KR20190047582A - 식물성 소재의 2단계 순차적 효소처리 추출물과 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물과 상기 추출물을 함유하는 미백, 보습, 피부탄력 및 주름개선 기능성 화장료 조성물, 그리고 상기 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

식물성 소재의 2단계 순차적 효소처리 추출물과 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법 {Two Step-sequential Enzyme treated extract of Plant originated materials, its functional cosmetic composition comprising the same and method producing the same}

본 출원은 식물성 소재의 2 단계 순차적 효소처리 추출물 특히 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 효소처리 추출물, 그 제조방법 및 상기 추출물을 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 웰빙 문화의 정착과 소비자들의 생활 소비 수준이 높아짐에 따라 과거에 비하여 천연물을 소재로 한 화장품이 각광받고 있다. 특히 동물성 콜라겐과 같은 동물성 소재를 이용한 화장품의 사용을 피하고 식물성 단백질이나 아미노산 성분을 사용한 각종 미백, 항노화, 항주름 기능을 살린 화장품 산업이 각광을 받고 있다. 또한, 지난 수십 년에 걸쳐 화장품 산업은 다양한 화장품 제제 및 제품 내에 식물 및 식물 생산물의 사용을 수용하여 왔다. 이러한 경향이 계속될 것으로 예상되나, 화장품 산업 및 소비자에게 흥미로운 특성들을 일관되게 나타내는 더 정제되고 더 높은 품질의 식물 성분이 요구되고 있다.

식물성 화장품의 성분으로 사용될 수 있는 당근에서 유래한 당 단백질은 콜라겐 생합성 시 사용되는 히드록시프롤린이 다량 함유되어 있는데 히드록시프롤린은 동물 콜라겐 이외에는 발견되기 어려운 단백질이다. 또한, 글리신 함량은 동물성 콜라겐 펩타이드에 함유된 것과 유사한 것으로 알려져 있다. 당근 당 단백질은 일차 세포벽의 중요한 구성 단백질로서 외부의 자극에 대해 방어 역할을 하며 아미노산의 조성에서 볼 때 분자 측쇄에 수산기를 가진 세린의 함량이 높기 때문에 보습력이 뛰어나며, 인체 내에서 콜라겐의 생합성이 용이한 것으로 알려져 있다.

느타리버섯은 다양한 기능을 가진 기능성 식품으로 식용 뿐 아니라 약용으로도 널리 사용되고 있다. 느타리버섯에는 단백질과 지방 함량이 높고, 이중 alanine, methionine, arginine, aspartic acid, serine, isoleucine, threonine 등의 아미노산이 함유되어 있다. 또한 느타리버섯에는 비타민 D2의 모체인 에르고스테롤이 많이 함유되어 콜레스테롤 수치를 낮추어 고혈압과 동맥경화 등을 예방한다. 또한, 느타리버섯 내에는 lactic acid, oxalic acid, fumaric acid, succinic acid, malic acid등의 유기산과 trehalose, glucose, fructose 등의 유리당이 함유되어 있다.

또, 화장품 원료로 사용될 수 있는 솔잎에는 인체를 형성하는 중요한 단백질원인 필수 아미노산이 풍부하게 들어 있는데 이것은 체내에서 합성될 수 없으므로 외부로부터 섭취할 수밖에 없다.

동의보감에서는 솔잎을 오랫동안 생식하면 늙지 않고 원기가 왕성해지며 머리가 검어지고 추위와 배고픔도 모른다고 하였고, 향약집성방에서는 솔잎 적당량을 좁쌀처럼 잘게 썰어 갈아먹으면 몸이 거뜬해지고 힘이 솟으며 추위를 타지 않는다는 효능을 소개하고 있다.

이러한 솔잎 성분 가운데 중요하게 거론되는 것이 공기 중으로 날아가는 휘발성 성분인 테르펜(terpene)으로써,현재 솔잎의 테르펜은 밝혀진 것만 40종이 넘는데 가장 많은 성분은 알파-피넨, 베타-피넨, 베타-펠란드렌, 베타-카료필렌, 미르센, 캄페인, 알파-테르피놀렌 등이다.또한 상기 솔잎에 들어 있는 지방산은 동물성 지방산과 같은 식물성 지방과는 다른 리놀렌산이 약 20%로서 가장

많이 들어 있고, 그 다음이 팔미트산으로 10%를 차지하고 있으며, 이외에도 쉽게 산화되지 않는 5-올레핀산을 비롯해 고도불포화지방산이 많이 들어있다.

본 발명에 사용된 1 단계 탄수화물 분해효소는 목재부후균 유래 자일라제(EC 3.2.18) 및 버섯균주 유래 만나나제(EC 3.2.25) 단백질 분해효소는 Papaya Latex에서 유래 (EC 3.1.22.2, Endopeptidase) 한 Papain 및 Pineapple Stem 에서 유래 (EC 3.4.22.4, Protease)한 Bromelain 으로 모두 4 종의 식물성 유래의 분해효소만을 사용하여 동물성 콜라겐을 대체하는 식물 유래 화장품 소재 개발을 목표로 하였다.

이러한 배경 하에 본 출원인들은 식물성 원료만을 이용한 기능성 화장료를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과 상기 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 효소처리 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물의 기능을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원 관련 선행기술로는 대한민국 등록특허 제 10-0579170호가 공지되어 있으나 이는 당근 주정 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 대한민국 등록특허 제 10-0334608호가 있으나 이는 느타리버섯의 주정 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이외에도 대한민국 등록특허 제 10-1773452는 증숙 건조를 이용한 솔잎의 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 그리고, 공개특허 제10-2008-63711호는 동·식물성 유래의 소재를 열탕처리후 활성탄층을 통과시켜 유기산 용액에서 단백질을 효소가수분해하여 얻는 콜라겐 수득방법을 개시하고 있다.

그러나 본 출원의 식물성 재료중 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 3종의 소재를 2 단계 순차적 효소처리하여 얻은 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 이용한 화장료 조성물은 상기 선행문헌 어디에도 개시되어 있거나 암시된 바 없다.

본 발명자들은 2017.6.30자 이후에 정부과제보고서를 기초로 선출원한 특허출원 제10-2017-0145543호의 기술적 단점을 해결하기 위해 본 발명을 착수하고 완성하기에 이르렀다. 특히 본 발명자들은 상기 공지된 화장료용 식물성 원료를 xylase와 mannanase 효소 혼합물을 이용하여 2 단계 순차적 효소처리를 통하여 솔잎유래의 Terpene류를 완전히 분해시켜서 화장료 저장중 색상변화를 방지하고 함황 및 가지사슬 아미노산 함유농도를 증가시켜 피부탄력 및 주름개선 효과를 제공하였다.

따라서 본 출원의 목적은 식물성 재료 중에서 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 3종의 식물성 소재에 대하여 탄수화물 분해효소 xylase와 mannanase의 가장 바람직한 배합비 1:1(w/w)를 선처리한 후 papain과 Bromelain 단백질 분해효소를 2 단계 순차적으로 처리된 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 당근, 느타리버섯 및 솔잎 3종의 식물성 소재의 2 단계 순차적 효소처리 추출물 및 이를 함유하는 미백, 보습, 피부탄력 및 주름개선 기능성 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 실시 양태의 설명 및 실시 형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또, 본 출원에서는 콜라겐 추출물의 추출수율과 미백, 보습, 피부탄력 및 주름개선 기능성 향상을 위해 세포벽을 구성하는 불용성 다당류 즉 셀룰로오스 및 당단백 분해를 위해 식물성 기원의 탄수화물 분해효소를 전처리하는데 그 특징이 있다.

