されているRNeasy Plus Mini Kitを使用しmRNAを抽出し、Invitrogen社より販売されているSuperScript VILO cDNA synthesis Kitを用いてcDNA（プライマー配列は、非公開）を合成した後、リアルタイムPCR法により、目的とするCRLRmRNA、RAMP２mRNA、RAMP３mRNA発現量を測定することができる。
また、ADM結合受容体結合親和性は、例えば特開平１１−１６９１８７号に記載の方法に従って測定することができる。

上記（iii）の工程における被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する方法は特段限定されないが、例えば被験物質を添加したものをサンプル群、被験物質を添加しないものをコントロール群とした場合、以下の式を用いる方法が挙げられる。

また、ADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価するために用いるADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性も１種に限定されず、複数種類測定して、任意の処理方法によってADMシグナル伝達系の不活性化作用を算出してもよい。
さらに、上記（ii）の工程において測定されたADM結合受容体遺伝子発現量又はADM結合受容体蛋白質発現量を直接用いて、スクリーニングを行ってもよく、上記（iii）の工程を必要としないものでもよい。

上記（iv）の工程の判定に用いる基準も特に限定されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、上記［数２］の計算式で計算する場合、メラニン産生抑制剤として、その値は１０％以上が好ましく、２０％以上がさらに好ましい。かかる値を示すメラニン産生抑制剤を含有する組成物は、優れた色素沈着予防又は改善効果を発揮する。従って、判定に用いる基準も上記範囲に基づいて設定されることが好ましい。

本スクリーニング方法の評価に使用する細胞は、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を有し、上述のADM伝達系の不活性化作用を評価可能な細胞であれば特段限定されないが、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を有する通常の細胞のほか、遺伝子導入等によりADM結合受容体を過剰発現させた細胞等も好適なものとして例示出来る。また、本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法には、通常の培養条件により培養した細胞を用いることも出来るし、ADM結合受容体を解するシグナル伝達系を活性化した細胞を用いることも出来る。かかる細胞の培養条件としては、単独培養であっても共培養であってもよく、特にメラノサイトの単独培養、メラノサイト及びケラチノサイト共培養系が好適に例示出来る。さらに、本スクリーニング法におけるADM結合受容体を介するシグナル伝達系の活性化要因としては、紫外線照射、ADM添加等が好ましく、特に、メラノサイトの単独培養におけるADM添加、メラノサイト及びケラチノサイトの共培養における紫外線照射が好適に例示出来る。前記ADM結合受容体を介するシグナル伝達系の活性化は、被験物質添加前又は添加後の何れに行ってもよい。

更に、本発明のスクリーニング方法に用いる細胞を培養する培地としては、通常の細胞培養に用いられる培地を使用することも出来るが、通常の培地よりメラニン産生に影響を与える成長因子を除くことが好ましい。これは、メラニン産生に影響を与える成長因子を除くことにより、ADM情報伝達系を介するメラニン産生抑制作用を選択的、精度よく正確に測定することが出来るためである。本スクリーニング方法に使用するメラノサイトを培養するための培地としては、市販のメラニン細胞基礎培地（Medium２４５、倉敷紡績株式会社）にメラニン産生増殖添加剤（HMGS、倉敷紡績株式会社）を添加し使用するが、かかる細胞増殖促進剤の内、ウシ脳下垂体抽出液（BPE：Bovine Pituitary Extraction）、インスリンを除くことが好ましい。

３）c-AMP産生量を測定するスクリーニング方法
以下に説明するスクリーニング方法は、本発明のうち、特にメラノサイト等の細胞に被験物質を添加して、細胞内情報伝達物質であるc-AMP産生量を測定することを特徴とするスクリーニング方法である。ADM結合受容体は、G−蛋白質共役型受容体であるため、その活性化度合いをc-AMP等の二次情報伝達物質産生量によっても把握することができる。c-AMP産生量は、ADM結合受容体以外の受容体にも影響されるため、ADMシグナル伝達系の活性
化に係るc-AMP産生を特異的に観測できる条件を設定することが必要である。即ち、本スクリーニング方法は、ADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する工程、及びc-AMPを測定する工程を含むことが重要となる。

