CN117126243B - 一种小分子肽pypdw及其应用 - Google Patents
一种小分子肽pypdw及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117126243B CN117126243B CN202311393472.3A CN202311393472A CN117126243B CN 117126243 B CN117126243 B CN 117126243B CN 202311393472 A CN202311393472 A CN 202311393472A CN 117126243 B CN117126243 B CN 117126243B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pypdw
- peptide
- small molecule
- difference
- molecule peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 86
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 32
- 229940109850 royal jelly Drugs 0.000 abstract description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 17
- 101100444898 Mus musculus Egr1 gene Proteins 0.000 abstract description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 14
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 13
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 abstract description 12
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 abstract description 12
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 abstract description 12
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 abstract description 11
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 abstract description 11
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 abstract description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 6
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 31
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 31
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 26
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 13
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 13
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 12
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 11
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 10
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 10
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 241000256836 Apis Species 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 5
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000256843 Apis mellifera ligustica Species 0.000 description 4
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 4
- JGDITNMASUZKPW-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.Cl[Al](Cl)Cl JGDITNMASUZKPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229940009861 aluminum chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 229960003135 donepezil hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- XWAIAVWHZJNZQQ-UHFFFAOYSA-N donepezil hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].O=C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CC1CC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 XWAIAVWHZJNZQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N chloroacetamide Chemical compound NC(=O)CCl VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- -1 potassium ferricyanide Chemical compound 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- BVCOHOSEBKQIQD-UHFFFAOYSA-N 2-tert-butyl-6-methoxyphenol Chemical compound COC1=CC=CC(C(C)(C)C)=C1O BVCOHOSEBKQIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 3-phosphanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCP QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 101150058765 BACE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 208000031124 Dementia Alzheimer type Diseases 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 108010067722 Dipeptidyl Peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006933 amyloid-beta aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 1
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 1
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008812 hippocampal apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000011977 language disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007787 long-term memory Effects 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004373 mandible Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007087 memory ability Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019629 palatability Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000002542 parent ion scan Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009290 primary effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000002550 vasoactive agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种小分子肽PYPDW及其应用，属于酶解加工产品技术领域。所述小分子肽PYPDW的氨基酸序列为Pro‑Tyr‑Pro‑Asp‑Trp，如SEQ ID NO.1所示。所述小分子肽PYPDW在制备缓解阿尔茨海默症的药物中的应用。本发明利用分子对接从蜂王浆多肽中筛选得到了小分子肽PYPDW，研究发现，小分子肽PYPDW对氧化应激引起认知功能障碍的关键受体蛋白Fyn及Keap 1具有抑制活性，具有乙酰胆碱酯酶抑制功效，对超氧化物歧化酶的活力具有增强的效果，能上调egr 1基因和下调caspase 3基因表达。因此，小分子肽PYPDW具有作为缓解阿尔茨海默症的药物的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种小分子肽PYPDW及其应用，属于酶解加工产品技术领域。
背景技术
蜂王浆是由蜜蜂工蜂的咽下腺和下颌腺分泌而来的粘性浆状物，具有多种活性成分，以及多种生物学功能，如降压降脂、抗氧化和保护神经系统等。但是蜂王浆适口性低，加工利用度低，制约了利用价值。而多肽具有多种优势，如益于消化吸收且具有低敏性，易透过血脑屏障等。因此，对蜂王浆进行酶解得到蜂王浆酶解物，从蜂王浆酶解物中挖掘具有特殊生物活性的多肽是当前的研究热点。
阿尔茨海默症（AD）是老年人群中常见的不可逆的神经退行性疾病，临床表现为进行性记忆和认知能力减退、语言障碍、精神运动异常等症状。氧化应激作为阿尔茨海默病进展的主要因素，通过引起神经元线粒体功能障碍、大分子氧化、金属离子与Aβ斑块结合产生活性氧（ROS），以及过度磷酸化的tau蛋白和Aβ合成的上调促进病理学形成。目前治疗阿尔茨海默症的药物有胆碱酯酶抑制剂和n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂，其伴随较为严重的副作用。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种小分子肽PYPDW及其应用，属于酶解加工产品技术领域。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种小分子肽PYPDW，其氨基酸序列为Pro-Tyr-Pro-Asp-Trp，如SEQ ID NO.1所示。
小分子肽PYPDW在制备缓解阿尔茨海默症的药物中的应用。
