JP2013099305A - 抗老化剤のスクリ−ニング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】オ−トファジ−活性化作用、取り分け、オ−トファゴソ−ム形成後の細胞質成分の分解過程の活性化作用を指標とすることにより、優れた抗老化剤(シワ形成に対する予防又は改善剤)を有する成分を精度よく、簡便に選択することが出来る。さらに、かかる成分を含有する組成物は、優れた抗老化効果(シワ形成に対する予防又は改善効果)を発揮する。
【選択図】図3
Description
<1> オ−トファジ−活性化作用を評価する工程を含む抗老化剤のスクリ−ニング方法であって、被験物質のオ−トファジ−活性化作用を測定し、当該活性化作用が高い場合には、抗老化作用が高いと判断することを特徴とする、抗老化剤のスクリ−ニング方法。
<2> 前記抗老化作用が、シワ形成に対する予防又は改善作用であることを特徴とする、<1>に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法。
<3> 前記オ−トファジ−活性化作用が、オ−トファゴソ−ム形成後の細胞質成分の分解過程の活性化作用であることを特徴とする、<1>又は<2>に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法。
<4> 前記オ−トファジ−活性化作用が、オ−トファゴソ−ムに局在する蛋白質LC3−ll(microtuble- associated protein 1 light chain 3−ll)量調節作用であることを特徴とする、<1>〜<3>何れかに記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法。
<5> 前記抗老化剤のスクリ−ニングに用いる細胞が、高齢者の皮膚線維芽細胞であることを特徴とする、<1>〜<4>何れかに記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法。
<6> オ−トファジ−活性化作用を評価する工程を含む抗老化剤のスクリ−ニング方法であって、被験物質を添加した高齢者の皮膚細胞にオ−トファジ−を介する細胞質成分の選択的な分解抑制作用を有する成分を添加し(非添加の細胞を対照とする)、当該細胞のLC3−ll蛋白質量を測定し、当該測定値よりオ−トファジ−活性化度合いを推定し、オ−トファジ−活性化度合いが高い場合には、抗老化作用が高いと判別することを特徴とする、抗老化剤のスクリ−ニング方法。
<7> <1>〜<6>何れかに記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法により選択された抗老化剤を含有することを特徴とする、抗老化用組成物。
<8> シワ形成の予防又は改善用であることを特徴とする、<7>に記載の抗老化用組成物。
<9> 皮膚外用剤であることを特徴とする、<7>又は<8>に記載の抗老化用組成物。
<10> 化粧料(但し、医薬部外品を含む)であることを特徴とする、<7>〜<9>何れかに記載の抗老化用組成物。
<11> 使用対象が高齢者であることを特徴とする、<7>〜<10>何れかに記載の抗老化用組成物。
<12> <1>〜<6>の何れかに記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法により抗老化用を有すると判断された成分を含有させることを特徴とする、抗老化用組成物の設計方法。
<13> <1>〜<6>に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法により選択される抗老化剤。
<14> 前記オ−トファジ−活性化作用を有する成分のスクリ−ニング方法により選択される抗老化剤が、ユキノシタ科アジサイ属アマチャより得られる植物抽出物、イチョウ科イチョウ属イチョウより得られる植物抽出物、シソ科タツミソウ属コガネバナより得られる植物抽出物、フフトモモ科テンニンカ属テンニンカより得られる植物抽出物、バラ科サクラ属サクラより得られる植物抽出物、ラン科の植物より得られる植物抽出物より選択される1種又は2種以上よりなることを特徴とする<13>に記載の抗老化剤。
