CN110330564B - 丝氨酸蛋白酶抑制剂及其最小功能片段和免疫抑制作用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂及其最小功能片段和免疫抑制作用，来源于长角血蜱中的丝氨酸蛋白酶抑制剂SA，其对组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、木瓜蛋白酶和凝血X因子具有活性抑制作用，确定了其具有免疫抑制活性的最小功能片段SA‑RCL，其对组织蛋白酶G有抑制活性，验证了SA以及SA‑CRL对免疫细胞的免疫抑制作用，并在小鼠关节炎模型中的治疗作用。通过上述方式，本发明SA制备成本低，小功能片段SA‑RCL分子量小，性质稳定，吸收容易，免疫原性差，不易被宿主中和降解，SA及SA‑RCL可用于抗蜱传疾病疫苗的开发及抗炎症性疾病的治疗中。

Description

丝氨酸蛋白酶抑制剂及其最小功能片段和免疫抑制作用

技术领域

本发明涉及生物医药应用技术领域，特别是涉及一种丝氨酸蛋白酶抑制剂及其最小功能片段和免疫抑制作用。

背景技术

蜱是一种吸血节肢动物，寄生于人畜体表，是多种人畜共患传染病的重要传播媒介，可引发巨大的经济损失。蜱在吸血的过程中通过唾液将其所携带的病原微生物传播到人体内。大部分蜱传疾病是自然疫源性疾病，彻底消除很困难，且蜱传病的分布、自然疫源地和流行规律等尚不清楚。目前防治蜱的最主要的办法是利用化学杀虫剂，由于杀虫剂的长期使用使蜱产生抗药性，缺乏安全高效的驱杀药物。同时国内外有关抗蜱疫苗正在研究中，缺乏有效的蜱及蜱传病的疫苗。因此，新的蜱虫抗原候选的开发成为抗蜱疫苗的迫切需求，同时为防范虫媒传染病提供新的靶点。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)广泛存在于多种生物物种中，是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂，能调节生物体内许多重要的生命过程，如炎症反应、血液凝固、补体激活、免疫调节以及肿瘤抑制等。因此，HlSerpin-a(以下简称SA)及其最小功能片段SA-RCL可作为优良的疫苗候选，以消除蜱虫唾液中的免疫抑制性，并且为抗蜱疫苗的研发，保护动物及人体对抗蜱虫的叮咬和病原体的传播提供新思路，同时也为今后开发新型免疫抑制药物提供依据。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种丝氨酸蛋白酶抑制剂及其最小功能片段和免疫抑制作用，来源于长角血蜱中的丝氨酸蛋白酶抑制剂SA，其对组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、木瓜蛋白酶和凝血X因子具有活性抑制作用，确定了其具有免疫抑制活性的最小功能片段SA-RCL，其对组织蛋白酶G有抑制活性，验证了SA以及SA-RCL对免疫细胞的免疫抑制作用，并在小鼠关节炎模型中的治疗作用。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种丝氨酸蛋白酶抑制剂SA，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的cDNA序列为：