本スクリーニング方法における具体的な工程を、以下に挙げる。
（i）評価に使用する細胞に、ADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する
（ii）被験物質を添加する（比較対照として被験物質を添加せずにADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した細胞も用意する）
（iii）被験物質の添加及び非添加の場合のc-AMP産生量を測定する
（iv）測定したc-AMP産生量を比較して、被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する
（v）測定したc-AMP産生量、又は評価したc-AMP産生抑制作用を、予め設定した基準に基づいて判定し、被験物質を判別する

上述したように、本スクリーニング方法の場合は、ADMシグナル伝達系の活性化に係るc-AMP産生を特異的に観測できる条件を設定することが必要である。従って、上記（i）の工程、即ちADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する工程を含む。ADMシグナル伝達系の活性化因子の付与は、上記（ii）の工程における被験物質の添加前及び／又は添加後の何れであってもよいが、ADMシグナル伝達系を不活性化する作用発現機序を明確にする観点から、被験物質の添加前に行われることが好ましい。また、ADMシグナル伝達系の活性化因子は、ADMシグナル伝達系を活性化することができれば特段限定されないが、例えばADMの添加、紫外線の照射等が挙げられる。

上記（iii）の工程におけるc-AMP産生量を測定する方法は、特段限定されず、市販のc-AMP測定キットを用い、公知の方法を適用して測定することができる。

上記（iv）の工程における被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する方法は特段限定されないが、例えば「ADM添加時における被験物質の添加及び非添加のc-AMP産生量の差」から「ADM非添加時における被験物質の添加及び非添加のc-AMP産生量の差」を引き、それを「被験物質添加時におけるADM添加及び非添加時のc-AMP産生量の差」で割って百分率とした、以下の［数３］の計算式を用いてADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価してもよい。

上記（v）の工程の判定に用いる基準も特に限定されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、上記［数３］の計算式で計算する場合、その値は１０％以上が好ましく、２０％以上がさらに好ましい。かかる値を示すメラニン産生抑制剤を含有する組成物は、優れた色素沈着予防又は改善効果を発揮する。従って、判定に用いる基準も上記範囲に基づいて設定されることが好ましい。

本スクリーニング方法の評価に使用する細胞は、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を有し、上述のADM伝達系の不活性化作用を評価可能な細胞であれば特段限定されないが、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を有する通常の細胞のほか、遺伝子導入等に
よりADM結合受容体を過剰発現させた細胞等も好適なものとして例示出来る。また、本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法には、通常の培養条件により培養した細胞を用いることも出来るし、ADM結合受容体を解するシグナル伝達系を活性化した細胞を用いることも出来る。かかる細胞の培養条件としては、単独培養であっても共培養であってもよく、特にメラノサイトの単独培養、メラノサイト及びケラチノサイト共培養系が好適に例示出来る。さらに、本スクリーニング法におけるADM結合受容体を介するシグナル伝達系の活性化要因としては、紫外線照射、ADM添加等が好ましく、特に、メラノサイトの単独培養におけるADM添加、メラノサイト及びケラチノサイトの共培養における紫外線照射が好適に例示出来る。前記ADM結合受容体を介するシグナル伝達系の活性化は、被験物質添加前又は添加後の何れに行ってもよい。

＜試験例１： ADM添加によるメラノサイトのメラニン産生量及び細胞数に関する検討＞
以下の手順に従い、AMD添加によるメラノサイトの産生量及び細胞数への影響を検討した。４８穴プレートに正常ヒトメラノサイト（NHEM）（倉敷紡績株式会社）１．５×１０⁴（cells/well）の密度で播種し、播種２４時間後、合成ADM（ペプチド研究所４２７８−s）を２（μM）になる様に添加し、さらに０．２５（μCi/well）の[¹⁴C]−２−Thiouracilを添加した。CO₂インキュベーターにて７２時間培養後、Cell Counting Kit−８（株式会社同仁研究所）を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター（アロカ株式会社）により[¹⁴C]−２−Thiouracilの取り込みを測定した。結果を図１に示す。図1において、縦軸は、メラニン産生量又は細胞数を表す。また、メラニン産生量又は細胞数は、ADM非添加群におけるメラニン産生量又は細胞数を１００％とした場合の百分率で表示した。

図１の結果より、AMD添加によってメラノサイトのメラニン産生量が増加することが確認された。この際、メラノサイト細胞数の増加は認められなかった。即ち、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系が活性化されることにより、メラニン産生量が増加することが明らかである。

