CN115806588B - 具有酪氨酸酶抑制活性的小分子肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子肽，其氨基酸序列为IIPFIF，如SEQ ID NO.2所示。所述小分子肽在制备具有酪氨酸酶抑制功效的药物或保健品中的应用。一种具有酪氨酸酶抑制活性的药物或保健品，其有效成分为该小分子肽。本发明还提供了一种具有酪氨酸酶抑制活性的蜂王浆多肽，是利用酸性蛋白酶酶解蜂王浆得到的。本发明通过实验研究，筛选得到了对酪氨酸酶具有高抑制活性的小分子肽，具有作为抑制黑色素水平功能性产品的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及具有酪氨酸酶抑制活性的小分子肽及其应用，属于酶解加工产品技术领域。
背景技术
蜂王浆是年轻工蜂下咽和下颌腺分泌物，由水、蛋白质、碳水化合物、脂质、矿物质和维生素组成，具有很高的营养价值，广泛应用于食品、生物和医疗等领域，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、增强机体免疫等多种生理功能。但是其加工利用程度很低，经济附加值低。
生物活性肽是蛋白质在水解、裂解或成熟过程中产生的功能性肽片段，其相对分子质量通常小于6000Da。常见的生物活性肽有大豆肽、谷胱甘肽、酪蛋白磷酸肽等，酶生物技术是一种适用于生产生物活性肽的高效方案，已被广泛应用于生物活性肽的生产。
酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，对于黑色素的合成至关重要，抑制酪氨酸酶的活性可以有效减少黑色素的含量。目前常见的酪氨酸酶抑制剂存在热不稳定性和潜在的毒副作用等诸多不足，对其使用造成了极大限制。近年来，人们更趋向于从天然物质中分离提取出新的酪氨酸酶抑制剂，例如玫瑰、苦参等，研究表明这些植物提取物具有很强的酪氨酸酶抑制活性。目前尚未有从蜂王浆中提取酪氨酸酶抑制活性物质的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明对蜂王浆进行酶解研究，发现了具有很强的酪氨酸酶抑制活性的小分子肽。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种小分子肽，命名为TIP-II(Tyrosinase inhibitory peptide)，其氨基酸序列为IIPFIF，如SEQ ID NO.2所示。
经实验证明，上述小分子肽具有良好的酪氨酸酶抑制活性，具有作为抑制黑色素形成的功能性产品的潜力，因此，可用于制备具有酪氨酸酶抑制功效的药物或保健品。
具有酪氨酸酶抑制活性的药物或保健品，其有效成分为上述小分子肽。
本发明还提供了具有酪氨酸酶抑制活性的蜂王浆多肽，通过以下方法制备得到：
(1)将蜂王浆与水混合，制成料液比为1:3～11(g:mL)的底物液，调节初始PH值为2～6(用氢氧化钠溶液或盐酸调节)，按加酶量2000～10000U/g(酶活/蜂王浆)加入酸性蛋白酶，于30～70℃下反应2～6h，得酶解液；
(2)酶解液通过G-15葡聚糖凝胶层析柱分离洗脱，流动相为超纯水，洗脱速度为3.5mL/min，共出现5个洗脱峰，收集D1～D4中的任意一种或两种以上的洗脱液，冻干，即得蜂王浆多肽。
优选的，所述步骤(1)中，料液比为1:4。
优选的，所述步骤(1)中，初始PH值为4.0。
优选的，所述步骤(1)中，加酶量为10000U/g。
优选的，所述步骤(1)中，酶解温度为55℃。
优选的，所述步骤(1)中，酶解时间为4h。
优选的，所述步骤(2)中，G-15葡聚糖凝胶层析柱的规格为16mm×70cm。
优选的，所述步骤(2)中，收集洗脱峰D4的洗脱液，冻干，得组分D4；经分离富集后的组分D4的酪氨酸酶抑制率较原酶解液和其它组分有显著提高。
本发明通过酶解+凝胶过滤层析处理蜂王浆，得到了具有酪氨酸酶抑制活性的蜂王浆多肽，经LC-MS/MS鉴定，筛选得到了对酪氨酸酶具有高抑制活性的三条小分子肽，分别为：TIPPPT(IC50＝7.59mg/mL)，IIPFIF(IC50＝6.16mg/mL)，ILFTLL(IC50＝9.25mg/mL)，这三条小分子肽均具有作为抑制黑色素水平功能性产品的潜力。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：蛋白酶对酪氨酸酶抑制率的影响示意图。
图2：温度对酪氨酸酶抑制率的影响示意图。
图3：酶解时间对酪氨酸酶抑制率的影响示意图。
图4：初始PH值对酪氨酸酶抑制率的影响示意图。
图5：加酶量对酪氨酸酶抑制率的影响示意图。
图6：料液比对酪氨酸酶抑制率的影响示意图。
图7：料液比和温度对酪氨酸酶抑制率影响的等高线和响应面图，其中，Ⅰ：等高线Ⅱ：响应面。