CTTGGGGAAAGCGCGACGCTCAAGTCACCCACTCGTCCAGTGAGTGCAAGAGGTCAAGTTTACTCGACTTGGCAACCGTCACGGTCAGCCTCGGCAGATTGAAGAGCGATTTCGCGGCGTCAAGGAGGGCCACACCAGTGCGAAGGCGTGATGAAGTTGGTGACAGCGCTGGGCGCCATTCTGGCGGTGGGATGTTTCCGCTCCTCCTTGGGCCTCACGGACAAGGAAGCGAAGCTCATCGCGGCGAACAACGACTTCGCCGTGAGGCTCCTAAAGGTGCTTCCCAGCCGGCTGGACGAGAACGTGTTCTTCTCGCCCTACAGTCTCTCTGTCGCGCTTGGCATGGCTTACGCCGGCGCCCGCGGGGAAACTCTGCAGCAGTTGTCCGAAGGGCTCGGCTATCAGGCTGCTGGACTCGCCCCCACCGACGTCCACGATGCATTCGCCGTCCAGAACAGCCGGCTGCAGTCCCAAGCGTCCCGTTCGGGCCTGGAGGTCGCCAACAGCGCAGCGGTTCAGGAAGGTTTCGACGTTCTCGACACCTACTACGCTGTCCTGAACCACACCTTCAACGCACACGTGTTCTCGGTGGACTTCGAAAACGCTGCCCAGCAGGCCGTGGACACGATCAACGCGTGGGTCAAGCAGGCGACGCACGGCAAGATCGACGAGCTGTTCGCAGAGCCGCTGGACACCAGCACCCGACTGGTCCTGACCAATGGCATCGTCTTCAAGGGGCTCTGGGCGCGCCAGTTCCGACCTGAGCTGACGCAAAAGCGGCCCTTCTACAACGTTGGCACGCAGCCCACCCAGGTGGACATGATGTTCCAGCAACTCCAGGCCAACCGCGCCTTCTCGGAAGAGCTGCAGGCGAGCGTCTTGGAACTGCCATACCGCGAAGGCGACTACAGCATGTTAATCGTGCTGCCGACGGAGAGGGACGGCGTGGAAGCCCTCAAGCAGGTCCTCACCATCGGCAAGATCGAAGCGGCCGTCGCGTCGCTGAGGAACCTCACTGCAGCCGTGTCCCTACCCAAGTTCCAGCTGGACAAGCTGTACCAGCTGAAAGACACGCTGAGGGGTCTGGGCCTGGAGAAGATGTTCAGCGACGGCGCAGACTTGTCGGGCATCACGGGGAGCCGCAACCTGGTCGTGTCCGACGTCGTCCAGCGGGCAGTGGTCAAGGTGGACGAAGAAGGCACTGAGGCTGCCGCTGCGACCAGCGTCGTCGCCGTCAACCGCATCGGAAGCGAGCCGTTCCGCTTCACCGCCGACCACCCGTTCCTCTTCTTCATCCGCAACACGCTCACACATGAGATCTTCTTCGCCGGGCAGCTCAACAGGCTCTGAACGGAGGGCCGCACTTTTTACAGTCGGGGATTCGGAAAAGGCTCAGCCTTTCTTCCAATTTCTTCGAACCTCATTTTCATCGA。

在本发明一个较佳实施例中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA来源于长角血蜱中。

在本发明一个较佳实施例中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的蛋白表达过程为：(1)克隆丝氨酸蛋白酶抑制剂SA基因到原核表达载体pGEX-6P-2中；(2)大肠杆菌重组表达丝氨酸蛋白酶抑制剂SA；(3)柱层析的方法纯化重组的丝氨酸蛋白酶抑制剂SA蛋白。

在本发明一个较佳实施例中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的蛋白表达过程为：(1)提取长角血蜱RNA，制备cDNA，从cDNA文库中扩增出目的基因的蛋白编码区片段，将目的基因的编码区双酶切后连接到大肠杆菌表达载体pGEX-6P-2中；(2)将构建好的重组pGEX-6P-2目的基因表达质粒转化至大肠杆菌BL21菌株中，用IPTG诱导表达重组目的蛋白；(3)用GST介质纯化重组目的蛋白，用特异性蛋白酶在柱上酶切的方法，去除GST标签。

在本发明一个较佳实施例中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA对组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、木瓜蛋白酶和凝血X因子具有活性抑制作用。

在本发明一个较佳实施例中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA对细菌内毒素脂多糖LPS刺激的BMDMs或BMDCs分泌炎症因子的影响作用。

在本发明一个较佳实施例中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA在制备治疗类风湿性关节炎疾病的药物中的应用。

在本发明一个较佳实施例中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的最小功能片段SA-RCL(SA-Reaction Center Loop：SA反应中心环)的序列为：GTEAAAATSVVAVNRIGSEP；在最小功能片段SA-RCL序列的前面添加一段细胞穿膜肽-HIV-TAT：GRKKRRQRRRPPQ，合成的最小功能片段完整序列为：GRKKRRQRRRPPQGTEAAAATSVVAVNRIGSEP。

在本发明一个较佳实施例中，所述最小功能片段SA-RCL对组织蛋白酶G具有活性抑制作用。

在本发明一个较佳实施例中，所述最小功能片段SA-RCL对细菌内毒素脂多糖LPS刺激的BMDMs分泌炎症因子的影响作用。

在本发明一个较佳实施例中，所述最小功能片段SA-RCL在制备治疗类风湿性关节炎疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂及其最小功能片段和免疫抑制，丝氨酸蛋白酶抑制SA原核表达的蛋白即生物学活性，制备成本低，小功能片段SA-RCL分子量小，性质稳定，吸收容易，免疫原性差，不易被宿主中和降解，因蜱蛋白酶抑制剂对树突状细胞DC和巨噬细胞有免疫抑制和免疫调节作用并可以缓解关节炎症状，SA及SA-RCL可用于抗蜱传疾病疫苗的开发及抗炎症性疾病的治疗中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的序列图；

