JP2017210452A

JP2017210452A - 蛋白質糖化反応阻害剤

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Publication number: JP2017210452A
Application number: JP2016105996A
Authority: JP
Inventors: 佳代子井上; Kayoko Inoue; 恭男佐藤; Takao Sato; 雅之八木; Masayuki Yagi
Original assignee: RENE CO Ltd
Current assignee: RENE CO Ltd
Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2017-11-30
Anticipated expiration: 2036-05-27
Also published as: JP6411403B2

Abstract

【課題】近年、蛋白質の糖化反応が老化現象、認知症、癌、高血圧、動脈硬化症などにも関与していることが明らかになっている。このような蛋白質の糖化反応を阻害し得る天然素材を見出し、その抽出物を有効成分とする蛋白質糖化反応素材剤などを提供することを課題とする。
【解決手段】上記課題を解決するために、黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を有効成分として含有する蛋白質糖化反応素材剤を提供する。また、上記の蛋白質糖化反応素材剤を含有する食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品及び化粧品を提供する。
【選択図】図３

Description

本発明は、黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を含有する蛋白質糖化反応阻害剤などに関する。

蛋白質糖化反応（以下、糖化反応と省略）は、Ｌ．Ｃ．Ｍａｉｌｌａｒｄがアミノ酸と還元糖を加熱すると褐色の色素が生成することを発見したことからメイラード反応として知られるようになった。近年、この糖化反応が老化現象、認知症、癌、高血圧、動脈硬化症などにも関与していることが明らかになっている。例えば、糖化反応により蛋白質は褐変化するが、これにより、肌などにくすみが生じることになる。また、糖化反応により皮膚や骨のコラーゲンが硬化することにより、皮膚や骨の弾力及びしなやかさが損なわれてしまう。そこで、生体に様々な影響を及ぼす糖化反応を阻害するための研究が種々行われている。

例えば、特定の植物の抽出物が蛋白質糖化反応を抑制することについて有効であることが報告されている（特許文献１）。

特開２００５−３５９１１号公報

上記事情を鑑み、蛋白質の糖化反応を阻害し得る天然素材を見出し、その抽出物を有効成分とする蛋白質糖化反応素材剤などを提供することを課題とする。

上記課題を解決するための手段として、以下の発明などを提供する。すなわち、黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を有効成分として含有する蛋白質糖化反応素材剤を提供する。

また、上記の蛋白質糖化反応素材剤を含有する食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品及び化粧品を提供する。

本発明により、生体に好ましくない影響を及ぼす蛋白質の糖化反応を阻害する蛋白質糖化反応阻害剤などを提供することができる。

実施形態１における蛋白質糖化反応阻害作用の測定結果を示す表実施形態１における蛋白質糖化反応阻害作用の測定結果を示す表実施形態１における蛋白質糖化反応阻害作用の測定結果を示すグラフ実施形態１における蛋白質糖化反応阻害作用の測定結果を示すグラフ糖化反応によるAGEsの生成過程と、この生成過程における黒ガリンガルのAGEs生成阻害能の推定作用ポイント実施形態２におけるAGEs架橋切断作用の測定結果を示す表実施形態２におけるAGEs架橋切断作用の測定結果を示すグラフ実施形態３におけるOPH活性増強作用の測定結果を示す表及びグラフ

以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本発明は、これらの実施形態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
＜実施形態１＞

本実施形態の蛋白質糖化反応阻害剤は、黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を有効成分として含有するものである。

「黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）」は、ショウガ科ケンペリア属の植物である。また、「クラチャイ・ダム（(Krachai dam）」や「黒ショウガ（Black Ginger）」などとも称される。タイやラオスなど東南アジアでは古来より塊茎を薬用としてきた。また、近年では、乾燥及び粉末化し滋養強壮などの健康用途に日本でも使用されている。

黒ガリンガル抽出物は、主に塊茎を原料とし精製水、エタノール、メタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、プロピレングリコールなどの溶媒を用いて抽出する。抽出は、塊茎を破砕したものを溶媒に浸漬してもよいし、破砕し粉体としてから浸漬してもよい。また、塊茎だけでなく葉や茎を用いてもよい。また、液体として抽出物を得た後にさらに乾燥等を施し粉体や粒体として得てもよい。

黒ガリンガルの抽出物を有効成分とする本実施形態の蛋白質糖化反応阻害剤は、さらに既知の方法を用いることにより、当該蛋白質糖化反応阻害剤を含有する食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして提供することが可能である。

