JP2014214139A

JP2014214139A - Ｎａｄｈ産生促進剤

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Publication number: JP2014214139A
Application number: JP2013094671A
Authority: JP
Inventors: 佳奈江田代; Kanae Tashiro; まゆみ宍戸; Mayumi Shishido; 五味　貴優; Takamasa Gomi; 貴優五味; 多田　明弘; Akihiro Tada; 明弘多田; 将三豊久; Shozo Toyohisa; 真奈北畠; Mana Kitahata
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc; Kilt Planning Office Inc
Current assignee: Pola Chemical Industries Inc; Kilt Planning Office Inc
Priority date: 2013-04-26
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2014-11-17

Abstract

【課題】皮膚外用剤として好適な、優れたＮＡＤＨ産生促進剤を提供することを課題とする。【解決手段】ユキノシタ科アジサイ属アマチャの抽出物を、ＮＡＤＨ産生促進剤の有効成分とする。【選択図】図４

Description

本発明は、ユキノシタ科アジサイ属アマチャの抽出物を含有するＮＡＤＨ産生促進剤、該ＮＡＤＨ産生促進剤を含有する抗シワ剤、肌色改善剤、及び該ＮＡＤＨ産生促進剤を含有する皮膚外用剤に関する。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(Nicotinamide adenine dinucleotide、ＮＡＤ)は生体内の酸化還元状態を調節する重要な物質で、酸化型（ＮＡＤ^＋）と還元型（ＮＡＤＨ）の２つの形で存在している。解糖系やクエン酸回路において糖や脂肪酸が酸化されるときに、共役的にＮＡＤ^＋からＮＡＤＨに変換される。ＮＡＤＨはミトコンドリア内膜に存在するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼによってＮＡＤ^＋に変換され、その酸化反応によって膜内外に生じたプロトン濃度勾配がＡＴＰ合成に利用される。即ち、ＮＡＤＨはエネルギー産生において非常に重要な役割を担っている物質である。

また、ＮＡＤＨは蛍光特性を有する物質であり、肌の反射光スペクトルを構成することが知られている（例えば非特許文献１）。なおＮＡＤＨの発する蛍光波長は４６０ｎｍである。

他方、オートファジーは、細胞が持っている、細胞内のタンパク質及び細胞小器官を分解するための仕組みの一つである。オートファジーの活性化はアポトーシス、ネクローシス等の細胞死の抑制、そして組織中の幹細胞の減衰の抑止などに繋がることが知られ、オートファジーを活性化する物質には、抗老化作用及び長寿化の作用があることが知られている（非特許文献２参照）。

またオートファジーは生体内に侵入した微生物などの病原菌を分解する作用もあり、生体を微生物の感染から守る免疫機構の一端を担っている（非特許文献２参照）。
さらにオートファジーは抗炎症作用も有していることが知られている（非特許文献２参照）。

オートファジーが関連する疾患としては、癌、神経障害疾患、感染症、免疫異常などが報告されている（非特許文献２参照）。また、オートファジー機能を調節することによりかかる疾患に対する治療効果を期待した医薬品、例えば、抗癌剤（特許文献７）、抗痴呆薬及び神経変性疾患治療薬（特許文献８）等の開発が進められている。

一方、ユキノシタ科アジサイ属アマチャのエキスには、これまでセラミド産生促進効果（例えば、特許文献１を参照）、アポトーシス抑制効果（例えば、特許文献２を参照）、α−グルコシダーゼ阻害効果（例えば、特許文献３を参照）、細胞賦活効果（例えば、特許文献４を参照）、インスリン様成長因子-１発現促進効果（例えば、特許文献５を参照）、腫瘍壊死因子-α産生抑制効果（例えば、特許文献６を参照）等があることが知られているが、ＮＡＤＨ産生促進作用があることは全く知られていなかった。

特開２０００−１６９３５９号公報特開２００２−８０３８２号公報特開２００５−１０４８９１号公報特開２０１１−２１９４０３号公報特開２００９−２５６２７０号公報特開２００４−２４４３９６号公報再表２００９−１１９６６２号公報再表２００６−１１８１９６号公報

Skin Res Technol. 2000 Aug;6(3):112-117. N Engl J Med. 2013 Feb 14;368(7):651-62.