图2是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的信号肽预测图；

图3是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的表达与纯化图；

图4是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA不同剂量时对Cathepsin G的抑制活性图，其中***p<0.001Vs相应的酶(t检验)；

图5是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA不同剂量时对FXa的抑制活性图，其中*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001Vs相应的酶(t检验)；

图6是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA不同剂量时对Cathepsin B的抑制活性图，其中*p<0.05Vs Ctrl(t检验)；

图7是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA不同剂量时对papin的抑制活性图，其中***p<0.001Vs Ctrl(t检验)；

图8是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA对LPS刺激的BMDMs分泌细胞因子的影响图；*p<0.05，**p<0.01,Vs PBS组(t检验)；

图9是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA对LPS刺激的BMDCs分泌细胞因子的影响图；*p<0.05，**p<0.01,Vs PBS组(t检验)；

图10是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的结构和序列分析图；

图11是本发明确认丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的RCL及铰链区区域图；

图12是本发明最小功能片段SA-RCL抑制Cathepsin G的酶活性图，其中*p<0.05VsCathepsin G(t检验)；

图13是本发明最小功能片段SA-RCL抑制LPS刺激的BMDMs分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β在蛋白水平的表达图；*p<0.05，**p<0.01,Vs PBS组(t检验)；

图14是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA作用后小鼠踝关节肿胀程度和脾脏大小的对比；

图15是本发明最小功能片段SA-RCL作用后小鼠踝关节肿胀程度和脾脏大小的对比；

图16是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA作用后实验进程中小鼠踝关节的厚度变化；

图17是本发明最小功能片段SA-RCL作用后实验进程中小鼠踝关节的厚度变化；

图18是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA作用后小鼠关节病理切片评分图，其中***p<0.001Vs PBS组(t检验)；

图19是本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂SA作用后小鼠关节病理切片图，***p<0.001VsPBS组(t检验)；

图20是本发明最小功能片段SA-RCL作用后小鼠关节病理切片评分图，其中**p<0.001Vs PBS组(t检验)；

图21是本发明最小功能片段SA-RCL作用后小鼠关节病理切片图，**p<0.01Vs PBS组(t检验)。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

提供一种丝氨酸蛋白酶抑制剂SA，其蛋白表达过程为：

(1)克隆SA基因到原核表达载体pGEX-6P-2中

提取长角血蜱RNA，制备cDNA，通过基因特异性引物从cDNA文库中扩增出目的基因的蛋白编码区片段，将目的基因的编码区双酶切后连接到大肠杆菌表达载体pGEX-6P-2中。

(2)大肠杆菌重组表达丝氨酸蛋白酶抑制剂SA

将构建好的重组pGEX-6P-2目的基因表达质粒转化至大肠杆菌BL21菌株中，用IPTG诱导表达重组目的蛋白。

(3)柱层析的方法纯化重组的丝氨酸蛋白酶抑制剂SA蛋白

用GST介质纯化重组目的蛋白，用特异性蛋白酶在柱上酶切的方法，去除GST标签。重组的SA蛋白浓缩后除去内毒素用于活性测试。

长角血蜱是研究蜱传疾病的良好的模式生物，其全基因转录组测序已经由申请人完成。具体克隆了全长的SA的cDNA，SA基因的ORF为1197bp，编码399个氨基酸。经SignalP4.0软件的分析，含有一个21个氨基酸的信号肽。并实现了SA在蛋白GST原核表达系统中的表达，纯化后得到的SA蛋白为47kD。丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的序列见序列表和图1。图2是丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的信号肽预测。图3是丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的表达与纯化图。

实施例二：

丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的活性抑制作用

1、丝氨酸蛋白酶抑制剂SA对组织蛋白酶G(cathepsin G)、凝血X因子(FXa)的活性抑制作用的鉴定实验，包括步骤为：

(a)反应总体系为200ul，Cathepsin G(6.6nM)和FXa(0.33nM)分别与SA(0.1uM，0.4uM)室温下孵育30min。

(b)加入底物，终浓度均为250uM：Cathepsin G，methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide；FXa，发色底物S2765。37℃，共反应90min，每30min用酶标仪测量，A＝405nm。