＜試験例２： ADM添加によるメラノサイトのRAMP２、RAMP３遺伝子発現量変化に関する検討＞
以下の手順に従い、ADM添加によるメラノサイトのRAMP２mRNA、RAMP３mRNA発現量への影響を検討した。４８穴プレートに、正常ヒトメラノサイト（NHEM）（倉敷紡績株式会社）１．５×１０⁴（cells/well）の密度で播種し、播種２４時間後、合成ADM（ペプチド研究所、４２７８−s）を２（μM）となる様に添加し、CO₂インキュベーターにて２４時間培養し、Buffer RLT（QIAGEN社）により細胞を溶解し回収した。細胞回収後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を用いmRNAを抽出し、SuperScript VILO cDNA synthesis Kit（Invitrogen社）を用いcDNA（プライマー配列は、非公開）を合成し、QuantiTect Primer Assay（QIAGEN社）を用い、リアルタイムPCR法によりmRNA発現量を測定した。各遺伝子のmRNA発現量は、TBP（内在性コントロール、プライマー配列は、配列表に記載）のmRNA発現量を測定し、TBPのmRNA発現量との比率で算出した。結果を図２及び図３に示す。図２及び
図３において、縦軸は、RAMP２及びRAMP３mRNA発現量を表す。また、RAMP２及びRAMP３mRNA発現量は、ADM非添加群におけるRAMP２及びRAMP３mRNA発現量を１００％とした場合の百分率で表示した。

図２及び図３の結果より、ADM添加によってメラノサイトにおけるRAMP２mRNA、RAMP３mRNA発現量の増加が認められた。即ち、ADM添加によって、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系が活性化されることが明らかである。

＜試験例３：ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系における紫外線照射によるメラニン産生量の検討＞
以下の手順に従い、ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系における紫外線照射によるメラニン産生量変化を調べた。更に、ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系における紫外線照射により増加したメラニン産生量に対するADM産生遺伝子発現を特異的に阻害するsi−RNA添加の影響を調べた。
１）４８穴プレートに、正常ヒトケラチノサイト（NHEK）（倉敷紡績株式会社）を、７．０×１０⁴（cells/well）の密度で、また、正常ヒトメラノサイト（NHEM）（倉敷紡績株式会社）を２．６×１０⁴（cells/well）の密度でHumedia−KG２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて播種し、２４時間培養した（UV非照射群）。
２）si−RNA溶液を、Hs ADM ６ FlexiTube siRNA（QIAGEN社、プライマー配列CGGGACGTGCACGGTGCAGAA）si−RNA溶液添加２４時間、４８時間後に東芝FL２０S・E-３０／DMRランプで６５mJ/cm²の紫外線（UV−B）を照射した（UV照射＋si-RNA添加群）。その後14C-thiouracilを０．２５μCi/well添加した。
４）比較対照群として、紫外線照射を行い、si−RNAを添加しない群（UV照射群）を設定した。
５）さらに４８時間培養後Cell Counting Kit-８（株式会社同仁化学研究所）を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター（アロカ株式会社）により¹⁴Cの取り込みを測定した。メラニン量は、UV照射群から回収した細胞の放射線量を１００％とした場合の、UV非照射群又はUV照射＋si−RNA添加群から回収した細胞の放射線量の百分率として算出した。即ち、各細胞内に取り込まれた放射線量が小さい程、メラニン量が小さいと判断することが出来る。結果を図４に示す。

図４の結果より、ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系におけるUV照射群のメラニン産生量は、UV非照射群に比較し、紫外線照射により増加したが、細胞数に大きな変化は認められなかった。更に、ケラチノサイト及びメラノサイト共培養系にsi−RNAを添加した後に、紫外線照射した場合には、si−RNAを添加せずに紫外線照射したUV照射群に比較し、メラニン産生量は減少した。このとき、細胞数には、大きな変化は認められなかった。即ち、ケラチノサイト及び／又はメラノサイト共培養系における紫外線照射によってメラニン産生量が増加すること、並びに紫外線照射により増加したメラニン産生量は、ADM産生遺伝子発現を特異的に抑制するsi−RNA添加によって、メラニン産生量が減少することが確認された。このことは、ケラチノサイトが産生するADMによって、メラノサイトにおけるメラニン産生量が調節されることを示している。