图8：料液比和加酶量对酪氨酸酶抑制率影响的等高线和响应面图，其中，Ⅰ：等高线Ⅱ：响应面。
图9：加酶量和温度对酪氨酸酶抑制率影响的等高线和响应面图，其中，Ⅰ：等高线Ⅱ：响应面。
图10：Sephadex G-15洗脱曲线示意图。
图11：样品质谱Basepeak图。
图12：TIPPPT的质谱图。
图13：IIPFIF的质谱图。
图14：ILFTLL的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
下述实施例所采用的蜂王浆，购自山东丰采健康产业有限公司，置于密封不透光袋中，置于-20℃环境，备用。
实施例1蜂王浆酶解工艺响应面优化
1.筛酶
选取木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶对原料进行酶解。准确称取预冻后的蜂王浆2g，以料液比1:5配成底物液，按加酶量4000U/g(酶活/蜂王浆)分别加入五种蛋白酶，在50℃、200rpm条件下反应4h后取样，灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)取上清，测定酪氨酸酶抑制率。
酪氨酸酶抑制率的测定：分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至475nm。将100μL的2U/mL的酪氨酸酶加入96酶标仪检测板中，37℃孵育10min后，分别将40μl待测样品，100μL的索莱宝酪氨酸酶活性检测试剂盒中的试剂一(货号：BC4055)，充分混匀后立即测定10s时在475nm下的吸光度，记为A1，之后迅速将其放入25℃水浴或培养箱中3min(若酶标仪自带控温功能，将温度调至25℃)。然后迅速拿出擦净后测定190s时的吸光度，记为A2。将样品换成缓冲液，按照上述方法，充分混匀后立即测定10s时在475nm下的吸光度，记为A3，190s时的吸光度记为A4。根据公式计算样品对酪氨酸酶的抑制率。
酪氨酸酶抑制率(％)＝(1-ΔA/ΔB)/×100％；式中，ΔA为A2-A1，ΔB为A4-A3。
本实验选择了五种蛋白酶对蜂王浆进行酶解，结果如图1所示。结果显示，酸性蛋白酶的酶解效果最佳，所得酶解液的酪氨酸酶抑制率为56.7％，明显优于木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶(蜂王浆经木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶酶解后，酪氨酸酶抑制率反而有所降低)。
2.酶解温度优化
准确称取预冻后的蜂王浆2g，以料液比1:5配成底物液，初始pH值为4，按加酶量4000U/g加入酸性蛋白酶，分别在不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)以及200rpm条件下反应4h后取样，将样品煮沸10min灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)取上清，测定酪氨酸酶抑制率。
温度对酪氨酸酶抑制率的影响如图2所示，随着酶解温度的升高，酪氨酸酶抑制活性呈现先升高后降低的趋势，其中，当酶解温度为60℃时，酪氨酸酶抑制活性最高，与50℃无显著性差异(P>0.05)而显著高于其他组(P<0.05)。综合考虑酶解效果与经济成本，选定50℃为酶解处理温度。
3.酶解时间优化
准确称取预冻后的蜂王浆2g，以料液比1:5配成底物液，按加酶量4000U/g加入酸性蛋白酶，调节底物液的初始PH值为4，在50℃，200rpm条件下分别反应3h、4h、5h、6h、7h后取样，灭酶，冷却，8000rpm离心10min，取一定量上清液测定测定酪氨酸酶抑制率。
酶解时间对酪氨酸酶抑制率的影响如图3所示，酪氨酸酶抑制活性在短时间内随着酶解时间的增加而增加，酶解3与酶解4小时之间不存在显著性差异(P>0.05)，酶解3与酶解5小时之间存在显著性差异(P<0.05)，酶解4小时与酶解6小时之间无显著性差异(P>0.05)，酶解5小时与酶解6小时之间不存在显著性差异(P>0.05)。综合考虑酶解效果与酶解成本，最终选定4h为酶解处理时间。
4.初始PH值优化
准确称取预冻后的蜂王浆2g，以料液比1:5配成底物液，以1M盐酸和1M NaOH溶液调底物液的初始PH值为2、3、4、5、6，按加酶量4000U/g加入酸性蛋白酶，在50℃，200rpm条件下反应4h后取样，灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)取上清液测定酪氨酸酶抑制率。
初始PH值对酶解效果的影响如图4所示。随着初始PH值的升高，酪氨酸酶抑制活性不断下降，初始pH 4与初始pH 5之间存在显著性差异(P<0.05)，酶解液的酪氨酸酶抑制活性在初始PH在2～4之间较好，在初始PH>4时较差。综合蜂王浆本身酸碱特性，选定初始PH为4进行下一步实验。