如图4和图5所示，结果发现，丝氨酸蛋白酶抑制剂SA抑制Cathepsin G及FXa的酶活性，并呈剂量性依赖。

2、丝氨酸蛋白酶抑制剂SA对组织蛋白酶B(cathepsin B)的活性抑制作用的鉴定实验

根据InnoZyme Cathepsin B Activity Assay Kit,Fluorogenic Cat.No.CBA001说明书对cathepsin B活性进行检测。为阐明SA的抑制效果，采用了不同剂量的纯化的SA蛋白进行检测。具体见下表格。

具体操作如下：

(a)分别加入活化、底物、Cathepsin B(100ng/孔)，每组现体积100ul，室温慢摇5min；

(b)分别加入Cathepsin B、SA或抑制剂，每组现体积150ul；

(c)37度摇床1到2小时后360nm，460nm处测荧光。

请参阅图6，结果发现SA的使用剂量与抑制效果成线性关系，随着使用剂量的增多，抑制效果明显增强。当SA剂量为1000ng每孔时，对Cathepsin B的活性的抑制达到61％。

3、丝氨酸蛋白酶抑制剂SA对木瓜蛋白酶(papin)的活性抑制作用的鉴定实验

用国标GB/T 23527-2009规定的方法测SA对papin的作用。

具体操作如下：

(a)SA(0.1uM、0.4uM，三个平行样)和papin于37℃水浴中保温10min，再加入在37℃水浴中预热的酪蛋白溶液5.00ml，摇匀，置37℃水浴中，反应十分钟。加入在37℃水浴中预热的三氯乙酸溶液5.00ml，摇匀，于37℃水浴中放置40min，用干燥滤纸滤过，取滤液，在波长为275nm处用蒸馏水为参比测滤液的吸光度A1。

(b)空白对照：papin于37℃水浴中保温10min，加入在37℃水浴中预热的三氯乙酸溶液5.00ml，摇匀，反应10min，加入在37℃水浴中预热的酪蛋白溶液5.00ml，摇匀，于37℃水浴中放置40min，用干燥滤纸滤过，取滤液，在2h内在波长为275nm处用蒸馏水为参比测滤液的吸光度A2。

(c)酪氨酸标准溶液的吸光度：用蒸馏水做参比，在波长275nm处测定50ug/ml酪氨酸标准溶液的吸光度A3。

(d)结果计算:木瓜蛋白酶活力X1(U/g)

其中m1:对照品溶液每毫升中含酪氨酸的量，单位为ug，m2:SA的质量，n:稀释倍数。结果请参阅图7。

实施例三：

所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA对细菌内毒素脂多糖LPS刺激的BMDMs或BMDCs分泌炎症因子的影响作用

用细菌内毒素脂多糖(LPS)刺激BMDMs或BMDCs，通过实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)实验，检测在mRNA水平和蛋白水平上，SA对炎症因子表达的影响。

样品制备和细胞实验步骤如下：

(a)BMDMs或BMDCs细胞铺于24孔板中，设置NC(空白对照)、PBS(阴性对照)、SA三个组。

(b)PBS以及去除了内毒素的SA与细胞孵育两小时。

(c)用1μg/ml的细菌脂多糖(LPS)刺激PBS和SA组中细胞。

(d)刺激12h后，提取细胞RNA并逆转录成cDNA，作为Q-PCR实验的样品。刺激24h后，收集细胞上清，作为ELISA实验的样品。

如图8和图9的结果显示，在mRNA水平SA和SB均抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的表达；在蛋白质水平，SA和SB均抑制TNF-α、IL-6的表达。同样在BMDCs中，我们也可以观察到，在mRNA水平SA和SB均抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的表达；在蛋白水平，SA和SB均抑制TNF-α、IL-6的表达。图8为SA对LPS刺激的BMDMs分泌细胞因子的影响，图8A为SA抑制mRNA水平的TNF-α、IL-1β和IL-6表达，图8B为SA抑制蛋白水平的TNF-α、IL-6的表达，*p<0.05，**p<0.01Vs PBS(t检验)。图9为SA对LPS刺激的BMDCs分泌细胞因子的影响。图9A为SA抑制mRNA水平的TNF-α、IL-1β和IL-6表达，图9B为SA抑制蛋白水平的TNF-α、IL-6的表达，*p<0.05，**p<0.01Vs PBS(t检验)。