ところで、近年、化粧料の分野においては、アンチエイジングをテーマとした化粧料の開発が活発に行われており、新たな有効成分の探索も積極的に行われている。
本発明は、この様な状況下為されたものであり、新規なＮＡＤＨ産生促進剤、肌色改善剤、抗シワ剤を提供することを課題とする。特に、本発明は、新規な肌色改善用の皮膚外用剤、抗シワ用の皮膚外用剤を提供することを課題とする。

この様な状況に鑑みて、本発明者らは、ＮＡＤＨ産生促進作用を担う植物抽出物を求めて、鋭意努力を重ねた結果、ユキノシタ科アジサイ属アマチャの抽出物（以下、「アマチャの抽出物」という場合がある。）が、ＮＡＤＨ産生促進作用を有することを見出し、発明を完成させるに至った。
また、本発明者らは、ＮＡＤＨ量の増大と抗シワや肌色の改善との関係を考察し、アマチャの抽出物が抗シワ作用や肌色改善作用を有することを見出し、発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は以下に示すとおりである。
＜１＞ユキノシタ科アジサイ属アマチャの抽出物を含有することを特徴とするＮＡＤＨ産生促進剤。
＜２＞＜１＞に記載のＮＡＤＨ産生促進剤を含有することを特徴とする、抗シワ剤。
＜３＞＜１＞に記載のＮＡＤＨ産生促進剤を含有することを特徴とする、肌色改善剤。
＜４＞＜１＞に記載のＮＡＤＨ産生促進剤を含有する抗シワ用の皮膚外用剤。
＜５＞＜１＞に記載のＮＡＤＨ産生促進剤を含有する肌色改善用の皮膚外用剤。
＜６＞化粧料であることを特徴とする、＜４＞又は＜５＞に記載の皮膚外用剤。

本発明によれば、新規なＮＡＤＨ産生促進剤、肌色改善剤、抗シワ剤を提供することができる。
本発明のＮＡＤＨ産生促進剤は、優れた抗シワ効果、肌色改善効果を有するものである。従って、本発明によれば、新規な肌色改善用の皮膚外用剤、抗シワ用の皮膚外用剤を提供することができる。

各年齢由来の真皮線維芽細胞におけるオートファジー状態を表すグラフである。オートファジー状態に対するアマチャの抽出物の影響を表すグラフである。オートファジー状態とＮＡＤＨ産生量の関連を示すグラフである。オートファジー停滞下で、ＮＡＤＨ産生量に対するアマチャの抽出物の影響を表すグラフである。アマチャの抽出物を含む化粧料が腕の肌の明度に与える影響を表すグラフである。アマチャの抽出物を含む化粧料が腕の４６０ｎｍにおける皮膚反射光強度に与える影響を表すグラフである。アマチャの抽出物を含む化粧料が顔の肌の明度に与える影響を表すグラフである。

本発明のＮＡＤＨ産生促進剤は、ユキノシタ科アジサイ属アマチャの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。ここで、アマチャの抽出物とは、アマチャの抽出物自体、アマチャの抽出物を分画、精製した分画、アマチャの抽出物又は分画・精製物の溶媒除去物の総称を意味する。ユキノシタ科アジサイ属アマチャは、日本、中国等原産の落葉小低木であり、本州、四国、九州等の日本全国で生育し、甘味飲料や加工食品の甘味原料として使用されている。本発明のアマチャの抽出物は、日本において、自生又は生育された植物、漢方生薬原料等として販売される日本産のものを用いて抽出物を作製することもできるし、丸善製薬株式会社等より販売されている市販の抽出物を購入し使用することもできる。

前記植物より得られる植物抽出物の作製に用いる植物の部位は、特段限定されない。植物抽出物の作製には、全草を用いることができるが、勿論、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾、果実等の部位のみを使用することもできる。前記植物の抽出に際しては、植物体等の抽出に用いる部位は、予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出物製造においては、植物体等の抽出に用いる部位又はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬する。浸漬後は、室温まで冷却し、所望により不溶物を除去した後、溶媒を減圧濃縮する等により除去することができる。しかる後、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィー等で分画精製し、該抽出物を得ることができる。

前記抽出溶媒としては、極性溶媒が好適に例示でき、より好ましくは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール等のアルコール類、１，３−ブチレングリコール、ポリプロピレングリコール等の多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ヘキサン、ペンタン等の炭化水素類等から選択される１種又は２種以上が好適に例示でき、さらに好ましくは、エタノール、含水エタノール、１，３−ブチレングリコール、含水１，３−ブチレングリコールが好適に例示でき、抽出効率の点からは、５０〜９５％（溶量）含水エタノール、より好ましくは、５０〜７５％（溶量）含水エタノール、１，３−ブチレングリコールが好ましく例示できる。