<15> ユキノシタ科アジサイ属アマチャより得られる植物抽出物、イチョウ科イチョウ属イチョウより得られる植物抽出物、シソ科タツミソウ属コガネバナより得られる植物抽出物、フフトモモ科テンニンカ属テンニンカより得られる植物抽出物、バラ科サクラ属サクラより得られる植物抽出物、ラン科の植物より得られる植物抽出物より選択される1種又は2種以上よりなることを特徴とする、オ−トファジ−活性化剤。
オ−トファジ−は、自食作用とも呼ばれ、リソソ−ムにより細胞質成分を非選択的に分解する細胞の分解・再生機構である。オ−トファジ−は、主に、1)細胞質に隔離膜と呼ばれる扁平な小胞が現れた後、細胞質成分を取り込みながら伸張し、先端同士が融合しオ−トファゴソ−ムが形成される過程、2)オ−トファゴソ−ムがリソソ−ムと融合し細胞質成分が分解される過程に分類され、かかる過程を通じ自己消化されたアミノ酸が栄養源として再利用される。本発明者は、皮膚生理老化とオ−トファジ−との関連性を調べるために若年及び高齢者の皮膚線維芽細胞を用いオ−トファジ−活性化作用に関し検討を行った。その結果、高齢者の皮膚線維芽細胞におけるオ−トファゴソ−ムに局在する蛋白質量(LC3-ll量)が多いこと、さらには、オ−トファゴソ−ム形成に関与する因子にはほとんど違いがないことを見出した。かかる事実は、高齢者の皮膚線維芽細胞におけるオ−トファジ−機能が低下していること、特に、オ−トファゴソ−ム形成後の細胞質成分の分解過程の抑制によるオ−トファジ−機能が低下していることを意味する。また、オ−トファジ−を介した細胞質成分の分解を人為的に阻害した若年者の皮膚線維芽細胞においてもヒアルロン酸量が低下することを確認した。この様な事実は、皮膚生理老化現象、取り分け、シワ形成に対しオ−トファジ−が深く関与していることを示し、皮膚生理老化現象を改善するためには、オ−トファジ−機能を活性化すること、取り分け、単純にオ−トファジ−を惹起するのではなく、「オ−トファゴソ−ム形成後の細胞質成分の分解過程を活性化しオ−トファジ−過程全体を完遂する」ことが重要であることを示唆している。また、高齢者の皮膚細胞において確認されるオ−トファジ−機能の低下は、光皮膚老化とは作用機序が異なり、加齢による生体反応が関与する皮膚の生理的な老化との関連性が高い。
本発明の抗老化剤は、オ−トファジ−活性化作用を測定し、当該活性化作用が高い場合には、抗老化作用が高いと判別することを特徴とする、抗老化剤のスクリ−ニング方法である。本発明の抗老化剤(シワ形成に対する予防又は改善剤)は、前述の抗老化剤のスクリ−ニング方法によりオ−トファジ−活性化作用が高いと判断された成分であれば特段の限定なく適用することが出来るが、特に、本願発明の実施例1に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法によりオ−トファジ−活性化作用が高いと判断され選択された抗老化剤であることが好ましい。また、実施例1に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法においてオ−トファジ−活性化作用が高いと判断される成分としては、被験物質がオ−トファジ−活性化作用を示す成分、より好ましくは、前述のautophagic vacuole値が、1.2以上、さらに好ましくは、1.5以上である成分が好適に例示出来る。また、かかる成分を含有する組成物は、オ−トファジ−活性化作用、取り分け、オ−トファゴソ−ム形成後の細胞質成分の分解促進作用により優れた抗老化効果を発揮する。また、本発明の抗老化剤は、高齢者用に使用することが好ましい。高齢者の皮膚細胞においては、オ−トファジ−活性、取り分け、オ−トファゴソ−ム形成後の細胞質成分の分解過程の活性が低下しているため、かかる作用を活性化する抗老化剤は、高齢者に適用することが好ましい。さらに、本発明の抗老化剤を適用するのに好ましい対象としては、60歳以上の高齢者であること、及び/又は、若年者に比較しオ−トファジ−活性化作用が低下している人を選択し、本発明の抗老化剤を含有する皮膚外用剤を適用することが好ましい。本発明における若年者とは、30歳以下の人を、より好ましくは、30歳以下の女性を若年者とすることが好ましい。本発明者の検討によれば、30歳以下の人は、加齢によるオ−トファジ−機構の活性化及び皮膚老化現象の進行が低い。