試験例１〜３の結果より、メラノサイトにおけるAMDシグナル伝達系を活性化することによりメラニン産生量、ADM結合受容体遺伝子発現量が増加することが明らかになった。また、ケラチノサイト等により産生されるADM産生量の増減によりメラノサイトのADMシグナル伝達系の活性が調整され、メラニン産生量が増減することが明らかとなった。このため、メラノサイトにおけるADMシグナル伝達系を不活性化させることにより、メラノサイトにおけるメラニン産生量を減少させることが出来ることが明らかである。ADMシグナル伝達系を不活性化させる作用を有する成分は、新規な作用機序に基づいたメラニン産生抑制剤といえる。

＜本発明の美白用組成物及び美白用組成物の設計方法＞
上述した本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法によって、メラニン産生抑制効果に優れるメラニン産生抑制剤を選択することができるが、本スクリーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤を用い調製された美白用組成物、及び本スクリーニング方法を利用して美白用組成物を設計する方法も本発明である。
本発明の美白用組成物及び美白用組成物の設計方法は、上述したスクリーニング方法によって選択されたメラニン産生抑制剤を用いるものであれば、その他の構成については特に限定されず、公知の調製方法を適宜用いることができる。

本発明の美白用組成物及び美白用組成物の設計方法における、メラニン産生抑制剤の量は特段限定されないが、美白用組成物全量に対し、０．００００１質量％〜１５質量％、より好ましくは、０．０００１質量％〜１０質量％、さらに好ましくは、０．００１質量〜５質量％含有させることが好ましい。メラニン産生抑制剤の含有量が少なすぎると、目的とする色素沈着予防又は改善効果が低下する傾向にあり、多すぎても効果が頭打ちになる傾向があり、この系の自由度を損なう場合がある。
また、美白用組成物に含有させるメラニン産生抑制剤の種類も１種類に限定されず、２種類以上を含有させてもよい。

本発明の美白用組成物の製剤化にあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチトールやソルビトールなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料など好適に例示出来る。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。製造は、常法に従い、これらの成分を処理することにより、困難なく、為しうる。

また、本発明のスクリーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤は、ADMシグナル伝達系の不活性化作用によるメラニン産生抑制作用に加え、標的部位への集積性及び選択性に優れ、高い安全性及び安定性を有するために、医薬、化粧料等として利用が好ましい。その投与経路も、経口投与、経皮投与の何れもが可能であるが、皮膚における色素沈着予防又は改善作用を発揮するためには、皮膚への貯留性、標的部位への到達効率等を考慮し、経皮投与を採用することが好ましい。

また、後述する実施例１に記載の本発明のメラニン産生抑制剤であるシソ科ハナハッカ
属マジョラムより得られる植物抽出物、アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシより得られる植物抽出物は、丸善製薬株式会社より購入した植物抽出物を使用した。シソ科ハナハッカ属マジョラムは、エジプト、地中海沿岸を原産地とする多年草であり、香辛料、精油等に使用されている。また、前記の精油や植物抽出物には、沈静、抗不安作用等が存することが知られている。アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシは、欧州、中央アジアを原産地とする多年草であり、日本各地の水中や湿地に自生する。別名クレソンとも呼ばれ、食用として用いられる。シナノキ科シナノキ属シナノキは、日本を原産地とする落葉高木であり、本州に自生する。街路樹などに見られるシナノキの樹皮は、繊維が強くロープの材料などに使用される。

以下に、本発明に付いて、実施例を挙げて更に詳しく説明を加えるが、本発明がかかる実施例のみに限定されないことは言うまでもない。

＜試験例４：本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法１＞
以下の手順に従い、メラニン産生抑制剤のスクリーニング操作を行った。
４８穴プレートに正常ヒトメラノサイト（NHEM）（倉敷紡績株式会社）１．５×１０⁴（cells/well）の密度で播種し、播種２４時間後、合成ADM（ペプチド研究所４２７８−s）を最終濃度２μMになる様に添加し、さらに被験物質を培地中に最終濃度１％となる様に添加した。さらに０．２５（μCi/well）の[¹⁴C]−２−Thiouracilを添加した。CO₂インキュベーターにて７２時間培養後、Cell Counting Kit−８（株式会社同仁研究所）を用い、細胞数を測定後、液体シンチレーションカウンター（アロカ株式会社）により[¹⁴C]−２−Thiouracilの取り込みを測定した。メラニンが合成された場合、Thiouracilが取り込まれ、放射活性が増加するため、放射活性の測定で合成されたメラニン量の比較が可能となる。尚、比較対照のために、ADM非添加群、被験物質非添加群でも同様な処理を行い、ADM（＋）被験物質（−）群、ADM（＋）被験物質（＋）群、ADM（−）被験物質（＋）群、ADM（−）被験物質（−）群のメラニン産生量を検出した。これらの各群のメラニン産生量データを用い、以下の［数４］の計算式を用いて、被験物質のメラニン産生抑制作用を算出した。