进一步地，所述缓解阿尔茨海默症的药物的有效成分为小分子肽PYPDW。
进一步地，所述缓解阿尔茨海默症的药物中还含有药学上常用的辅料，所述辅料选自水、葡萄糖、硬脂酸镁等；所述缓解阿尔茨海默症的药物的剂型选自常见剂型，如注射剂、口服液、片剂、胶囊等。
本发明通过实验研究发现，蜂王浆多肽具有抗氧化活性，因此蜂王浆多肽具有作为缓解阿尔茨海默症的药物的潜力。进一步地，经LC-MS/MS鉴定，利用分子对接从蜂王浆多肽中筛选得到了小分子肽PYPDW（存在于R4中），研究发现，小分子肽PYPDW对氧化应激引起认知功能障碍的关键受体蛋白Fyn及Keap 1具有抑制活性，具有乙酰胆碱酯酶（AchE）抑制功效，对超氧化物歧化酶（SOD）的活力具有增强的效果，能上调早期生长反应因子1（egr 1）基因和下调半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3）基因表达。因此，小分子肽PYPDW具有作为缓解阿尔茨海默症的药物的潜力。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：蛋白酶对还原力的影响示意图，其中，采用字母标注法标注差异结果，a、b、c、d、e表示不同实验组之间的差异显著性，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图2：加酶量对还原力的影响示意图，其中，采用字母标注法标注差异结果，a、b、c、d表示不同实验组之间的差异显著性，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图3：初始pH对还原力的影响示意图，其中，采用字母标注法标注差异结果，a、b、c、d表示不同实验组之间的差异显著性，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图4：酶解温度对还原力的影响示意图，其中，采用字母标注法标注差异结果，a、b、c、d表示不同实验组之间的差异显著性，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图5：料液比对还原力的影响示意图，其中，采用字母标注法标注差异结果，a、ab、b、c、d、e表示不同实验组之间的差异显著性，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图6：酶解时间对还原力的影响示意图，其中，采用字母标注法标注差异结果，a、b、c、d、e表示不同实验组之间的差异显著性，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。
图7：标准品及蜂王浆酶解液的分子量分布图。
图8：酶解液经G-10葡聚糖凝胶柱层析的分离结果示意图。
图9：各样品处理后斑马鱼乙酰胆碱酯酶荧光值比较示意图，其中，与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01。
图10：各样品处理后斑马鱼的超氧化物歧化酶活力比较示意图，其中，与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
图11：egr 1基因相对表达量比较示意图，其中，与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
图12：caspase 3基因相对表达量比较示意图，其中，与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
下述实施例所采用的蜂王浆，购自山东丰采健康产业有限公司，置于密封不透光袋中，置于-20℃环境，备用。
实施例1 蜂王浆酶解工艺的优化
1.筛酶
（1）准确称取蜂王浆1 g，加入10 ml蒸馏水配置成料液比为1:10的底物溶液，分别调节底物溶液至酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶的最佳pH（分别为3.0～4.0、6.0～7.0、6.8～7.0、6.0～8.0和8.0～11.0），按加酶量2000 U/g（酶活/蜂王浆）加入五种蛋白酶，在水浴摇床50℃、200 rpm条件下酶解5小时；将样品煮沸15分钟灭酶，冷却至室温，以8000 rpm离心10分钟，测定酶解上清液的还原力。每组设三个平行。
（2）体外还原力的测定：取0.5 ml试样，与0.5 ml的0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和0.5 ml的1.0%（单位g/ml）铁氰化钾溶液混合，在50℃水浴条件中孵育20分钟。冷却至室温，加入0.5 ml的10%（单位g/ml）三氯乙酸溶液以停止反应。将混合物以1500 g离心10分钟，取1 ml上清液，与1 ml蒸馏水和0.2 ml的0.1%（单位g/ml）FeCl3溶液混合，室温避光反应10分钟，在700 nm处测量吸光度，以BHA（叔丁基羟基茴香醚）为阳性对照（浓度为0.1 mg/ml）。
体外还原力的计算公式如下：
体外还原力（%）=（Abs样品/Abs阳性对照）×100%。
（3）结果：蛋白酶对还原力的影响示意图如图1所示。由图1可知，中性蛋白酶酶解产物的体外还原能力最强，达107.82%，显著优于其他4种蛋白酶，因此选择中性蛋白酶进行单因素优化实验，详见下述。
2.加酶量的优化
准确称取蜂王浆1 g，加入10 ml蒸馏水配置成料液比为1:10的底物溶液，调节底物溶液初始pH为7.0，按加酶量1000、2000、3000、4000、5000 U/g（酶活/蜂王浆）加入中性蛋白酶，在水浴摇床50℃、200 rpm条件下酶解5小时。将样品煮沸15分钟灭酶，冷却至室温，以8000 rpm离心10分钟，测定酶解上清液的还原力。每组设三个平行。
结果：加酶量对还原力的影响示意图如图2所示。随着加酶量的升高，还原能力也逐渐增强，至加酶量为4000 U/g时还原力下降后又升高，加酶量为3000 U/g及5000 U/g时还原能力显著高于其他组（P＜0.05）。出于经济考虑，选择中性蛋白酶加酶量为3000 U/g进行下一步优化。
3.初始pH的优化