前述した本発明の抗老化剤のスクリ−ニング方法により、オ−トファジ−活性化作用に有し抗老化作用に優れる抗老化剤を選択することが出来る。また、本発明の抗老化剤のスクリ−ニング方法により選択された抗老化剤を用い調製された抗老化用組成物、及び本スクリ−ニング方法を利用して抗老化用組成物を製造する方法も本発明である。本発明の抗老化用組成物及び抗老化用の製造方法は、前述したスクリ−ニング方法によって選択された抗老化剤を用いるものであれば、その他の構成については特に限定されず、公知の調製方法を適宜用いることができる。
23歳、27歳、63歳、68歳、70歳女性腹部皮膚由来線維芽細胞1.5×105(cells)を含む2(mL)の培地を6穴プレ−トの各ウェルに添加し、細胞播種した。播種翌日、20(μM)クロロキンニリン酸(CQ)又は溶媒を添加した。さらに24時間培養後、細胞を回収した。ウェスタンブロットによりLC3−ll及びβ−actin蛋白質を検出し、Image-Jを用いバンドの定量解析を行った。測定値を以下の式に当てはめ、autophagic vacuole分解度を算出した。結果を図1に示す。
23歳、27歳、68歳、70歳女性腹部皮膚由来線維芽細胞4.5×104(cells)を含む1(mL)の培地を24穴プレ−トの各ウェルに添加し、細胞播種した。播種翌日に培地を交換し、さらに24時間培養後、培養上清を回収した。5000rpm×1min遠心後の上清をヒアルロン酸量測定サンプルとし、Hyaluronan Assay Kit(生化学バイオビジネス株式会社製)を用いてヒアルロン酸量を定量した。結果を図2に示す。
FIB311−1ML2152(70歳女性腹部皮膚由来線維芽細胞)を1.0×105(cells)を含む2(mL)の培地を6穴プレ−トの各ウェルに添加し、細胞播種した。播種翌日、培地を除去し、各濃度の被験物質(植物抽出物)を含む培地を各ウェルに3(mL)を加えた。前記の植物抽出物は、原液を使用し、植物抽出物の最終濃度は、1.0及び0.5(v/v%)とした。2日間培養した後、CQを最終濃度50(μM)になるように添加し、4時間インキュベ−トした。その後、培地を除去し、1(mL)のPBSで洗浄後、細胞回収用溶液を200(μL)加え、スクレ−パ−を用い1.5(mL)チュ−ブに細胞を回収した。SDS−PAGE後にウエスタンブロットを行い、回収したサンプル中のLC3−ll及びβ−actinをバンドとして検出し、Imager−Jを用いてバンド輝度を測定した。測定値を前記の式1に当てはめ、autophagic vacuole分解度を算出した。結果を図3に示す。
以下の手順に従い、本発明の抗老化剤のスクリ−ニング法により選択された抗老化剤を含有する抗老化用組成物(皮膚外用剤)を作製した。即ち、表1及び表2の処方成分(A)に記載の各成分を合わせ、室温下に溶解した。一方、処方成分(B)に記載された各成分を室温下に溶解し、これを前記(A)に記載された成分の混合物を加え可溶化し、本発明の抗老化用組成物(皮膚外用剤1〜6)を得た。また、本発明の抗老化剤を水に置換した比較例1を作製した。
実施例2に記載の方法に従い作製された化粧料1〜6、比較例1を用い、以下の方法に従いシワ改善効果を調べた。即ち、目尻のシワが気になるパネラ−28名(女性、年齢層40〜60歳)を4名ずつ7群に分け、各群に対しそれぞれ化粧料1〜6、比較例1を渡し、1日朝晩2回、連日8週間使用してもらい、試験の前後の目尻のレプリカの比較からシワ改善効果を調べた。レプリカは、光を透過させない白色のものを用い、これに皮膚表面形態をうつしとり、このレプリカを実体顕微鏡の標本台に固定し、45度の角度で光を照射し、レプリカを回転させて、皮溝の陰影が強く観察される方向の陰影画像(1×1cm2)を画像解析装置に取り込んだ。この画像はシワの凹凸に従って、シワの深いところは輝度が低く、シワのないところは輝度が高く、陰影を形成する。陰影画像における輝度の分布を求め、輝度のメジアン値を境に、メジアン値以上の輝度の輝点は最大輝度に、メジアン値未満の輝度の輝点は輝度0に変換して、二値化を行い、陰影部分(輝度0の部分)の面積率を求めた。(試験前の陰影の面積率−試験後の陰影の面積率)/(試験前の陰影の面積率)×100でシワ改善度(%)を求めた。結果を各群4名の平均値±標準偏差として表3に示す。表3の結果より、本発明の化粧料1〜6は、優れたシワ改善作用を有することがわかる。