实施例四：

最小功能片段SA-RCL的确定和合成

通过同源建模的方法和将SA的序列与已报道的serpin序列进行比对，确定了其最小功能片段，合成小分子多肽SA-RCL。

(1)SA的结构和序列分析

(a)在https://swissmodel.expasy.org/interactive网站上，利用同源建模的方法，得到SA的二级结构和三维结构。并利用NCBI上的结构域分析，初步确定了SA的反应中心环(Reactive center loop，RCL)结构。具体如图10所示，经NCBI上的结构域分析，初步预测SA的RCL区域；同源建模得到SA的二级结构(图10中圆柱形状代表α螺旋，箭头形状代表β折叠)和三维结构。

(b)将SA的序列与已报道的I ricinus的serpin—IRS-2的序列进行比较，初步推断出SA的最小活性片段。我们将这一片段命名为SA-RCL，包括SA全长序列的RCL及旁边的铰链区，共20个氨基酸。具体如图11所示，与已报道的蜱Serpin IRS-2的序列进行比对，确认SA的RCL及铰链区区域。

(c)合成最小功能片段SA-RCL

通过合成活性区域小分子多肽的方法，我们在SA-RCL序列的前面添加了一段细胞穿膜肽-HIV-TAT：GRKKRRQRRRPPQ，帮助SA-RCL进入细胞内发挥作用，SA-RCL的序列应为：GTEAAAATSVVAVNRIGSEP。因此我们构建合成的最小功能片段完整序列为：GRKKRRQRRRPPQGTEAAAATSVVAVNRIGSEP，一共33个氨基酸。同时，我们另外构建了一个删掉RCL及铰链区序列的SA突变体蛋白作为对照，命名为SA-delete RCL。

实施例五：

最小功能片段SA-RCL对cathepsin G活性抑制作用的鉴定实验

具体操作同实施例二的SA的酶活性实验。如图12所示，结果发现，SA-RCL能抑制Cathepsin G的酶活性。

实施例六：

最小功能片段SA-RCL具有免疫抑制作用

具体操作参照实施例三种SA对LPS刺激的BMDMs分泌炎症因子的影响实验。如图13所示，结果表明，SA-RCL抑制LPS诱导的BMDMs分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β在蛋白水平的表达，SA-delete RCL不发挥免疫抑制作用。图13为SA-RCL抑制LPS刺激的BMDMs分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β在蛋白水平的表达，SA-delete RCL不发挥免疫抑制作用，*p<0.05，**p<0.01VsPBS(t检验)。

通过酶活性实验和检测炎症因子的表达，验证了SA-RCL是可以发挥生物学作用的最小功能片段，为今后药物的开发提供基础。

实施例七：

SA及最小功能片段SA-RCL在制备治疗胶原诱导的类风湿性关节炎疾病(CIA)的药物中的应用

具体操作如下：

(1)构建CIA小鼠模型，试剂准备：0.02M醋酸配置2mg/mL的牛Ⅱ型胶原(CⅡ)，保存于-20℃。在冰上，将CⅡ与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混和并充分乳化，将乳化后的液体滴在水中后成形且不扩散，则视为乳化完全。

(2)实验分为三个组：NC组(空白对照组)、PBS组和SA蛋白或SA-RCL蛋白组。

(3)除开NC组，其余组的小鼠在距离小鼠尾根1-2cm处，注射100μl CⅡ与CFA的混合乳剂(含CⅡ0.1μg)进行初次免疫。当天记为第一天，到第21天用同样方法进行第二次免疫。一般初次免疫使用完全佐剂进行，再次免疫用不完全佐剂。

(4)初次免疫后的第7、14、21、28和35天，分别向PBS、SA或SA-RCL组小鼠大腿肌肉注射PBS、100μg去过内毒素SA或25ugSA-RCL蛋白。

(5)小鼠踝关节测量：使用测厚仪测量小鼠左右两侧踝关节厚度。再次免疫前每周测量一次，再次免疫后每三天测量一次。

(6)到第42天处死小鼠，取小鼠踝关节做病理切片，进行病理评分和观察关节部位炎症情况；取小鼠脾脏观察并测量小鼠脾脏的大小及重量。

结果显示，SA、SA-RCL可以缓解由牛二型胶原诱导的关节炎症。

(a)结果如图14和15所示，肉眼观察到第42天，SA、SA-RCL蛋白可以缓解关节炎的肿胀程度，并且与对照PBS组相比，SA、SA-RCL组的脾脏较小、重量更轻。