准确称取蜂王浆1 g，加入10 ml蒸馏水配置成料液比为1:10的底物溶液，以1 M盐酸和1 M的NaOH溶液调整底物溶液的初始pH值分别为4、5、6、7、8，按加酶量3000 U/g（酶活/蜂王浆）加入中性蛋白酶，在水浴摇床50℃、200 rpm条件下酶解5小时。将样品煮沸15分钟灭酶，冷却至室温，以8000 rpm离心10分钟，测定酶解上清液的还原力。每组设三个平行。
结果：初始pH对还原力的影响示意图如图3所示。随着pH的升高，酶解液的还原能力呈现先增强后减弱的趋势，其中当初始pH为6时，还原能力达到85.32%，显著高于其他组（P＜0.05）。因此，选择初始pH为6进行下一步优化。
4.酶解温度的优化
准确称取蜂王浆1 g，加入10 ml蒸馏水配置成料液比为1:10的底物溶液，调整底物溶液的初始pH值为6，按加酶量3000 U/g（酶活/蜂王浆）加入中性蛋白酶，分别在30、40、50、60、70℃，200 rpm条件下酶解5小时。将样品煮沸15分钟灭酶，冷却至室温，以8000 rpm离心10分钟，测定酶解上清液的还原力。每组设三个平行。
结果：酶解温度对还原力的影响示意图如图4所示。随着温度的升高，酶解产物的还原能力呈现先增强后减弱的趋势，其中当酶解温度为50℃时，还原能力达到97.72%，显著高于其他组（P＜0.05）。因此，选择酶解温度为50℃进行下一步优化。
5.料液比的优化
分别配置料液比为1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12的底物溶液，调整底物溶液的初始pH值为6，按加酶量3000 U/g（酶活/蜂王浆）加入中性蛋白酶，在水浴摇床50℃、200 rpm条件下酶解5小时。将样品煮沸15分钟灭酶，冷却至室温，以8000 rpm离心10分钟，测定酶解上清液的还原力。每组设三个平行。
结果：料液比对还原力的影响示意图如图5所示。酶解产物的还原能力随着料液比的增大而减弱，其中1:2、1:4之间没有显著性，还原能力达到113.55%及111.19%，但显著性高于其他组（P＜0.05）。出于经济考虑，选择料液比1:4进行下一步优化。
6.酶解时间的优化
将蜂王浆配置成料液比为1:4的底物溶液，调整底物溶液的初始pH值为6，按加酶量3000 U/g（酶活/蜂王浆）加入中性蛋白酶，在水浴摇床50℃、200 rpm条件下分别酶解2、3、4、5、6小时。将样品煮沸15分钟灭酶，冷却至室温，以8000 rpm离心10分钟，测定酶解上清液的还原力。每组设三个平行。
结果：酶解时间对还原力的影响示意图如图6所示。随着酶解时间的延长，酶解产物还原能力呈现先增强后减弱的趋势。当酶解时间为3小时及4小时时没有显著性，还原能力达到141.93%及143.92%，但显著性明显高于其他时间组（P＜0.05）。因此，出于经济考虑，选择酶解时间3小时进行下一步优化。
7.正交试验优化
根据单因素实验结果，确定料液比，初始pH值、温度及加酶量四个因素的水平，设置4因素3水平正交实验，测定还原能力，获得最佳酶解条件（酶解时间3小时）。正交实验设计因素水平表详见表1。
表1 正交实验设计因素水平表
蜂王浆酶解正交优化实验结果如表2所示，表2中采用字母标注法标注还原力的差异结果，a、b、c、d、f、g、h表示不同肽段之间的差异显著性，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。从R值分析可以看出，料液比、初始pH值、温度及加酶量对酶解效果影响的主次效应为：B＞A＞C＞D，即料液比的影响最大，温度对酶解效果的影响最小。最终得到优化组合为A3B1C3D1，即料液比为1:3，初始pH为7， 酶解温度为45℃，加酶量4000 U/g，经过验证得还原能力为205.24%。
表2 蜂王浆酶解正交优化实验结果
实施例2 葡聚糖凝胶过滤层析及各组分活性分析
将蜂王浆配置成料液比为1:3的底物溶液，调整底物溶液的初始pH值为7，按加酶量4000 U/g（酶活/蜂王浆）加入中性蛋白酶，在水浴摇床45℃、200 rpm条件下酶解3小时，得蜂王浆酶解液。
使用Vivaflow 50R（Sartorius，德国）超滤膜包依次获得＜10 KDa和＜5 KDa的酶解液组分，将＜5 KDa的酶解液组分冻干并在-20℃保存，称为R0，作为下述待测样品。超滤膜包经0.5 mol/l的NaOH溶液洗涤并用10%乙醇溶液密封置于4℃环境保存。
采用高效液相色谱法测定标准品及蜂王浆酶解液的分子量的分布情况，标准品及蜂王浆酶解液的分子量分布图如图7所示。设定色谱条件为：色谱柱，TSK gel 2000 SWXL300 mm×7.8 mm；流动相比例为乙腈:水:三氟乙酸=45:55:0.1（体积比）；检测波长选择UV220 nm；流速设定为0.5 mL/min；柱温设定为30℃，进样体积为10μl。选择细胞色素C（12384Da），猪胰岛素（5733.49 Da），杆菌肽（1422.69 Da），谷胱氨肽（307.32 Da）作为凝胶过滤色谱柱分子量的标准品。
用纯水配制流动相并超声至无气泡。将待测样品及混合标准品用流动相分别配制为10 mg/ml及8 mg/ml，0.22μm微孔滤膜过滤后进样。根据标准品的出峰时间绘制标准曲线，根据绘制的标准曲线拟合计算样品中多肽的分子量范围。蜂王浆酶解液中多肽分子量分布结果如表3所示，分子量主要集中在485.47 Da以下，故选择葡聚糖凝胶G-10（SephadexG-10）作为层析柱的填料。
表3 蜂王浆酶解液中多肽分子量分布结果
葡聚糖凝胶G-10加入适量超纯水，静置溶胀24小时，除去浮沫及杂质；反复加入超纯水搅拌、静置并除去上层杂质，重复至上层无破碎杂质。加入合适比例的水，将填料连续沿壁填入16 mm×70 cm层析柱，避免分层和气泡出现。待层析柱填料高度基本不再变化后，泵入超纯水将填料压实，直至层析柱高度不再发生变化。
上样：配制100 mg/ml的样品溶液，上样体积为3 ml；洗脱速度为1.5 ml/min；流动相为超纯水，收集出峰的组分并冻干，测定不同组分的抗氧化活性。