＜製造例：本発明のアマチャの抽出物の製造方法＞
本発明のＮＡＤＨ産生促進作用を有するアマチャの抽出物を以下の手順に従い製造した。ユキノシタ科アジサイ属アマチャの葉部及び枝先部の粗砕物１００ｇを６０％（容量）エタノール溶媒４０００Ｌに投入し、穏やかに攪拌しながら３時間、７０℃に保った後、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下にて濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥し、固形分の植物抽出物を得た。

本発明のＮＡＤＨ産生促進剤における、アマチャの抽出物の好ましい含有量は、固形分として、７０質量％以上、より好ましくは、８０質量％以上であり、さらに好ましくは、９０質量％以上である。

本発明のＮＡＤＨ産生促進剤は、生体内においてＮＡＤＨの産生を促進する目的で、医薬や化粧料として提供される皮膚外用剤、食品、飲料等の成分として使用することができる。
本発明のＮＡＤＨ産生促進剤は、皮膚、特に真皮のＮＡＤＨ産生促進作用を高める目的で使用するのに好適であり、この点から、好ましくは皮膚外用剤の成分として使用することができる。

上述した通り、ＮＡＤＨはエネルギー産生において非常に重要な役割を担っていることから、ＮＡＤＨの産生を促進することにより、皮膚における真皮線維芽細胞等の代謝が活性化することが知られている。従って、本発明者らは、前記ＮＡＤＨ産生促進剤は、シワ形成に対する予防又は改善の作用を有すると推測し、前記ＮＡＤＨ産生促進剤に抗シワ作用があることを実証した（後述する実施例を参照）。
すなわち、本発明の一つは、前記ＮＡＤＨ産生促進剤を含有する抗シワ剤である。
また、本発明の抗シワ剤は、皮膚外用剤の形態として用いることが好ましい。すなわち、本発明の好ましい形態は、前記ＮＡＤＨ産生促進剤を含有する、抗シワ用の皮膚外用剤である。

また、上述した通り、ＮＡＤＨは蛍光特性を有する物質であり、肌の反射光スペクトルを構成することが知られている。従って、本発明者らは、皮膚のＮＡＤＨ量が増大することにより、肌の反射光の強度が増大し、肌の明度（Ｌ＊値）が増大すると推測した。
そして、本発明者らは、アマチャの抽出物がＮＡＤＨ量の増加に伴う皮膚反射光強度を高め、また肌の明度を増大させることを、実証した（後述する実施例を参照）。
すなわち、本発明の一つは、前記ＮＡＤＨ産生促進剤を含有する肌色改善剤である。
また、本発明の肌色改善剤は、皮膚外用剤の形態として用いることが好ましい。すなわち、本発明の好ましい形態は、前記ＮＡＤＨ産生促進剤を含有する肌色改善用の皮膚外用剤である。

本発明の抗シワ剤、肌色改善剤におけるＮＡＤＨ産生促進剤の含有量の好ましい含有量は、アマチャの抽出物の固形分として、０．０００１質量％〜１質量％、より好ましくは、０．００１質量％〜０．１質量％であり、さらに好ましくは、０．００５質量％〜０．０５質量％である。これは、あまり濃すぎると効果が頭打ちになる場合があり、少なすぎると有効濃度とならない場合があるからである。
本発明の皮膚外用剤におけるＮＡＤＨ産生促進剤の含有量は、アマチャの抽出物の固形分として、０．０００１質量％〜１質量％、より好ましくは、０．００１質量％〜０．１質量％であり、さらに好ましくは、０．００５質量％〜０．０５質量％である。これは、あまり濃すぎると効果が頭打ちになる場合があり、少なすぎると有効濃度とならない場合があるからである。

皮膚外用剤の形態としては、化粧料が好ましく採用される。化粧料の形態には特段の限定はなく、例えば、エッセンス、乳液、クリーム等の基礎化粧料、アンダーメークアップ、ファンデーション、チークカラー、マスカラ、アイライナー等のメークアップ化粧料、ヘアクリーム等の毛髪化粧料等が好適に例示できる。

本発明のＮＡＤＨ産生促進剤を化粧料に含有せしめる場合、化粧料で通常使用されている任意成分を本発明の効果を損なわない範囲において、含有することができる。

このような任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボカド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類、オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類、セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール等、イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン、アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、ポリグリセリン脂肪酸エステル類、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等の多価アルコール類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類、グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸，ローカストビーンガム，サクシノグルカン、カロニン酸、キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール等の増粘剤、表面を処理されていても良い、マイカ、シリカ、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類、表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２'−ヒドロキシ−５'−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４'−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ₆塩酸塩、ビタミンＢ₆トリパルミテート、ビタミンＢ₆ジオクタノエート、ビタミンＢ₂又はその誘導体、ビタミンＢ₁₂、ビタミンＢ₁₅又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類等、フェノキシエタノール等の抗菌剤等が好ましく例示できる。