結果、メラニン産生抑制作用として、シソ科ハナハカ属マジョラムより得られる植物抽出物は６２％、アブラナ科オランダカラシ属オランダカラシより得られる植物抽出物は７９％の数値が算出された。かかる成分が、ADMシグナル伝達系の不活性化作用に基づいて優れたメラニン産生抑制作用を発揮することが明らかである。

＜試験例５：本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法２＞
以下の手順に従い、メラニン産生抑制剤のスクリーニング操作を行った。尚、本スクリーニング法に使用した被験物質は、シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物であり、丸善製薬株式会社より購入した市販の植物抽出物である。
４８穴プレートに正常ヒトメラノサイト（NHEM）（倉敷紡績株式会社）１．５×１０⁴（cells/well）の密度で播種し、播種２４時間後、合成ADM（ペプチド研究所、４２７８
−ｓ)を最終濃度２μMとなる様添加、被験物質を培地中に最終濃度１％となる様に添加しCO₂インキュベーターにて２４時間培養し、Buffer RLT（QIAGEN社）により細胞を溶解し回収した。細胞回収後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を用いmRNAを抽出し、SuperScript
VILO cDNA synthesis Kit（Invitrogen社）を用いcDNA（プライマー配列は、非公開）を合成し、QuantiTect Primer Assay（QIAGEN社）を用い、リアルタイムPCR法によりRAMP２mRNA発現量を測定した。また、ADM結合受容体を介する作用を有さない美白剤のアルブチン１０μｇ／ｍＬ（シグマ株式会社）について、同様の操作によりRAMP２mRNA発現量を測定した。RAMP２mRNA発現量は、TBP（内在性コントロール、プライマー配列は、配列表に記載）のmRNA発現量を測定し、TBPのmRNA発現量との比率で算出した。結果を図５及び図６に示す。図５及び図６において、縦軸はRAMP２mRNA発現量を表す。また、各々サンプルのRAMP２mRNA発現量は、ADM及び被験物質非添加群のRAMP２mRNA発現量を１００％とした場合の百分率で表示した。

図５の結果より、シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物は、ADM非添加時及び添加時共に、RAMP２mRNA発現量を抑制した。ADM非添加時、添加時における、シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物のRAMP２mRNA発現量抑制作用（（植物抽出物非添加群のRAMP２mRNA発現量−植物抽出物添加群の群のRAMP２mRNA発現量）／（植物抽出物非添加群のRAMP２mRNA発現量）×１００）は、それぞれ１７％（ADM非添加時）及び５２％（ADM添加時）の数値が算出された。一方、図６の結果より、美白剤であるアルブチンは、ADM非添加及び添加時のRAPM２mRNA発現量にほとんど影響を及ぼさなかった。シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物、アルブチンは、共に本試験に用いた濃度においてメラニン産生抑制作用を示すが、シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物については、ADM添加時の方がより高いメラニン産生抑制作用を示すことが確認されている。また、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を活性化することによりメラニン産生量が増加し、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系が関与するメラニン産生系の存在が示されている。このため、上記結果から、本スクリーニング方法が、ADM結合受容体を介するシグナル伝達系を阻害することによりメラニン産生抑制作用を発揮する成分を選択的、精度よくスクリーニング出来る方法であるといえる。

＜製造例１：本発明の美白用組成物の製造方法１＞
以下の手順に従い、本発明のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤を含有する美白用組成物（皮膚外用剤）を作製した。即ち、表１の処方成分（A）に記載の各成分を合わせ、室温下に溶解した。一方、処方成分（B）に記載された各成分を室温下に溶解し、これを前記（A）に記載された成分の混合物を加え可溶化し、本発明の美白用組成物（皮膚外用剤１）を得た。また、本発明のシソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物を水に置換した比較例１を作製した。