5.加酶量优化
准确称取预冻后的蜂王浆2g，以料液比1:5配成底物液，按加酶量2000、4000、6000、8000、10000U/g加入酸性蛋白酶，在50℃，200rpm条件下反应4h后取样，灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)取上清，测定酪氨酸酶抑制率。
加酶量对酶解效果的影响如图5所示，随着加酶量的增加，酶解液的酪氨酸酶抑制活性总体呈现逐渐上升的趋势，加酶量为6000U/g与加酶量为8000U/g之间没有显著性差异(P>0.05)；加酶量为6000U/g与加酶量为10000U/g之间也没有显著性差异(P>0.05)。加酶量大于6000U/g时，酶解液的酪氨酸酶抑制活性与加酶量变化关系不大，综合成本考虑选择加酶量为6000U/g进行进一步实验。
6.料液比优化
准确称取预冻后的蜂王浆2g，分别以料液比1:3、1:5、1:7、1:9、1:11配成底物液，按加酶量6000U/g加入酸性蛋白酶，在50℃，200rpm条件下反应4h后取样，灭酶，冷却，离心(8000rpm，10min)取上清，测定酪氨酸酶抑制率。
料液比对酶解效果的影响如图6所示。随着料液比的增加，酶解液的酪氨酸酶抑制活性呈现逐渐下降的趋势。料液比为1:5与料液比为1:3之间酶解液的酪氨酸酶抑制活性没有显著性差异(P>0.05)。料液比为1:5与料液比为1:7之间酶解液的酪氨酸酶抑制活性存在显著性差异(P<0.05)，选定料液比为1:5进行下一步实验。
7.蜂王浆酶解工艺响应面优化
在单因素实验的基础上，每个因素选取三个对酪氨酸酶抑制率影响较大的水平，建立三因素三水平的Box－Benhnken中心组合试验，以酪氨酸酶抑制率为响应值，各因素的水平采用－1、0、1进行编码，如表1。
表1 Box－Behnken试验设计因素水平表
根据单因素实验的结果，由Design－Expert 10.0.7统计分析软件设计出的实验方案及实验结果如表2所示，以酪氨酸酶抑制率为响应值，以料液比(A)、温度(B)、加酶量(C)为自变量，建立三因素三水平中心组合实验设计，共包括17组实验方案。
表2Box－Behnken实验设计与结果
回归方程拟合及方差分析：
采用Design－Expert 10.0.7系统软件对所得数据进行回归分析，回归分析结果见表3，对各因素回归拟合后，得到回归方程：
Y＝84.43-6.96*A+1.61*B+3.09*C-1.07*AB+0.65*AC-0.31*BC-5.91*A^2-3.82*B^2-0.55*C^2
表3回归模型及方差分析
回归模型的R2＝0.9484，R2Adj＝0.8820，表中方差分析显著性检验表明，该回归模型p＜0.001，方程模拟达到极显著，失拟项p＝0.7870＞0.05，不显著，表明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例较小，使用该方程模拟真实的三因素三水平的分析是可行的。
由表3可知，影响感官评分因素按主次顺序排列为：料液比(A)＞加酶量(C)＞温度(B)。由设计试验所得的响应面曲面图如图7、8、9所示。
利用Design Expert 10软件对试验模型进行分析，得到酶解的最佳制备条件：料液比为1:4，温度为55℃，加酶量为10000U/g，预测酪氨酸酶抑制率为88.88％，为了验证响应面优化模型的准确性，以此工艺验进行验证实验，实际测得的酪氨酸酶抑制率为90.80％，与预测值接近，说明回归方程可以反映各因素对工艺的影响，具有实用价值。
实施例2凝胶过滤层析及其组分活性分析
葡聚糖凝胶G-15加入适量超纯水煮沸2h，除去浮沫及杂质；再加入超纯水搅拌、静置。除去上层杂质，重复以上操作直至上层无杂质。吸掉凝胶上层多余的水，将填料以玻璃棒引流至26mm×80cm层析柱，避免分层和气泡出现，柱子填好后用纯水冲洗，直至层析柱高度不再发生变化。
上样：以实施例1.7中制备的酶解液(料液比为1:4，温度为55℃，加酶量为10000U/g)作为样品进行上样。上样浓度及体积为：200mg/mL，1mL；收集出峰的组分(流动相为超纯水，洗脱速度为3.5mL/min)，冻干测定不同组分的活性。
酶解液经凝胶色谱柱的分离结果如图10所示，收集洗脱峰D1-5，冻干后复配成多肽浓度21mg/mL的溶液，测定各组分的酪氨酸酶抑制率，结果如表4所示。
表4不同组分酪氨酸酶抑制率
随着出峰时间的延迟，D1～D5各组分的平均分子量逐渐降低，如表4所示，未经分离的酶解液酪氨酸酶抑制率为7.22％，纯化后的D4组分酪氨酸酶抑制率达到82.89％，显著高于其他组分(P<0.01)。选择组分4进行进一步LC/MS分析。
实施例3F4肽段组成LC-MS/MS质谱鉴定
样品加入适量0.1％TFA(三氟乙酸)溶液复溶，转入30KD的超滤管12000g离心15min，将离心后的液体转入新的1.5mL EP管﹐使用c18 StageTip柱进行脱盐﹐浓缩干燥。然后使用0.1％甲酸水溶液复溶肽段。
每例样品取适量肽段使用纳升流速Easy nLC 1200色谱系统(ThermoScientific)进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸、乙腈和水混合溶液(其中乙腈为80％)。色谱柱以100％的A液平衡。样品进样到TrapColumn(100μm*20mm，5μm，C18，Dr.Maisch GmbH)后经过色谱分析柱(75μm*150mm，3μm，C18，Dr.MaischGmbH)进行梯度分离,流速为300nl/min。液相分离梯度如下：0分钟～2分钟，B液线性梯度从2％到5％；2分钟～44分钟，B液线性梯度从5％到28％；44分钟～51分钟，B液线性梯度从28％到40％；51分钟～53分钟，B液线性梯度从40％到100％；53分钟～60分钟，B液维持在100％。
肽段分离后用Q-Exactive Plus质谱仪(Thermo Scientific)进行DDA(数据依赖采集)质谱分析。分析时长为60min，检测模式：正离子，母离子扫描范围：350-1800m/z，一级质谱分辨率：60,000@m/z 200，AGC target:3e6，一级Maximum IT：50ms。肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱(MS2scan)，二级质谱分辨率：15,000@m/z 200，AGC target：le5，二级Maximum IT:50ms，MS2 Activation'Type：HCD,Isolation window：1.6m/z，Normalized collisionenergy：28。
质谱数据库检索软件为Pfind；使用如下蛋白质数据库：uniprot-Apis mellifera(Honeybee)[7460]-40765-20220524，其中Pfind搜库软件分析参数设置如表5所示。
表5pFind分析参数设置
D4组分经质谱数据检索后分别采用PSM FDR≤0.01和Protein FDR≤0.01为肽段、位点与蛋白鉴定的筛选标准，得到47条肽段序列和41条蛋白序列。多数肽带1或2个电荷，分子量范围为603～1058Da。
实施例4肽段筛选、合成及验证
1.多肽活性预测
根据Peptide Raker(http://ldistilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)对多肽生物活性的预测分数进行排序，筛选出分数大于0.5的多肽。
使用PeptideRanker评估肽具有生物活性的可能性，得分不小于0.5的肽段有10个，如表6所示。
表6 Peptide Ranker预测评分
2.分子对接
本研究通过开源软件AutoDock Vina1.1.2进行分子对接来评估肽与蛋白之间的相互作用，分子对接结果以Vina评分(kcal/mol)表示。Vina评分可以反映酪氨酸酶与肽的结合亲和力，表现为负值，Vina评分越低，结合亲和力越高。
大分子受体的准备和处理参照冯兰的方法对受体进行处理。从PDB数据库中下载酪氨酸酶(PDB ID：2ZMX)的晶体结构，该晶体结构为球童蛋白与酪氨酸酶的复合物。保留活性中心的2个铜离子，用PyMOL软件删除所有水分子，B链球童蛋白及其他配体，加氢等操作后保存为pdbqt格式备用。
小分子配体的准备和处理采用Chemdraw19.0软件绘制多肽的分子结构，用Chem3D将其转化为3D结构(MM2力场优化构型)，AutoDockTools软件加氢，检测扭转中心和扭转键，保存为pdb格式。
使用Autodock Vina软件进行分子对接模拟。设置对接中心坐标为(-2.927，22.019，-32.487)(x，y，z)，盒子大小为110×100×110，网格间距为0.43A，其它参数采取默认值，将多肽配体逐一与pdbqt格式酪氨酸酶晶体结构进行对接。采用PyMOL软件和AutoDockTools软件展示相互作用。
3.分子对接分析：如表7所示。
表7Auto Dock Vina软件分子对接结果
由表7可知，41个多肽与酪氨酸酶的结合能介于-5.2kcal/moL和-7.5kcal/moL之间，其中有11个结合能小于-6.9kcal/moL，有8个多肽的结合能小于-7.0kcal/moL。结合能越小则代表着肽段和受体蛋白的结合越稳定，并且有的Peptide Ranker评分大于0.5的肽段其结合能存在比较低的情况，Peptide Ranker评分只能代表存在生理活性可能性的大小，并不能反映是否具有生理活性。