また、本発明者らは、アマチャの抽出物がオートファジー活性化能を有することを見出した（後述する試験例２参照）。
また、上述した通り、生体内のオートファジーを活性化させることで、抗老化作用、長寿化作用、自然免疫の強化作用、抗炎症作用、そして凝集したタンパク質の分解作用が得られることが知られている。
従って、アマチャの抽出物を含む本発明のＮＡＤＨ産生促進剤は、オートファジーが関連する疾患を治療する目的で使用することができる。例えば、上記アマチャの抽出物は、抗老化、長寿化、自然免疫の強化、抗炎症、そして凝集したタンパク質の蓄積を原因とする疾患の予防又は治療を目的とする成分として使用することができる。
より具体的には、癌、神経障害疾患、感染症、免疫異常等の治療の目的で、アマチャの抽出物を使用することができる。神経障害疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病等が挙げられる。

以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、かかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。

＜試験例１：若年者及び高齢者由来の培養ヒト皮膚線維芽細胞におけるオートファジー状態測定試験＞
２３歳、２７歳、６３歳、６８歳、７０歳の女性腹部皮膚由来線維芽細胞１．５×１０^５cellsを含む２mLの培地を６穴プレートの各ウェルに添加し、細胞播種した。２日間培養した後、クロロキンニリン酸（CQ）を最終濃度５０μMになるように添加し、４時間インキュベート後、細胞を回収した。ウェスタンブロットによりLC３-II及びβ-actin蛋白質を検出し、Image-Jを用いバンドの定量解析を行った。測定値を以下の式に当てはめ、autophagic vacuole分解度を算出した。この値が低いほどオートファジーが停滞していると言える。結果を図１に示す。

（数１）
autophagic vacuole分解度＝（CQ添加群の（LC３-II/β-actin）） / （CQ非添加群の（LC３-II/β-actin））

図１の試験結果より、高齢者由来の線維芽細胞では若齢者由来の線維芽細胞と比較して、autophagic vacuole分解度が低値を示し、オートファジーが停滞していることが確認された。

＜試験例２：本発明のアマチャの抽出物のオートファジー活性化測定試験＞
試験例１で、高齢者由来の線維芽細胞ではオートファジーが停滞していることが分かったので、高齢者由来の線維芽細胞を用いてアマチャの抽出物のオートファジーに対する影響を調べた。即ち、７０歳女性腹部皮膚由来の線維芽細胞を１．０×１０^５cellsを含む２mLの培地を６穴プレートの各ウェルに添加し、細胞播種した。播種翌日、被験物質（製造例に記載のアマチャの抽出物を５５％
エタノールで希釈したもの）又は５５％エタノール（溶媒コントロール）を添加した。２日間培養した後、クロロキンニリン酸（CQ）を最終濃度５０μMになるように添加し、４時間インキュベート後、細胞を回収した。以下、試験例１と同様にして、autophagic vacuole分解度を算出した。結果を図２に示す。

図２の試験結果より、本発明のアマチャの抽出物は、autophagic vacuole分解度が高値を示し、優れたオートファジー改善作用を有することが確認された。

＜試験例３：オートファジーとＮＡＤＨの関連性確認試験＞
２３歳女性腹部皮膚由来線維芽細胞を６ well plateに１．０×１０^５cells/well播種し、一晩培養した。培養後、オートファジーを停滞させる作用を有することが知られているリソソーム酵素阻害剤LeupeptinとPepstatin（文献１：ＢｏｌａｎｄＢ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５，３７４１５−３７４２６，２０１０を参照）を各１００μM、又はＤＭＳＯ（溶媒コントロ−ル）を添加し、２４時間後の細胞を回収し、細胞中のＮＡＤＨ産生量を、ＮＡＤ/ＮＡＤＨ assay kit（abcam社製）を用いて測定した。ＮＡＤＨ産生量は、Leupeptin・Pepstatin添加時のＮＡＤＨ産生量の、コントロ−ル群のＮＡＤＨ産生量に対する比率として表示した。結果を図３に示す。

図３の結果より、Leupeptin・Pepstatin添加によりオートファジーが停滞した線維芽細胞では、ＮＡＤＨ産生量の低下が認められた。

＜試験例４：本発明のアマチャの抽出物によるＮＡＤＨ産生量の影響測定試験＞
７０歳女性腹部皮膚由来の線維芽細胞を６ well plateに１．０×１０^５cells/well播種し、一晩培養した。培養後、被験物質（製造例に記載のアマチャの抽出物を５５％エタノールで希釈したもの）又は５５％エタノール（溶媒コントロ−ル）を添加し、２４時間後の細胞を回収し、細胞中のＮＡＤＨ産生量を、試験例３と同様にして、ＮＡＤ/ＮＡＤＨassay kit（abcam社製）を用いて測定した。結果を図４に示す。