结果：酶解液经G-10葡聚糖凝胶柱层析的分离结果示意图如图8所示，5个洗脱峰分别命名为R1、R2、R3、R4、R5。依次收集R1～R5所对应的洗脱液并冻干。冻干粉加水复配成浓度为10 mg/ml的溶液，测定各组分的还原力（以0.1mg/ml BHA的百分比表示），各组分的还原力测定结果如表4所示，表4中采用字母标注法标注还原力的差异结果，a、b、c、d、e、f表示不同实验组之间的差异显著性，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。洗脱峰R4的还原能力最强，因此选择组分R4进行下一步的实验。
表4 各组分的还原力测定结果
实施例3 LC-MS/MS质谱鉴定组分R4的肽段组成
肽段脱盐：实施例2中组分R4冻干粉，加入适量8 M UA（尿酸）复溶，取适量溶液，加入适量（2-羧乙基）膦（TCEP）和氯乙酰胺（CAA），37℃孵育1 h，将上清转移至10 K超滤管，12000 g 离心 15 min，再加入200μl 8 M UA，12000 g离心 15 min，接着加入200μl 0.2%TFA（三氟乙酸），12000 g离心15 min，重复一遍；收集滤液，使用C18 StageTip脱盐，真空干燥。干燥后肽段用0.1% FA（甲酸）复溶，OD280测定肽段浓度，以备LC-MS分析。
LC-MS/MS分析：每例样品取适量肽段使用纳升流速Easy nLC 1200色谱系统（Thermo Scientific，塞默飞世尔科技）进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸、乙腈和水的混合溶液（其中乙腈为80%）。色谱柱以100%的A液平衡。样品进样到Trap Column（捕集柱）（100μm*20 mm，5μm，C18，Dr.Maisch GmbH，德国迈克）后经过色谱分析柱（75μm*150 mm，3μm，C18，Dr.Maisch GmbH）进行梯度分离，流速为300 nl/min。
液相分离梯度如下：0 min～2 min，B液线性梯度从2%到5%；2 min～44 min，B液线性梯度从5%到28%；44 min～51 min，B液线性梯度从28%到40%；51 min～53 min，B液线性梯度从40%到100%；53 min～60 min，B液维持在100%。
肽段分离后用Q-Exactive Plus质谱仪（Thermo Scientific）进行DDA（数据依赖采集）质谱分析。分析时长为60 min，检测模式：正离子，母离子扫描范围：50～750 m/z，一级质谱分辨率：60,000 @m/z 200，AGC target:3e6，一级 Maximum IT:50 ms。
肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后触发采集 20个最高强度母离子的二级质谱图谱（MS2 scan），二级质谱分辨率：15,000 @ m/z 200，AGCtarget: 1e5，二级 Maximum IT：50 ms，MS2 Activation Type: HCD，Isolation window：1.6 m/z，Normalized collisionenergy:28。
数据库检索：采用的质谱数据库检索软件为MaxQuant 2.1.2.0，常规设置分析参数。使用如下蛋白质数据库：ncbi-Apis mellifera ligustica(Common honeybee)(Italian honeybee)[7469]-1917-20230508.fasta和uniprot-Apis melliferaligustica(Common honeybee)(Italian honeybee)[7469]-111-20230508.fasta。
R4组分经质谱数据检索后采用PSM FDR≤0.01和Protein FDR≤0.01分别为肽段、位点与蛋白鉴定的筛选标准，得到195条肽段和8条蛋白。
实施例4 肽段筛选、合成及验证
1.多肽的活性预测
首先根据肽段匹配错误的概率（PEP）、肽段匹配得分（Score）和肽段的峰强度值（Intensity）进行筛选，将得分和强度为零及匹配错误率过高的筛除。使用PeptideRanker评估肽具有生物活性的可能性并进行排序，195条肽中评分超过0.5的肽段有74条，大于0.9的肽段有21条。
通过搜索BIOPEP数据库来评估PeptideRanker（肽段评分的一个在线软件）评分大于0.5的74条短肽的生物活性，通过Toxin Pred（毒性预测的一个在线软件）毒性评价来评估74条短肽的毒性及PI值。大多数短肽潜在或具有降血压（ACE抑制、肾素抑制和血管活性物质的释放活性），降血糖（DPP-IV抑制、葡萄糖吸收刺激活性和α-葡萄糖苷酶抑制的活性），控制疼痛（DPP-Ⅲ抑制活性）和AChE抑制活性，少部分具有抗氧化活性。大量的研究统计结果发现，氨基酸的组成以及位点对多肽抗氧化活性起着至关重要的作用，活性肽 N末端的氨基酸残基为芳香族氨基酸或Pro可能是作用于自由基清除的关键位点。除此之外，末端含有疏水氨基酸更容易进入受体活性口袋并稳定结合，而上述多肽的疏水性氨基酸在N端的多肽占比72%。通过评估，发现74条短肽均无毒性，pI值范围多数在5～7,少数在9～11。通过上述条件筛选48条多肽进行分子对接。
2.分子对接
配体的处理：采用Chemdraw 19.0及Chem3D 19.0软件绘制多肽的分子结构式，通过MM2力场优化，保存为pdb文件。使用AutoDock软件（分子对接的一个软件），将pdb文件导入并加氢，保存为pdbqt配体文件。
受体的处理：从PDB数据库中下载Fyn（2DQ7）和Keap 1（6SP1）的晶体结构，采用PyMOL软件将多余的氯离子和水分子删除，保存为pdb文件。使用AutoDock Tools软件对受体2DQ7和6SP1进行去水加氢，保存为pdbqt受体文件备用。
分子对接：使用AutoDock Tools软件的vina功能进行分子对接，模拟多肽小分子与大分子蛋白质的相互作用。设置2DQ7的对接中心坐标为（-3.031，-9.266，39.033）（x，y，z），盒子大小为50×51×58，设置6SP1的对接中心坐标为（-26.315，20.346，-16.173）（x，y，z），盒子大小为51×51×49，其它参数采取默认值。然后，将氨基酸和多肽配体逐一与2DQ7晶体结构进行对接处理。
结果：将上述筛选的48条肽段分别与2DQ7和6SP1进行Vina模拟对接，根据Vina得分，筛选14条小分子肽进行合成验证。