実施例３に記載の方法に従い製造された本発明の美白用組成物（皮膚外用剤１）及び比較例１に関し、以下の手順に従い色素沈着抑制作用を評価した。自由意思で参加したパネラーの上腕内側部に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの部位を合計３ケ所設けた。最少紅斑量（１ＭＥＤ）の紫外線照射を設けた部位に１日１回、３日連続して３回照射した。試験１日目の紫外線照射終了時（一回目照射終了後）より、１日２回３５日連続してローション５０μＬを塗布した。３部位のうち１部位は無処置部位とした。３５回の塗布終了２４時間後に色彩色差計（ＣＲ-３００、コニカミノルタ株式会社）にて各試験部位の皮膚明度（Ｌ＊値）を測定し、処理部位のＬ＊と無処理部位Ｌ＊の差（ΔＬ＊＝処理部位のＬ＊−無処理部位Ｌ＊）を算出した。Ｌ＊値は、色素沈着の程度が強いほど低い値となる。従って、ΔＬ＊値が大きいほど、色素沈着が改善されたと判断することが出来る。結果を表２に示す。これにより、本発明の皮膚外用剤１は優れた色素沈着抑制効果を有することが分かる。これは、皮膚外用剤１に含有されるメラニン産生抑制剤（シソ科ハナハッカ属マジョラムより得られる植物抽出物）のADM産生抑制作用によるメラニン産生抑制作用によると考えられる。

＜製造例２：本発明のメラニン産生抑制剤を含有する健康食品の製造＞
表３に示す処方に従い、健康食品１を作製した。即ち、処方成分を１０重量部の水と共に転動相造粒（不二パウダル株式会社製「ニューマルメライザー」）し、打錠して錠剤状の健康食品を得た。尚、表中の数値の単位は、重量部を表す。本健康食品は、優れた色素沈着予防又は改善効果を示していた。

本発明は、食品、医薬品、化粧料等に応用出来る。

Claims

アドレノメジュリン（ADM：Adrenomedullin）結合受容体を介するシグナル伝達系（ADMシグナル伝達系）への不活性化作用を指標とする、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
被験物質を細胞に添加することにより、前記被験物質のADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する、請求項１に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、
前記被験物質の添加前及び／又は添加後にADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した場合、及び前記被験物質を添加せずにADMシグナル伝達系の活性化因子を付与した場合のメラニン産生量、チロシナーゼの酵素活性、チロシナーゼ遺伝子発現量、チロシナーゼ酵素蛋白質発現量、又はc-AMP産生量を比較して、前記ADMシグナル伝達系の不活性化作用を評価する、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
被験物質を細胞に添加することにより、前記被験物質のADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価する、請求項１に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、前記被験物質を添加した場合、及び前記被験物質を添加しない場合のADM結合受容体遺伝子発現量、ADM結合受容体蛋白質発現量又はADM結合受容体結合親和性を比較して、前記ADMシグナル伝達系への不活性化作用を評価する、メラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
前記被験物質の添加前及び／又は添加後にADMシグナル伝達系の活性化因子を付与する、請求項３に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
前記ADMシグナル伝達系の活性化因子の付与が、ADM添加である請求項２又は４に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
前記ADM結合受容体が、カルシトニン受容体様受容体（CRLR：Calcitonin receptor−like
receptor）と、受容体活性化調節蛋白２又は３（RAMP２又は３：Receptor activity−modifying protein２又は３）より形成される受容体である、請求項１〜５の何れか１項に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
前記ADM結合受容体遺伝子発現量が、ADM結合受容体mRNA発現量である、請求項３〜６の何れか１項に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
前記ADM結合受容体mRNA発現量が、CRLRmRNA発現量、RAMP２mRNA発現量、及びRAMP３mRNA発現量のうち少なくとも１以上である、請求項７に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
メラノサイト単独培養、又はケラチノサイト及びメラノサイトの共培養系を使用する、請求項１〜８の何れか１項に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法。
請求項１〜９の何れかに記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法により選択されたメラニン産生抑制剤を含有する、美白用組成物。
皮膚外用剤である、請求項１０に記載の美白用組成物。
化粧料（但し、医薬部外品を含む）である、請求項１０又は１１に記載の美白用組成物。
請求項１〜９に記載のメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法によりメラニン産生抑制
作用を有すると判別された成分を含有させる、美白組成物の設計方法。