図４の結果より、本発明のアマチャの抽出物には、線維芽細胞におけるＮＡＤＨ産生促進作用が認められた。

＜実施例１：本発明の皮膚外用剤＞
以下の表１に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である化粧料１を作製した。又、本発明のアマチャの抽出物を水に置換した比較例１を作製した。

＜試験例５：本発明の皮膚外用剤のシワ改善効果の検討＞
実施例１に記載の方法に従い作製された化粧料１及び比較例１を用い、以下の方法に従いシワ改善効果を調べた。即ち、目尻のシワが気になるパネラー８名（女性、年齢層４０〜６０歳）を４名ずつ２群に分け、それぞれ化粧料１、比較例１を渡し、１日朝晩２回、連日８週間使用してもらい、試験の前後の目尻のレプリカの比較からシワ改善効果を調べた。レプリカは、光を透過させない白色のものを用い、これに皮膚表面形態をうつしとり、このレプリカを実体顕微鏡の標本台に固定し、４５度の角度で光を照射し、レプリカを回転させて、皮溝の陰影が強く観察される方向の陰影画像（１×１ｃｍ²）を画像解析装置に取り込んだ。この画像はシワの凹凸に従って、シワの深いところは輝度が低く、シワのないところは輝度が高く、陰影を形成する。陰影画像における輝度の分布を求め、輝度のメジアン値を境に、メジアン値以上の輝度の輝点は最大輝度に、メジアン値未満の輝度の輝点は輝度０に変換して、二値化を行い、陰影部分（輝度０の部分）の面積率を求めた。（試験前の陰影の面積率−試験後の陰影の面積率）／（試験前の陰影の面積率）×１００でシワ改善度（％）を求めた。結果を各群４名の平均値±標準偏差として表２に示す。表２の結果より、本発明の化粧料１は、優れたシワ改善作用を有することがわかる。

＜試験例６：本発明の皮膚外用剤の腕の肌色改善効果の検討＞
パネラー（２０名）の前腕内側部に、試験初日（１日目）に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの試験部位を設け、試験部位の明度（Ｌ＊値）と４６０ｎｍにおける皮膚反射光強度を分光測色計（ＣＭ−２６００ｄ、コニカミノルタ株式会社）にて測定した。試験初日に皮膚明度及び４６０ｎｍにおける皮膚反射光強度を測定した後、１日２回、毎日試験部位に本発明の化粧料１を５０μＬ塗布し、１ヶ月後に改めて明度及び４６０ｎｍにおける皮膚反射光強度を測定した。明度の測定結果は図５に、４６０ｎｍにおける皮膚反射光強度の測定結果は図６に示す。ここで、４６０ｎｍの波長は、ＮＡＤＨの発する蛍光波長である。

図５の結果より、アマチャの抽出物には、腕の皮膚の明度を向上させる効果があることが認められた。

また、図６の結果より、アマチャの抽出物には、腕の４６０ｎｍにおける皮膚反射光強度を増加する効果があることが認められた。すなわち、アマチャ抽出物により皮膚細胞中のＮＡＤＨ産生量が増加していることが認められた。

＜試験例７：本発明の皮膚外用剤の顔の肌色改善効果の検討＞
試験初日にパネラー（１６名）の頬部の皮膚明度を測定した後、１日２回、毎日全顔に本発明の化粧料１を塗布させ、１ヶ月後に改めて明度を測定した。結果を図７に示す。

図７の結果より、アマチャの抽出物には、顔の皮膚の明度を向上させる効果があることが認められた。

試験例６、７の結果から、アマチャの抽出物は、肌色を改善する効果を有することが分かった。

Claims

ユキノシタ科アジサイ属アマチャの抽出物を含有することを特徴とするＮＡＤＨ産生促進剤。
請求項１に記載のＮＡＤＨ産生促進剤を含有することを特徴とする、抗シワ剤。
請求項１に記載のＮＡＤＨ産生促進剤を含有することを特徴とする、肌色改善剤。
請求項１に記載のＮＡＤＨ産生促進剤を含有する肌色改善用の皮膚外用剤。
請求項１に記載のＮＡＤＨ産生促進剤を含有する抗シワ用の皮膚外用剤。
化粧料であることを特徴とする、請求項４又は請求項５に記載の皮膚外用剤。