表4及び表5に示す処方に従い、健康食品(健康食品)を作製した。即ち、処方成分を10重量部の水と共に転動相造粒(不二パウダル株式会社製「ニュ−マルメライザ−」)し、打錠して錠剤状の健康食品1を得た。尚、表中の数値の単位は、重量部を表す。本健康食品は、優れた抗老化作用(シワ形成に対する予防又は改善作用)を有していた。
Claims (15)
- オ−トファジ−活性化作用を評価する工程を含む抗老化剤のスクリ−ニング方法であって、被験物質のオ−トファジ−活性化作用を測定し、当該活性化作用が高い場合には、抗老化作用が高いと判断することを特徴とする、抗老化剤のスクリ−ニング方法。
- 前記抗老化作用が、シワ形成に対する予防又は改善作用であることを特徴とする、請求項1に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法。
- 前記オ−トファジ−活性化作用が、オ−トファゴソ−ム形成後の細胞質成分の分解過程の活性化作用であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法。
- 前記オ−トファジ−活性化作用が、オ−トファゴソ−ムに局在する蛋白質LC3−ll(microtuble- associated protein 1 light chain 3−ll)量調節作用であることを特徴とする、請求項1〜3何れか1項に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法。
- 前記抗老化剤のスクリ−ニングに用いる細胞が、高齢者の皮膚線維芽細胞であることを特徴とする、請求項1〜4何れか1項に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法。
- オ−トファジ−活性化作用を評価する工程を含む抗老化剤のスクリ−ニング方法であって、被験物質を添加した高齢者の皮膚細胞にオ−トファジ−を介する細胞質成分の選択的な分解抑制作用を有する成分を添加し(非添加の細胞を対照とする)、当該細胞のLC3−ll蛋白質量を測定し、当該測定値よりオ−トファジ−活性化度合いを推定し、オ−トファジ−活性化度合いが高い場合には、抗老化作用が高いと判別することを特徴とする、抗老化剤のスクリ−ニング方法。
- 請求項1〜6何れか1項に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法により選択された抗老化剤を含有することを特徴とする、抗老化用組成物。
- シワ形成の予防又は改善用であることを特徴とする、請求項7に記載の抗老化用組成物。
- 皮膚外用剤であることを特徴とする、請求項7又は8に記載の抗老化用組成物。
- 化粧料(但し、医薬部外品を含む)であることを特徴とする、請求項7〜9何れか1項に記載の抗老化用組成物。
- 使用対象が高齢者であることを特徴とする、請求項7〜10何れか1項に記載の抗老化用組成物。
- 請求項1〜6の何れか1項に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法により抗老化用を有すると判断された成分を含有させることを特徴とする、抗老化用組成物の設計方法。
- 請求項1〜6に記載の抗老化剤のスクリ−ニング方法により選択される抗老化剤。
- 前記オ−トファジ−活性化作用を有する成分のスクリ−ニング方法により選択される抗老化剤が、ユキノシタ科アジサイ属アマチャより得られる植物抽出物、イチョウ科イチョウ属イチョウより得られる植物抽出物、シソ科タツミソウ属コガネバナより得られる植物抽出物、フフトモモ科テンニンカ属テンニンカより得られる植物抽出物、バラ科サクラ属サクラより得られる植物抽出物、ラン科の植物より得られる植物抽出物より選択される1種又は2種以上よりなることを特徴とする請求項13に記載の抗老化剤。
- ユキノシタ科アジサイ属アマチャより得られる植物抽出物、イチョウ科イチョウ属イチョウより得られる植物抽出物、シソ科タツミソウ属コガネバナより得られる植物抽出物、フフトモモ科テンニンカ属テンニンカより得られる植物抽出物、バラ科サクラ属サクラより得られる植物抽出物、ラン科の植物より得られる植物抽出物より選択される1種又は2種以上よりなることを特徴とする、オ−トファジ−活性化剤。
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