JP2015172017A - 不知火菊抽出物を含む抗皮膚老化剤 - Google Patents

Abstract

【課題】抗皮膚老化剤の提供。
【解決手段】不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する抗皮膚老化剤、並びにそれを含む化粧料及び医薬。
【選択図】なし

Description

本発明は、不知火菊抽出物を含む抗皮膚老化剤に関する。

皮膚において、加齢、太陽光（紫外線）、乾燥、酸化、糖化等の各種要因により、張りや弾力性が低下し、シワやたるみが発生する等の様々な皮膚症状が生じることはよく知られている。これらの皮膚症状は皮膚の老化現象とされている。このような皮膚老化現象は、真皮中の細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンやエラスチンの減少や変性が大きな原因の１つと考えられている。例えば、加齢により皮膚細胞の生理機能が低下し、コラーゲンやエラスチンの減少・変性やそれによる細胞外マトリックスの機能低下が生じることで、皮膚の老化が引き起こされる。一方、慢性の紫外線傷害である光老化は、肌が紫外線に暴露されることで皮膚内に生じた活性酸素によってマトリックスメタロプロテアーゼの活性が亢進し、皮膚に存在するコラーゲン、エラスチン等を変性させ、皮膚のたるみ、しわなどを生じるものとされている。近年では、皮膚において紫外線などの様々な要因によりコラーゲンやエラスチンの糖化が起こり、この糖化コラーゲンや糖化エラスチンの存在により真皮中の細胞外マトリックスの機能が低下し、皮膚老化が引き起こされることも知られるようになっている。このため、皮膚老化の予防や改善のために、皮膚のコラーゲンやエラスチンの減少や変性に対する対策が重要な課題となっている。

コラゲナーゼ阻害活性、エラスターゼ阻害活性、抗酸化活性は皮膚老化防止に特に関連が深い因子とされている。コラゲナーゼやエラスターゼは細胞外マトリックスを破壊する酵素群（マトリックスメタロプロテアーゼ）の一つである。

コラゲナーゼ阻害活性を有する生薬としては、例えばユキノシタ科ベルゲニア・リグラータの根茎の溶媒抽出物（特許文献１参照）、松樹皮抽出物（特許文献２参照）などが報告されている。また、エラスターゼ阻害活性を有する生薬としては、例えば、セイヨウトニコの抽出物（特許文献３参照）、ホホバ葉抽出物（特許文献４参照）などが報告されている。さらに抗酸化活性を有する生薬としては、例えばキク科トウヒレン属植物の粉末及び／又は抽出物（特許文献５参照）などが報告されている。しかし、これらの生薬の抗皮膚老化効果は十分なものではない。そこで、ヒトの肌に対する安全性の面から、天然物由来であり、かつ低濃度で利用可能であるようにコラゲナーゼ阻害活性、エラスターゼ阻害活性、抗酸化活性等の皮膚老化防止効果を強く有するさらなる生薬が求められている。

不知火菊（シラヌイギク；Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）は、キク科植物の一種であり、熊本県宇城市不知火町の一部で栽培されている品種である。不知火菊は形態的に既存のキク科植物と異なっており、新種として認定されている。不知火菊の一般的な形態としては、必ずしも以下に限定されるものではないが、茎は約50〜100cmでやや木質となり、葉は深緑色で互生し葉柄があり、葉身は卵円形で普通は5つに羽裂し、裂片にはきょ歯があり、長さ3〜6cm、幅2.5〜5cmである。不知火菊は11月中旬〜12月上旬に径2.5〜3.5cmの白い頭花をほぼ散房状につけることが知られている。

不知火菊の花弁の乾燥物を水や日本酒で煎じたものは、民間伝承薬として、癌や糖尿病への効果を期待して古くから利用されてきた。また不知火菊の花弁抽出物や葉抽出物のヒトにおける効能については、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の産生促進効果（非特許文献１）や、ヒスタミン放出抑制効果（非特許文献２）などが報告されている。しかしながら、不知火菊抽出物の他の効能はまだ十分知られていない。

特開２００４−３１５４９２号公報 特開２００３−２３８４２６号公報 特開平１１−１４７８３２号公報 特開２００３−４８８１２号公報 特開２００４−１５５９６１号公報

児林ら、「不知火姫菊抽出液のTNF-α産生促進効果」、日本食品科学工学会誌、日本食品科学工学会、２００６年８月、５３巻、８号、４３０頁 山田ら、「不知火姫菊の花弁および葉抽出液のヒスタミン放出抑制効果」、日本食品科学工学会誌、日本食品科学工学会、２０１２年８月、５９巻、８号、３９４頁

本発明は、抗皮膚老化剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、不知火菊抽出物が皮膚老化の防止又は改善に寄与する優れた抗皮膚老化作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、抗皮膚老化剤。
［２］皮膚老化防止用の、上記［１］に記載の抗皮膚老化剤。
［３］コラゲナーゼ阻害作用、エラスターゼ阻害作用、抗酸化作用、及び抗糖化作用からなる群より選択される少なくとも１つに基づく皮膚老化防止用である上記［２］に記載の抗皮膚老化剤。
［４］皮膚老化改善用の、上記［１］に記載の抗皮膚老化剤。
［５］コラーゲン産生促進作用及びエラスチン産生促進作用のうち少なくとも１つに基づく皮膚老化改善用である、上記［４］に記載の抗皮膚老化剤。
［６］皮膚外用剤である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の抗皮膚老化剤。
［７］不知火菊抽出物がアルコール抽出物又は水抽出物である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の抗皮膚老化剤。
［８］不知火菊抽出物が不知火菊の地上部又は全草の抽出物である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の抗皮膚老化剤。
［９］不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、コラゲナーゼ阻害剤。
［１０］不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、エラスターゼ阻害剤。
［１１］不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、抗酸化剤。
［１２］不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、抗糖化剤。
［１３］不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、コラーゲン産生促進剤。
［１４］不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、エラスチン産生促進剤。
［１５］上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の剤を含む、化粧料。
［１６］上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の剤を含む、医薬。

本発明に係る抗皮膚老化剤は、皮膚老化の防止及び改善に寄与する優れた抗皮膚老化作用をもたらすことができる。

図１は、不知火菊の外観を示す写真である。 図２は、不知火菊抽出物のコラゲナーゼ活性阻害作用を示す図である。 図３は、不知火菊抽出物のエラスターゼ活性阻害作用を示す図である。 図４は、不知火菊抽出物の抗酸化作用を示す図である。三角は地上部抽出物、ひし形は全草抽出物、四角は茶抽出物を示す。 図５は、不知火菊抽出物の抗糖化作用を示す図である。 図６は、不知火菊抽出物のコラーゲン産生促進作用を示す図である。 図７は、不知火菊抽出物のエラスチン産生促進作用を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、不知火菊抽出物を有効成分として含有する、抗皮膚老化剤に関する。
上記抽出物の原料である不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）は、熊本県宇城市不知火町の一部で栽培されているキク科植物の一種であり、シマカンギク種Chrysanthemum indicamとヒメジョオンErigeron annuusとの２種のキク科植物の属間雑種である。不知火菊は、不知火姫菊、又は大見菊とも呼ばれている。不知火菊の外観の一例として写真を図１に示す。不知火菊は上記栽培地では一般的に秋に開花する。

本発明で用いる不知火菊抽出物は、不知火菊の全草の抽出物であってもよいし、不知火菊の一部、例えば、地上部、花（蕾を包含する）、花弁、葉、茎等、及びそれらの任意の組み合わせの抽出物であってもよいが、花若しくは花弁又は葉を含む不知火菊の一部又は全草の抽出物が好ましく、不知火菊の地上部又は全草の抽出物がより好ましく、不知火菊の地上部の抽出物が特に好ましい。不知火菊の地上部は、花又は花弁、並びに葉及び茎を含む。不知火菊の地上部は、おしべ、めしべ、がく、種子等をさらに含んでもよい。不知火菊の全草とは、不知火菊の地上部と地下部（主として根）とを含む植物体全体を指す。不知火菊の全草は、花又は花弁、並びに葉、茎及び根を含む。

不知火菊抽出物は、任意の抽出技術によって得られた抽出物であってよいが、好ましくはアルコール抽出物又は水抽出物である。本発明においてアルコール抽出物とは、不知火菊から無水アルコール又はアルコール水溶液を用いて得られた抽出物を意味する。本発明において水抽出物とは、不知火菊から水（限定するものではないが、例えば、冷水、常温水、温水又は熱水）又は緩衝液を用いて得られた抽出物を意味する。

不知火菊抽出物は、不知火菊の全草又は一部（例えば、地上部、花等）を抽出溶媒に浸漬し、抽出溶媒に植物成分を溶出させることにより、得ることができる。不知火菊の全草又は一部は、採取したものをそのまま抽出に用いてもよいし、抽出処理に適した加工、例えば乾燥、適当なサイズへの切断又は破砕等を行った後に抽出に用いてもよい。抽出効率の面では、不知火菊の全草又は一部は、乾燥及び粉砕後に抽出処理を行うことが好ましい。抽出溶媒としては、アルコール、水、緩衝液、希酸、及び希アルカリ、並びにそれらの任意の組み合わせ又は混合溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。アルコール抽出物の場合、抽出溶媒としてはアルコール（無水アルコール）又はアルコール水溶液（アルコールと水の混合溶媒）を用いることができる。アルコールは、一価アルコールであっても、多価アルコールであってもよい。具体的には一価アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ベンジルアルコール等が挙げられる。多価アルコールとしては、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール等が挙げられる。抽出溶媒としてアルコール水溶液を用いる場合には、アルコール濃度を５０％以下、例えば１０〜４０％とすることも好ましい。例えば、１０〜４０％濃度のエタノール水溶液、１０〜４０％濃度の１，３−ブチレングリコール水溶液等も好適に用いることができる。無水エタノール及び１，３−ブチレングリコール（無水）も、抽出溶媒として特に好適である。

例えば、不知火菊の１重量部（乾燥重量）に対し、好ましくは１〜２００重量部、より好ましくは２〜１００重量部、さらに好ましくは５〜１００重量部、例えば５〜５０重量部の抽出溶媒を加え、不知火菊を抽出溶媒に一定時間浸漬することにより抽出を行うことができるが、この方法に限定されない。抽出溶媒での抽出温度及び抽出時間は、当業者であれば抽出溶媒の種類や量等を考慮して適宜調節することができる。抽出温度（抽出溶媒の温度）は、限定するものではないが、通常は０℃超〜加圧下での沸点であり、好ましくは室温（１５〜３０℃）〜加圧下での沸点、より好ましくは２０℃〜１００℃、例えば５０℃〜７０℃であり得る。抽出時間（抽出溶媒に浸漬する時間）は抽出溶媒の種類や抽出温度により変動するが、通常は３０分間〜４週間、好ましくは１時間〜２週間、より好ましくは３時間〜５日間、例えば１０時間〜４８時間であり得る。好適例としては、水抽出の場合、抽出温度２０〜７０℃、例えば６０℃で抽出時間を、例えば１時間〜２週間、好ましくは１０時間〜４８時間とすることができる。また、無水エタノール又は濃度１０〜４０％のエタノール水溶液（含水エタノール）を用いたアルコール抽出の場合、抽出温度２０〜７０℃、例えば６０℃で抽出時間を、例えば１時間〜２週間、好ましくは１０時間〜４８時間とすることができる。さらに１，３−ブチレングリコール（無水）又は濃度１０〜４０％の１，３−ブチレングリコール水溶液を用いたアルコール抽出の場合、抽出温度２０〜１００℃、例えば６０℃で抽出時間を、例えば１時間〜２週間、好ましくは１０時間〜４８時間とすることができる。

このようにして抽出された不知火菊成分を含む抽出液は、そのまま不知火菊抽出物として用いてもよいが、その抗皮膚老化効果に大きな影響を及ぼさない範囲で、抽出物に一般的に適用され得る通常の処理を施してもよい。例えば、抽出された不知火菊成分を含む抽出液について、遠心分離して沈殿物を濾過する等の周知の精製法による精製を行ってもよいし、活性炭カラム濾過等による脱臭及び脱色のための精製処理などを行ってもよい。また、抽出された不知火菊成分を含む抽出液について、常法により、濃縮処理、希釈処理又は溶媒交換処理をおこなってもよい。抽出された不知火菊成分を含む抽出液やその処理物を、スプレードライ法等の熱乾燥法、凍結乾燥法を始めとする任意の乾燥技術により乾燥させて、乾燥物としてもよい。本発明では、このような抽出された不知火菊成分を含む抽出液やその処理物（例えば、真空凍結乾燥物を始めとする凍結乾燥物などの乾燥物、精製物、濃縮物、希釈物、抽出溶媒以外の溶媒中への溶液、又はそれらの組み合わせ等）を、不知火菊抽出物と総称する。

こうして得られる不知火菊抽出物は、後述の実施例で示すとおり、高いコラゲナーゼ阻害活性、高いエラスターゼ阻害活性、高い抗酸化活性、高い抗糖化活性、高いコラーゲン産生促進活性、高いエラスチン産生促進活性を示す。これらの活性は、いずれも抗皮膚老化活性として知られている。したがって本発明に係る不知火菊抽出物は、抗皮膚老化剤として用いることができる。すなわち本発明は、本発明に係る不知火菊抽出物を有効成分として含有する、抗皮膚老化剤を提供する。ここで「抗皮膚老化」とは、皮膚老化、特に皮膚の細胞外マトリックスの劣化を防止又は改善する効果を意味する。

本発明に係る不知火菊抽出物の、コラゲナーゼ阻害活性、エラスターゼ阻害活性、抗酸化活性、抗糖化活性、コラーゲン産生促進活性、及びエラスチン産生促進活性は、常法により測定し、評価することができる。具体的には、後述の実施例に記載されているようにしてそれぞれの活性を測定し、評価することができる。

特にコラゲナーゼ阻害活性、エラスターゼ阻害活性、及び抗酸化活性の増強は、皮膚老化防止、とりわけ光老化防止に有効である。光老化を防止するには、紫外線曝露により生成する活性酸素の消去、及び活性酸素により活性亢進するマトリックスメタロプロテアーゼ（特にコラゲナーゼやエラスターゼ）の阻害が重要とされている。そのため、活性酸素を消去する抗酸化剤及びマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は有効な皮膚老化防止剤、特に皮膚の光老化防止剤として利用することができる。

また、生体内糖化反応では、還元糖がタンパク質と結合することで、タンパク糖化最終生成物（AGEs；Advanced Glycation End Products）が生じる。皮膚において、AGEsである糖化コラーゲンは組織に沈着し、皮膚の弾力性を弱め、シワ形成に関与する。このAGEs蓄積による皮膚劣化は紫外線により増強される。したがってAGEsの生成・蓄積を抑制する抗糖化剤は、有効な皮膚老化防止剤、特に皮膚の光老化防止剤として利用することができる。

すなわち本発明に係る不知火菊抽出物は、コラゲナーゼ阻害作用、エラスターゼ阻害作用、抗酸化作用、及び抗糖化作用をもたらす用途に有効に用いることができ、特に、それらの作用に基づく皮膚老化防止用、特に皮膚の光老化防止用に有効に用いることができる。本発明は、本発明に係る不知火菊抽出物を有効成分として含有する、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、及び抗糖化剤、並びに皮膚老化防止用の抗皮膚老化剤を提供する。本発明に係るコラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、及び抗糖化剤は、生体内の皮膚又は皮膚細胞（例えば皮膚線維芽細胞）を作用対象として用いてもよいし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで皮膚細胞（例えば皮膚線維芽細胞）を作用対象として用いてもよいし、皮膚細胞（例えば皮膚線維芽細胞）以外の細胞（例えば皮膚以外の組織又は臓器（肺など）の線維芽細胞）又は酵素（コラゲナーゼ、エラスターゼ）やラジカル等の非細胞物質を作用対象として用いてもよい。

本発明において「皮膚老化防止」とは、皮膚に存在するコラーゲン、エラスチンの減少及び／又は変性を抑制することにより、皮膚の細胞外マトリックスの劣化を防止することを意味する。コラーゲン、エラスチンの減少や変性の抑制は、皮膚の細胞外マトリックスの劣化を防止することにより、皮膚の張りや弾力性の低下、シワ、たるみなどの皮膚老化現象の発生を抑制することができる。

一方、加齢や紫外線等の要因により細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンやエラスチンは減少及び変性し、細胞外マトリックスの機能や量が低下し、皮膚の老化が生じる。皮膚を正常な状態に維持するためには、細胞外マトリックスにコラーゲンやエラスチンを補うことが重要である。コラーゲン産生促進剤やエラスチン産生促進剤は、細胞によるコラーゲン、エラスチンの産生を増強し、皮膚のコラーゲン、エラスチンの量を増加させることができ、それにより細胞外マトリックスを活性化できることから、皮膚老化改善剤として利用することができる。

すなわち本発明に係る不知火菊抽出物は、コラーゲン産生促進作用、及びエラスターゼ産生促進作用をもたらす用途に有効に用いることができ、特に、それらの作用に基づく皮膚老化改善用に有効に用いることができる。本発明は、本発明に係る不知火菊抽出物を有効成分として含有する、コラーゲン産生促進剤、及びエラスターゼ産生促進剤、並びに皮膚老化改善用の抗皮膚老化剤も提供する。本発明において「皮膚老化改善」とは、皮膚の非変性コラーゲンや非変性エラスチンの量を増加させることにより、細胞外マトリックスの劣化（皮膚老化状態）を改善することを意味する。コラーゲンやエラスチン量の増加は、皮膚の細胞外マトリックスの構成成分を補うことでその機能を活性化し、細胞外マトリックスの劣化（皮膚老化状態）を改善することにより、皮膚の張りや弾力性の低下、シワ、たるみなどの改善につながる。

本発明に係る抗皮膚老化剤、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、抗糖化剤、コラーゲン産生促進剤、及びエラスターゼ産生促進剤は、経口又は非経口的に用いてもよいが、特に皮膚外用剤として有利に用いることができる。

本発明に係る不知火菊抽出物、又はそれを含む抗皮膚老化剤、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、抗糖化剤、コラーゲン産生促進剤、若しくはエラスターゼ産生促進剤は、化粧料に配合して用いることができる。すなわち本発明は、本発明に係る不知火菊抽出物、又はそれを含む抗皮膚老化剤、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、抗糖化剤、コラーゲン産生促進剤、若しくはエラスターゼ産生促進剤を含む化粧料も提供する。このような本発明に係る化粧料は、皮膚に適用することにより、それぞれの抗皮膚老化効果を発揮することができる。

本発明に係る化粧料は、溶液状、懸濁液状、乳化状、粉末状、ペースト状、ムース状、ジェル状の任意の形態の組成物であってよい。本発明に係る化粧料は、皮膚に接触して使用され得る任意の化粧料であってよく、具体的には、例えば、化粧水、乳液、美容液、一般クリーム（フェイスクリーム、ハンドクリーム、ボディクリーム等）、洗顔料（クレンジングクリーム等）、パック、髭剃り用クリーム、日焼けクリーム、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼けローション、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、パウダー、口紅、リップクリーム、アイライナー、アイクリーム、アイシャドウ、マスカラ、浴用化粧品、シャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアパック、スカルプケア剤、ボディリンス、ボディジェル、制汗消臭剤、染毛料、頭髪用化粧品等が挙げられる。配合量は、化粧料の組成物中、本発明に係る不知火菊抽出物の乾燥重量で０．０００１〜１００％、好ましくは０．００１〜１０％の濃度とすることができる。不知火菊抽出物は、本発明に係る化粧料に任意の形態で配合することができ、例えば、液状、ゲル状、粉末状、顆粒状、カプセル封入体等の形態で配合することができる。

本発明に係る化粧料には、不知火菊抽出物に加えて、化粧料に配合され得る任意の他の成分を配合することができる。他の成分としては、化粧料において用いられる添加剤、賦形剤、及び他の活性成分（例えば、他の抗皮膚老化剤、保湿剤、美白剤、日焼け防止剤、収斂剤等）が挙げられるが、これらに限定されず、化粧料の用途及び形態に適したものを任意に選択して用いることができる。本発明に係る化粧料は、原料を混合、撹拌等することにより、常法により製造することができる。

例えば以下に挙げられる成分のうち任意のものを、不知火菊抽出物と共に本発明に係る化粧料に配合することができる。

コラーゲン、コラーゲン誘導体、コラーゲン加水分解物、ゼラチン、ゼラチン加水分解物、エラスチン、エラスチン加水分解物、ラクトフェリン、ケラチン、ケラチン加水分解物、カゼイン、アルブミン、ハチミツ、及びローヤルゼリー等の、タンパク質及びタンパク質加水分解物。ヒアルロン酸ナトリウム、キサンタンガム、カラギーナン、グアーガム、アルギン酸及びその塩、ペクチン、コンドロイチン硫酸及びその塩、水溶性キチン、キトサン誘導体及びその塩、デオキシリボ核酸、アラビアゴム、トラガントゴム、プルラン等の天然高分子及びそれらの誘導体。

チューリップ花エキス、シチヘンゲ根エキス、オタネニンジンエキス、キビ芽エキス、大麦発酵エキス、栗渋皮発酵エキス、リュウガン種子エキス、ラッカセイ種皮エキス、ピンクロックローズエキス、甘草エキス、アロエエキス、カモミラエキス、シソエキス、果実水等の植物抽出物。酵母エキス等の微生物由来物。海藻末及び海藻エキス。プラセンタエキス等の動物由来物。カルボキシビニルポリマー及びその塩、ポリアクリル酸及びその塩、カルボキシメチルセルロース及びその塩等の酸性ポリマー、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ニトロセルロースポリビニルメチルエーテル等の中性ポリマー。カチオン化キトサン、カチオン化セルロース、ポリエチレンイミン、カチオン化グアーガム等のカチオン性ポリマー。エタノール、イソプロピルアルコール等の低級アルコール類。パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、アントラニエール酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤等の紫外線吸収剤。酸化チタン、酸化亜鉛等の紫外線散乱剤。

ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、リン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウム及びその誘導体、ビタミンＤ群、酢酸ｄ−α−トコフェノール、ビタミンＥ群、葉酸類、β−カロチン、γ−オリザノール、ニコチン酸、パントテン酸類、ビオチン類、フェルラ酸等のビタミン類。グリチルリチン酸及びその塩類、グアイアズレン及びその誘導体、アラントイン等の抗炎症剤。ステアリン酸エステル、ノルジヒドログアセレテン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、パラヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、セサモール、セサモリン、ゴシポール等の抗酸化剤。パラ安息香酸メチル、パラ安息香酸エチル、パラ安息香酸プロピル、パラ安息香酸ブチル等のパラ安息香酸エステル類、ソルビン酸、デヒドロ酢酸、フェノキシエタノール、安息香酸等の防腐剤。

エデト酸、エデト酸二ナトリウム等のエデト酸及びその塩類、フィチン酸、ヒドロキシエタンジスルホン酸等の金属イオン封鎖剤。グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類。L-アスパラギン酸、ＤＬ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン等のアミノ酸類及びその塩。マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等の糖類。クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等の有機酸類及びその塩類。流動パラフィン、スクワラン、ワセリン等の炭化水素類。ゴヨウマツ種子油、オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等の油脂類。ラウリン酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等の脂肪酸類。

ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等の高級アルコール類。ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等のエステル類。レシチン及びその誘導体等のリン脂質類。ウシ骨髄脂やウシ脳脂質などの動植物由来脂質。ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸エタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸トリエタノールアミン等のアルキル硫酸塩。

ポリオキシエチレン（２ＥＯ）ラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン（なお、ＥＯはエチレンオキサイドを意味し、ＥＯの前の数値はエチレンオキサイドの付加モル数を示す）、ポリオキシエチレン（３ＥＯ）アルキル（炭素数１１〜１５のいずれか又は２種以上の混合物）エーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキル硫酸塩。ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン等のアルキルベンゼンスルホン酸塩。ポリオキシエチレン（３ＥＯ）トリデシルエーテル酢酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩。ヤシ油脂肪酸サルコシンナトリウム、ラウロイルサルコシントリエタノールアミン、ラウロイルメチル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、ヤシ油脂肪酸−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ラウロイルメチルタウリンナトリウム等のＮ−アシルアミノ酸塩、エーテル硫酸アルカンスルホン酸ナトリウム、硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム、硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム、ウンデシノイルアミドエチルスルホコハク酸二ナトリウム、オクチルフェノキシジエントキシエチルスルホン酸ナトリウム、オレイン酸アミノスルホコハク酸二ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキル（炭素鎖１２〜１５）エーテルリン酸（８〜１０ＥＯ）、ポリオキシエチレンオレイルエーテルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンセチルエーテルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンスルホコハク酸ラウリル二ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、テトラデセンスルホン酸ナトリウム等のアニオン性界面活性剤。塩化ステアリルジメチルアンモニウム、塩化ジ（ポリオキシエチレン）オレイルメチルアンモニウム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化トリ（ポリオキシエチレン）ステアリルアンモニウム、塩化ポリオキシプロピレンメチルジエチルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等のカチオン性界面活性剤。２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ウンデシルヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインナトリウム、ウンデシル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−カルボキシメチルイミダゾリニウムベタイン、ステアリルジヒドロキシエチルベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ヤシ油アルキル−Ｎ−カルボキシエチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインナトリウム、ヤシ油アルキル−Ｎ−カルボキシメトキシエチル−Ｎ−カルボキシメチルイミダゾリニウムジナトリウムラウリル硫酸、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｎ−アルギニンエチル−ＤＬ−ピロリドンカルボン酸塩等の両性界面活性剤。ポリオキシエチレンアルキル（炭素数１２〜１４）エーテル（７ＥＯ）、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンオレイン酸グリセリン、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンセチルステアリルジエーテル、ポリオキシエチレンソルビトール・ラノリン（４０ＥＯ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレンラノリン、ポリオキシエチレンラノリンアルコール、ポリオキシプロピレンステアリルエーテル等のノニオン性界面活性剤。イソステアリン酸ジエタノールアミド、ウンデシレン酸モノエタノールアミド、オレイン酸ジエタノールアミド、牛脂脂肪酸モノエタノールアミド、硬化牛脂脂肪酸ジエタノールアミド、ステアリン酸ジエタノールアミド、ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド、ステアリン酸モノエタノールアミド、ミリスチン酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸エタノールアミド、ラウリン酸イソプロパノールアミド、ラウリン酸エタノールアミド、ラウリン酸ジエタノールアミド、ラノリン脂肪酸ジエタノールアミド等の増粘剤。鎖状又は環状メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジメチルポリシロキサンポリエチレングリコール共重合体、ジメチルポリシロキサンポリプロピレン共重合体、アミノ変性シリコンオイル、第四級アンモニウム変性シリコンオイル等のシリコンオイル。

ビールエキス、ｐＨ調整剤、着色料、香料、安定化剤、清涼剤、血流促進剤、角質溶解剤、収斂剤、創傷治療剤、増泡剤、口腔用剤、消臭・脱臭剤、抗アレルギー剤、細胞賦活剤等。不活性担体（固体又は液体担体）、賦形剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解補助剤、懸濁化剤、コーティング剤、保存剤、緩衝剤等。

本発明に係る不知火菊抽出物、又はそれを含む抗皮膚老化剤、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、抗糖化剤、コラーゲン産生促進剤、若しくはエラスターゼ産生促進剤は、医薬に配合して用いることもできる。すなわち本発明は、本発明に係る不知火菊抽出物、又はそれを含む抗皮膚老化剤、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、抗糖化剤、コラーゲン産生促進剤、若しくはエラスターゼ産生促進剤を含む医薬も提供する。このような本発明に係る医薬は、皮膚トラブルを有する患者に投与されることにより、それぞれの抗皮膚老化効果を発揮することができる。

本発明に係る医薬は、医薬品及び医薬部外品を包含する。本発明に係る医薬は、経口薬又は非経口薬であってよいが、外用薬であることが好ましく、外皮用薬であることがさらに好ましい。本発明に係る医薬は、任意の剤型であってよく、例えば、軟膏剤、貼付剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、エキス剤、流エキス剤、チンキ剤、エリキシル剤、シロップ剤、リモナーデ剤、芳香水剤、液剤、懸濁化剤、乳剤、薬用入浴剤、薬用シャンプー、エアゾール剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等が挙げられる。

本発明に係る医薬には、不知火菊抽出物に加えて、医薬に配合され得る任意の他の成分を配合することができる。他の成分としては、医薬において用いられる不活性担体（固体又は液体担体）、賦形剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、保存剤、緩衝剤等、及び他の活性成分（例えば、他の抗皮膚老化剤、保湿剤、美白剤、日焼け防止剤、収斂剤等）が挙げられるが、これらに限定されず、医薬の用途及び形態に適したものを任意に選択して用いることができる。医薬に配合され得る他の成分の一部は、化粧料について上記で列挙した成分と共通である。本発明に係る医薬は常法により製造することができる。

例えば、賦形剤の具体例としては、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等が挙げられる。

崩壊剤の具体例としては、結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース（カルボキシメチルセルロース）、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、トラガント等が挙げられる。

結合剤の具体例としては、結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロースナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＲＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、メタクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、アラビアゴム末、寒天、ゼラチン、白色セラック、トラガント、精製白糖、マクロゴール等が挙げられる。

滑沢剤の具体例としては、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、タルク、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類、水素添加植物油、ポリエチレングリコール等が挙げられる。

界面活性剤の具体例としては、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴール等が挙げられる。

本発明に係る抗皮膚老化剤、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、抗酸化剤、抗糖化剤、コラーゲン産生促進剤、若しくはエラスターゼ産生促進剤（本願明細書ではこれらを「剤」と総称することがある）、又は本発明に係る化粧料若しくは医薬は、ヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む任意の哺乳動物（被験体）に投与（適用）することができるが、皮膚老化が認められる被験体、紫外線に高度に曝露されているなど皮膚老化の促進リスクが高い被験体、皮膚老化が促進されている被験体、皮膚老化防止又は改善の必要性が高い被験体等への投与に特に有用である。本発明は、本発明に係る剤、又は本発明に係る化粧料若しくは医薬を被験体に投与（好ましくは皮膚に適用）することにより、抗皮膚老化作用を増強する方法、及びそれによる皮膚老化防止又は改善方法も提供する。本発明はまた、本発明に係る剤、又は本発明に係る化粧料若しくは医薬を被験体に投与（好ましくは皮膚に適用）することによる、コラゲナーゼ阻害作用、エラスターゼ阻害作用、抗酸化作用、抗糖化作用、コラーゲン産生作用、又はエラスターゼ産生作用を増強する方法も提供する。

本発明に係る剤、又は本発明に係る化粧料若しくは医薬の投与量（適用量）は、被験体の生物種、年齢、体重、投与経路、剤型、用途、投与回数等により異なり、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。具体的には、その投与量は、特に限定されるものではないが、有効成分である本発明に係る不知火菊抽出物の乾燥重量換算で、例えば、０．００１ｇ／回〜１ｇ／回とすることができる。本発明に係る剤、又は本発明に係る化粧料若しくは医薬は、限定するものではないが、例えば６〜２４時間間隔で繰り返し投与することも好ましい。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

以下、本発明を実施例により説明するが、本実施例によって本発明が限定されるものではない。

（実施例１）
＜不知火菊地上部抽出物の調製＞
（１）アルコール抽出物の調製−１
不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）の地上部（花、葉、及び茎を含み、根を含まない）１０ｋｇを、収穫後、直ぐに風通しの良い日陰にて約２週間風乾した。それを裁断後、９０℃で１８０分間乾燥し、粉砕した。得られた粉砕物の１０ｇを２０％エタノール水溶液１００ｍＬに浸漬し、６０℃で２４時間かけて抽出を行った。抽出後の溶液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、溶液中の沈殿物を濾過により除去し、褐色で清澄な不知火菊抽出液を得た。

（２）凍結乾燥粉末の調製
上記（１）「アルコール抽出物の調製−１」で得られた不知火菊抽出液をエバポレーターにより濃縮した後、真空凍結乾燥させて、凍結乾燥粉末を得た。

（３）水抽出物の調製
上記（１）のとおり不知火菊の地上部（花、葉、及び茎を含み、根を含まない）を乾燥及び粉砕して得られた粉砕物の１０ｇを水１００ｍＬに浸漬し、６０℃で２４時間かけて抽出を行った。抽出後の溶液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、溶液中の沈殿物を濾過により除去し、褐色で清澄な不知火菊抽出液を得た。

（４）アルコール抽出物の調製−２
上記（１）のとおり不知火菊の地上部（花、葉、及び茎を含み、根を含まない）を乾燥及び粉砕して得られた粉砕物の１０ｇを無水エタノール１００ｍＬに浸漬し、６０℃で２４時間かけて抽出を行った。抽出後の溶液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、溶液中の沈殿物を濾過により除去し、薄褐色で清澄な不知火菊抽出液を得た。

（５）アルコール抽出物の調製−３
上記（１）のとおり不知火菊の地上部（花、葉、及び茎を含み、根を含まない）を乾燥及び粉砕して得られた粉砕物の１０ｇを２０％ １，３−ブチレングリコール水溶液１００ｍＬに浸漬し、室温で２週間かけて抽出を行った。抽出後の溶液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、溶液中の沈殿物を濾過により除去し、薄褐色で清澄な不知火菊抽出液を得た。

（６）アルコール抽出物の調製−４
上記（１）のとおり不知火菊の地上部（花、葉、及び茎を含み、根を含まない）を乾燥及び粉砕して得られた粉砕物の１０ｇを１，３−ブチレングリコール１００ｍＬに浸漬し、６０℃で２４時間かけて抽出を行った。抽出後の溶液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、溶液中の沈殿物を濾過により除去し、薄褐色で清澄な不知火菊抽出液を得た。

（実施例２）
＜不知火菊全草抽出物の調製＞
（１）アルコール抽出物の調製−５
不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）の全草（花、葉、茎及び根を含む）１０ｋｇを、収穫後、直ぐに風通しの良い日陰にて約２週間風乾した。それを裁断後、９０℃で１８０分間乾燥し、粉砕した。得られた粉砕物の１０ｇを２０％エタノール水溶液１００ｍＬに浸漬し、６０℃で２４時間かけて抽出を行った。抽出後の溶液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、溶液中の沈殿物を濾過により除去し、褐色で清澄な不知火菊抽出液を得た。

（２）凍結乾燥粉末の調製
上記（１）「アルコール抽出物の調製−５」で得られた不知火菊抽出液をエバポレーターにより濃縮した後、真空凍結乾燥させて凍結乾燥粉末を得た。

（３）水抽出物の調製
上記（１）のとおり不知火菊の全草（花、葉、茎及び根を含む）１０ｋｇを乾燥及び粉砕して得られた粉砕物の１０ｇを水１００ｍＬに浸漬し、６０℃で２４時間かけて抽出を行った。抽出後の溶液を１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、溶液中の沈殿物を濾過により除去し、褐色で清澄な不知火菊抽出液を得た。

（実施例３）
＜コラゲナーゼ阻害試験＞
実施例１（２）で調製した不知火菊地上部由来の凍結乾燥粉末、及び実施例２（２）で得られた不知火菊全草由来の凍結乾燥粉末を、それぞれ、５００μｇ／ｍＬ（５００ｐｐｍ）、１００μｇ／ｍＬ（１００ｐｐｍ）、及び５０μｇ／ｍＬ（５０ｐｐｍ）の濃度で水に懸濁し、試験液を調製した。

調製した試験液について、コラゲノキットＣＬＮ−１００（コラーゲン技術研修会有限会社、東京都清瀬市）を用いてコラゲナーゼ阻害作用の評価を行った。具体的には、基質コラーゲン溶液（蛍光標識コラーゲン０．１％／０．０１Ｍ酢酸）２００μＬに、試験液５０μＬ、及びヒト皮膚線維芽細胞由来コラゲナーゼ溶液（０．１ユニット／ｍＬ）２００μＬを加え、３５℃で２時間反応させた後、酵素反応停止液（ｏ−フェナントロリン）を添加して酵素反応を停止させ、冷却後、７０％エタノールを加えて２０秒間撹拌し、遠心分離で上清を回収することにより、コラーゲン分解物を含むエタノール抽出液を得た。得られた抽出液について、蛍光分光光度計を用いて、蛍光強度（Ｅｘ＝４９５ｎｍ，Ｅｍ＝５２０ｎｍ）を測定した。蛍光強度の測定値が高い程、高いコラゲナーゼ活性が示されたことを意味する。コントロールとして、不知火菊抽出物を含む試験液の代わりに緩衝液を添加して、同様の反応及び測定を行った。各試験液のコラゲナーゼ活性阻害率は、コントロール（不知火菊抽出物無添加）の測定値と比較して以下のように算出した。

コラゲナーゼ活性阻害率（％）＝（コントロールの蛍光値−試験液添加時の蛍光値）／コントロールの蛍光値×１００

結果を図２に示す。図２に示されるように、５００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、及び５０μｇ／ｍＬのいずれの濃度の試験液でも、高いコラゲナーゼ阻害活性が認められた。また不知火菊地上部由来の抽出物と不知火菊全草由来の抽出物は、いずれも高いコラゲナーゼ阻害活性を示したが、不知火菊地上部由来の抽出物の方がより高いコラゲナーゼ阻害活性を示した。またコラゲナーゼ阻害レベルは、不知火菊抽出物の濃度依存的に増加した。

このように不知火菊抽出物は、マトリックスメタロプロテアーゼの１種であるコラゲナーゼの活性を強く阻害したことから、皮膚老化防止に有効であることが示された。

（実施例４）
＜エラスターゼ阻害試験＞
実施例１（２）及び実施例２（２）で調製した不知火菊抽出液凍結乾燥粉末を、それぞれ、５００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、及び５０μｇ／ｍＬの濃度で０．２Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５，１％ ＢＳＡ，１Ｍ ＮａＣｌ含有）に懸濁し、試験液を調製した。

基質Ｓｕｃ−（ＯＭｅ）−（Ｌ−アラニル）２−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐ−ＭＣＡを０．２Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５，１％ ＢＳＡ，１Ｍ ＮａＣｌ含有）で２０μＭに調製した基質溶液２００μＬと、各濃度の試験液１００μＬを混合し、その混液に０．２ユニット／ｍＬに調製したヒト好中球由来エラスターゼ溶液１００μＬを加え、３７℃で１時間反応させた。反応後、蛍光強度（Ｅｘ＝３５５ｎｍ，Ｅｍ＝４６０ｎｍ）を測定した。蛍光強度の測定値が高い程、高いエラスターゼ活性が示されたことを意味する。コントロールとして、不知火菊抽出物を含む試験液の代わりに緩衝液を添加して、同様の反応及び測定を行った。各試験液のエラスターゼ活性阻害率は、コントロール（不知火菊抽出物無添加）の測定値と比較して以下のように算出した。

エラスターゼ活性阻害率（％）＝（コントロールの蛍光値−試験液添加時の蛍光値）／コントロールの蛍光値×１００

結果を図３に示す。図３に示されるように、不知火菊抽出物は、濃度依存的にエラスターゼ活性を高度に阻害した。不知火菊地上部由来の抽出物と不知火菊全草由来の抽出物は、いずれも高いエラスターゼ阻害活性を示したが、不知火菊地上部由来の抽出物の方がより高いエラスターゼ阻害活性を示した。

このように不知火菊抽出物は、エラスターゼの活性を強く阻害したことから、この点でも皮膚老化防止に有効であることが示された。

（実施例５）
＜抗酸化作用の評価＞
不知火菊抽出物の抗酸化作用を、ＤＰＰＨラジカル消去法により評価した。ＤＰＰＨラジカル消去法とは、可視部に吸収を持ち、かつ還元されると吸収を示さなくなる安定ラジカルであるＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリル−ヒドラジル）を抗酸化物質と反応させた後、抗酸化物質で還元されなかったＤＰＰＨ量を吸光度測定により決定することに基づいて、抗酸化物質の抗酸化能を評価する方法である。

まず、実施例１（２）及び実施例２（２）で調製した不知火菊抽出液凍結乾燥粉末を、それぞれ、５０％エタノール水溶液に混合し、１００ｐｐｍの試験液を調製した。反応指示薬（８００μＭ １，１−ジフェニル−２−ピクリル−ヒドラジル １２ｍＬ，４００ｍＭ ２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液 １２ｍＬ，５０％エタノール水溶液２４ｍＬ）０．９ｍＬを試験管に分注し、５０％エタノール水溶液を加えた。５０％エタノール水溶液の添加量は、試験液の添加量ａμＬに対して、（３００−ａ）μＬとして定めた。ａ＝０、３０、６０、１２０、１８０、２４０μＬとした。試験液ａμＬを加え、ボルテックスミキサーでミキシングし、試験液添加の２０分後に５２０ｎｍでの吸光度を測定した。コントロールとして、不知火菊抽出物を含む試験液の代わりに５０％エタノールを添加して、同様の反応及び測定を行った。また比較実験として、不知火菊抽出液凍結乾燥粉末に代えて、茶抽出液凍結乾燥粉末を用いて、同様の反応及び測定を行った。各試験液のラジカル消去率を、コントロールの測定値と比較して以下のように算出した。

ラジカル消去率（％）＝（コントロールの蛍光値−試験液添加時の蛍光値）／コントロールの蛍光値×１００

結果を図４に示す。図４に示されるように、不知火菊抽出物には、抗酸化作用が知られている茶抽出物よりも高いラジカル消去活性が認められた。そのラジカル消去レベルは、不知火菊抽出物の濃度依存的に増加した。不知火菊地上部由来の抽出物と不知火菊全草由来の抽出物は、いずれも高いラジカル消去活性を示したが、不知火菊地上部由来の抽出物の方がより高いラジカル消去活性を示した。このことから、不知火菊抽出物が高い抗酸化作用を有することが示された。不知火菊抽出物は、この抗酸化作用の点でも、老化防止に有効であることが示された。

（実施例６）
＜抗糖化作用の評価＞
実施例１（２）及び実施例２（２）で調製した不知火菊抽出液凍結乾燥粉末を、８％エタノールに４０００μｇ／ｍＬとなるよう溶解後、それぞれ、５００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、及び５０μｇ／ｍＬの濃度で脱塩水に懸濁し、試験液を調製した。

遮光マイクロチューブに２５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５８０μＬを加えたところに、試験液２０μＬを添加した。次に２．５Ｍグルコース水溶液２００μＬを添加し、さらに、リン酸緩衝液で調製したＢＳＡ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン）２００μＬを加えた。調製した試料溶液を攪拌し、６０℃で１８時間加温した後、マイクロチューブを氷浴に浸漬して降温した。１００％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸１００μＬを加えて攪拌した後、４℃で１５分間冷却した。次に遠心分離（１１０００ｒｐｍ，４℃，１０分）して上澄みを除去し、アルカリＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ， ８．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４， ２．６８ｍＭ ＫＣｌ， １．４７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４； ０．２５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１０に調製）１０００μＬを加え、攪拌して沈殿を溶解し、蛍光強度（Ｅｘ＝３５５ｎｍ，Ｅｍ＝４６０ｎｍ）を測定した。蛍光強度の測定値は、ＢＳＡとグルコースの糖化反応により生成されたＡＧＥｓ量を示す。ブランクとしてグルコース水溶液の代わりに脱塩水を添加して同様の反応及び測定を行った。さらにコントロールとして、不知火菊抽出物を含む試験液の代わりに脱塩水を添加して、同様の反応及び測定を行った。各試験液のＡＧＥｓ生成抑制率を、以下のように算出した。

ＡＧＥｓ生成抑制率（％）＝１００−［（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）］×１００
Ａ： 試験液添加時の測定値
Ｂ： 試験液添加時のブランクの測定値
Ｃ： コントロールの測定値
Ｄ： コントロールにおけるブランクの測定値

結果を図５に示す。図５に示されるように、不知火菊抽出物は、ＡＧＥｓ生成を高レベルに抑制し、すなわち高い抗糖化活性を示した。その抗糖化活性は、不知火菊抽出物の濃度依存的に増加した。不知火菊地上部由来の抽出物と不知火菊全草由来の抽出物は、いずれも高い抗糖化活性を示したが、不知火菊地上部由来の抽出物の方がより高い抗糖化活性を示した。不知火菊抽出物は、抗糖化作用の点でも、老化防止に有効であることが示された。

（実施例７）
＜コラーゲン産生促進作用の評価＞
１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）添加ＤＭＥＭ培地に懸濁した、コラーゲン産生能を有するヒト胎児肺線維芽細胞ＷＩ−３８細胞をコンフルエントになるまで４８時間培養した。培地を捨て、ＰＢＳにて３回洗浄した細胞に、実施例１（２）及び実施例２（２）で調製した不知火菊抽出液凍結乾燥粉末を５００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、及び５０μｇ／ｍＬとなるように添加したＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ無添加）を加え、４８時間培養した。培養後、培地中に分泌されたコラーゲン量を、コラーゲン測定キットであるＴＡＫＡＲＡ Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩＣ−Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＩＰ） ＥＩＡ Ｋｉｔを用いて測定した。コントロールとして、ＦＢＳ不含のＤＭＥＭ培地に不知火菊抽出液凍結乾燥粉末を添加しないこと以外は同様にして培養及び測定を行った。コラーゲン産生促進率を、コントロール（１００％）と比較して以下のように相対値として算出した。

コラーゲン産生促進率（％）＝不知火菊抽出物添加時のコラーゲン量／コントロールのコラーゲン量×１００

結果を図６に示す。図６から、不知火菊抽出物が、高いコラーゲン産生促進作用を有することが示された。コラーゲン産生促進率は、不知火菊抽出物の濃度依存的に増加した。不知火菊地上部由来の抽出物と不知火菊全草由来の抽出物は、いずれも高いコラーゲン産生促進作用を示したが、不知火菊地上部由来の抽出物の方がより高いコラーゲン産生促進作用を示した。このような高いコラーゲン産生促進作用は、不知火菊抽出物が、皮膚老化防止や皮膚の弾力や柔軟性の改善に有効であることを示す。

（実施例８）
＜エラスチン産生促進作用の評価＞
１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）添加ＤＭＥＭ培地を含む２４穴プレートに、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ細胞）を１ウェルあたり３０，０００個播種し、５ｖｏｌ％ＣＯ_２環境下、３日間培養した。培養後、実施例１（２）及び実施例２（２）で調製した不知火菊抽出液凍結乾燥粉末を５００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、及び５０μｇ／ｍＬとなるように添加したＦＢＳ不含のＤＭＥＭ培地に培地交換し、さらに培養した。４日後に培地を回収し、培地中のエラスチン濃度を、エラスチン測定キットであるＦａｓｔｉｎ Ｅｌａｓｔｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ Ｌｔｄ．）を用いて測定した。併せて各ウェル中の細胞数を計測し、各ウェルの単位細胞数あたりのエラスチン量を算出した。コントロールとして、ＦＢＳ不含のＤＭＥＭ培地に不知火菊抽出液凍結乾燥粉末を添加しないこと以外は同様にして培養及び測定を行った。エラスチン産生促進率を、コントロール（１００％）と比較して以下のように相対値として算出した。

エラスチン産生促進率（％）＝不知火菊抽出物添加時の単位細胞数あたりのエラスチン量／コントロールの単位細胞数あたりのエラスチン量×１００

結果を図７に示す。図７から、不知火菊抽出物が、高いエラスチン産生促進作用を有することが示された。エラスチン産生促進率は、不知火菊抽出物の濃度依存的に増加した。不知火菊地上部由来の抽出物と不知火菊全草由来の抽出物は、いずれも高いエラスチン産生促進作用を示したが、不知火菊地上部由来の抽出物の方がより高いエラスチン産生促進作用を示した。このような高いエラスチン産生促進作用は、不知火菊抽出物が、皮膚老化防止や皮膚の弾力・柔軟性の改善に有効であることを示す。

（実施例９）
＜化粧水の製造＞

表１の処方に従い、不知火菊抽出物を配合した抽出物添加品と不知火菊抽出物を配合しない対照品のそれぞれについて、成分（１）〜（１０）を混合し８０℃で撹拌して溶解した後、室温に冷却し、化粧水を調製した。得られた化粧水はいずれも清澄であり、４０℃、相対湿度（ＰＨ）７５％の条件下において３ヶ月間白濁を生じることもなく安定であった。

また、専門パネラー１０名による官能試験を行なった。評価は下記の項目（１）〜（３）について５段階の評点評価を実施した。
（１） 肌のしっとりさ
１．かさつく
２．ややかさつく
３．普通
４．ややしっとりする
５．しっとりする
（２） 肌の滑らかさ
１．ざらつく
２．ややざらつく
３．普通
４．やや滑らか
５．滑らか
（３） 肌のべたつき
１．べたつく
２．ややべたつく
３．普通
４．ややさっぱり
５．さっぱり

パネラー１０名の評点の平均を表２に示した。表２に示されるように、不知火菊抽出物を配合した抽出物添加品は、不知火菊抽出物を配合しない対照品よりも優れた保湿性と皮膚平滑性を示した。

（実施例１０）
＜シャンプー剤の製造＞
表３の処方に従い、成分（１）〜（８）を７０℃で混合撹拌し、室温まで冷却させてシャンプー剤を調製した。

得られたシャンプー剤を用いて洗髪したところ、髪の感触が滑らかで、髪に潤いを与えることができた。

（実施例１１）
＜クリーム剤の製造＞

表４に示す処方に従い、成分（１）〜（６）を８０℃で混合撹拌した後、成分（７）〜（１０）を別途８０℃で混合攪拌したものを加え、ホモジナイズし、攪拌しながら室温まで冷却し、クリーム剤を調製した。

得られたクリーム剤（抽出物添加品）は使用中にべたつかず、肌をしっとりとさせることができた。

また、専門パネラー１０名を対象とし、得られたクリーム剤について１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、肌のシワ、タルミの改善作用の評価を、以下の５段階の評点評価にて実施した。

１．悪化した
２．やや悪化した
３．変わらず
４．やや改善した
５．改善した

パネラー１０名の評点の平均を表５に示した。表５に示されるように、不知火菊抽出物を配合した抽出物添加品は、不知火菊抽出物を配合しない対照品よりも優れたシワ、タルミの改善作用を示した。

（実施例１２）
＜ボディジェル剤の製造＞
表６に示す処方に従い、成分（１）〜（８）を混合撹拌し、溶解してボディジェル剤を調製した。

得られたボディジェル剤は使用中にべたつかず、肌をしっとりとさせることができた。

（実施例１３）
＜ヘアパック剤の製造＞
表７に示す処方に従い、成分（１）〜（２）を８０℃混合撹拌した後、成分（３）〜（１３）を別途８０℃で混合撹拌したものを加え、８０℃にて混合攪拌しながら成分（１４）及び（１５）をさらに添加して混合攪拌し、ヘアパック剤を調製した。

得られたヘアパック剤を用いて髪のトリートメントをしたところ、髪の感触が滑らかで、髪に潤いを与えることができた。

（実施例１４）
＜シャンプー剤の製造＞
表８に示す処方に従い、成分（１）〜（８）を７０℃で混合撹拌し、室温まで冷却させてシャンプー剤を調製した。

得られたシャンプー剤を用いて洗髪したところ、髪の感触が滑らかで、髪に潤いを与えることができた。

（実施例１５）
＜クリーム剤の製造＞
表９に示す処方に従い、成分（１）〜（６）を８０℃で混合撹拌した後、成分（７）〜（１０）を別途８０℃で混合攪拌したものを加え、ホモジナイズし、攪拌しながら室温まで冷却し、クリーム剤を調製した。
得られたクリーム剤は使用中にべたつかず、肌をしっとりとさせることができた。

（実施例１６）
＜ボディリンスの製造＞
表１０に示す処方に従い、定法によりボディリンスを調製した。得られたボディリンスは肌をしっとりとさせることができた。

（実施例１７）
＜顆粒状浴用剤の製造＞
表１１に示す処方に従い、（１）〜（３）の各成分を混合撹拌し顆粒状浴用剤を調製した。得られた顆粒状浴用剤は肌をしっとりとさせることができ、使用後の体温の保温性に優れていた。

（実施例１８）
＜ボディジェル剤の製造＞
表１２に示す処方に従い、成分（１）〜（８）を撹拌し、溶解してボディジェル剤を調製した。得られたボディジェル剤は使用中にべたつかず、肌をしっとりとさせることができた。

（実施例１９）
＜シャンプー剤の製造＞
表１３示す処方に従い、成分（１）〜（８）を７０℃で混合撹拌し、室温まで冷却させてシャンプー剤を調製した。

得られたシャンプー剤を用いて洗髪したところ、髪の感触が滑らかで、髪に潤いを与えることができた。

（実施例２０）
＜ボディリンスの製造＞
表１４に示す処方に従い、定法によりボディリンスを調製した。得られたボディリンスは肌をしっとりとさせることができた。

Claims (16)

1. 不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、抗皮膚老化剤。
2. 皮膚老化防止用の、請求項１に記載の抗皮膚老化剤。
3. コラゲナーゼ阻害作用、エラスターゼ阻害作用、抗酸化作用、及び抗糖化作用からなる群より選択される少なくとも１つに基づく皮膚老化防止用である、請求項２に記載の抗皮膚老化剤。
4. 皮膚老化改善用の、請求項１に記載の抗皮膚老化剤。
5. コラーゲン産生促進作用及びエラスチン産生促進作用のうち少なくとも１つに基づく皮膚老化改善用である、請求項４に記載の抗皮膚老化剤。
6. 皮膚外用剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗皮膚老化剤。
7. 不知火菊抽出物がアルコール抽出物又は水抽出物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗皮膚老化剤。
8. 不知火菊抽出物が不知火菊の地上部又は全草の抽出物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗皮膚老化剤。
9. 不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、コラゲナーゼ阻害剤。
10. 不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、エラスターゼ阻害剤。
11. 不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、抗酸化剤。
12. 不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、抗糖化剤。
13. 不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、コラーゲン産生促進剤。
14. 不知火菊（Chrysanthemum indicam×Erigeron annuus）抽出物を有効成分として含有する、エラスチン産生促進剤。
15. 請求項１〜１４のいずれか１項記載の剤を含む、化粧料。
16. 請求項１〜１４のいずれか１項記載の剤を含む、医薬。

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