实施例5 小分子肽的合成及活性验证
1.合成
小分子肽PYPDW、WP、FW等14条小分子肽均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
2.活性验证
还原力的测定：将各小分子肽配成10 mg/ml溶液，根据实施例1中的方法测定小分子肽的体外还原力。还原力排名前8的小分子肽的相关性质及抗氧化活性验证结果如表5所示，表5中采用字母标注法标注还原力的差异结果，a、b、c、d、e、f、g表示不同小分子肽之间的差异显著性，凡有一个相同标记字母的即为差异不显著，凡具不同标记字母的即为差异显著（p<0.05）。其中，小分子肽PYPDW的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，小分子肽DRWRD的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，小分子肽YYSPL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，小分子肽KFFDY的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，小分子肽YDPRY的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。小分子肽WP、小分子肽FW和小分子肽FY均为二肽，氨基酸残基的个数均为2个，无需显示在序列表中。
表5 还原力排名前8的小分子肽的相关性质及抗氧化活性验证结果
注：（1）还原力以0.1 mg/ml BHA的百分比表示；（2）由于分子对接结果具有随机性，表中显示的Vina得分为9次对接结果最低值的平均值（注：得分越低表示对接结果越好）。
由表5可知，小分子肽PYPDW具有较强的还原能力，同时vina评分和PeptideRanker评分较高。
实施例6 蜂王浆酶解产物及肽段防治阿尔兹海默症功效检测
1.实验动物
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后4天（4 dpf）的斑马鱼，用于防治阿尔兹海默症功效最大检测浓度（MTC）测定及乙酰胆碱酯酶抑制、对超氧化物歧化酶的影响和对相关基因影响评价。斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO3）。
2.MTC测定
随机选取4 dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予不同样品，各样品的浓度详见表6，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余实验组均水溶给予六水氯化铝建立斑马鱼痴呆模型。28℃处理48h后，测定样品对模型斑马鱼的MTC。
结果：详见表6。在本实验条件下，R0、小分子肽FW、小分子肽WP和小分子肽PYPDW对防治阿尔茨海默症功效斑马鱼MTC分别为1000μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL和62.5μg/mL。因此选择R0浓度为1000μg/mL，三条小分子肽浓度均为62.5μg/mL进行后续实验。
表6 样品防治阿尔茨海默症功效最大检测浓度摸索实验结果（n=30）
3.乙酰胆碱酯酶抑制功效评价
随机选取4 dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予不同样品，阳性对照为盐酸多奈哌齐（浓度3.33μg/mL），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL。除正常对照组外，其余实验组均水溶给予六水氯化铝建立斑马鱼痴呆模型。28℃处理48 h后，采用乙酰胆碱酯酶测定试剂盒，利用多功能酶标仪采集数据，分析斑马鱼体内乙酰胆碱酯酶荧光值，以该指标的统计学分析结果评价样品对乙酰胆碱酯酶的抑制功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS 27.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
结果：在本实验条件下，R0和小分子肽PYPDW均具有乙酰胆碱酯酶抑制功效，小分子肽WP和小分子肽FW的乙酰胆碱酯酶抑制功效不明显。各样品处理后斑马鱼乙酰胆碱酯酶荧光值比较示意图如图9所示。
4.对超氧化物歧化酶的影响
随机选取4 dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予不同样品，阳性对照为盐酸多奈哌齐（浓度3.33μg/mL），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL，平行设置三个生物学重复实验。除正常对照组外，其余实验组均水溶给予六水氯化铝建立斑马鱼痴呆模型。28℃处理48 h后，采用SOD试剂盒（WST-1法），利用多功能酶标仪采集数据，分析斑马鱼分析斑马鱼体内SOD活性，以该指标的统计学分析结果评价样品对超氧化物歧化酶的影响。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS 27.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
结果：在本实验条件下，R0和小分子肽PYPDW对SOD的活力均具有增强的效果，小分子肽WP和小分子肽FW对SOD活力增强的效果不明显。各样品处理后斑马鱼的超氧化物歧化酶活力比较示意图如图10所示。
5.对相关基因的影响