본 출원에서 사용된 탄수화물 분해효소는 식물 세포벽을 구성하는 불용성의 다당류 셀룰로오스의 가수분해를 촉진하는 고등식물의 싹(sprout), 목재부후균, 및 진균류 등 버섯균주 기원의 자일라나제 (xylanase; EC 3.2.18), 만나나제 (mananase: EC 3.2.25)가 가장 바람직하다.

본 출원에서 선택되는 상기 탄수화물 가수분해효소는 고순도의 경우 1.5 unit/mg 이상 사용될 수 있고, 저농도의 경우 11%(w/w)이상의 효소농도가 사용될 수 있다. 바람직하게는 각 탄수화물 분해효소는 5%(w/w)이상의 농도가 사용될 수 있으며 가장 바람직하게는 저순도의 효소를 5%(w/w) 이상을 사용한다.

본 발명자들이 확인한 바로는 상기 탄수화물 분해효소는 각 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 정제수 추출물에 바람직하기는 그 배합비율은 1:1(w/w)이 사용될 수 있다.

또, 본 출원의 목적을 달성하기 위하여 선택할 수 있는 단백질 분해 효소는 본 발명자들의 실험결과에 따르면 아미노산 또는 펩티드 혼합물을 만드는 효소로서, 펩티드 결합의 가수분해 작용에 관여하는 효소이다. 그 중에는 펩신, 펩티데이스, 트립신 등이 포함될 수 있으나 바람직하게는 식물성 기원의 단백 분해효소, 가장 바람직하게는 Papain (EC 3.4.22.2) 또는 Bromelain이다.

한편, 본 발명의 콜라겐 펩티드의 수율과 보습, 미백, 피부탄력 및 주름개선 기능을 증대시키기 위하여 단백질 분해효소처리 전에 탄수화물 분해효소처리를 선수행하여, 세포벽 구성물질인 셀룰로스 당단백을 분해하는 전처리가 반드시 선행되는 것을 그 특징으로한다.

본 출원에서 사용된 단백질 분해 효소는 고순도의 경우 1.5unit/mg 이상의 농도가 사용될 수 있고, 저농도의 경우 11% (w/w)이상의 효소 농도가 사용될 수 있다. 바람직하게는 각 단백질 분해 효소는 5% (w/w) 이상의 농도가 사용될 수 있으며 가장 바람직하게는 저순도의 효소를 5% (w/w) 이상의 농도로 사용할 수 있다.

본 출원에서 2 단계 순차적 효소처리 추출물의 제조를 위하여 해당 원료를 정제수를 이용하여 추출할 때 그 배합 비율은 바람직하게는 75%(w/w):25%(w/w)가 사용될 수 있고 pH는 5.5 내지 7.5의 범위가 사용될 수 있으나 가장 바람직하게는 중성범위 pH 7.0이다. 또한 추출 시간은 30분 내지 2시간 동안 추출할 수 있으나 바람직하게는 1시간 동안 추출할 수 있다.

본 출원에서 사용된 “미백 기능 성분”이란 멜라닌 억제 등 피부의 미백효과를 나타내는 성분을 지칭하며 닥나무추출물, 알부틴, 에칠아스코빌에텔, 유용성감초추출물, 아스코빌글루코사이드 그리고 나이아신아마이드(Niacinamide)가 있다. 이들 성분은 일정 농도 이상이 되어야 기능성 화장료 성분으로 인정받을 수 있다. 특히 나이아신아마이드는 수용성 비타민 B 복합체로 피부를 맑게하고 산화를 막아 피부건강을 유지하는 데에 도움이 되고 바람직하게는 2% 이상 함유하는 경우 기능성이 인정되고 있다.

본 출원에서 사용된 “보습력 평가”는 피부의 수분을 측정하는 것으로 Hydrometer, Tewanmeter, Corneometer가 사용될 수 있다. 바람직하게는 각질층 하방 30 내지 40 micrometer 깊이 이내의 수분함량을 일정하게 측정하는 Corneometer를 통하여 보습 효능이 측정될 수 있다.

이상 설명한 바와 같이 본 출원은 식물성 원료 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물 및 그 제조방법을 제공하는 효과가 있을 뿐 아니라, 상기 추출물을 함유하는 미백, 보습, 피부탄력 및 주름개선 기능성 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 출원의 당근, 느타리버섯, 솔잎 등 3종의 식물성 소재의 2 단계 순차적 효소처리 추출물의 제조 공정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 출원의 당근, 느타리버섯, 솔잎 등 3종의 식물성 소재의 2 단계 순차적 효소처리 추출물 제조에 있어서, 무효소 처리, 각 효소 각 Low purity(LP, 저순도) 및 High purity(HP, 고순도)에 따라 적용하여 얻은 시료들을 나타내는 사진도이다.
도 3은 본 출원의 당근, 느타리버섯, 솔잎 등 3종의 식물성 소재의 2 단계 순차적 효소처리하여 얻은 15종의 추출물을 Bovine Serum Albumin을 표준으로 Lowry Assay법에 따라 총 단백질 정량 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 출원의 당근, 느타리버섯, 솔잎 등 3종의 식물성 소재의 2 단계 순차적 효소처리 추출물 적용 크림의 제조 공정을 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 출원의 당근, 느타리버섯, 솔잎 등 3종의 식물성 소재의 2 단계 순차적 효소처리 추출물 적용 크림의 온도에 따른 성상 변화를 나타내는 사진도이다.
도 6은 Niacinamide 표준품 및 본 출원의 당근, 느타리버섯, 솔잎 등 3종의 식물성 소재의 2 단계 순차적 효소처리 추출물 적용 크림에서의 Niacinamide를 정량한 크로마토그래피이다.
도 7은 대조군 크림, 동물성 소재 (돼지) 콜라겐을 첨가한 크림 및 본 출원의 당근의 효소처리 추출물 크림의 측정 시간 별 수분 보유도 변화를 나타내는 그래프이다. (제품 #1: 대조군 크림, #2: 동물성 콜라겐을 첨가한 크림, #3: 당근 SEL (Papain) 크림, #4: 당근 ANFLA (Bromelain) 크림)

본 출원은 당근, 느타리버섯, 솔잎 등 3종의 식물성 소재의 각 단백질 분해효소처리 추출물 및 그의 제조방법을 개시한다.

더욱 구체적으로는. 본 발명은 상기 각 식물성 소재의 단백질 분해효소 처리전 식물 세포벽 분해와 세포내 함유된 Terpene 류 등 탄수화물의 제거를 위해 식물성 유래의 탄수화물 분해효소를 선처리한 후 단백질 분해효소를 처리하는 2 단계 효소처리를 순차적으로 수행하여 얻은 추출물의 아미노산 조성과 ?량(농도 mol%) 변화를 확인하였다.

이하, 본 출원에 따른 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만 본 출원의 하기 실시예는 본 출원의 일 예시에 불과하다. 이들 실시예는 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 출원의 범위가 이 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예 1. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물의 제조

당근, 느타리버섯 및 솔잎의 단백질 효소처리 추출물을 제조하기 위하여 효소는 Papaya Latex 기원의 Papain (EC 3.4.22.2) 및 Pineapple Stem 기원의 Bromelain (EC 3.4.22.4)을 사용하였고, 아무런 효소도 처리하지 않은 열수 추출물을 대조군으로 이용하였다. 효소의 순도는 고순도와 저순도의 두 종류를 사용하였으며, 고순도의 경우 Xylase, Mananase, Papain 및 Bromelain≥1.5 unit/㎎ Protein, 저순도의 경우 Xylase, Mananase, Papain 및 Papain, Bromelain≥식물성 Protease 11%를 사용하였다. 효소 처리 추출 조건은 하기 표1과 같다.