例えば、医薬品とする場合には、本実施形態の蛋白質糖化反応阻害剤を粉体や粒体としカプセルに充填したり、あるいは、賦形剤、結合剤、崩壊剤などを添加して打錠機等を用いて錠剤とすることができる。また、食品とする場合には、黒ガリンガルを適宜乾燥や破砕等を施してから湯で煮出すことで提供できる。また、医薬品のようにカプセルや錠剤のような形態で提供してもよいし、他の飲料、調味料、菓子等の各種の食品に蛋白質糖化反応阻害剤を添加した態様で提供することもできる。

また、美容液、クリーム、ローションなどの化粧品とすることもできる。例えば、美容液とする場合には、本実施形態の蛋白質糖化反応阻害剤の他、水、コメヌカ油、ペンチレングリコール、グリセリン、スクワラン、パルミチン酸セチル、ダイマージリノール酸などを主成分とし、ヒアルロン酸Ｎａ、水添ナタネ油アルコール、カルボマー、キサンタンガム、水酸化Ｋ、ジメチコン、ポリソルベート−６０、ステアリン酸グリセリル、水添ヒマシ油、フェノキシエタノール、尿素、アルギニン、アルブチン、クエン酸などを添加剤とする。そして、各成分を水溶性原料・油溶性原料に分けて溶解してから、それらを加熱して混合・乳化する。これを冷却しながらエキスなどの添加物を配合し、さらに低温になったところで精油や香料などの揮発性の高いものを添加する。その後、所定の安全性の検査（菌、ｐＨ、温度安定性、粘度等）を行い、瓶などに充填して製品として提供することができる。上述した種々の応用は、実施形態２のAGEsが関与する架橋切断剤、実施形態３の酸化蛋白質分解酵素活性の増強剤についても同様に適用できる。
＜試験＞

≪１≫黒ガリンガル抽出液の調製
真空ポンプを用いずに４０℃未満の真空状態にて乾燥（低温真空乾燥）させ粉末化して得た黒ガリンガル乾燥粉末2gと、高温状態で乾燥（高温乾燥）させ粉末化して得た黒ガリンガル乾燥粉末2gのそれぞれを、80mLの熱水で1時間抽出し、常温まで冷却後、濾紙を用いて濾過後、試料溶液とした。以降の測定には本抽出液を使用した。各試料溶液の固形分濃度は、各試料溶液5mLをアルミトレイに入れ、110℃に設定したインキュベーター内で4時間乾燥させた後の残重量を測定して算出した。低温真空乾燥による固形分濃度（mg/ mL）は7.87±0.18であり、高温乾燥による固形分濃度は7.63±0.15であり、両サンプルともほぼ同様であった。

≪２≫測定概要
AGEs（糖化最終生成物）は糖化反応における最終生成物の総称であり、その特徴の一つとして蛍光性を有する。蛍光性を有するAGEsにはペントシジン、クロスリン、ピロピリジンなどがある。

糖化反応抑制作用はヒト血清アルブミン（HSA）-グルコース糖化反応系に試験サンプルを添加し、試験サンプルによる蛍光性AGEs、3-deoxyglucosone(3DG)、グリオキサール(GO)、メチルグリオキサール(MGO)、ペントシジン、CMLの生成阻害率を測定した。蛍光性AGEsは反応液には370nmの励起波長を照射したときの蛍光を440nmで測定した。3DG、GO、MGO、ペントシジンの測定にはHPLC法を使用した。CMLの測定にはELISA法を使用した。

糖化反応抑制作用のポジティブコントロールとしては糖化反応阻害剤の一種であるアミノグアニジンまたはエピガロカテキンガレート（EGCg）を使用した。

≪３≫方法
in vitro 糖化反応
0.1 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4リン酸緩衝液（pH7.4）、8 mg/mLヒト血清アルブミン（HSA）、0.2moL/Lグルコース糖化反応液中に、調製した各濃度のサンプルを1/10濃度になるように添加し、60℃で40時間インキュベートした。コントロールとしてはサンプルの代わりに蒸留水を添加したものを用いた。

蛍光性AGEs測定
糖化反応終了後、反応液中に生成した蛍光性AGEsをマイクロプレートリーダーで測定した（励起波長370nm/蛍光波長440nm）。

3DG、GO、MGO測定
糖化反応終了後、反応液中に生成した3DG、GO、MGOを2.3-diaminonaphthalen（DAN）プレラベル化逆相HPLC法により定量した。

ペントシジン測定HPLC法の場合はScheijenaら(2009) の方法を参考に、反応液を塩酸加水分解後、逆相HPLCで測定した。（参考文献１「Scheijena et al, Journal of Chromatography B, 2009 ; 877 : 610-614」）

CML測定
反応液中に生成したCMLはELISA法（CircuLex CML/Nε-(carboxymethyl)lysine), サイクレックス)で測定した。

AGEs生成阻害作用の算出
AGEsの生成阻害率（%）は、in vitro糖化反応系においてサンプルを添加した反応液（A）、グルコース水溶液の代わりに蒸留水を添加したもの（B）、サンプルを添加しない溶液のみを添加してインキュベーションしたもの（C）、ブランクとしてグルコースの代わりに蒸留水を添加したもの（D）として下記の式に従って算出した。
AGEs生成阻害率(%) = {1-(A -B)/(C -D)} ×100
抗AGEs活性はIC50（50%生成阻害濃度）を算出し、有効数字3桁で表示した。
IC50は値が小さいほど活性が強いことを示している。

≪４≫結果
図１及び図２は、測定結果を表として示すものである。また、図３及び図４は、測定結果をグラフで示すものである。MGO及びペントシジンについては拡大したグラフも併せて示す。図示するように、低温真空乾燥粉末と高温乾燥粉末の各熱水抽出液にはAGEs生成抑制作用がみられた。その作用は蛍光性AGEs、3DG、GO、ペントシジンにおいて低温真空乾燥粉末が強かった。MGOの生成阻害作用は両サンプルともにアミノグアニジンと同等以上に強かった。CMLの生成阻害作用は高温乾燥粉末が約2倍強かった。

図５は、糖化反応によるAGEsの生成過程の概略と、この生成過程において黒ガリンガルのAGEs生成阻害能の推定作用ポイントを示している。「×」を付した過程が推定作用ポイントである。また、○で囲んだ物質が本実施形態で生成阻害作用を評価した物質である。上述した測定結果から黒ガリンガルは生体内糖化反応の多経路を抑制する可能性があった。
＜効果＞

本実施形態により、黒ガリンガル抽出物を有効成分とする蛋白質糖化反応阻害剤などを提供することができる。
＜実施形態２＞

黒ガリンガル抽出物にAGEsが関与する架橋構造を分解（切断）する作用があるかについて検証する。実施形態１で示したように蛋白質は糖化反応により様々な経路でAGEsへ至る。

ここで、AGEsの生成に至る中間体である糖化反応中間体として例示したグリオキサール（GO）、メチルグリオキサール（MG）、３−デオキシグルコソン（3DG）は、いずれも分子内に２つのカルボニル基(C＝０）を有するα−ジカルボニル化合物である。

このα−ジカルボニル化合物は反応性に富んでおり蛋白質間に架橋を形成し、例えば生体内のコラーゲン分子間で架橋を形成する。正常な状態の皮膚や骨は、酵素の作用を介して遺伝的に規定された部位に秩序立って形成される架橋（生理的架橋）により皮膚や骨の適正な柔軟性や強度を維持しているが、α−ジカルボニル化合物による無秩序で余分に形成される架橋は皮膚の硬化や骨の脆弱化をもたらす。

このようなα−ジカルボニル化合物を分解することは、ＡＧＥｓの生成及び蓄積を抑制するとともに、糖化反応により形成された無秩序で余分な架橋を分解し、皮膚の硬化や骨の脆弱化などを回復させるために有効であると考えられる。

このような架橋を分解する化合物としてN?フェナシルチアゾリウムブロミド（N-phenacylthiazolium bromide: PTB）が報告されている。PTBはαジケトン構造のC?C結合を切断分解することで血管内のAGEsの蓄積を抑制し、糖尿病性血管合併症の治療に寄与する可能性が示唆されている。このため本作用は糖化ストレスの治療的なアプローチとして注目されている。
＜試験＞

≪１≫試験概要
以下の試験ではαジケトン構造を有する1-フェニル-1,2-プロパンジオン（1-phenyl-1,2-propanedione: PPD）をモデル基質とした反応系を使用して、AGEs架橋切断作用を評価する。ポジティブコントロールとしてはPTBを使用した。

≪２≫方法
試験サンプルには各熱水抽出液（サンプル溶液）を使用した。架橋切断作用のポジティブコントロールとしてはPTBを使用した。

AGEs架橋切断作用の測定にはサンプル溶液または10mmol/L PTB、10 mmol/L PPD、0.2mol/Lリン酸緩衝液（pH7.4）を5:1:4の割合で混合し、37℃で8時間反応させた（n=3）。反応終了後、塩酸を加えて反応停止させた。
反応液は20℃、3,000×gで10分間遠心分離し、上清中の安息香酸量を逆相HPLCで分析した。反応液中の安息香酸量は、別途測定したサンプル中の安息香酸量を差し引いて求めた。1molのPPDは1molの安息香酸を生成することから、以下の式で架橋切断率を算出した。架橋切断の相対値はPTBの架橋切断率を100としたときの値を求めた。
架橋切断率（%）= {(A -B)/C} ×100
A：反応液中の安息香酸量
B：サンプル中の安息香酸量
C：反応に供したPPD量（基質量）