随机选取4 dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予不同样品，阳性对照为盐酸多奈哌齐（浓度3.33μg/mL），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3 mL，平行设置三个生物学重复实验。除正常对照组外，其余实验组均水溶给予六水氯化铝建立斑马鱼痴呆模型。28℃处理24 h后，使用全自动核酸提取仪提取各组斑马鱼总RNA，利用紫外-可见光分光光度计对总RNA浓度进行测定。取2.00μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20.0μL cDNA，通过q-PCR检测β-actin、egr 1基因和caspase 3基因的表达。用β-actin作为基因表达的内参，计算egr 1基因和caspase 3基因的RNA相对表达量。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS 27.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
研究表明，egr 1对学习和长期记忆具有重要作用，在神经退行性疾病中，认知障碍与egr 1的减少有关，AD小鼠中egr 1表达水平显著降低。生物信息学分析表明，egr 1表达水平降低与AD患者的认知障碍显著相关，是AD的生物标志物之一；egr 1通过与bace 1启动子结合并阻断APP信号的激活，最终抑制Aβ沉积并改善AD的认知功能。因此，通过上调egr1基因表达可改善AD认知功能障碍。Caspase 3是细胞凋亡的标志物，与AD密切相关。Caspase 3的激活通常被认为是海马区细胞凋亡的主要标志之一，AlCl3通过激活caspase3诱导大鼠大脑中的细胞凋亡，从而诱导AD发生。
结果：在本实验条件下，R0、小分子肽FW、小分子肽WP和小分子肽PYPDW均能上调egr 1基因和下调caspase 3基因表达，但小分子肽WP和小分子肽FW上调egr 1基因和下调caspase 3基因表达不明显。egr 1基因相对表达量比较示意图如图11所示，caspase 3基因相对表达量比较示意图如图12所示。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (1)
1.小分子肽PYPDW在制备缓解阿尔茨海默症的药物中的应用，小分子肽PYPDW的氨基酸序列为Pro-Tyr-Pro-Asp-Trp，如SEQ ID NO.1所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311393472.3A CN117126243B (zh) | 2023-10-26 | 2023-10-26 | 一种小分子肽pypdw及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311393472.3A CN117126243B (zh) | 2023-10-26 | 2023-10-26 | 一种小分子肽pypdw及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117126243A CN117126243A (zh) | 2023-11-28 |
| CN117126243B true CN117126243B (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=88860383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311393472.3A Active CN117126243B (zh) | 2023-10-26 | 2023-10-26 | 一种小分子肽pypdw及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117126243B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118001370A (zh) * | 2024-04-10 | 2024-05-10 | 北京汉氏联合生物技术股份有限公司 | 一种用于治疗神经退行性疾病的组合物和方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101206226A (zh) * | 2007-10-25 | 2008-06-25 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 蜂王浆新鲜度检测试纸制备及应用 |
| CN103429614A (zh) * | 2010-12-22 | 2013-12-04 | 曼努卡米德有限公司 | 抗发炎蛋白与制备及使用其的方法 |
| WO2015164981A1 (en) * | 2014-05-02 | 2015-11-05 | Bee-Biomedicals Inc. | Isolated honey glycoprotein for use as an antimicrobial agent |
| CN110850001A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-02-28 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 液相色谱串联质谱定量意蜂蜜mrjp3的方法 |
-
2023
- 2023-10-26 CN CN202311393472.3A patent/CN117126243B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101206226A (zh) * | 2007-10-25 | 2008-06-25 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 蜂王浆新鲜度检测试纸制备及应用 |
| CN103429614A (zh) * | 2010-12-22 | 2013-12-04 | 曼努卡米德有限公司 | 抗发炎蛋白与制备及使用其的方法 |
| WO2015164981A1 (en) * | 2014-05-02 | 2015-11-05 | Bee-Biomedicals Inc. | Isolated honey glycoprotein for use as an antimicrobial agent |
