TW201336429A

TW201336429A - 蜂王乳溶液及其製造方法

Info

Publication number: TW201336429A
Application number: TW101107190A
Authority: TW
Inventors: Wei-Lin Shao; Amanda Meng-Hsueh Lin
Original assignee: Vitalon Foods Co Ltd
Priority date: 2012-03-03
Filing date: 2012-03-03
Publication date: 2013-09-16
Also published as: JP2013179941A; JP6000741B2; US20130230621A1

Abstract

一種蜂王乳溶液及其製造方法，該方法包含：將一蜂王乳原料與水混合為一蜂王乳水懸浮液，於該蜂王乳水懸浮液中添加含有半胱胺酸內切酶的酵素後，使其在溫度20℃~70℃下進行反應，就能獲得一凝乳狀且呈穩定懸浮狀態的蜂王乳溶液。藉由在該蜂王乳水懸浮液中添加含有半胱胺酸內切酶的酵素，能夠提高該蜂王乳溶液中蛋白質分子的水合能力，使該蜂王乳溶液中的蛋白質分子不易分層沉澱且呈穩定懸浮狀態，因而不需離心、過濾、乳化與均質處理，藉此能保留蜂王乳全成分而有更高營養價值，並能減少處理程序而有較佳的製程效率與經濟效益。

Description

蜂王乳溶液及其製造方法

本發明是有關於一種蜂王乳溶液及其製造方法，特別是指一種用以處理原生蜂王乳使其呈現非透明凝乳狀的生物技術特酵製造法。即利用此生技酵素處理技術使蜂王乳溶液能呈穩定懸浮且乳白非透明狀的蜂王乳溶液及其製造方法。

蜂王乳(Royal Jelly，又稱為蜂王漿、蜂皇漿)是由工蜂之咽喉腺所分泌出的黃白色黏稠漿狀物。經研究發現，整個幼蟲期都餵食蜂王乳的幼蟲只需16天即可發育成蜂王，且其壽命長達5~6年，因此，蜂王乳被認為具有延年益壽的功效。

一般新鮮的蜂王乳呈乳白色或淡黃色，為一種漿狀半流體，部份可溶於水及乙醇，並會產生白色沉澱，放置一段時間後更會有分層現像。蜂王乳的含水量平均為60~70%，並含有9~18%的蛋白質、7~16%的醣類及3~8%的脂質，其他成分還有游離胺基酸、維生素(例如，生物素、葉酸、肌醇、菸鹼酸、泛酸、維生素B₁、B₂、維生素E)、礦物質、胜肽、脂肪酸及對人體具有保健功能的生物活性物質，例如，癸烯酸(10-Hydroxy-2-decenoic acid，簡稱為10-HDA)及MRJPs(Major Royal Jelly Proteins)等。因此，蜂王乳也常被用來當作天然營養保健品，且台灣專利公開號第200526193號申請案亦揭示蜂王乳為抗老化用組合物的其中一成份，台灣專利公告號第I340651號專利案則揭示了可利用蜂王漿增進膠原蛋白產生量的內容。

雖然原態蜂王乳可直接食用，但因其具有特殊之收斂性辛辣、酸味及黏稠感，對喉部親和力低，直接食用較不易為大眾所接受。此外，原態蜂王乳需以冷凍或冷藏方式保存，主要是因蜂王乳所含的蛋白質及蛋白酶類對溫度敏感，在高溫儲存環境下易使蜂王乳發生褐變現像，因此保存性不佳且使食用的便利性受到影響。為了克服不易保存之問題，食品業者多將蜂王乳加工製成粉末充填於膠囊或製成錠劑型式。雖然中國專利公告號第CN100421578號專利案、中國專利公告號第CN101223946號專利案、中國專利公開號第CN1076362A號申請案，及日本專利公開號特開平5-9125號申請案分別公開了將蜂王漿製成飲料的方法，並藉由在其中混以大量醣類與膠體或將其製成乾燥粉末的方式來改善蜂王乳溶液的保存性，但前述處理方式僅能將少量蜂王乳混入飲料等液態食品中，使原態蜂王乳在飲料加工食品中的使用量仍然受到限制，導致蜂王乳相關飲品的營養價值仍然未臻理想，因此，仍有開發可增加蜂王乳添加量之處理技術的需求。

其中，由於蜂王乳特有的流變特性，使其容易在溫度大於25℃時形成假塑性體，並造成製程及儲藏過程中的品質控管的難度，雖然中國專利公開號第CN1076362A號申請案與日本專利特開平5-320060號申請案分別公開了將蜂王乳以水溶解後，先離心去除非水溶性沉澱物，再以乙醇或丙酮提取沉澱物中的活性成分，並於加溫及調整其pH值後，再以離心或膜過濾法處理該沉澱物以獲得含有活性成分的抽出液，並將該抽出液回添到去除沉澱物的蜂王乳水溶液中，藉此，除去造成蜂王乳假塑體之不溶性成分，但此種處理方法易同時除去蜂王乳中醇不可溶性蛋白質，而無法完整保留蜂王乳中的活性成分，且用於提取沉澱物中活性成分的溶劑殘留在最終產品中可能會危害消費者的健康。而日本專利特開平1-215268號申請案與特開2008-118869號則公開了在蜂王乳水溶液中添加防腐劑以提高其保存性的內容，然而添加防腐劑仍存有易危害到消費者健康的風險。

另外，在中華民國專利第208043號專利案與日本專利特願平2-333641號申請案分別公開以酵素分解蛋白質的方式來提高蜂王乳之蛋白質分解率、回收率及保存性，進而得到透明澄清之蜂王乳溶液的內容。但前述方法皆是使用二種以上的蛋白酶作用於調整好pH值的蜂王乳溶液中，且仍然有大量不溶性蛋白質沉澱物而形成明顯分層的情形，且由於過多的沉澱物使產品保存性受限且賣相不佳而易引起消費者對產品品質狀態的疑慮，通常會再以離心過濾或膜過濾去除沉澱物，以獲得不含明顯沉澱物的澄清蜂王乳溶液。然而，經離心或過濾處理後，蜂王乳中特有的活性(bioactive)物質或不可溶性蛋白質會因離心或過濾的處理方式而被除去，導致蜂王乳中所有蛋白質及有效成分無法完整保留，而有營養價值相對較差的缺點。且前述申請案所揭露的技術內容顯然要使用二種以上來自哺乳動物的酵素處理蜂王乳溶液才能達到較高的回收率，同時為了減少白濁、沉澱與絮結現象，還要控制原態蜂王乳的添加量，因此，前述現有方法因為要使用二種以上來自哺乳動物的酵素及過濾除去沉澱物手續，而有製造成本較高而不符經濟效益的缺失。此外，在現有的製造方法中，原態蜂王乳仍然容易因為添加量過多而產生白濁或凝結沉澱較嚴重而無法維持安定懸浮的狀態，並使其添加量受限，導致所製出的蜂王乳飲料的營養價值仍有提升的空間。

因此，目前仍有開發安定性佳且具有較高的營養價值的蜂王乳以因應食品市場的需求，此外，為了減少因加工而導致蜂王乳浪費的情形，也有改善蜂王乳溶液相關產品的製法的需求。

因此，本發明的目的，是在提供一種利用含有特定酶的生技酵素處理後，能夠呈穩定懸浮狀態且不會有明顯的沉澱與分層，因而不需進行去除沉澱物的處理程序而能保留完整的蜂王乳營養成分的蜂王乳溶液的製造方法。

於是，本發明蜂王乳溶液的製造方法，包含下列步驟：

一、將一蜂王乳原料與水混合以獲得一蜂王乳水懸浮液；

二、在該蜂王乳水懸浮液中添加含有半胱胺酸內切酶(cysteine endopeptidase)的酵素以獲得一蜂王乳預反應液；及

三、使該蜂王乳預反應液在溫度20℃~70℃下進行反應，就能獲得一凝乳狀且呈穩定懸浮狀態的蜂王乳溶液。

本發明蜂王乳溶液的製造方法的有益效果在於：蜂王乳的蛋白質主要由水溶性與非水溶性蛋白質組成，其中王漿蛋白(MRJPs)佔總水溶性蛋白質含量約90%，而MRJPs蛋白質中則具有半胱胺酸位點且其C末端具有高度疏水性之性質，因此本法藉由在該蜂王乳水懸浮液中添加含有半胱胺酸內切酶的酵素，而能將蜂王乳蛋白質降解為分子更小的胜肽或胺基酸分子，並使可電離的氨基及羧基隨著水解而顯露出來。此外，還可藉由半胱胺酸內切酶作用於蜂王乳蛋白質，尤其是蛋白質中的硫醇基(-SH，thiol)的特性，而能藉由在硫醇基之間所形成的氫鍵，來提高蜂王乳溶液中的蛋白質分子的水合能力，通過蛋白質的降解作用與半胱胺酸內切酶作用於特定基團的特性，使所製出的蜂王乳溶液中的蛋白質分子不易沉澱且能夠長時間保持穩定懸浮狀態，因而不需如現有的方法另外以離心或過濾方式去除沉澱部分，因此，本發明的製造方法具有能保留蜂王乳全成分以提供營養價值更高的蜂王乳溶液產品的特性。此外，以本發明的製造方法所製得的蜂王乳溶液由於能保持穩定懸浮狀態，因而不需再經過濾、乳化、均質就能將該蜂王乳溶液作為飲料或液劑原料，能減少處理程序而有較佳的製程效率與經濟效益。

進一步地，本發明還提供一種不會形成明顯分層而能保持穩定懸浮狀態的蜂王乳溶液。

本發明蜂王乳溶液，是在一蜂王乳原料與水混合而成的一蜂王乳水懸浮液中添加含有半胱胺酸內切酶的酵素反應後獲得，該蜂王乳溶液為凝乳狀且呈穩定懸浮狀態，並包含具有下列特徵蛋白質質量：1214m/z±0.5%及/或2032m/z±0.5%。

本發明蜂王乳溶液的有益效果在於：藉由在該蜂王乳水懸浮液中添加含有半胱胺酸內切酶的酵素所配製出的蜂王乳溶液中，除了在該蜂王乳溶液中出現上述特徵蛋白質的質量外，還呈現凝乳狀與穩定懸浮狀，且不會出現明顯的沉澱物與分層而不需離心或過濾處理，藉此，使該蜂王乳溶液能在保有完整蜂王乳全溶液的條件下直接製成具有完整營養成分的全蜂王乳飲品或液劑產品，而有營養價值較高的特性。

有關本發明之前述及其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之二個較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。

參閱圖1，本發明蜂王乳溶液的製造方法的一較佳實施例包含下列步驟：

步驟201是將一蜂王乳原料與水混合以獲得一蜂王乳水懸浮液。其中，該蜂王乳原料可以選自於原態生鮮蜂王乳、冷凍蜂王乳或經凍結乾燥的蜂王乳。用於配製蜂王乳水懸浮液的水溫則不受限。然而，為了能快速配製完成及避免水溫過高導致蜂王乳原料中的蛋白質產生褐變，較佳是以20℃~70℃的水溫配製該蜂王乳水懸浮液，更佳是以40℃~55℃的水溫配製。此外，該蜂王乳水懸浮液中的蜂王乳原料的濃度亦不受限，可依需求調配該蜂王乳水懸浮液中的蜂王乳原料的濃度，在該蜂王乳水懸浮液中的蜂王乳原料的濃度較佳為0.1~40 wt%，更佳為2~20 wt%。

步驟202是在該蜂王乳水懸浮液中添加含有半胱胺酸內切酶(cysteine endopeptidase)的酵素以獲得一蜂王乳預反應液。在本實施例中所用的酵素為來自植物或其他方式製得的木瓜酵素(papain，在本實施例是選用EC編號為3.4.22.2、3.4.22.6及3.4.22.30的木瓜酵素)、鳳梨酵素(bromelain，在本實施例是選用EC編號為3.4.22.32及3.4.22.33的鳳梨酵素)、無花果酵素(ficain，在本實施例是選用EC編號為3.4.22.3的無花果酵素)，或前述酵素的組合。其中，只需取前述其中一種酵素添加就能獲得所要求的效果，而該酵素的添加量可為蜂王乳水懸浮液的重量的0.01%~90%。較佳地，為了避免酵素劑量太高而發生絮結情形，該酵素的添加量為蜂王乳水懸浮液的重量的0.05%~10%，更佳為0.1%~5%。

上述的EC編號是酶學委員會(Enzyme Commission)依據每種酵素所催化的化學反應為分類基礎，為酶(酵素)所製作的一套編號分類法，據此每一種酵素被指定一個建議的編號，每一個酵素編號都以字母「EC」開始，接著以四個號碼來表示，越後面位置的號碼代表越細的分類，藉此，透過EC編號就能看出酵素的分類及屬性。例如，三肽氨基蛋白酶的編號為EC3.4.11.4，當中的「EC3」指水解酶，「EC3.4」則指作用在胜肽鍵的水解酶，「EC3.4.11」指從多胜肽中分開胺基酸胺基末端的水解酶，「EC3.4.11.4」則是從三胜肽中分開胺基末端的水解酶。

較佳地，由於本發明所用的含有半胱胺酸內切酶的酵素，例如，木瓜酵素、鳳梨酵素與無花果酵素皆為酸-中性蛋白酶，為了獲得較佳反應效率，可以預先將該蜂王乳水懸浮液的pH值調整至適合上述酵素作用的範圍。由於一般在步驟201調製好的蜂王乳水懸浮液的pH值通常都會在3~5的範圍內，因此，也可以不調整該蜂王乳水懸浮液的pH值，並直接添加酵素進行反應。此外，當蜂王乳水懸浮液因蜂王乳原料來源不同，或數不同批次原料，或蜂王乳水懸浮液中的蜂王乳濃度高低而使其pH值發生變動時，也可以使用食品工業上或醫學上許可且符合安全規格的酸鹼值調整劑進行蜂王乳水懸浮液的pH值調整。常用的調整劑有：檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸及乳酸等。可以使用上述調整劑先將該蜂王乳水懸浮液的pH值調整為2~8，再添加酵素，如果要得到更佳的反應效率，則較佳是將該蜂王乳水懸浮液的pH值調整為3~6，更佳則為3~5。

步驟203是使該蜂王乳預反應液在溫度20℃~70℃下進行反應約0.5~10小時後，就能獲得一凝乳狀、幾乎無沉澱且不分層而呈穩定懸浮狀態的蜂王乳溶液。其中，為了避免於高溫作用下容易產生褐變，導致該蜂王乳溶液不穩定，則酵素反應溫度較佳為30-60℃間，更佳35-55℃。

為了達到所要求的反應效果又要避免反應時間過長而使製程時間太久不符製造效率要求，可藉由調整酵素添加量及反應溫度再調整反應時間，較佳是將該蜂王乳預反應液的反應時間控制在0.6~5小時，更佳為0.7~3小時，當達到所要求的反應效果或所設定的反應時間後，可採用一選自下列群組中的方式抑制酵素繼續作用：對該蜂王乳預反應液加熱至溫度70℃~110℃，或將該蜂王乳預反應液中的pH調整到小於2或大於8。即藉由高溫及不適合該類酵素活動的pH值環境使酵素失活而停止作用。在本實施例中，是利用加熱至高溫的方式抑制酵素繼續作用。其中，為了避免經木瓜酵素或鳳梨酵素作用後的蜂王乳溶液產生褐變，抑制酵素活性的溫度較佳為設定於80~105℃的範圍內，更佳為90~100℃的範圍內。

值得一提的是，當以本步驟所獲得的蜂王乳溶液進行蛋白質的質譜分析後，可以發現以本發明的方法所獲得的蜂王乳溶液中含有具有下列特徵蛋白質質量：1016m/z±0.5%、1214m/z±0.5%、2016m/z±0.5%、2032m/z±0.5%、3477m/z±0.5%、6030m/z±0.5%、6314m/z±0.5%、7413m/z±0.5%及8640m/z±0.5%。其中，經上述酵素處理後，特徵蛋白質質量為1214m/z±0.5%及2032m/z±0.5%的至少其中一種蛋白質將存在該蜂王乳溶液中，其餘的蛋白質質量則可能會全部存在，也可能只有部分存在。

需要補充說明的是，在步驟202中只需取上述酵素的其中一種添加於該蜂王乳水懸浮液中，就能利用半胱胺酸內切酶的作用，在不添加乳化劑、穩定劑、賦型劑、抗凝集劑、溶解輔助劑、安定化劑、防腐劑、增稠劑等一般食品工業上容許使用的添加劑的情況下，獲得非透明、非澄清而呈水凝乳狀、幾乎懸浮、不沉澱、不分層且安定的蜂王乳溶液，由於所獲得的蜂王乳溶液呈穩定懸浮狀態，因此，不需經澄清化或過濾處理，使該蜂王乳溶液能保留完整蜂王乳成分，加上經上述酵素處理後的蜂王乳溶液的安定性佳，在不添加安定劑與防腐劑的情況下，仍具有可長期保存的特性，使本發明的蜂王乳溶液因為能保留完整營養成分與不需添加食品添加劑而有較佳的營養價值，此外，相較於以往的酵素處理法通常要添加兩種以上蛋白質酵素於該蜂王乳水懸浮液中才能獲得所要求的處理效果的方式，本發明只需添加一種酵素，及使用植物酵素的方式，能節省購買酵素的成本，同時更符合經濟環保效益。

此外，基於產品多樣化開發設計考量，該蜂王乳溶液還可藉由搭配醫學上或食品法規上許可的添加劑進一步調製成不同形態、具不同食用特性、不同風味或有其他附加效果的飲料產品，例如，可於該蜂王乳溶液中添加營養劑、保健食品原料、保健食品食材、賦形劑、安定劑、增稠劑及抗凝集劑等醫學或食品上容許的添加劑與原料。例如，可於該蜂王乳溶液中添加醫學或食品容許之添加劑或進行調味，以進一步製成每100 cc含有40g前述蜂王乳溶液的蜂王乳飲料產品。

本發明蜂王乳溶液是由前述方法製得，即該蜂王乳溶液是在一蜂王乳原料與水混合而成的一蜂王乳水懸浮液中添加含有半胱胺酸內切酶的酵素反應後獲得，該蜂王乳溶液為凝乳狀且呈穩定懸浮狀態，其pH值為3~5，並包含具有下列特徵蛋白質質量：1214m/z±0.5%及/或2032m/z±0.5%。進一步地，除了上述兩種主要特徵蛋白質質量至少其中一種將存在該蜂王乳溶液中外，該蜂王乳溶液還可包含具有至少下列其中一種特徵蛋白質質量：1016 m/z±0.5%、2016 m/z±0.5%、3477 m/z±0.5%、6030 m/z±0.5%、6314m/z±0.5%、7413 m/z±0.5%及8640 m/z±0.5%。

其中，該含有半胱胺酸內切酶的酵素可為木瓜酵素、鳳梨酵素、無花果酵素，或前述酵素的組合，且其添加量可為蜂王乳水懸浮液的重量的0.01%~90%，較佳為0.05%~10%。由於前述酵素在酵素分類中皆屬於半胱胺酸內切酶，因此都能作用於蛋白質中的硫醇基(thiol，-SH)，在經前述三種酵素中任一種酵素作用後的蜂王乳蛋白質會降解成胜肽或更小的胺基酸分子，使可電離的氨基及羧基隨著水解顯露出來，蛋白質表面電荷及分子結構發生改變，尤其是親水性基團(例如，硫醇基團)的增加，且硫醇基之間形成的氫鍵也使得基團之間因為氫鍵結合而提高該蜂王乳溶液中蛋白質的水合能力，因而使該蜂王乳溶液中經前述酵素作用後形成的蛋白質具有良好的水合能力而能保持不沉澱與不分層的穩定懸浮狀態。此外，前述三種酵素皆屬酸性-中性蛋白酶，調配好的蜂王乳水懸浮液本身也是酸-中性溶液(其pH值約為4左右)，在經酵素作用後，蜂王乳溶液仍呈酸性，藉此，該蜂王乳溶液的pH值小於蛋白質等電點(pI)，更能促進整體溶液呈水合狀。因此，該蜂王乳溶液中的所有蛋白質(包括易形成沉澱的不可溶蛋白質)，在添加含有半胱胺酸內切酶的酵素後，配合pH值、蛋白質等電點及親水性胺基酸基團的特性，確實能保持穩定懸浮狀態，且不易形成沉澱與分層，能大幅減少容易沉澱的不可溶蛋白質的比例，因而不需進行分離處理，由於所有蛋白質能以懸浮狀態存在，相較於以往因為分層沉澱量多且明顯而需要進行移除沉澱物的處理程序所獲得蜂王乳溶液，顯然本發明的蜂王乳溶液保有完整的蜂王乳成分而有更佳的營養價值。

要補充說明的是，當該蜂王乳溶液中的pH值高於蛋白質等電點時，仍可藉由使用食品工業上或醫學上許可的酸鹼值調整劑調整該蜂王乳溶液的pH值，使其低於蛋白質的等電點而使溶液維持穩定懸浮狀態。

<具體例一>現有酵素與本發明酵素的處理結果比較

在7支編號依序為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7的試管中分別裝入配製好的蜂王乳水懸浮液，每一支試管中的蜂王乳水懸浮液的蜂王乳濃度皆為5.8wt%，分別對每一支試管內的蜂王乳水懸浮液進行如下處理：

A1：添加相當於該蜂王乳水懸浮液的0.1 wt%的量的胃白酶於溫度45℃下作用6小時後，再添加相當於該蜂王乳水懸浮液的0.1 wt%的量的酸性蛋白酶(使用源自Aspergillus Oryzae的蛋白酶)，再於溫度45℃下作用6小時後，將溶液pH值調整為5.5，並於溫度80℃加熱10分鐘，終止酵素作用。

A2：將該蜂王乳水懸浮液的的pH值調整為8，並分別添加相當於該蜂王乳水懸浮液的0.05 wt%的量的中性蛋白酶(使用源自枯草桿菌的蛋白酶Prolease)及胰酶，於溫度45℃下作用6小時後，將溶液pH值調整為5.5，並於溫度80℃加熱10分鐘，終止酵素作用

A3：不添加酵素，溶液溫度為55℃，pH值為4.0，經3小時後觀察溶液狀態。

A4：添加相當於該蜂王乳水懸浮液的0.15 wt%的量的木瓜酵素，溶液溫度為55℃，pH值為4.1，經0.5小時後，於溫度95℃下加熱5分鐘，終止酵素作用。

A5：添加的酵素種類、添加量、溶液溫度、pH值與A4相同，差別為在酵素作用1小時後，再藉由加熱終止酵素作用。

A6：添加的酵素種類、添加量、溶液溫度、pH值與A4相同，差別為在酵素作用3小時後，再加熱終止酵素作用。

A7：添加的酵素種類、添加量、溶液溫度、pH值與A4相同，差別為在酵素作用5小時後，再加熱終止酵素作用。

結果：參閱圖2，為A1~A7試管中的溶液分別經上述處理後的所呈現的外觀情形。其中，A1的上層澄清狀，下層則為明顯沉澱物。A2的上層為澄清狀，下層則為乳白不透明混濁狀且含有沉澱物。A3底部有乳白沉澱物，上層則呈非澄清狀。A4相較於A3，其底部的乳白沉澱物的量已減少一半以上，上層亦呈非澄清狀，A5~A7整支試管皆呈非澄清狀沒有明顯分層情形，底部已沒有沉澱物存在。由於A4~A7皆是以本發明所採用的木瓜酵素處理的結果，由圖2所呈現的結果顯示，經本發明方法所處理的蜂王乳水懸浮液，會呈現穩定懸浮狀態，因此不會出現明顯分層，且由A3到A4底部沉澱物的量明顯減少的結果，更說明經本發明處理的蜂王乳水懸浮液，確實能作用於不可溶蛋白質而改善沉澱與分層情形，顯然只要再增加酵素濃度或作用時間(如A5~A7所示)就可使整支試管中的溶液呈現沒有沉澱與分層，且呈凝乳狀與穩定懸浮狀態，而以現有酵素處理的蜂王乳水懸浮液(如A1與A2)，雖然上層呈澄清狀，但仍會出現大量的沉澱物。

<具體例二>溶液安定性、穩定係數、有效成分與懸浮程度的測試

提供五種以本發明的製造方法所獲得的蜂王乳試液B1、B2、B3、B4與B5，另外提供以一般現有方法所獲得的蜂王乳試液C1、C2、C3、C4與C5作為對照比較，並分別針對上述試液進行沉澱率、穩定係數、癸烯酸含量與其安定性，以及懸浮安定性等項目進行測試比較。其中，試液B1~B5及試液C1~C5的製備方法分別如下所述：

試液B1：取100g蜂王乳與常溫水(約為25℃)均勻混合定容為1kg，製成10 wt%的蜂王乳水懸浮液，並調整其pH值為4，加熱至60℃後，對該蜂王乳水懸浮液添加10g的木瓜酵素(為蜂王乳水懸浮液的重量的1%的量)以獲得一蜂王乳預反應液，並在60℃下實施酵素作用3小時，再使該經酵素作用後獲得的蜂王乳溶液於85℃下加熱20分鐘以終止其內的酵素作用。

試液B2：取205g蜂王乳與45℃水均勻混合並定容為1kg，製成20.5 wt%蜂王乳水懸浮液，並以檸檬酸或檸檬酸鈉調整其pH值為4，接著再添加鳳梨酵素10g(為蜂王乳水懸浮液的重量的1%的量)形成蜂王乳預反應液，使該預反應液於溫度55℃下進行酵素作用1小時，再將該經鳳梨酵素作用後獲得的蜂王乳溶液加熱至90℃並於該溫度維持5分鐘，以終止酵素作用。

試液B3：取400g蜂王乳與1kg溫水(50℃)混合均勻配製為蜂王乳水懸浮液，並調整其pH為4，加熱至溫度50℃後，對該蜂王乳水懸浮液添加相當於該蜂王乳水懸浮液的重量的5%之鳳梨酵素，並實施酵素作用1小時，接著再將該經酵素處理後獲得溶液於80℃下加熱5分鐘以終止酵素作用。

試液B4：依製備試液B3所述的方式配製5.5 wt%的蜂王乳水懸浮液，加熱至60℃後，對該蜂王乳水懸浮液添加相當於該蜂王乳水懸浮液的重量的0.5%的木瓜酵素，並在60℃下實施酵素作用50分鐘後，再於溫度90℃下加熱10分鐘以終止酵素作用。

試液B5：取58g蜂王乳配製為5.8 wt%的蜂王乳水懸浮液，加熱至55℃後，對該蜂王乳水懸浮液添加相當於該蜂王乳水懸浮液的重量的0.15%的木瓜酵素，並在55℃下實施酵素作用45分鐘，接著，再於95℃下加熱5分鐘以終止酵素作用。

試液C1：依試液B1所述的方式配製10 wt%的蜂王乳水懸浮液，並加熱至溫度60℃，在不添加酵素下實施水解作用3小時，獲得乳白狀的蜂王乳溶液，過濾並除去其中的沉澱物及不可溶性成分。

試液C2：取蜂王乳以45℃水配製成20.5 wt%的蜂王乳水懸浮液，並加入乙醇，使乙醇的添加量為該溶液重量的35%(wt%)，於溫度45℃下進行水解作用1小時。

試液C3：配製6 wt%的蜂王乳水懸浮液，調整其pH值為4，於溫度50℃水浴下靜置1.5小時。

試液C4：配製10wt%的蜂王乳水懸浮液1kg，並使用20 wt%的氫氧化鈉溶液將其pH值調整為4，再對此溶液添加1g的胃蛋白酶，於45℃下實施酵素處理6小時，接著，添加1g的酸性蛋白酶(使用源自Aspergillus Oryzae的蛋白酶)，並於溫度45℃下實施酵素處理6小時。最後，對經前述酵素處理後之溶液，分別利用20 wt%的氫氧化鈉溶液或10 wt%的檸檬酸溶液將其pH值調整為5.5，並於溫度80℃加熱10分鐘，使酵素失活後，不經過濾，就會獲得上層為澄清狀，下層為沉澱物之蜂王乳溶液。

試液C5：配製10wt%的蜂王乳水懸浮液1kg，並使用20 wt%的氫氧化鈉溶液將其pH值調整為8，再對此溶液添加中性蛋白酶(使用源自枯草桿菌的蛋白酶Prolease)及胰酶各0.5g，在溫度45℃下實施酵素處理6小時後，對經前述此酵素處理後之溶液，以20 wt%的氫氧化鈉溶液與10 wt%的檸檬酸溶液將其pH值調整為5.5，並於溫度80℃加熱10分鐘，使酵素失活後，不經過濾，就會獲得上層為澄清狀，下層為乳白不透明之蜂王乳溶液。

(1)沉澱率測試、安定性評估與收斂性酸味品評

蜂王乳溶液沉澱率是表示溶液的長期安定性，通常由其沉澱率來表示。於蜂王乳溶液中，粒徑越大或越重的粒子，經重力加速度後，沉澱於管底，因此，可用以來判斷此一溶液之粒子懸浮穩定度。一般而言，溶液的沉澱率越低表示溶液之安定性越佳。此測試是用來本發明的方法所製得試液B1~B5與現有方法所製得得試液C1~C5的溶液沉澱率，並藉此表示溶液凝乳化及懸浮程度。進行測試時，是分別將試液B1~B5與試液C1~C5置於離心管中，並使各試液於溫度小於25℃的環境下以轉速4000r.p.m.離心10分鐘，並由下列公式(E1)計算而得。另外，同時進行前述試液的安定性評估與收斂性酸味測試，安定性評估是測試前述試液B1~B5與試液C1~C5放置1個月後之安定程度，並依沉澱或凝集物之生成程度表示。收斂性酸味則為經專業人員品評後之結果。

測試結果如下表-1所示。

表-1　試液B1~B5與C1~C5的沉澱率與飲料安定性

由表-1的結果顯示，經木瓜酵素或鳳梨酵素作用後所得到的蜂王乳溶液(試液B1~B5)，即使經離心後，其沉澱率與非經本發明所界定的酵素處理的試液C1~C5相比仍明顯低得多。且試液B1~B5放置1個月後也幾乎無沉澱物或凝集物產生，顯示其安定性良好，相較於試液C1~C5，以試液B1~B5進一步製成的蜂王乳飲料產品顯然較無沉澱或凝集物產生之疑慮。在風味上，經本發明所界定的酵素處理過後之蜂王乳溶液(試液B1~B5)其特有的收斂性酸味明顯較試液C1~C5低，顯示以本發明的製造方法及經本發明的酵素處理後的蜂王乳溶液於風味也具有改善之效果。整體來看，經本發明製造方法所獲得的蜂王乳溶液，其製成飲料後的安定性及其特有之收斂性酸味明顯較未以本發明方法所用之酵素處理的蜂王乳溶液佳。

(2)穩定係數

主要是用來表示蜂王乳溶液於酸性環境下的溶液穩定性。穩定係數越高表示其穩定度越佳，此試驗是針對前述試液B1~B5與試液C1~C5於轉速3500r.p.m.下離心15分鐘後，以分光光度計(廠牌：Beckman Coulter’s Paradism Detection Platform)測其於660nm之吸光值，並經由下列公式計算而得：

測試結果如圖3所示，該結果顯示經本發明的酵素處理的蜂王乳溶液(試液B1~B5)，其穩定係數較未經本發明酵素處理的蜂王乳溶液(試液C1~C5)為佳。其中，又以試液B4的穩定係數最佳、試液B3次之。由上述結果可以說明本發明的製造方法及在該方法所使用的酵素具有提高蜂王乳溶液的溶液穩定性的功效。

(3)癸烯酸含量及其安定性

癸烯酸是蜂王乳中的生物活性物質，對人體具有保健功能，也是評估蜂王乳相關產品營養價值的一個重要指標。此試驗是針對前述試液B1~B5與試液C1~C5分別測試其癸烯酸含量及在前述試液中癸烯酸的安定性。癸烯酸含量係以C₁₈層析管柱(管徑：4.6mm，長度：250mm)以HPLC(高效能液相層析儀，廠牌：Agilent，型號：1200series)於波長210nm下偵測，再經由與標準品檢量線進行比對而獲得。

表-2　試液B1~B5與C1~C5的癸烯酸含量及安定性測試結果

表-2的結果顯示經本發明製造方法製得蜂王乳溶液(試液B1~B5)，經1個月常溫儲存後，其癸烯酸含量與其原態蜂王漿之癸烯酸比較並無明顯差異，顯示經本發明製造方法中的酵素處理的蜂王乳溶液，不但能保留蜂王乳有效成分-癸烯酸，且其含量安定性比未以本發明方法處理的蜂王乳溶液佳。而試液C1~C5的蜂王乳溶液中的癸烯酸含量則有輕微下降趨勢，且經常溫儲存後，其含量也有衰退的趨勢。據此說明經本發明製造方法所獲得的蜂王乳溶液能獲得較安定之癸烯酸含量，而有較佳的營養品質。

(4)懸浮程度測試

針對前述試液B1~B5與試液C1~C5分別測試其溶液的懸浮程度。懸浮程度是使用濁度計(Turbidity meter，型號：HACH 2100Q)進行測式，主要是利用光線散射原理量測，以光入射水體時被散射的程度作為判斷懸浮程度的標準。於懸浮狀態下，溶液會阻礙光的穿透，使得溶液之濁度會偏高，單位採用為標準濁度單位(Nephelometric Turbidity Unit,NTU)。其中，試液C4與試液C5的蜂王乳溶液是先經過濾除去沉澱物後，再針對無沉澱物的澄清透明蜂王乳溶液進行濁度測定。

表-3　試液B1~B5與C1~C5的濁度與懸浮安定性

表-3的結果顯示本發明製造方法所製得蜂王乳溶液(試液B1~B5)，經1個月常溫儲存後，其濁度沒有明顯變化，顯然以本發明製造方法中的酵素處理的試液B1~B5能長時間維持穩定懸浮狀態，且不易形成分層或沉澱。而試液C1~C5的蜂王乳溶液雖然因為沉澱與分層而使其溶液部分的原始濁度較小(也就是溶液相對較澄清)，但經1個月常溫儲存後，量測到的濁度還是有上升的趨勢，顯示溶液經儲存後其澄清液中仍持續有沉澱產生且有白濁現象而導致濁度上升，也就是說，試液C1~C5溶液中的物質無法維持穩定懸浮狀態，且據此可合理推測試液C1~C5中的成分無法穩定存在。據此說明經本發明製造方法所獲得的蜂王乳溶液中的蛋白質分子確實有保持穩定懸浮的效果，顯然溶液中成分可長時間穩定存在，因此不需進行過濾或離心移除，並能利用此種穩定懸浮與成分安定的特性，以保留完整蜂王乳蛋白質的方式生產蜂王乳相關飲品或液劑產品。

<具體例三>蛋白質身分鑑定

主要是採用胜肽質量指紋(Peptide Mass Fingerprinting)技術，並利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀(MALFI-TOF-MASS，廠牌：Applied Biosystems Voyager-DE PR，操作模式：線性，極性：正電，電壓：2000V，質量範圍：500~15000Da)鑑別所配製的試液中的蛋白質質量。分別針對未經酵素作用的蜂王乳水懸浮液-試液D1，及經不同種類、濃度的酵素於不同作用條件獲得的蜂王乳溶液-試液D2~D7的實施蛋白質身分鑑定的測試。試液D1~D7如下所述：

試液D1：未經酵素作用的6 wt%的蜂王乳懸浮液。

試液D2：配製6 wt%的蜂王乳水懸浮液，並於其中添加相當於蜂王乳水懸浮液的重量的0.1%的木瓜酵素，於溫度50~55℃下進行酵素作用30分鐘。

試液D3：配製6 wt%的蜂王乳水懸浮液，並於其中添加相當於蜂王乳水懸浮液的重量的0.1%的木瓜酵素，於溫度50~55℃下進行酵素作用3小時。

試液D4：配製6 wt%的蜂王乳水懸浮液，並於其中添加相當於蜂王乳水懸浮液的重量的1%的木瓜酵素，於溫度50~55℃下進行酵素作用30分鐘。

試液D5：配製6 wt%的蜂王乳水懸浮液，並於其中添加相當於蜂王乳水懸浮液的重量的1%的木瓜酵素，於溫度50~55℃下進行酵素作用3小時。

試液D6：配製6 wt%的蜂王乳水懸浮液，並於其中添加相當於蜂王乳水懸浮液的重量的0.1%的鳳梨酵素，於溫度50~55℃下進行酵素作用1小時。

試液D7：配製6 wt%的蜂王乳水懸浮液，並於其中添加相當於蜂王乳水懸浮液的重量的1%的鳳梨酵素，於溫度50~55℃下進行酵素作用1小時。

將上述試液D1~D7以現有的蛋白質身分鑑定方式，即胜肽質量指紋技術(Peptide Mass Fingerprinting)並經MALDI-TOF MS(廠牌：Applied Biosystems Voyager-DE PR)脫鹽手續後進行質譜分析，並找出其特徵蛋白質質量

比較圖4與圖5~圖10的質譜圖，可以看出施以酵素處理的蜂王乳溶夜與未經酵素處理之蜂王乳水懸浮液，其蛋白質質量於1000~1900 m/z(mass to charge ratio，質荷比)、2000~2900 m/z、3100~3600 m/z、4200~4500 m/z、6000~6400 m/z出現顯著差異，判斷此處出現的波峰(peak)訊號為經酵素作用後而剪切出的蛋白質分子的質量，經蛋白質身分鑑定的胜肽質量指紋技術處理後，評估1016 m/z±0.5%、1214 m/z±0.5%、2016m/z±0.5%、2032m/z±0.5%、3477m/z±0.5%、6030±0.5% m/z、6314m/z±0.5%、7413±0.5%、8640m/z±0.5%為本發明製造方法所製出的蜂王乳溶液的特徵蛋白質質量。即經本發明製造方法中的酵素處理而得到的蜂王乳溶液中含有上述特徵蛋白質質量的蛋白質分子。

歸納上述，本發明蜂王乳溶液的製造方法，可獲致下述的功效及優點，故能達到本發明的目的：

一、由上述實施例處理方式可以清楚看出，本發明不需如現有技術(例如，中華民國專利第208043號專利案與日本專利特願平2-333641號申請案所述)一定要使用二種或二種以上酵素才能達到預定的處理效果。實際上，本發明只需添加一種酵素，就能將原生蜂王乳處理為穩定懸浮且成分安定的蜂王乳溶液，據此所製出的蜂王乳溶液的品質相當穩定，因而適合以保留全蜂王乳成分的方式將其進一步製成蜂王乳相關產品。由於可以只使用一種酵素進行處理，也不需要另外進行過濾或離心的程序，使本發明能降低原料成本、簡化製程步驟，且所獲得的產品品質穩定，故本發明相較於現有技術在實際應用上確實具有更佳的經濟及環保效益。

二、本發明藉由使用含有半胱胺酸內切酶的酵素處理蜂王乳水懸浮液，只需要將單一的一種酵素添加於該蜂王乳水懸浮液中，就能製得非透明、水凝乳狀的全蜂王乳溶液，可以簡化製程、縮短因長時間的製造過程造成的高成本，不但能提升製程效率還可節省製造成本，更符合商業經濟實惠原則，而有較佳的經濟效益。

三、本發明製造方法所得到的蜂王乳溶液，不但能以保留完整成分的方式製成產品，由上述測試分析結果更顯示以本發明的酵素處理的蜂王乳溶液，在溶液本身的安定性與穩定係數、有效成分含量與有效成分安定性，以及懸浮狀態的長期保持與安定性上，都有很穩定的表現，顯示本發明的蜂王乳溶液不但有更完整的營養成分，也有產品品質較穩定的特性。

四、本發明所製得的蜂王乳溶液，由於能維持穩定懸浮狀態，不需再進行除去沉澱及過濾過程，能完整保留蜂王乳成份，有效避免珍貴食材浪費及回收率的問題，相較於過去以二種或二種以上的酵素作用於蜂王乳水懸浮液而得到澄清蜂王乳飲品之方式，不但製程更為簡便且經濟，還有營養價值更高的特性，而且本方法製造成本低，又適合大量生產，在食品業的製造生產上極具實用價值。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

圖1為本發明蜂王乳溶液的製造方法的一較佳實施例的一流程圖；

圖2為蜂王乳水懸浮液經不同處理方式後分別呈現沉澱、分層與懸浮狀態的一對照比較圖；

圖3為一長條圖，用於對照比較不同酵素處理的試液的穩定係數；

圖4為一質譜圖，用於說明試液D1中的蛋白質質量分布情形；

圖5為一質譜圖，用於說明試液D2中的蛋白質質量分布情形；

圖6為一質譜圖，用於說明試液D3中的蛋白質質量分布情形；

圖7為一質譜圖，用於說明試液D4中的蛋白質質量分布情形；

圖8為一質譜圖，用於說明試液D5中的蛋白質質量分布情形；

圖9為一質譜圖，用於說明試液D6中的蛋白質質量分布情形；及

圖10為一質譜圖，用於說明試液D7中的蛋白質質量分布情形。

Claims

一種蜂王乳溶液的製造方法，包含下列步驟：一、將一蜂王乳原料與水混合以獲得一蜂王乳水懸浮液；二、在該蜂王乳水懸浮液中添加含有半胱胺酸內切酶的酵素以獲得一蜂王乳預反應液；及三、使該蜂王乳預反應液在溫度20℃~70℃下進行反應，就能獲得一凝乳狀且呈穩定懸浮狀態的蜂王乳溶液。
依據申請專利範圍第1項所述的蜂王乳溶液的製造方法，其中，在步驟二中所用的酵素為木瓜酵素、鳳梨酵素、無花果酵素，或前述酵素的組合。
依據申請專利範圍第2項所述的蜂王乳溶液的製造方法，其中，在步驟二中的酵素的添加量為該蜂王乳水懸浮液的重量的0.01%~90%。
依據申請專利範圍第1項所述的蜂王乳溶液的製造方法，其中，在步驟二中是先將該蜂王乳水懸浮液的pH值調整為2~8，再添加酵素。
依據申請專利範圍第1項所述的蜂王乳溶液的製造方法，其中，在步驟一所配製的蜂王乳水懸浮液的蜂王乳原料的濃度為0.1~40 wt%。
依據申請專利範圍第1項所述的蜂王乳溶液的製造方法，其中，在步驟三中，使該蜂王乳預反應液在溫度20℃~70℃下進行反應0.5~10小時後，以一選自下列群組中的方式抑制酵素繼續作用：對該蜂王乳預反應液加熱至溫度70℃~110℃，及將該蜂王乳預反應液中的pH調整到小於2或大於8。
一種蜂王乳溶液，是在一蜂王乳原料與水混合而成的一蜂王乳水懸浮液中添加含有半胱胺酸內切酶的酵素反應後獲得，該蜂王乳溶液為凝乳狀且呈穩定懸浮狀態，並包含具有下列特微蛋白質質量：1214m/z±0.5%及/或2032m/z±0.5%。
依據申請專利範圍第7項所述的蜂王乳溶液，其中，該蜂王乳溶液還包含具有至少下列其中一種特徵蛋白質質量的蛋白質：1016m/z±0.5%、2016m/z±0.5%、3477m/z±0.5%、6030m/z±0.5%、6314m/z±0.5%、7413m/z±0.5%及8640m/z±0.5%。
依據申請專利範圍第7項所述的蜂王乳溶液，其中，該蜂王乳溶液的pH值為3~5。
依據申請專利範圍第7項所述的蜂王乳溶液，其中，含有半胱胺酸內切酶的酵素的添加量為該蜂王乳水懸浮液的重量的0.01%~90%，且所添加的含有半胱胺酸內切酶的酵素為木瓜酵素、鳳梨酵素、無花果酵素，或前述酵素的組合。