≪３≫結果
図６は、測定結果を表として示すものである。また、図７は、測定結果をグラフとして示すものである。低温真空乾燥粉末と高温乾燥粉末の各熱水抽出液にはAGEs架橋切断作用がみられた。その作用は低温真空乾燥粉末が強かった。
＜効果＞

本実施形態により、黒ガリンガル抽出物を有効成分とするAGEs架橋切断剤などを提供することができる。
＜実施形態３＞

黒ガリンガル抽出物に酸化蛋白質分解酵素の活性を増強する作用があるかについて検証する。酸化蛋白質分解酵素(oxidized protein hydrolase: OPH)は、蛋白質のN末端アシル化アミノ酸を遊離するセリンプロテアーゼの一種で、アシルアミノ酸遊離酵素(acylamino-acid releasing enzyme: AARE) 、アシル化ペプチド分解酵素(acylpeptide hydrolase: APH)などとも言われている。OPHはブタ肝臓、ラット脳、ヒト血液、角層などの生体組織に広く存在している。OPHは酸化蛋白質や糖化蛋白質を優先的に分解するとともにプロテアソームと協働して老化した蛋白質を分解すること、アルツハイマー病の原因であるアミロイドβを減少させることが報告されている。またOPHがAGEsを分解することも確認されている。
＜試験＞

≪１≫測定概要
本測定ではOPHとその反応基質であるN-acetyl-L-alanine p-nitro-anilide（AAPA）との反応系に試料溶液を添加し、OPHの酵素反応への影響を評価した。なお、サンプルについては実施形態１の試験と同様に調製した。

≪２≫方法
OPHとしてacylamino-acid releasing enzyme (AARE)、OPHの反応基質としてN-acetyl-L-alaninep-nitroanilide(AAPA) 溶液を使用した。測定にはOPHを0.01 U/mL、0.005 U/mL、0.001 U/mLに調製して使用した。96ウェルマイクロプレートの各wellにOPH、AAPA、試料溶液を混合添加し、37°Cに設定したインキュベーター内で4時間反応させた反応液の405nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。OPHの酵素活性は1時間当たりの吸光度変化量（反応速度）を求めた。同時にreference(Ref)として試料無添加時の反応速度を求め、下式に従ってRefの反応速度を100%とした時の活性増強作用を算出した。OPH活性増強作用ネガティブコントロールにはエピガロカテキンガレート（EGCg）を使用した。

≪３≫結果
図８（ａ）に測定結果を示す。図８（ｂ）はグラフで示したものである。図示するように、黒ガリンガル抽出液はOPH活性を試料無添加時（Ref）よりも約２倍増強させる作用がみられた。
＜効果＞

本実施形態により、黒ガリンガル抽出物を有効成分とするOPH活性増強剤などを提供することができる。

Claims

黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を有効成分として含有する蛋白質糖化反応阻害剤。
請求項１に記載の蛋白質糖化反応阻害剤を含有する医薬品。
請求項１に記載の蛋白質糖化反応阻害剤を含有する食品。
請求項１に記載の蛋白質糖化反応阻害剤を含有する医薬部外品。
請求項１に記載の蛋白質糖化反応阻害剤を含有する食品添加物。
請求項１に記載の蛋白質糖化反応阻害剤を含有する化粧品。
黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を有効成分として含有するAGEs架橋切断剤。
請求項７に記載のAGEs架橋切断剤を含有する医薬品。
請求項７に記載のAGEs架橋切断剤を含有する食品。
請求項７に記載のAGEs架橋切断剤を含有する医薬部外品。
請求項７に記載のAGEs架橋切断剤を含有する食品添加物。
請求項７に記載のAGEs架橋切断剤を含有する化粧品。
黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を有効成分として含有するOPH活性増強剤。
請求項１３に記載のOPH活性増強剤を含有する医薬品。
請求項１３に記載のOPH活性増強剤を含有する食品。
請求項１３に記載のOPH活性増強剤を含有する医薬部外品。
請求項１３に記載のOPH活性増強剤を含有する食品添加物。
請求項１３に記載のOPH活性増強剤を含有する化粧品。