综合考虑，选择结合能较低(≥-6.80kcal/moL)，且Peptide Ranker评分≥0.5的肽段进行合成并验证其活性。分别是TIPPPT(如SEQ ID NO.1所示)、IIPFIF(如SEQ ID NO.2所示)、ILFTLL(如SEQ ID NO.3所示)、IYVIF(如SEQ ID NO.4所示)、FIILIIIL(如SEQ IDNO.5所示)、IFFAI(如SEQ ID NO.6所示)、TLLLYLFI(如SEQ ID NO.7所示)
4.肽段合成及活性验证
肽段IYVIF、TIPPPT、FIILIIIL、IFFAI、IIPFIF、ILFTLL，LLLYLFI均由湖北强耀生物科技有限公司合成。根据实施例1的方法测定合成多肽的酪氨酸酶抑制率。
上述合成的7条肽段中，TIPPPT、IIPFIF、ILFTLL这3条的活性较强(另外四条肽段的活性弱)，具有较高的保护价值和应用价值，这3条活性较强肽段的酪氨酸酶抑制率IC50如表8所示。这3条小分子肽之间，除了均具有酪氨酸酶抑制活性外，不具有结构或机理上的共性，氨基酸残基的组成有较大差异，也不具有共同的活性部位或基团。其质谱图分别如图12、13、14所示。
表8肽段酪氨酸酶抑制率IC50
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (3)
1.一种小分子肽，其氨基酸序列为IIPFIF，如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的小分子肽在制备具有酪氨酸酶抑制功效的药物中的应用。
3.具有酪氨酸酶抑制活性的药物，其特征在于：其有效成分为权利要求1所述的小分子肽。
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Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN117205297A (zh) * | 2023-10-26 | 2023-12-12 | 中国海洋大学 | 小分子肽wp在制备缓解阿尔茨海默症的功能性产品中的应用 |
| CN117482209B (zh) * | 2023-11-13 | 2024-06-07 | 北京金王健康科技有限公司 | 一种具有ace抑制作用的蜂王胎活性肽组合物及其制备方法和应用 |
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| CN119570889B (zh) * | 2025-02-07 | 2025-06-13 | 齐鲁工业大学(山东省科学院) | 一种具有黑色素抑制活性的王浆蛋白酶解物及其制备和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009280550A (ja) * | 2008-05-26 | 2009-12-03 | Sanei Gen Ffi Inc | チロシナーゼ活性阻害剤 |
| JP2014124163A (ja) * | 2012-12-27 | 2014-07-07 | Morikawa Kenkodo Kk | チロシナーゼ阻害作用を有するローヤルゼリーの製造方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009280550A (ja) * | 2008-05-26 | 2009-12-03 | Sanei Gen Ffi Inc | チロシナーゼ活性阻害剤 |
| JP2014124163A (ja) * | 2012-12-27 | 2014-07-07 | Morikawa Kenkodo Kk | チロシナーゼ阻害作用を有するローヤルゼリーの製造方法 |
| KR20150136857A (ko) * | 2014-05-28 | 2015-12-08 | 대한민국(농촌진흥청장) | 알레르기성이 감소된 수용성 로열젤리를 포함하는 피부 미백 및 노화방지용 화장료 조성물 |
| CN114163516A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-03-11 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种胶原蛋白源酪氨酸酶抑制肽及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
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| 朱作艺等.蜂王浆蛋白肽的制备及其降血糖和抗氧化活性研究.食品工业科技.2020,第41卷(第17期),45-57. * |
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