구분	효소 농도 (%)
효소	저순도	고순도
원료(당근, 느타리버섯, 솔잎) (%)	25	25
정제수 (%)	75	75
효소 처리농도(%)	5.0	5.0

구체적으로, 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 효소처리 추출물의 제조를 위하여 각 해당 원료 당근, 느타리버섯 및 솔잎을 정제수(추출용매)에 그 배합비율이 75%(w/w): 25%(w/w)이 되도록 용해한 후 중성조건 pH 7.0, 60℃에서 1시간 동안 추출하였다. 상기 열수추출물에 각 저순도 및 고순도의 xylase와 mananase 중량비 1:1 배합효소를 5%(w/w)를 각각 처리하여 10~20분간 교반, 탄수화물을 분해자화시켰다. 이어서, 각 저순도 및 고순도의 Papain 또는 Bromelain을 각각 5% (w/w) 처리를 순차적으로 수행하고 각각 10 내지 20분 동안 교반하였다. 대조군 시료에는 상기 효소들의 처리를 생략하였다. 교반시킨 상기 효소처리 추출물은 효소 불활성화를 위하여 80 내지 85℃ 온도에서 30분간 처리하여 추출을 종료한 후 20 내지 25℃의 실온에서 냉각시켰다. 한편, 상기 냉각시킨 상기 효소처리 추출물에서 원료를 제거하고 여과시킨 후 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 추출물에 대하여 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 수득하였다 (도 1).

상기 수득한 추출물은 원료 3종을 대상으로 각 효소를 적용하지 않은 대조군 추출물, 고순도(High Purity) 및 저순도(Low Purity)의 각 Papain(SEL) 효소처리 추출물, 고순도(High Purity) 및 저순도(Low Purity)의 각 Bromelain(ANFLA) 추출물의 5개의 시료로, 총 15개의 2 단계 순차적 효소처리 추출물이 제작되었으며, 확인 결과 2 단계 순차적으로 Papain 또는 Bromelain 단백질 분해효소를 처리한 추출물 모두 대조군 시료에 비하여 외색이 진해지고 그 색상의 진함의 정도는 처리한 단백질 분해효소의 종류나 순도에 따라 각각 다르게 나타났다 (도 2).

실시예 2. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물의 총 단백질 함량 측정

상기 실시예 1에서 제조된 15종의 효소 추출물을 대상으로 각 추출물간 단백질 함량 차이를 확인하기 위해 Lowry Assay법에 따라 총 단백질을 정량하였다. 본 정량은 BSA (Bovine Serum Albumin)를 표준품으로 사용했으며, 단백질 정량을 위한 BSA의 농도별 표준 검량선 (Standard Curve)을 사용하였다 (도 3). 상기 검량선 그래프에 따르면 BSA의 표준 검량선의 R²값은 0.9971로 확인되어 본 표준 검량선을 토대로 추출물 15종의 총 단백질을 정량했으며 그 결과는 하기 표 2 내지 4 (당근, 느타리버섯, 솔잎)와 같다.

당근 추출물	Carrot Extract	Carrot SEL Extract LP	Carrot SEL Extract HP	Carrot ANFLA Extract LP	Carrot ANFLA Extract HP
Total Protein (ppm)	555/575	562/592	560/580	616/654	717/763

[보기] 단백질 단독분해효소처리 추출물/ 탄수화물 가수분해효소 처리후 단백질 분해효소의 2 단계 순차적 효소처리 추출물

느타리버섯 추출물	Mushroom Extract	Mushroom SEL Extract LP	Mushroom SEL Extract HP	Mushroom ANFLA Extract LP	Mushroom ANFLA Extract HP
Total Protein (ppm)	536/578	539/585	582/632	559/598	547/572

[보기] 상기 [표 2]와 동일함.

솔잎 추출물	Pine Extract	Pine SEL Extract LP	Pine SEL Extract HP	Pine ANFLA Extract LP	Pine ANFLA Extract HP
Total Protein (ppm)	586/612	554/594	558/598	548/593	671/702

[보기] 상기 [표 2]와 동일함.

이상에서 서로 다른 원료 3종을 대상으로 한 각 단백질 분해효소처리 추출물 15종의 단백질 함량을 분석한 결과, 각 추출물별 단백질 함량은 비교적 일정한 수준을 유지하였다. 즉 당근을 원료로 한 추출물의 단백질 함량은 575~763 ppm (0.058~0.076 %), 느타리버섯을 원료로 한 추출물은 572~678 ppm (0.06~0.07 %), 솔잎을 원료로 한 추출물은 593~702 ppm (0.06~0.07%)으로 확인되었다. 상기 추출물 중 당근과 솔잎을 원료로 한 추출물에서 총 단백질 함량은 고순도 Bromelain을 적용했을 시, 그리고 느타리버섯을 원료로 한 추출물의 경우 고순도 Papain을 적용했을 시 총 단백질 함량이 가장 높았다. 결과적으로 본 실험에서 적용한 효소의 순도가 총 단백질 함량에는 그리 큰 영향을 미치지 않았으므로 본 발명 크림 제조시에는 저순도 효소로 처리한 추출물을 적용하였다. 이와 같은 결과는 상기 각 3종의 원료를 대상으로 하는 단백질 분해효소 처리전 탄수화물 분해효소로 자일라제 (EC 3.2.18)와 만나나제 (EC 3.2.25) 1:1 (w/w) 혼합물을 5% (w/w) 선처리한 결과에서도 큰 차이가 없었고 다만 15종의 총단백질 함량 (ppm)이 각각 5~10% 증가되었음이확인되었다.

실시예 3. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물의 아미노산 함량 측정

상기 실시예 1에서 제조된 2 단계 순차적 효소추출물 내 아미노산을 정량하여 효소 처리의 여부가 아미노산 조성 및 함량 변화에 어떠한 영향을 미치는지를 측정하였다.

우선 당근을 원료로 한 추출물 내 아미노산 조성 및 정량 결과에 따르면 3종의 추출물(효소 무처리 및 xylase 와 mannanase 1:1 혼합효소 처리후 즉시 Papain 처리 또는 Bromelain의 순차적 처리)에서 효소 처리 여부에 관계없이 가장 많은 비중을 차지하는 아미노산은 Alanine 이었다. 효소 무처리 시료(수추출물)에서의 Alanine은 약 48%로 이는 전체 아미노산의 절반에 가까운 수준이었다. 여기에 단백질 분해효소를 처리할 경우 그 농도는 감소하여 Papain 처리시 예컨대, 최고함량을 가지는 Alanine 농도는 약 34%로 효소 무처리 시료 대비 약 29%가 낮아졌고, Bromelain 처리시에는 약 29%로 효소 무처리 시료 대비 약 40%의 감소를 보였다. 한편, 단백질 분해효소 처리로 함황아미노산 MET 농도가 5~7 배 증가되고 또, 가지사슬 아미노산 VAL, ILE 및 LEU의 농도도 각각 1.5~1.6, 1.7~2.7 및 2.7~6.6 배가 증가됐다 (표5).

Amino Acid	효소무처리 (mol%)	단백질분해효소 단독처리 (mol %)		탄수화물 분해효소 순차처리 (mol %)
		Papain	Bromelain	Papain	Bromelain
CYS★	0.00	0.00	0.00	1.05	1.47
ASP	8.91	7.16	4.95	6.18	3.65
GLU	3.11	6.57	0.40	5.95	0.35
ASN	7.17	6.26	8.84	5.92	5.85
SER	9.31	6.55	6.86	6.11	5.88
GLN	0.87	2.36	2.17	2.31	2.15
GLY	1.10	4.83	2.49	4.15	2.53
HIS	0.39	0.51	0.56	0.67	0.65
ARG	0.53	1.94	3.27	2.03	3.32
THR	1.52	1.94	2.05	2.01	2.09
ALA	47.83	33.85	29.10	22.28	16.36
PRO	3.22	3.18	2.59	3.02	2.62
TYR	0.46	0.89	3.63	0.93	2.72
VAL*	2.91	4.49	4.68	8.98	9.37
MET★	0.35	1.54	2.45	4.12	5.08
ILE*	2.00	3.49	5.44	8.21	11.72
LEU*	0.85	2.32	5.57	5.78	12.84
PHE	5.44	2.60	5.61	2.68	3.64
TRP	0.32	1.38	1.75	1.44	1.83
LYS	3.72	8.14	7.58	6.18	5.88
TOTAL	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00

[보기] ★ 함황아미노산, * 가지사슬아미노산.

특히, 틴수화물 분해효소 (xylase와 mannanse 1:1(w/w)혼합물) 처리를 선행한 후 2 단계로 단백질 분해효소 papain 또는 bromelain을 순차적으로 처리한 경우 함황아미노산 CYS와 MET이 각각 1 mol%와 4~5 mol% 이상 농도를 가지며 가지사슬아미노산 VAL, ILE 및 LEU의 농도도 각각 2배 이상 증가되었다.

또, 느타리버섯을 원료로 한 효소추출물의 아미노산 조성 및 정량 결과에 따르면, 당근을 원료로 한 수추출물과 마찬가지로 Alanine 함량이 가장 높았는데, 효소 처리 전 농도는 약 37%였고, Papain 단독처리시 33%, Bromelain 단독처리시 25%로 점차 낮아졌음을 확인하였다. Alanine 다음으로 높은 비중을 차지하는 아미노산은 Tryptophan으로 효소 처리전 12%였고 Papain 단독처리시 10%, Bromelain 단독처리시 9%로 낮아져 단백질 분해효소 단독처리를 통해 농도가 감소하였고, 이는 Alanine에서와 동일한 결과를 나타냈다. 한편, 느타리버섯을 원료로 한 본 발명 2 단계 순차적 효소처리 추출물 역시 함황아미노산 cystine과 methionine의 농도가 8~9배, 가지사술아미노산 valine, isoleucine 및 leucine 농도함량이 2~3배 각각 높아짐을 확인할 수 있었다 (표 6).

Amino Acid	효소 무처리 (mol%)	단백질 분해효소 단독처리 (mol %)		탄수화물 분해효소 순차처리 (mol %)
		Papain	Bromelain	Papain	Bromelain
Cys★	0.00	0.00	0.00	0.87	0.98
ASP	2.63	1.49	1.92	1.22	1.62
GLU	7.93	6.25	1.47	5.81	1.21
ASN	1.23	1.65	3.84	1.35	3.26
SER	2.93	3.37	3.78	2.64	2.91
GLN	2.79	5.54	4.19	4.82	3.84
GLY	1.91	4.26	2.74	3.75	1.99
HIS	1.90	1.98	1.60	1.62	1.23
ARG	4.85	5.00	4.87	3.89	3.65
THR	2.91	3.11	3.12	2.74	3.06
ALA	36.75	32.81	24.57	27.63	19.01
PRO	2.13	2.21	1.84	1.85	1.62
TYR	2.53	2.57	4.75	1.63	2.92
VAL*	3.85	4.17	5.73	8.54	11.72
MET★	0.21	0.65	2.07	2.22	8.24
ILE*	2.42	3.05	6.30	6.21	10.28
LEU*	3.49	4.52	6.76	9.14	13.18
PHE	4.27	3.91	5.37	2.79	1.94
TRP	12.02	10.20	8.73	8.32	5.13
LYS	3.23	3.25	6.36	2.96	2.21
TOTAL	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00

[보기] ★ 함황아미노산 * 가지사슬아미노산

마지막으로 솔잎을 원료로 한 추출물 내 아미노산 조성 및 정량 결과에 따르면 상기 당근 및 느타리버섯을 원료로 한 추출물의 아미노산 조성과는 많은 차이를 보였다. 이 경우 효소 무처리시 가장 높은 비중을 차지한 아미노산은 Arginine (약 31%)과 Glycine (약 24%)이었고 이 두 종류의 아미노산이 전체 아미노산의 절반 이상을 차지하였다. 여기에 Papain을 단독처리할 경우 Arginine(ARG)과 Glycine(GLN)의 함량은 현저히 줄어드는 반면, Alanine(ALA)과 Proline(PRO)의 비중이 각각 약 13%로 증가하였다. Bromelain을 단독처리했을 경우는 Arginine(ARG)과 Glycine(GLN) 함량은 Papain으로 단독처리했을 때와 마찬가지로 유사하게 줄어든 반면, Asparagine(ASP), Arsene(ASN)의 함량은 각각 2배, 3배로 증가하였다 (표 7).

한편, 솔잎을 원료로 한 본 발명 2 단계 순차적 효소처리 추출물 역시 함황아미노산 농도가 CYS의 경우 2~3배, MET의 경우 2~2.5배 각각 증가하였고, 가지사술아미노산 농도함량도 VAL 각각 약 40 %, 20%, ILE 약 30%, 60% 및 LEU 약 50%, 50% 이상 증가하였다.

Amino Acid	효소 무처리 (mol%)	단백질 분해효소 단독처리 (mol %)		탄수화물 분해효소 순차처리 (mol %)
		Papain	Bromelain	Papain	Bromelain
Cys★	0.58	0.00	0.00	2.13	3.12
ASP	1.58	2.11	5.65	1.93	4.11
GLU	0.00	3.84	1.83	3.11	1.63
ASN	1.51	5.38	17.72	4.86	15.42
SER	6.66	3.37	4.21	3.15	3.68
GLN	8.41	1.34	1.32	1.03	1.13
GLY	23.54	14.10	3.36	12.8	3.25
HIS	6.10	0.89	0.74	0.64	0.51
ARG	30.66	5.48	5.57	4.92	4.26
THR	1.64	2.15	2.25	1.86	2.14
ALA	7.93	12.94	11.78	11.14	9.42
PRO	4.11	12.79	8.35	10.92	7.09
TYR	0.92	5.05	3.92	4.87	3.15
VAL*	0.49	5.23	6.53	4.35	7.98
MET★	0.64	3.89	1.95	8.13	5.21
ILE*	0.38	6.35	5.07	8.35	8.27
LEU*	0.36	4.63	6.36	7.31	9.24
PHE	1.36	4.83	4.66	3.56	3.17
TRP	1.37	3.33	3.32	3.05	3.03
LYS	1.77	2.30	5.41	1.89	4.19
TOTAL	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00

[보기] ★ 함황아미노산 * 가지사슬아미노산

제조예 1. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 효소처리 추출물을 함유하는 크림 제조

상기 실시예1에서 수득한 추출물을 이용하여 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림을 제조하였다. 크림에 함유된 전성분과 배합비는 하기 표 8에 기재된 바와 같이 사용하였고 3종의 원료당 효소 무처리, Papain 순차적 처리, Bromelain 순차적 처리의 군의 3종류로, 총 9종의 크림을 제조하였다.

상기 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물의 크림을 제조하기 위하여, 우선수상 및 유상에 해당되는 각각의 성분들을 계량하여 서로 다른 온도(수상의 경우 60 내지 70℃, 유상의 경우 70 내지 80℃)에서 용해하여 균일하게 혼합한 후, 수상에 유상 성분을 첨가한 후 2000 내지 3000RPM의 교반속도에서 7 내지 13분간 유화(Emulsification)를 진행하고, 상기 유화를 마친 시료를 35 내지 40℃에서 냉각시킨 후 점증(Thickening)과정을 진행하였다. 상기 점증을 마친 시료는 고온의 유화공정 중 첨가로 인한 원료 고유 기능의 손실을 방지하기 위한 유효 기능성분을 첨가하고 크림 제품에 대한 품질관리 후 이상 여부를 확인하여 이상이 없을 경우 제품 포장을 하였다 (도4).

	INCI Name (Product Name)	함량 (%)
A	당근 추출물 / 느타리버섯 추출물 / 솔잎의 2 단계 순차적 효소 추출물 1)	to 100
	Glycerin	1 ~ 10
	Butylene Glycol	1 ~ 10
	1,2-Hexanediol	1 ~ 10
	Niacinamide	1 ~ 10
	Betaine	Max 1.0
	Adenosine	Max 0.1
	Disodium EDTA	Max 0.1
B	Stearic Acid	1 ~ 10
	Cetostearyl Alcohol	1 ~ 10
	Shea Butter	1 ~ 10
	Polysorbate-60	Max 1.0
	Sorbitan Stearate	Max 1.0
	Polyglyceryl-3 Methylglucose Distearate	1 ~ 10
	Hydrogenated Polydecene	1 ~ 10
	Caprylic/Capric Triglyceride	1 ~ 10
	Macadamia nut oil	1 ~ 10
	Olive Oil	1 ~ 10
	JoJoba Oil	Max 1.0
	Dimethicone	Max 1.0
	Cyclopentasiloxane	1 ~ 10
C	Sodium acrylate/Sodium Acryloyldimethyl taurate	1 ~ 10
D	Sodium Hyaluronate	1 ~ 10
	Sodium Polyglutamate	1 ~ 10
	Centella Asiatica	Max 0.1
	Copper Tripeptide-1	Max 1.0
	Centella Asiatica Extract	Max 1.0
	Ethylhexylglycerin	Max 0.1
	Fragrance	Max 0.1
Total		100.00%

_{1) 적용 추출물 - 당근 추출물 : Carrot Extract, Carrot SEL Extract, Carrot ANFLA Extract (총 3종)}

_{- 느타리버섯 추출물 : Mushroom Extract, Mushroom SEL Extract, Mushroom ANFLA Extract (총 3종)}

_{- 솔잎추출물 : Pine Needle Extract, Pine Needle SEL Extract, Pine Needle ANFLA Extract (총 3종)}

제조예 2. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 화장수 제조

상기 실시예1에서 얻은 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물이 함유된 화장수를 하기 표 9과 같이 제조하였다.

원료	원 료	함량(중량%)
1	본 출원 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2단계 순차적 효소처리 추출물	10.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌 글리콜	2.0
4	프로필렌 글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

제조예 3. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 로션 제조본 출원 상기 실시예1에서 얻은 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물이 함유된 로션을 하기 표 10과 같이 제조하였다.

원료	원 료	함량(중량%)
1	본 출원 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물	10.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비단 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비단 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린신 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

제조예 4. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 에센스 제조

본 출원 상기 실시예1에서 얻은 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물이 함유된 에센스를 하기 표 11과 같이 제조하였다.

함량	원 료	함량(중량%)
1	본 출원 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물	10.0
2	시토 스테롤	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
4	세라마이드	0.7
5	스테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	농글리세린	5.0
9	마카다미아 오일	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.2
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	젱제수	잔량

실험예 1. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 온도 안정성 및 외관 측정

상기 실시예 4에서 제조된 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 온도 안정성 및 외관을 측정하기 위하여, 상기 크림을 실온 (25℃ 항온), 변온 (-4 ~ 50℃), 고온 (50℃, 항온) 등 서로 다른 온도에서 30일간 보관하면서 이들 크림의 안정도 및 외관을 확인하였다. 상기 변온(變溫) 조건이란, 하루 (24시간) 중 각각 -4℃에서 8시간 , 25℃에서 8시간, 50℃에서 8시간으로 온도 변화를 수반하는 조건을 의미한다.

실험 결과, 당근 또는 느타리버섯의 2 단계 순차적 효소 처리 추출물을 함유하는 크림은 온도 조건에 따라 큰 차이를 보이지 않았고, 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 경우 실온 및 변온 조건에서는 변화가 없었으나, 고온 보관 중 색상이 미황색으로 변한 것을 확인하였다 (도 5).

이는 크림제조시 솔잎에 다량 함유된 테르펜 (Terpene) 등의 불포화 탄화수소가 가온과정에서 잔류하는 테르펜류가 보관 중 색상 변화를 수반한 것으로 판단되었다. 그러나, 본 발명 탄수화물 분해효소를 선처리하고 2 단계로 papain 및 bromelain을 순차적으로 처리한 본 출원에서 개발한 크림 9종에서는 보관중 일체의 색상변화를 발생시키지 않았는 바, 이는 선처리한 xylase와 mananase 효소가 상기 테르펜류의 화합물을 모두 분해한 것으로 판단된다.

실험예 2. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 점도 측정

상기 제조예 1에서 제조된 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 총 9종 (각 원료 추출물 당 무효소 처리군, Papain, Bromelain처리 군) 시료에 대하여 온도(실온, 변온 및 고온 조건)별 점도 안정성을 확인하였다. 본 출원에서 점도(CPS)를 측정하는 모델로는 LVT(Manufacturer Brookfield)가 이용되었고 Measuring Temperature는 25℃, Spindle Number - 67, RPM은 6에서 수행되었다. 실온 보관을 제외한 변온 및 고온의 경우 모두 30일간 서로 다른 온도에서 보관 후 측정 전일에 25℃ 항온 배양기에 옮겨 보관 후 점도를 측정하였다.

실험 결과, 변온 조건에서의 점도는 모든 시료에서 실온 보관 대비 10% 미만으로 점도가 상승한 반면, 고온 조건에서의 점도는 전 시료에서 낮아졌다. 이중 당근과 느타리버섯을 원료로 한 크림에서는 실온보관 대비 10% 미만으로 점도가 낮아졌으나, 솔잎을 원료로 한 크림에서는 실온보관 시료 대비 10~20% 범위로 점도가 낮아졌다.

변온 조건에서는 4~50℃ 까지 급격한 온도 변화가 수반되어 고온에서는 조직의 경도가 다소 떨어지나 0℃ 이하 저온에서는 조직의 경도가 높아지는데, 이 작업이 반복되면서 최종 크림의 점도는 상승한 것으로 판단된다. 반면 고온 보관시에는 50℃에서 온도가 지속적으로 유지됨에 따라 크림 조직이 연화되어 실온 보관 크림에 비해 점도가 낮아진 것을 알 수 있었다. 점도 변화 외에 상분리 등 크림에서 확인될 수 있는 물성변화는 수반되지 않아 일반 크림에서 가장 문제가 되는 유화 안정도에는 큰 이상이 없음을 확인하였다.

본 출원 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 적정 점도 범위는 45,000 ~ 65,000 cps 로서, 9종 크림의 점도가 모두 이 범위 내에 해당되었으므로 가혹 온도조건에서도 점도는 큰 문제가 되지 않는 것을 확인하였다(표 12).

원물	시료명	실온 (25℃, 항온)	변온 (-4 ~ 50℃)		고온 (50 ℃)
			점도 (cps)	실온대비 점도 변화율	점도 (cps)	실온대비 점도 변화율 2)
당근	Carrot Cream 1)	57,300	59,300	3.49%	51,750	-9.69%
	Carrot SEL Cream	53,300	55,700	4.50%	48,500	-9.01%
	Carrot ANFLA Cream	52,200	54,800	4.98%	49,200	-5.75%
느타리버섯	Mushroom Cream	59,200	59,500	0.51%	54,000	-8.78%
	Mushroom SEL Cream	55,700	58,000	4.13%	51,500	-7.54%
	Mushroom ANFLA Cream	57,700	60,600	5.03%	55,300	-4.16%
솔잎	Pine Needle Cream	59,100	62,000	4.91%	48,600	-17.77%
	Pine Needle SEL Cream	55,000	55,500	0.91%	49,700	-9.64%
	Pine Needle ANFLA Cream	54,600	58,500	7.14%	47,500	-13.00%

_{[주] 1) Cream - 효소가 첨가되지 않은 대조군 크림 (Ex, Carrot Cream : 당근을 원물로 한 열수 추출물 적용 크림)}

실험예 3. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 pH 측정

상기 실시예 4에서 제조된 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 총 9종 (각 원료 추출물 당 무효소 처리군, xylase와 mananase 1:1(w/w) 혼합효소와 Papain, Bromelain의 순차적 처리 군) 시료에 대하여 온도(실온, 변온 및 고온 조건)별 pH를 확인하였다. 실온 보관을 제외한 나머지 두 제품군 모두 30일간 서로 다른 온도에서 보관 후 측정 전일에 25℃ 항온조에 옮긴 후 pH를 측정하였다.

실험 결과 9종의 크림 모두 실온에서 보관했을 때보다 변온 및 고온 보관시 pH가 낮아짐을 확인하였고, 이때의 표준 편차는 약 0.1 ~ 0.4 이었다. 서로 다른 크림별 pH는 6.0 ~ 7.2로 일정한 수준을 유지하였고, 대조군 크림의 pH 표준편차는 0.12의 범위로 일정했던 반면, 추출물 함유 크림의 경우 이보다는 pH 편차가 높았다. 이중 당근과 느타리버섯에 비해 솔잎을 원물로 한 크림의 pH의 편차가 높았으며, 실온보다 변온(-4 ~ 50℃) 및 고온조건에서 저장시 pH는 낮아졌다. 본 출원 9종의 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림에 대한 적정 pH 범위는 5.5~7.5로, 모든 개발 크림이 이 범위 안에 포함되므로 보관 온도별 pH는 문제되지 않음을 확인하였다 (표 13).

원료	시료명	실온 (25℃, 항온)	변온 (-4 ~ 50℃)	고온 (50 ℃)	표준편차
대조군	Cream (Std) 1)	6.8	6.59	6.6	0.12
당근	Carrot Cream 2)	6.75	6.55	6.37	0.19
	Carrot SEL Cream	6.98	6.77	6.3	0.35
	Carrot ANFLA Cream	6.47	6.3	6.19	0.14
느타리 버섯	Mushroom Cream	6.77	6.62	6.4	0.19
	Mushroom SEL Cream	6.64	6.5	6.36	0.14
	Mushroom ANFLA Cream	6.9	6.81	6.47	0.23
솔잎	Pine Needle Cream	6.98	6.68	6.38	0.30
	Pine Needle SEL Cream	6.87	6.61	6.39	0.24
	Pine Needle ANFLA Cream	7.1	6.81	6.36	0.37

_{[주] 1) Cream (Std) : 추출물 무첨가}

_{2) Cream - 효소가 첨가되지 않은 대조군 크림 (예: Carrot Cream은 당근을 원료로 한 열수 추출물 적용 크림)}

실험예 4. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 미백 기능 성분 측정

상기 실시예 4에서 제조된 당근, 느타리버섯 및 솔잎 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 총 6종 (각 원료 추출물 당 Papain, Bromelain처리 군) 시료에 대하여 온도(실온, 변온 및 고온 조건)별 Niacinamide의 양을 확인하였다. Niacinamide는 개발 크림군에 함유된 미백 기능 성분 중 하나로 온도변화에 따라 기능성분의 농도변화가 수반되는지를 식품의약품안전처 발행 “기능성 화장품 기준 및 시험방법”중 “나이아신아마이드 크림제”정량법을 참고하여 확인하였다. Niacinamide 측정을 위하여 검출은 자외부 흡광 광도계 (측정파장 : 263 ㎚)를 이용하였고 칼럼은 안지름 약 4.6 ㎛, 길이 약 25㎝ 인 스테인레스관에 5㎛의 액체크로마토그래프용 옥타데실릴화한 실리카겔을 충전하여 사용하였다. 이동상은 0.05M 인산이수소칼륨용액 (pH 7.0, 25% 수산화 나트륨액)과 메탄올 혼합액 (75 : 25)이 사용되었고 유속은 1.0 ㎖ / min로 사용되었다. Niacinamide의 함량 변화는 HPLC로 정량하였으며 시료당 3회 반복 측정에 대한 평균값을 구하고 정량 수치간 차이는 표준 편차를 통해 확인하였다. 본 실험예에서 사용된 온도는 앞선 실험과 같이 실온(25℃), 변온 (-4 ~ 50℃), 고온(50℃)이었으며, 보관기간은 30일이었다. 실온 보관 시료를 제외한 나머지 온도에서 보관한 시료는 측정 전날 25℃ 항온 인큐베이터에서 1일간 보관한 후 기능성 정량을 수행하였다.

실험결과, 크림에 포함된 미백 기능 성분인 Niacinamide는 실온에서 모든 크림에 약 2.0%씩 첨가되어 있었고, 서로 다른 온도 조건에서 보관한 크림 내 함유된 Niacinamide 함량은 시료별 큰 차이를 보이지 않았다. 당근 중 Papain 효소 첨가 크림과 느타리버섯을 원료로 한 2종 크림의 표준편차 범위는 0.03 ~ 0.04로 측정한 시료군 중 가장 적었다. 이외 다른 크림에서의 표준 편차는 0.15 미만으로 실온, 온도변화 및 고온 조건에서의 Niacinamide 정량수치는 큰 차이를 보이지 않았다. 즉, 크림 내 첨가된 미백 기능성분인 Niacinamide는 서로 다른 온도 조건에서 일정하게 유지되어, 이들 모두 화학적으로 안정한 제품임을 확인하였다 (표 14, 도 6).

원료	시료명	실온 (25℃, 항온)	Cycling Temp. (-4 ~ 50℃)	고온 (50 ℃)	표준편차 1)
무첨가	Cream	2.02	2.08	1.81	0.14
당근	Carrot SEL Cream	2.05	2.07	2.11	0.03
	Carrot ANFLA Cream	2.22	1.94	2.13	0.14
느타리버섯	Mushroom SEL Cream	2.07	2.09	2.15	0.04
	Mushroom ANFLA Cream	2.04	2.03	2.11	0.04
솔잎	Pine Needle SEL Cream	2.07	2.01	2.06	0.03
	Pine Needle ANFLA Cream	2.08	1.91	1.97	0.09

_{[주] 1) 서로 다른 온도에서 보관한 3종 크림 내 Niacinamide 정량 수치간 표준편차}

실험예 5. 당근의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 보습력 평가

상기 실시예 4에서 제조된 당근의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림을 대상으로 in vivo 보습 효능을 확인하기 위하여 평가기관인 엘리드(경기도 성남시 분당구 황새울로 325 소재) 임상기관에서 Corneometer를 이용한 24시간 피부 보습 지속 효과를 측정하였다. 보습 지속효과를 측정하기 위한 연구대상자는 20~45세 여성 중 연구 대상자 제외 기준에 포함되지 않는 자로 여성 20명이 선정되었으며 시험의 목적과 내용을 이해하여 자발적으로 본 실험에 참여 의사를 밝힌 자로 피부 질환을 포함한 급, 만성 신체 질환이 없으며, 시험 1주전부터 시험 부위에 보습제를 사용하지 않은 자에 국한되었다. 연구대상자 제외 기준으로는 습진성 피부 질환 (습진, 아토피, 피부염 등)이 있는 경우, 화장품, 의약품 및 일상적 일광 노출에 자극이나 알러지가 있는 경우, 동일한 시험에 참여한 후 3개월이 경과되지 않은 경우가 사용되었다.

상기 당근의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 보습력을 평가하기 위하여 Corneometer 를 이용한 24시간 피부 보습 지속 효과 평가가 사용되었다.

시험부위 (전완부)는 연구 대상자의 왼쪽과 오른쪽 팔의 손목으로부터 5㎝ 거리의 전박 굴측부 부위로 하였으며, 시험 부위마다 가로, 세로 3㎝의 정사각형을 1.5㎝ 간격으로 총 5개를 그렸다. 이중 1개의 정사각형은 미적용 부위로 정했고, 각 시험부위는 무작위로 선정하였다. 연구 대상자는 시험 전 항온항습 (20~24℃, 40~60% RH) 조건의 대기실에서 30분간 대기하였고, 연구자가 Corneometer (CM825, Courage & Khazaka, Germany)를 이용하여 각 시험부위를 3회 측정 후, 측정값의 평균을 구하여 제품 적용 전(0시간, Baseline) 보습량을 확인하였다. Baseline 측정 후 연구 대상자의 제품 적용 부위에 2㎕/㎠ 씩 제품을 적용하고 충분히 흡수시간 다음 적용 전과 동일한 방법으로 제품 적용 1시간, 3시간, 6시간 경과 후 보습량 변화를 측정하였다. 6시간 측정 후 연구 대상자를 귀가 조치한 후 다음날 방문하여 항온항습 (20 ~ 24℃, 40 ~ 60% RH) 조건의 대기실에서 30분간 대기한 뒤 24시간 경과 후 보습량 변화를 측정하였다. 피부 보습 상태가 좋을수록 Corneometer를 통한 결과값은 높은 수치를 나타내며, 측정단위는 임의의 단위인 A.U. (Arbitrary Unit)를 사용하였다. 아무런 시료도 도포하지 않은 미적용 시료 및 하기 표 15에 기재된 본 실험예에서 사용한 크림 제품 4종에 대하여 피부 보습 결과 및 표준편차를 확인하였다 (표 16).

No	제품명	제품 설명
#1	Cream	대조군 크림
#2	Collagen Cream	동물성 콜라겐을 첨가한 크림
#3	Carrot SEL Cream	당근 추출시 Papain으로 처리한 추출물을 첨가한 크림
#4	Carrot ANFLA Cream	당근 추출시 Bromelain으로 처리한 추출물을 첨가한 크림

실험 결과, 아무런 시료도 도포하지 않은 미적용 시료의 수분 보유도는 모든 측정시간대에서 30 ~ 32 A.U.로 일정한 수준을 유지하였다. 제품 #1과 #2는 대조군 시료로 이중 #1은 단백질 (또는 아미노산) 및 추출물이 첨가되지 않은 일반 크림이고, #2는 동물성 콜라겐 (돼지 콜라겐)이 사용된 크림이다. 두 제품 모두 적용 1시간 후 가장 높은 수분 보유도를 보였는데 이때 수분 보유도는 제품 #1은 55.208 A.U., 제품 #2는 56.560 A.U. 로 확인되었고, 적용 3시간부터 24시간까지의 수분 보유도는 순차적으로 낮아졌다. 두 제품간 시간 경과에 따른 수분 보유도는 큰 차이를 보이지 않았다. 이와 달리 본 발명 2 단계 순차적 효소처리 제품 #3, #4의 도포 1시간 경과 후 수분 보유도는 각각 64.724 A.U., 67.221 A.U.로 제품 #1, #2에 비해 18% 이상 수분보유도가 높았으며, 이들 제품의 3~24시간 경과 후 수분보유도 역시 제품 #1, #2 대비 10% 이상 일정하게 높은 수준을 유지하였다.

결과적으로 동물성 콜라겐을 사용했을 때보다 당근을 원료로 한 추출물 적용 크림의 수분 보유도가 모든 측정시간 대에서 꾸준히 높게 측정되어 일반 및 동물성 콜라겐 적용 크림에 비해 당근을 원료로 한 2 단계 순차적 효소 처리 추출물을 적용시킨 크림에서 보다 우수한 보습 효능이 있음을 본 임상 연구를 통해 확인하였다 (표 16, 도 7).

	제품종류	적용전	적용 1시간 후	적용 3시간 후	적용 6시간 후	적용 24시간 후
평균±표준 편차 (A.U)	미적용	31.162	31.180	31.100	30.880	31.702
	제품 #1	30.643	55.208	49.157	42.525	37.583
	제품 #2	30.977	56.560	50.057	43.245	38.163
	제품 #3	30.822	58.987/64.724	53.523/60.224	46.647/42.225	40.157/49.878
	제품 #4	31.335	59.370/67.221	53.682/64.304	46.927/53.275	40.552/50.525

[보기] 단백질 효소 단독처리/ 탄수화물 분해효소 순차처리

실험예 6. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 피부자극평가

상기 실시예 4에서 제조된 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림을 대상으로 피부 자극이 수반되는지 여부를 확인하기 위하여 유효성분이 함유되지 않은 일반크림과 동물성 콜라겐 적용 크림을 대조군으로 하고, 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림을 시료로 사용하였다. 피부자극 평가는 평가 기관인 엘리드(경기도 성남시 분당구 황새울로 325 소재)에서 진행되었다. 본 실험예에 사용된 연구 대상자는 20~55세의 성인남녀 중 31명 (평균연령 43.74세)이 선정되었고 기타 선정기준과 연구 대상자 제외기준은 상기 실험예 5의 보습력 평가에 참여한 연구 대상자 조건과 동일하였다. 피부자극 평가를 위하여 피부 첩포 시험 (Patch Test)에 의한 안전성 평가 및 인체 적용시험을 수행하였고 구체적으로 연구 대상자 각 31명을 대상으로 Van der Bend chamber (Van der Bend, the Netherlands)를 이용하여 등에 척추를 중심으로 어깨뼈와 허리선 사이에 시료를 적용하였다. 시험 부위를 증류수로 닦아내고 건조한 다음, 시험 대상 크림 8종 (시료 #1~#8)을 각각 35 ㎕씩 Van der Bend chamber에 적하한 후 시험부위에 고정시켰다. 총 24시간 동안 피부에 첩포했으며 첩포를 제거한 후에는 marking pen으로 시험부위를 표시하여 각각 30분, 24시간, 48시간 경과 후 시험 부위를 관찰하였다.

피부 반응은 Draize Dermal Irritation Scoring System의 평가 기준(표 17)에 따라 자극 정도를 평가하였고, 평균 피부 자극도 계산 공식(반응식 1)에 따라 Mean Irritation Index (M.I.I.)를 산정한 후 EPA (Environmental Protection Agency) Standard Evaluation Procedure Dermal Classification System의 자극 분류법 기준을 반영한 피부 1차 자극 시험 결과 판정표(표 18)에 따라 자극군을 판정하였다.

Erythema and Eschar Formation (홍반 및 가피 형성)	Value	Edema Formation (부종 형성)	Value
No erythema	0	No edema	0
Very slight erythema (barely perceptible)	1	Very slight edema (barely perceptible)	1
Well-defined erythema	2	Slight edema (edges of area well-defined by definite raising)	2
Moderate to servere erythema	3	Moderate edema (raised approximately 1 ㎜)	3
Severe erythema (best redness) to slight, eschar formation (injuries in depth)	4	Severe edema (raised more than 1㎜ and extending beyond the area of exposure)	4

[주] [반응식 1] 평균 피부자극도 (M.I.I. : Mean Irritation Index) 계산 공식

자극군	M.I.I
무자극 (Negligible)	0.00 ≤ M.I.I. ≤ 0.50
미자극 (Slight)	0.50 ≤ M.I.I. ≤ 2.00
중자극 (Moderate)	2.00 ≤ M.I.I. ≤ 5.00
강자극 (Strong)	5.00 ≤ M.I.I. ≤ 8.00

피부 자극 평가 결과, 크림 8종의 피부 평균 자극도는 0.50 미만으로 피부 1차 자극 시험결과 판정표(표 18)에서 확인한 결과 “무자극 (Negligible)”으로 판정되어 본 실험예에서 사용한 모든 크림은 피부 자극을 수반하지 않는 안전한 제품임을 확인하였다. 결과적으로 본 출원에서 개발한 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림은 기존 동물성 콜라겐을 적용한 크림보다 보습효능이 뛰어남과 동시에 인체에도 안전한 제품임을 확인하였다 (표 19).

번호	시료명	반응자수		30분 경과 후				24시간 경과 후				48시간 경과 후				피부 평균 자극도
				1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4
#1	Cream	홍반	10	5	-	-	-	3	-	-	-	5	-	-	-	0.14 1)
		부종	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
#2	Collagen Cream	홍반	9	2	-	-	-	5	-	-	-	5	-	-	-	0.13
		부종	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
#3	Carrot SEL Cream	홍반	6	2	-	-	-	4	-	-	-	5	-	-	-	0.12
		부종	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
#4	Carrot ANFLA Cream	홍반	6	2	-	-	-	3	-	-	-	5	-	-	-	0.11
		부종	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
#5	Mushroom SEL Cream	홍반	10	3	-	-	-	5-	-	-	-	4	-	-	-	0.13
		부종	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
#6	Mushroom ANFLA Cream	홍반	7	2	-	-	-	4	-	-	-	4	-	-	-	0.11
		부종	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
#7	Pine Needles SEL Cream	홍반	15	5	-	-	-	6	-	-	-	7	-	-	-	0.19
		부종	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
#8	Pine Needles ANFLA Cream	홍반	8	2	-	-	-	4	-	-	-	4	-	-	-	0.11
		부종	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

_{[주] 1) 계산식 = (5+3+5)/(31)=0.14}

실험예 7. 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 피부탄력 개선효과

상기 실시예 4에서 제조된 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유한 크림 총 6 종에 대하여 인체 피부개선 효과를 측정하였다. 40~60세 이상의 건강한 여성 40명을 대상으로 눈가를 중심으로 1일 2회씩 8주간 도포한 후 피부탄력 측정기 (cutometer MPA 580, Courage khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 초기값과 8주 경과후 피부탄력을 측정하였다.

실험결과는 [표 20]과 같았으며 그 결과치는 개선도의 평균값으로 현저한 효과를 나타냈다.

번호	시료명	피부탄력 개선도(%)
#1	Cream	0.72
#2	Collagen Cream	16.32
#3	Carrot SEL Cream	30.93
#4	Carrot ANFLA Cream	36.83
#5	Mushroom SEL Cream	29.82
#6	Mushroom ANFLA Cream	37.24
#7	Pine Needles SEL Cream	30.55
#8	Pine Needles ANFLA Cream	38.27

실험예 8. 당근, 느타리버섯 미 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림의 피부주름 개선효과

상기 실시예 4에서 제조된 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물을 함유하는 크림 총 6종에 대하여 인체 주름개선 효과를 측정하였다.

50~60세 여성 40명을 random sampling하여 10명씩 임의로 4 group으로 나누고 1일 2회씩 제조된 활장료 조성물을 눈 주위에 균일하게 적용하였고 총 12주간 실험하였다. 화장료 조성물 상기 크림을 적용시킨 전과 후의 눈가의 주름을 주름측정기인 스킨바이오메터 (Skin Visicometer SV 600, CK Electonic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 주름개선효과를 측정하였다.

실험은, 주름의 길이는 주름을 측정하고자 하는 부위에 실리콘 고무를 이용하여 만든 표본을 5 등분하여 각 5개소에서 주름높이의 최고점과 최저점의 차이에 대한 평균값을 나타내어 측정하였다.

실험결과는 [표 21]에 나타내었으며, 주름개선의 현저한 효과를 나타냈다.

번호	시료명	기간	피부주름깊이 감소율 (%)
#1	Cream	T0	0.0
		T12	2.2
#2	Collagen Cream	T0	0.0
		T12	5.5
#3	Carrot SEL Cream	T0	0.0
		T12	25.5
#4	Carrot ANFLA Cream	T0	0.0
		T12	33.5
#5	Mushroom SEL Cream	T0	0.0
		T12	28.7
#6	Mushroom ANFLA Cream	T0	0.0
		T12	29.5
#7	Pine Needles SEL Cream	T0	0.0
		T12	35.9
#8	Pine Needles ANFLA Cream	T0	0.0
		T12	35.4

본 출원은 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물과 상기 추출물을 함유하는 미백, 보습, 피부탄력 및 주름개선 기능성 화장료 조성물, 그리고 상기 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있으며, 특히 크림 등 화장품용 신소재로서 사용될 수 있는 뛰어난효과가 있으므로 천연 식물성 화장품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (8)

1. 당근, 느타리버섯 및 솔잎 중 어느 하나 이상의 원료에 정제수를 첨가하여 열수 추출하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 열수 추출물에 탄수화물 분해효소와 단백질 분해효소를 순차적으로 2 단계 처리하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 효소처리 추출물에 승온하여 분해효소를 불활성화 시키는 단계와; 상기 단계에서 얻은 불활성화시킨 효소처리 추출물을 여과하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 여과물을 수득하는 단계로 이루어진 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물의 제조방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 탄수화물 분해효소는 xylase와 mananase 배합비 1:1(w/w)의 혼합물이며, 단백질 분해효소는 papain 또는 Bromelain 중에서 선택되는 어느 하나의 효소인 것이 특징인 방법.
   
3. 제 1항 또는 제 2항에 따라 제조된 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물.
   
4. 제 3항의 당근, 느타리버섯 및 솔잎의 2 단계 순차적 효소처리 추출물이 포함된 화장료 조성물.
   
5. 제 1항의 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백, 보습, 피부탄력 및 주름개선 기능성 화장료 조성물.
   
6. 제 5항의 조성물은 화장수, 로션, 크림 및 에센스 중 어느 하나의 제형인 것이 특징인 화장료 조성물,
   
7. 제 3항의 추출물이 포함된 크림 모델링 마스크팩 조성물.
   
8. 제 7항의 마스크팩 조성물을 이용하여 제조된 크림 모델링 마스크.
   

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