| CN110850001A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-02-28 | 中国农业科学院蜜蜂研究所 | 液相色谱串联质谱定量意蜂蜜mrjp3的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Dissection of the wheat transcription factor HBP-1a(17) reveals a modular structure for the activation domain;T. Nakayama等;《Mol Gen Genet》;第253卷;第553-561页 * |
| The Family of Major Royal Jelly Proteins and Its Evolution;Stefan Albert等;《J Mol Evol》;第49卷;第294页 * |
| 刘俊财等.蜂王浆肽对阿尔茨海默症模型斑马鱼运动能力与关键基因表达影响.《食品工业科技》.2023,第44卷(第21期),第395-401页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117126243A (zh) | 2023-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gray et al. | PA28 activator protein forms regulatory caps on proteasome stacked rings | |
| CN117126243B (zh) | 一种小分子肽pypdw及其应用 | |
| CN109293740B (zh) | 一种牡蛎来源的ace抑制及抗肿瘤活性肽 | |
| EP2754718B1 (en) | Vascular endothelial myostatin mutant that mutates at atp binding sites | |
| CN118005727A (zh) | 小分子肽agginlar及其在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用 | |
| Deng et al. | Synthesis and pharmacological evaluation of a novel synthetic peptide CWHTH based on the Styela clava-derived natural peptide LWHTH with improved antioxidant, hepatoprotective and angiotensin converting enzyme inhibitory activities | |
| Beekman et al. | Characterization of PdCP1, a serine carboxypeptidase from Pseudogymnoascus destructans, the causal agent of White-nose Syndrome | |
| CN103848914B (zh) | 一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途 | |
| CN110330564B (zh) | 丝氨酸蛋白酶抑制剂及其最小功能片段和免疫抑制作用 | |
| CN117205297A (zh) | 小分子肽wp在制备缓解阿尔茨海默症的功能性产品中的应用 | |
| CN117122667A (zh) | 小分子肽fw在制备缓解阿尔茨海默症的功能性产品中的应用 | |
| EP0811687B1 (en) | Polypeptides having l-asparaginase activity | |
| CN111440776A (zh) | 一种新的NETosis抑制剂TcpC及应用 | |
| US20210393501A1 (en) | Preparation method and application of recombinant mutant collagenase | |
| CN109912688B (zh) | 一类ptp1b多肽抑制剂及其制备方法和应用 | |
| Li-Chan et al. | Shrimp (Pandalopsis dispar) waste hydrolysate as a source of novel β–secretase inhibitors | |
| US20210309984A1 (en) | ChiA Enzyme | |
| CN117069796A (zh) | 一种用于降低血糖的多肽 | |
| CN111423495B (zh) | 具有抗氧化应激损伤的脉红螺多肽及其制备方法与应用 | |
| CN109880868A (zh) | 一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分及制备和应用 | |
| CN109517033B (zh) | 活性肽、重组载体、重组细胞、抗炎组合物及其制备方法和应用 | |
| Yang et al. | Efficiently Capturing Mitochondria‐Targeted Constituents with Hepatoprotective Activity from Medicinal Herbs | |
| CN112442108A (zh) | 一种枸杞ace、dpp-iv抑制肽及衍生多肽和应用、混合物 | |
| Liu et al. | Evolutionary relationships between seryl-histidine dipeptide and modern serine proteases from the analysis based on mass spectrometry and bioinformatics | |
| CN101144080A (zh) | 重组人VIP-Humanin融合蛋白制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |