KR20150136857A - 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리를 포함하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알레르기 유발 단백질이 제거된 수용성 로열젤리를 포함하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 알레르기 유발 단백질이 제거된 수용성 로열젤리를 포함하는 화장료 조성물은 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제 활성 저해능 및 멜라닌 생성 저해능을 나타내므로, 피부 미백 및 피부 노화방지를 위한 화장료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리를 포함하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물 {COSMETIC COMPOSITION COMPRISING ALLERGEN REMOVED WATER SOLUBLE ROYAL JELLY FOR SKIN WHITENING AND ANTI-AGING ACTIVITY}

본 발명은 알레르기 유발 단백질이 제거된 수용성 로열젤리를 포함하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

로열젤리(royal jelly)란 일벌의 외분비선으로부터 분비되어 꿀벌 벌집의 왕 자리(여왕벌 방)에 축적된 유백색 분비물이며, 여왕벌이 될 유충에게 먹이로 제공 되는 젤리 상태의 물질이다. 그 화학적 조성은 산지나 계절 등에 의해 다소 차이를 갖지만, 수분 65 내지 75 질량％, 단백질 15 내지 20 질량％, 탄수화물 10 내지 15 질량％, 지방질 1.7 내지 6 질량％, 회분 0.7 내지 2 질량％로 되어 있으며, 유기 산류, 각종 비타민류, 각종 미네랄류도 함유한다. 로열젤리는 예로부터 인간의 건강식품으로 널리 이용되고 있으며, 최근에는 인체에 대한 유용한 생리 활성, 예를 들면 항균 작용, 면역 증강 작용, 항종양 작용, 항염증 작용, 수명 연장 작용 등을 갖는다는 보고가 수많이 이루어져 있다.

그러나, 로열젤리에는 알레르기(allergy)를 유발하는 물질이 포함되어 있기 때문에, 개인차는 있지만 섭취에 의해 알레르기 증상이 일어나는 경우가 있으며, 경우에 따라서는 심각한 아나필락시 쇼크(anaphylaxis shock)를 일으키기도 한다. 이러한 로열젤리의 문제점을 해소할 목적으로, 일본국 특개 2002-112715호 공보에는 로열젤리에 당 분해 효소 처리 및 단백질 분해 효소 처리를 시행해서 저(低) 알레르기화하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 국제 공개 WO2004/21803호 명세서에는, 수용성 단백질 양이 총 단백질 양에 대하여 50％ 미만으로 저감된 로열젤리가 개시 되어 있다. 그러나, 이러한 로열젤리에는 알레르기를 유발하는 수용성 단백질이 잔존하며, 당 분해 효소 처리 및 단백질 분해 효소 처리를 시행한 로열젤리에는 알레르기 유발 물질의 분해가 불충분하거나 첨가한 효소 자체가 새로운 알레르기를 유발하는 물질로 될 가능성도 있어, 건강 유지를 목적으로 섭취하는 로열젤리로서 바람직하지 못하다는 문제점이 여전히 있었다.

한편, 피부 색소침착 형성 매커니즘은 멜라닌 합성과 관련이 있다. 멜라닌 합성은 멜라노좀 내에 존재하는 티로시나제의 작용을 통해 이루어진다. 이 티로시나제는 L-타이로신을 산화시켜 L-DOPA를 만드는 타이로신 하이드록실레이즈로 작용하며 또한, DOPA를 산화시켜 DOPA 퀴논을 만드는 DOPA 산화제로 작용하여 멜라닌을 합성하는 중요한 효소로 알려져 있다. 따라서, 멜라닌 생성을 억제하는 피부 미백제 개발에는 티로시나제의 활성을 억제하는 것이 필수적이다.

TRP-1(tyrosinase related protein-1)은 TRP-2에 의해 생성된 DHICA (5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid)를 산화시켜 IQCA(indole-2-carboxylic acid)를 생성하는데, IQCA는 흑갈색을 나타낸다. 따라서, TRP-1 발현을 억제하면 미백효과를 기대할 수 있다.

TRP-2는 DOPA 크롬 타토머레이즈로 알려져 있는 효소로서 DOPA 크롬을 이용하여 DHICA(5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid)를 생성한다. DHICA는 TRP-1에 의해 산화되어 IQCA(indole-2-carboxylic acid)를 생성하는데, IQCA는 흑갈색을 나타낸다. 따라서, TRP-2 발현이 억제되면 미백효과를 기대할 수 있다.

이미 아스코르빈산 (일본특허공개평 4-9320호), 하이드로퀴논 (일본특허공개평 6-192062호), 코직산 (일본특허공개평 56-7710호), 알부틴 (일본특허공개평 4-9315호) 및 일부의 화합물들이 티로시나아제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료의 원료로 이용되고 있으나, 처방계 중에서의 안정성이 떨어져 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나, 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체 레벨과 유사한 멜라노사이트 세포 배양에 의한 저해 효과가 요구되고 있는 실정이다. 또한 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있다. 코직산 및 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질로서, 소량 함유한 화장료를 실온에서 수주일동안 보관하면 갈변현상이 발생한다.

이에, 본 발명자들은 본 발명의 알레르기가 감소된 수용성 로열젤리가 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나아제 활성 억제 효과 및 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 발현 억제 효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

일본특허공개 2002-112715호 국제 공개 WO2004/21803호 일본특허공개평 4-9320호 일본특허공개평 6-192062호 일본특허공개평 56-7710호 일본특허공개평 4-9315호

본 발명의 목적은 알레르기 유발 단백질이 제거된 수용성 로열젤리를 포함하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알레르기 유발 단백질이 제거된 수용성 로열젤리를 포함하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “알레르기 유발 단백질이 제거된”은 로열젤리에 포함되어 있는 알레르기 유발 물질을 제거한 것을 말한다. 구체적으로, 로열젤리에서 단백질은 27 내지 41%를 이루고 있으며, 이 중 80% 이상이 가용성 단백질 (Major Royal Jelly Protein, MRJPs)이며, MRJP들 가운데 MRJP1~9이 30% 이상으로 알려져 있다. 상기 MRJP1 (55kDa)은 약산성의 pI를 가지며 MRJP2 내지 5는 염기성의 pI를 나타낸다. 로열젤리의 단백질 중 특히 47 및 55 Kd이 주요 항원으로 알려져 있다 (Tropical Biomedicine 25(3): 243-251). 본 발명의 알레르기 유발 단백질이 제거된 수용성 로열젤리는 40 내지 60kDa 의 알레르기 유발 단백질이 제거된 것일 수 있으며, 바람직하게는 47 kDa 과 55 kDa 사이즈의 단백질이 현저히 감소된 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “수용성 로열젤리”는 로열젤리의 비수용성 부분이 제거된 것을 말하며, 본 발명의 구체예에서 비수용성 부분을 제거하기 위해 에탄올로 추출된 추출물을 말한다.

본 발명의 상기 수용성 로열젤리는 40 내지 60kDa 의 알레르기 유발 단백질이 제거된 것일 수 있으며, 상기 수용성 로열젤리는 10-HDA 함량이 4.1% 이상으로 함유할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “10-HAD”는 로열젤리의 생리활성 지표 물질을 말한다. 10-HDA(10-hydroxy-decenoic acid) 및 10- hydroxy-decanoic acid는 로열젤리의 알칼리 가용성 분획에서 나타나는 다양한 생리활성을 의미내며, 이는 hydroxy fatty acid의 활성 증가로 인한 것으로 유추된다. 본 발명의 구체예에서, 생로열젤리는 10-HDA 가 1.95 %에 불과하나, 본 발명의 알레르기 유발 단백질이 제거된 수용성 로열젤리는 10-HDA 함량이 4.1% 이상이다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “생로열젤리”는 본 발명의 수용성 로열젤리를 조제하기 위한 원료로서 이용되는 것으로, 상기 생로열젤리를 분비하는 벌의 종류나 그 산지 및 공급 형태 (생 또는 냉동)는 특별히 한정되지 않는다. 상기 생로열젤리를 분비하는 벌의 종(種)으로는 양봉꿀벌(Apis mellifera), 동양종꿀벌(Apis cerana), 자이언트꿀벌(Apis dorsata), 최소종꿀벌(Apis florea) 등을 들 수 있다. 산지로는 일본, 남미, 북미, 호주, 중국을 비롯한 아시아 지역, 유럽 등을 들 수 있다. 이들의 로열젤리는 모두 본 발명의 로열젤리 분획물의 원료로 유리하게 이용 할 수 있으며, 가능한 한 신선하거나 저온 보존된 생로열젤리를 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 다시 말해, 꿀벌의 여왕 자리에 축적된 것을 채취하고 가공되지 않은 로열젤리를 본 명세서에서는 간단히 "생로열젤리"라고 지칭하였다.

본 발명의 알레르기성이 제거된 수용성 로열젤리는 동결건조된 생로열젤리 분말의 에탄올 추출물의 중성화 용액인 것일 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 알레르기성이 제거된 수용성 로열젤리는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다:

1) 생로열젤리를 동결건조하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 동결건조되어 생성된 로열젤리 분말을 에탄올로 추출하고 농축하여 로열젤리 추출물을 얻는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 로열젤리 추출물을 중성화하는 단계.

본 발명의 구체예에서, 상기 단계 2)의 로열젤리 추출물을 동결건조하여 분말화한 뒤, 증류수에 용해하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체예에서, 상기 단계 3)에서 중성화된 로열젤리 용액을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체예에서, 상기 단계 2)의 에탄올 추출 및 농축 단계에 의해 로열젤리가 수용성화(water soluble)되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체예에서, 상기 단계 3)의 중성화 단계에 의해 로열젤리의 pH가 7 내지 8로 조절되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체예에서, 상기 단계 3)의 중성화는 수산화나트륨, 탄산나트륨 및 암모니아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 첨가하여 수행하는 것이 바람직하나, 로열젤리의 성분을 파괴하지 않는 수산화나트륨이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체예에서, 상기 에탄올 추출에 의해 비수용성 부분이 제거된 수용성 로열젤리를 얻을 수 있으며, 상기 중성화 과정에 의해 로열젤리의 알레르기성이 제거된다.

상기 제조방법을 통해 본 발명의 알레르기성이 제거된 수용성 로열젤리를 얻을 수 있으며, 본 발명의 알레르기성이 제거된 수용성 로열젤리는 동결건조된 생로열젤리 분말의 에탄올 추출물의 중성화 용액인 것일 수 있다. 상기 중성화 용액은 수산화나트륨, 탄산나트륨 및 암모니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 용액일 수 있으며, 바람직하게는 수산화나트륨을 이용하여 중성화된 용액일 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 수용성 로열젤리는 상기 중성화 용액의 동결건조분말일 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 로열젤리 내의 단백질들의 pH 조절을 통해 염기성 상태로 일정하게 만들어 전하의 변화를 최소한으로 하여 수용성 로열젤리의 특성을 균질하게 하였으며, 10-HDA의 활성을 높이고자 중성화를 통해 로열젤리를 알칼리화하였다 (중성화 전 pH: pH3.8 내지 4.0, 중성화 후 pH: pH 7.4).

또한 본 발명의 상기 알레르기성이 제거된 수용성 로열젤리는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 90 중량%로 함유되는 것일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 로션 및 바디클린저의 제형이 포함될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있고, 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 해당되는데, 예를 들어, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코 올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 포함될 수 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로 서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산디에탄올아미드, 식물성유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있으며, 상기 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료 조성물에 배합되는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈 행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등의 다른 성분을 배합할 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 통상 화장료 조성물이 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 클렌저, 모발 화장료 등이 될 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명자들은 생로열젤리를 동결건조하여 분말로 만든 뒤, 이를 에탄올로 추출 및 농축하여 수용성화하였으며, 상기 추출물을 동결건조로 분말화한 뒤 이를 다시 증류수에 용해시키고 수산화나트륨을 이용하여 pH 7.4로 중성화시키고 동결건조로 분말화하였다. 이와 같이 제조한 본 발명의 로열젤리에서 알레르기 항체인 IgG와 반응하는 25 내지 55 kDa 단백질이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, RBL-2H3 세포에서 알레르기 유발시 분비되는 물질인 β-Hexosamindase 및 TNF-α의 발현이 생로열젤리에서보다 본 발명의 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리에서 현저하게 감소하는 것을 확인하여 알레르기 유발성이 감소함을 확인하였다. 아울러, 10-HDA 함량의 증가 및 피부 세포 생존률 강화 효과를 확인하여 본 발명의 로열젤리가 로열젤리 자체의 유효한 효과를 유지하는지 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리는 유용한 활성이 강화되었고, 알레르기 유발 특성이 감소되어 다양한 소비자군에 적용이 가능하며, 수용화되어 흡수 및 제형 개발에 용이함을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명의 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리를 포함하는 화장료 조성물은 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제 활성 저해능 및 멜라닌 생성 저해능을 갖는 것을 특징으로 한다.

멜라닌 생합성 신호전달 체계에는 매우 다양한 신호전달물질이 관여하고 있다. 멜라닌은 몇 가지 신호전달 기전을 통하여 합성되는데, 그 중 cAMP/PKA 경로가 멜라닌 합성의 주요 경로로서 UV에 피부가 노출되었을 때 맬라닌 세포의 cAMP가 증가되고 하류 신호전달 물질인 PKA를 활성화시키며, CREB를 거쳐 MITF의 발현을 증가시켜, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2의 합성을 촉진시켜 멜라닌 합성을 증가시킨다. 본 발명의 구체예에서, 알레르기성이 제거된 수용성 로열젤리의 피부 미백 및 노화방지 효과를 확인하기 위해 상기 멜라닌 합성과 관련된 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 활성 저해능과 관련한 실험을 실시하였다.

그 결과, 40∼60 kDa의 알레르기 유발단백질 제거된, 10-HDA 함량 4.1% 이상의 수용성 로열젤리(WSRJ)는 TRP-1, TRP-2 및 Tyrosinase 유전자 수준 및 단백질 발현 억제 효과가 기존의 로열젤리(RJ)에 비하여 탁월함을 확인하였다. 또한 본 발명의 구체예에서, 상기 본 발명의 알레르기성이 제거된 수용성 로열젤리는 멜라닌 생성 억제효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 알레르기성이 제거된 수용성 로열젤리가 상기 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제 활성 저해능 및 멜라닌 생성 저해능을 가짐으로써 피부 미백 및 노화방지를 위한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 알레르기 유발 단백질이 제거된 수용성 로열젤리를 포함하는 화장료 조성물은 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제 활성 저해능 및 멜라닌 생성 저해능을 나타내므로, 피부 미백 및 피부 노화방지를 위한 화장료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1 은 본 발명의 구체예에 따른 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리의 알레르기 물질 제거 및 수용성화 과정을 나타낸 도식이다.
도 2는 본 발명의 구체예에 따른 로열젤리의 알레르기 유발 단백질이 제거된 것을 확인한 젤 사진이다(위: 생 로열젤리; 아래: 본 발명의 로열젤리) (산지; A: 안성; C: 철원; J: 진주).
도 3은 본 발명의 구체예에 따른 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리의 세포독성을 평가한 그래프이다(RJ: 동결건조 로열젤리; WSRJ: 본 발명의 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리).
도 4는 본 발명의 구체예에 따라, 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리와 일반 로열젤리의 멜라닌 생성 억제 효과를 확인한 도이다(A:로열젤리 처리에 따른 B16F1세포에서의 멜라닌 생성 억제 정도를 나타낸 사진; B: 로열젤리 처리에 따른 멜라닌 함량; -: 무처리군; +: 처리군; 1: 1 ug/ml 농도의 본 발명의 로열젤리 처리군; 10: 10 ug/ml 농도의 본 발명의 로열젤리 처리군)
도 5는 본 발명의 구체예에 따라, 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리와 일반 동결건조 로열젤리의 티로시나아제(A), TRP-1(B), TRP-2(C) mRNA 발현 억제효과를 비교한 도이다.
도 6은 본 발명의 구체예에 따라, 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리와 일반 동결건조 로열젤리의 티로시나아제(A), TRP-1(B), TRP-2(C) 단백질 발현 억제효과를 비교한 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 알레르기 단백질 제거 수용성 로열젤리 제조

실시예 1-1. 로열젤리 알레르기 제거 및 수용성화

본 발명자들은 에탄올을 이용하여 로열젤리의 비수용성 부분을 제거하여 수용성화하였다(도 1).

구체적으로, 국내 중부, 남부 및 북부를 대표하는 산지인 안성, 진주 및 철원의 농가로부터 직접 구입한 국내산 생 로열젤리 100 g을 동결건조하여 35 g의 동결건조 로열젤리 분말을 수득하였다. 상기 로열젤리 분말을 70% 에탄올로 추출 및 농축을 2회 반복하여 에탄올 로열젤리 추출물을 수득하였다. 상기 추출물을 동결건조하여 분말화시켰으며, 얻은 동결건조 분말을 3차 증류수로 용해하여 수용성임을 확인하였다.

그 후 얻어진 로열젤리 수용성액에서 알레르기 유발 단백질을 불활성화하고 활성 물질을 활성화하기 위하여 수산화 나트륨을 이용하여 중성화하였다.

구체적으로, 상기 에탄올로 추출하고 동결건조한 수용성 로열젤리 분말을 증류수로 용해시킨 후 (pH 3.8 내지 4.0), 2N 수산화나트륨(NaOH)을 로열젤리 100 g 당 0.5 내지 1 ml의 비율로 첨가하여 중성화하였다 (pH7.4). 중성화한 로열젤리 액체를 동결건조하여 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리 분말 19.6 g을 수득하였다.

실시예 1-2. 알레르기 유발 단백질 감소 및 10- HDA 함량 확인

본 발명자들은 상기 <실시예 1-1>에서 수득한 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리의 알레르기 유발 단백질의 함량을 확인하였다. 구체적으로, 로열젤리에 알레르기 반응을 가지는 54명의 환자의 혈청에서 알레르기 항체로 알려져 있는 IgE와 로열젤리의 단백질들과의 반응을 SDS-PAGE 단백질 분리를 통해 확인한 결과, 로열젤리 단백질 중 25 내지 55 Kd의 단백질들이 IgE와 반응하여 항원으로 판단되었으며, 특히 47kd 및 55kd의 단백질이 주요한 항원으로 유추되었다. 이에, 본 발명에 따른 로열젤리의 주 항원 단백질의 함량 변화를 확인하기 위하여, 생 로열젤리 및 본 발명에 따른 로열젤리를 각각 0.1 g을 1 ml의 PBS에 녹인 다음 15 ㎕에 각각 샘플 버퍼 5 ㎕를 넣고 SDS-PAGE 젤에 로딩하여 전기영동하였다. 전기영동 후 젤을 Coomassie staining buffer로 1시간 동안 염색한 뒤 2시간 동안 destaining buffer로 탈색하였다. 탈색한 젤을 gel drying buffer로 40분 동안 처리한 후 dry system을 이용하여 젤을 수득하였다.

그 결과, 본 발명의 중성화한 수용성 로열젤리는 전체 단백질 함량의 변화는 없었으나, 로열젤리의 알레르기 유발 단백질인 40-60 kDa의 단백질이 대조군인 생로열젤리에 비해 감소된 것을 확인하였다 (도 2).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리의 10-HDA 함량을 확인하였다. 구체적으로, 생로열젤리 및 본 발명의 로열젤리의 10-HDA 함량을 이동상 0.02M (NH4)2HPO4·EtOH(7:3) 혼합액(pH 7.0), 1.4 mL/min유속으로 μ-Bondapak C18 컬럼을 사용하여 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 로열젤리는 4.1% 이상의 10-HDA 함량을 가지고 있는바, 생로열젤리보다 2배 이상의 10-HDA함량을 가짐을 알 수 있었다(표 1).

분석항목 (%)	생로열젤리	본 발명
10-HDA	1.95±0.02	4.1±0.06

* P < 0.05, 생로열제리와 비교

실시예 2. 알레르기 단백질이 제거된 수용성 로열젤리의 미백 및 노화방지 효과 확인

실시예 2-1. B16F1세포 배양 및 생존율 측정

본 발명자들은 마우스 흑색 B16F1 세포를 배양하여, 상기 실시예 1의 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리를 처리하여 세포 독성을 확인하였다.

구체적으로, 마우스 흑색 B16F1 세포주는 한국세포주은행(서울, 한국)에서 구입하여 사용하였으며, 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL, MD, USA), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Gibco BRL, MD, USA)이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 5% CO2배양기에서 37°C로 배양하였다. 동결건조 로열젤리와 수용성로열젤리의 멜라닌 합성을 유발하기 위해 사용되는 α- MSH (α-melanocyte stimulating hormone, Sigma, USA)에 대한 B16F1 세포 생존율을 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2-5-diphenytetrazolium bromide(MTT) 환원 방법으로 측정하였다. B16F1 세포를 96 well plate에 5 × 10³ cells/ml 농도로 분주하여 24시간 배양 후 각각 다양한 농도로 회석한 알레르기 제거 수용성 로얄제리와 α-MSH를 처리하였다. 24시간 동안 배양 후 배지를 제거한 다음 50㎕ MTT 용액을 첨가하여 3시간 배양하고 DMSO 200 ㎕를 처리한 다음 570 nM의 흡광도로 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리(WSRJ)에 대한 세포독성은 없는 것으로 확인되었다(도 3).

실시예 2-2. 멜라닌 생성 억제 효과 확인

본 발명자들은 멜라닌을 정량하고, 상기 실시예 1의 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리를 처리하여 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하였다.

구체적으로, 멜라닌 정량은 Hosoi의 방법을 변형하여 측정하였다. 6 well plate에 2 × 104 cells/ml 농도로 B16F1세포를 배양한 후, 10 nM의 MSH가 함유된 배지로 교체하였다. 48시간 후, 일반 동결건조 로열젤리(RJ)와 알레르기 제거 수용성 로열젤리(WSRJ)가 함유된 배지를 세포에 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포를 수집하여 1200 rpm 에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 펠렛(pellet)에 500 ㎕ lysis buffer(50 mM Sodium phosphate pH 6.5, 1% Triton X-100, 2 m M PMSF)을 더하여 용해시킨 후 14,000 rpm 15분간 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 여기에 200 ㎕의 10% DMSO가 첨가된 1N NaOH를 넣고 80°C 에서 1시간 동안 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 멜라닌 표준품(Sigma, USA)으로부터 얻은 값을 기준으로 이용하여 정하였다.

그 후, 알레르기 성분을 제거한 수용성 로열제리의 B16F1 melanoma 세포에서의 멜라닌 생합성 저해활성을 측정하였다. 도 4에서 보는 바와 같이 수용성 로열젤리 1 ㎍, 10 ㎍ 처리는 α-MSH 처리군에 비교하여 세포내의 멜라닌 합성이 크게 억제되었으며, 동결건조한 일반 로열젤리와 멜라닌 합성 억제 차이가 확인되지 않았다. 또한 멜라닌 합성 억제효과를 육안으로 확인하기 위해 세포를 수거하기 전 세포의 형태를 관찰하였다. 그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 α-MSH 처리군은 매우 진하게 멜라닌 생성 정도를 확인할 수 있었으나, 정상대조군과 10 ㎍ 및 1 ㎍ 수용성 로열제리 처리군에서 멜라닌 생성을 거의 확인 할 수 없었다. 이러한 결과로 α-MSH에 의해 멜라닌 합성이 촉진된 B16F1세포에서 1 ㎍ 이상의 농도에서 알레르기를 제거한 수용성 로열제리가 멜라닌 합성을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다(도 4).

실시예 2-3. 티로시나아제 , TRP -1, TRP -2 mRNA 발현 측정

본 발명자들은 상기 실시예 1의 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리가 미백관련 인자인 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2 mRNA발현에 미치는 영향을 보기 위하여 B16F1세포를 100 mm tissue culture dish에 2 × 10⁴ cells/ml가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 10nM의 MSH가 함유된 배지로 교체하여 48시간 동안 배양 한 후 동결건조 및 수용성 로열젤리를 각각 처리하였다. 처리 후 24시간 배양한 다음 세포를 수집하였다. Total RNA 추출은 Total RNA Purification kit(Invitrogen, USA)를 이용하여 분리하였다. Total RNA 1 ㎍이 cDNA 합성에 사용되었으며 RT Premix kit(Oligo dT primer) (iNtRON Biotechnology, USA)를 사용하여 45°C에서 1시간, 95°C에서 5분 방치하여 reverse transcriptase를 불활성화 시켰다. 합성된 cDNA는 PCR Premix kit(i-Taq) (iNtRON Biotechnology, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 조건은 94℃ 에서 5분간 변성(denaturation); 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃ 1분을 30번 순환한 후; 72℃에서 10분 동안 유지하였다.

실험에 사용한 primer 서열은 다음과 같다:

마우스 티로시나아제(mouse tyrosinase), 5’-GGCCAGCTTTCAGGCAGAGGT-3’(서열번호 1, 정방향 프라이머) 및 5’-TGGTGCTTCATGGGCAAAATC-3’(서열번호 2, 역방향 프라이머); 마우스 TRP-1, 5’-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC-3’(서열번호 3, 정방향 프라이머) 및 5’-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-3’ (서열번호 4, 역방향 프라이머); 마우스 TRP-2, 5’-GGATGACCGTGAGCAATGGCC-3’ (서열번호 5, 정방향 프라이머) 및 5’-CGGTTGTGACCAATGGGTGCC-3’(서열번호 6, 역방향 프라이머), 및 마우스 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 인터널 컨트롤(internal control)로서, 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’ (서열번호 7, 정방향 프라이머) 및 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ (서열번호 8, 역방향 프라이머).

PCR 산물은 1.5% 아가로오스겔의 전기영동을 통해 발현정도를 확인하였으며 각 밴드의 강도는 Quantity One(Bio-Rad, USA) 에 의해 정량하였다.

그 결과로 알레르기 제거 수용성 로열젤리의 멜라닌 합성 관련 단백질인 티로시나아제의 발현 억제가 확인됨에 따라 티로시나아제mRNA 발현에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과, 1 ㎍과 10 ㎍의 농도로 수용성 로열젤리를 처리한 군에서 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 mRNA 발현이 크게 억제되는 것으로 확인되었으며(도 5), 발현량이 정상 대조군과 비슷한 수준이었으며, 일반 동결건조 로열젤리 보다 효과적임이 확인되었다(도 5).

실시예 2-4. 티로시나아제, TRP -1, TRP -2 단백질 발현 측정

본 발명자들은 상기 실시예 1의 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리가 미백관련 인자인 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1, TRP-2 단백질 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. 먼저 B16F1세포를 100 mm 조직배양 디쉬(tissue culture dish)에 2 × 104 cells/ml가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 10 nM의 MSH가 함유된 배지로 교체하여 48시간 동안 배양 한 후 로열젤리를 처리하였다. 로열젤리 처리 후 24시간 배양한 다음 세포를 수집하였다. 프로테아제 저해제 혼합물(Protease inhibitor cocktail) 을 포함한 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 사용하여 세포를 용해시키고 12,000rpm에서 20분간 원심분리하여 얻은 단백질은 바이오-래드 단백질 분석 키트(Bio-rad protein assay kit)를 사용하여 단백질을 정량하였다. 10% SDS-PAGE 겔을 이용하여 전기영동하고 이를 PVDF 멤브레인(membrane)으로 이전시켰다. 1% 트윈 20(tween 20_이 함유된 트리스 버퍼 솔린(tris buffer saline)에 5% 스킴 밀크(skim milk)를 첨가하여 티로시나아제와 β-액틴(β-actin, abCam, USA)을 희석하였으며 4°C에서 반응시켰다. 다음 날, 호올스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)가 결합된 항체를 1시간 반응시킨 후 ECL로 발색시켰다. 각 밴드의 강도는 퀀티티 원(Quantity One, Bio-Rad, USA)에 의해 정량하였다.

그 후, 수용성 로열젤리의 멜라닌 억제효과 검증을 위한 멜라닌 합성 관련인자인 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 단백질 발현 정도를 측정하였다. 1ug과 10ug의 농도로 처리한 결과, 수용성 로열젤리 처리군에서 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 발현이 크게 감소되는 것으로 확인되었다. 정상 대조군과 비슷한 수준으로 감소하였다. 특히 일반 로열젤리 처리군보다 억제 효과가 크게 나타나는 것으로 확인되었다. 이는 수용성 로열젤리가 티로시나아제, TRP-1, TRP-2 발현 억제를 통하여 멜라닌 생성을 감소시키는 것으로 확인되었다.

실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS(18.0 version., USA) 통계 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 그 결과는 평균 ± 표준오차(mean ± SEM) 로 표시하였다. 대조군과 실험군간의 평균에 대한 유의성은 ANOVA(analysis of variance) 의 던칸의 다중범위검정(Duncan’s multiple range test) 를 이용하여 p<0.05에서 검증하였다.

제조예 . 화장료 조성물의 제조

제조예 1-1. 지용성(W/O 제형) 연고제제의 제조 (중량%)

알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리 0.01-10.0%

스테아릴 알콜 7.0%

스테아린산 2.2%

스쿠알렌 3.4%

옥틸두오데칸올 5.0%

올리브유 6.0%

글리세린모노하우릴 지방산 에스텔 10.0%

이소프로필 아디페이트 2.0%

테고 0.3%

카복실비닐폴리머 3.0%

프로필렌 글리콜 5.0%

코직산 0.05%

알파-케토글루타민산 0.2%

시스테인 0.2%

파라벤류 0.3%

멸균 정제수 또는 0.02M 인산 또는 완충용액 잔량

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 지용성 연고를 제조하였다.

제조예 1-2. 친수성(O/W형) 연고제제의 제조 (중량%)

알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리 0.01-10.0%

백색바세린 25.0%

스테아릴알콜 20.0%

프로필렌글리콜 12.0%

프로필렌미스스틴산 0.1%

소디움 글리세린 모노라우렐 0.2%

폴리옥시에틸렌경화피마자유 4.0%

베타인 함유 양이온성 유화제 0.2%

모노스테아린산글리세린에스텔 0.1%

파라옥시안식향산프로필 0.1%

정제수 잔량

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 친수성 연고를 제조하였다.

제조예 1-3. 영양화장수의 제조 (중량%)

글리세린 8.0 %

부틸렌글리콜 4.0 %

히알루론산 추출물 5.0 %

베타글루칸 7.0 %

카보머 0.1 %

알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리 0.05 %

카프필릭/카프릭 트리글리세라이드 8.0 %

스쿠알란 5.0 %

세테아릴 글루코사이드 1.5 %

소르비탄 스테아레이트 0.4 %

세테아릴 알콜 1.0 %

트리에탄올 아민 0.1 %

정제수 잔량

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 영양화장수를 제조하였다.

제조예 1-4. 영양크림의 제조 (중량%)

글리세린 3.0 %

부틸렌글리콜 3.0 %

유동파라핀 7.0 %

베타글루칸 7.0 %

카보머 0.1 %

알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리 3.0 %

카프필릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0 %

스쿠알란 5.0 %

세테아릴 글루코사이드 1.5 %

소르비탄 스테아레이트 0.4 %

폴리솔베이트 60 1.2 %

트리에탄올 아민 0.1 %

정제수 잔량

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 영양크림을 제조하였다.

제조예 1-5. 마시지 크림의 제조 (중량%)

글리세린 8.0 %

부틸렌글리콜 4.0 %

유동파라핀 45.0 %

베타글루칸 7.0 %

카보머 0.1 %

알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리 1.0 %

카프필릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0 %

밀납 4.0 %

세테아릴 글루코사이드 1.5 %

세스퀴 올레인산 소르비탄 0.9 %

바세린 3.0 %

파라핀 1.5 %

정제수 잔량

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 마사지 크림을 제조하였다.

제조예 1-6. 팩의 제조 (중량%)

글리세린 4.0 %

폴리비닐알콜 15.0 %

히알루론산 추출물 5.0 %

베타글루칸 7.0 %

알란토인 0.1 %

알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리 0.5 %

노닐 페닐에테르 0.4 %

폴리솔베이트 60 1.2 %

에탄올 6.0 %

정제수 잔량

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 팩을 제조하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA <120> COSMETIC COMPOSITION COMPRISING ALLERGEN REMOVED WATER SOLUBLE ROYAL JELLY FOR SKIN WHITENING AND ANTI-AGING ACTIVITY <130> P14R12D0367 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse tyrosinase forward primer <400> 1 ggccagcttt caggcagagg t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse tyrosinase reverse primer <400> 2 tggtgcttca tgggcaaaat c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TRP-1 forward primer <400> 3 gctgcaggag ccttctttct c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TRP-1 reverse primer <400> 4 aagacgctgc actgctggtc t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TRP-2 forward primer <400> 5 ggatgaccgt gagcaatggc c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TRP-2 reverse primer <400> 6 cggttgtgac caatgggtgc c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse GAPDH forward primer <400> 7 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse GAPDH reverse primer <400> 8 aagacgctgc actgctggtc t 21

Claims (8)

1. 알레르기 유발 단백질이 제거된 수용성 로열젤리를 포함하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 수용성 로열젤리는 40 내지 60kDa 의 알레르기 유발 단백질이 제거된 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 수용성 로열젤리는 10-HDA 함량이 4.1% 이상인 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 수용성 로열젤리는 동결건조된 생로열젤리 분말의 에탄올 추출물의 중성화 용액인 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 중성화 용액은 수산화나트륨, 탄산나트륨 및 암모니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 중성화된 용액인 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 수용성 로열젤리는 제4항 또는 제5항의 중성화 용액의 동결건조분말인 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 수용성 로열젤리는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 90 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제 활성 저해능 및 멜라닌 생성 저해능을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물.
   

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