(b)在病情的进展过程中利用测厚仪测量小鼠踝关节，我们可以发现，注射SA、SA-RCL蛋白组的踝关节厚度小于对照组。结果如图16和17所示，SA和SA-RCL可以缓解关节肿胀。

(c)结果如图18、图19、图20和图21所示，组织病理学分析表明，与对照相比，经SA、SA-RCL处理减轻了关节炎症。与SA、SA-RCL处理的小鼠相比，H&E染色显示对照小鼠的免疫细胞浸润增加，软骨破坏，骨侵蚀和滑膜组织肥大。小鼠关节炎病理切片的严重程度评分显示，SA、SA-RCL组关节病变程度轻于对照组PBS组。

本发明的有益效果是：

一、丝氨酸蛋白酶抑制剂SA是一种全新的，序列确定的长角血蜱的丝氨酸蛋白酶拮抗剂，可以准确克隆，并且纯化其重组蛋白；

二、丝氨酸蛋白酶抑制剂SA对组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、木瓜蛋白酶、凝血有明显的抑制作用，为开发蜱虫传染疾病相关药物的开发提供候选。

三、确定了丝氨酸蛋白酶抑制剂SA蛋白中具有蛋白酶抑制活性及免疫抑制活性的最小功能片段SA-RCL，并获得了对应的活性多肽。

四、SA及SA-RCL具有缓解关节炎症状的作用，对炎症性疾病的治疗具有借鉴意义。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表：

丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的cDNA序列为：

CTTGGGGAAAGCGCGACGCTCAAGTCACCCACTCGTCCAGTGAGTGCAAGAGGTCAAGTTTACTCGACTTGGCAACCGTCACGGTCAGCCTCGGCAGATTGAAGAGCGATTTCGCGGCGTCAAGGAGGGCCACACCAGTGCGAAGGCGTGATGAAGTTGGTGACAGCGCTGGGCGCCATTCTGGCGGTGGGATGTTTCCGCTCCTCCTTGGGCCTCACGGACA AGGAAGCGAAGCTCATCGCGGCGAACAACGACTTCGCCGTGAGGCTCCTAAAGGTGCTTCCCAGCCGGCTGGACGAG AACGTGTTCTTCTCGCCCTACAGTCTCTCTGTCGCGCTTGGCATGGCTTACGCCGGCGCCCGCGGGGAAACTCTGCA GCAGTTGTCCGAAGGGCTCGGCTATCAGGCTGCTGGACTCGCCCCCACCGACGTCCACGATGCATTCGCCGTCCAGA ACAGCCGGCTGCAGTCCCAAGCGTCCCGTTCGGGCCTGGAGGTCGCCAACAGCGCAGCGGTTCAGGAAGGTTTCGAC GTTCTCGACACCTACTACGCTGTCCTGAACCACACCTTCAACGCACACGTGTTCTCGGTGGACTTCGAAAACGCTGC CCAGCAGGCCGTGGACACGATCAACGCGTGGGTCAAGCAGGCGACGCACGGCAAGATCGACGAGCTGTTCGCAGAGC CGCTGGACACCAGCACCCGACTGGTCCTGACCAATGGCATCGTCTTCAAGGGGCTCTGGGCGCGCCAGTTCCGACCT GAGCTGACGCAAAAGCGGCCCTTCTACAACGTTGGCACGCAGCCCACCCAGGTGGACATGATGTTCCAGCAACTCCA GGCCAACCGCGCCTTCTCGGAAGAGCTGCAGGCGAGCGTCTTGGAACTGCCATACCGCGAAGGCGACTACAGCATGT TAATCGTGCTGCCGACGGAGAGGGACGGCGTGGAAGCCCTCAAGCAGGTCCTCACCATCGGCAAGATCGAAGCGGCC GTCGCGTCGCTGAGGAACCTCACTGCAGCCGTGTCCCTACCCAAGTTCCAGCTGGACAAGCTGTACCAGCTGAAAGA CACGCTGAGGGGTCTGGGCCTGGAGAAGATGTTCAGCGACGGCGCAGACTTGTCGGGCATCACGGGGAGCCGCAACC TGGTCGTGTCCGACGTCGTCCAGCGGGCAGTGGTCAAGGTGGACGAAGAAGGCACTGAGGCTGCCGCTGCGACCAGC GTCGTCGCCGTCAACCGCATCGGAAGCGAGCCGTTCCGCTTCACCGCCGACCACCCGTTCCTCTTCTTCATCCGCAA CACGCTCACACATGAGATCTTCTTCGCCGGGCAGCTCAACAGGCTCTGAACGGAGGGCCGCACTTTTTACAGTCGGGGATTCGGAAAAGGCTCAGCCTTTCTTCCAATTTCTTCGAACCTCATTTTCATCGA

其中151-1350bp为其开放阅读框，编码399个氨基酸。其编码的氨基酸序列为：

MKLVTALGAILAVGCFRSSLGLTDKEAKLIAANNDFAVRLLKVLPSRLDENVFFSPYSLSVALGMAYAGARGETLQQLSEGLGYQAAGLAPTDVHDAFAVQNSRLQSQASRSGLEVANSAAVQEGFDVLDTYYAVLNHTFNAHVFSVDFENAAQQAVDTINAWVKQATHGKIDELFAEPLDTSTRLVLTNGIVFKGLWARQFRPELTQKRPFYNVGTQPTQVDMMFQQLQANRAFSEELQASVLELPYREGDYSMLIVLPTERDGVEALKQVLTIGKIEAAVASLRNLTAAVSLPKFQLDKLYQLKDTLRGLGLEKMFSDGADLSGITGSRNLVVSDVVQRAVVKVDEEGTEAAAATSVVAVNRIGSEPFRFTADHPFLFFIRNTLTHEIFFAGQLNRL

丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的最小功能片段SA-RCL的序列为：GTEAAAATSVVAVNRIGSEP。

细胞穿膜肽-HIV-TAT的序列为：GRKKRRQRRRPPQ。

合成的最小功能片段完整序列为：GRKKRRQRRRPPQGTEAAAATSVVAVNRIGSEP。

序列表

<110> 上海景晗生物科技有限公司

<120> 丝氨酸蛋白酶抑制剂及其最小功能片段和免疫抑制作用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1433

<212> DNA

<213> 长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)

<400> 1

cttggggaaa gcgcgacgct caagtcaccc actcgtccag tgagtgcaag aggtcaagtt 60

tactcgactt ggcaaccgtc acggtcagcc tcggcagatt gaagagcgat ttcgcggcgt 120

caaggagggc cacaccagtg cgaaggcgtg atgaagttgg tgacagcgct gggcgccatt 180

ctggcggtgg gatgtttccg ctcctccttg ggcctcacgg acaaggaagc gaagctcatc 240

gcggcgaaca acgacttcgc cgtgaggctc ctaaaggtgc ttcccagccg gctggacgag 300

aacgtgttct tctcgcccta cagtctctct gtcgcgcttg gcatggctta cgccggcgcc 360

cgcggggaaa ctctgcagca gttgtccgaa gggctcggct atcaggctgc tggactcgcc 420

cccaccgacg tccacgatgc attcgccgtc cagaacagcc ggctgcagtc ccaagcgtcc 480

cgttcgggcc tggaggtcgc caacagcgca gcggttcagg aaggtttcga cgttctcgac 540

acctactacg ctgtcctgaa ccacaccttc aacgcacacg tgttctcggt ggacttcgaa 600

aacgctgccc agcaggccgt ggacacgatc aacgcgtggg tcaagcaggc gacgcacggc 660

aagatcgacg agctgttcgc agagccgctg gacaccagca cccgactggt cctgaccaat 720

ggcatcgtct tcaaggggct ctgggcgcgc cagttccgac ctgagctgac gcaaaagcgg 780

cccttctaca acgttggcac gcagcccacc caggtggaca tgatgttcca gcaactccag 840

gccaaccgcg ccttctcgga agagctgcag gcgagcgtct tggaactgcc ataccgcgaa 900

ggcgactaca gcatgttaat cgtgctgccg acggagaggg acggcgtgga agccctcaag 960

caggtcctca ccatcggcaa gatcgaagcg gccgtcgcgt cgctgaggaa cctcactgca 1020

gccgtgtccc tacccaagtt ccagctggac aagctgtacc agctgaaaga cacgctgagg 1080

ggtctgggcc tggagaagat gttcagcgac ggcgcagact tgtcgggcat cacggggagc 1140

cgcaacctgg tcgtgtccga cgtcgtccag cgggcagtgg tcaaggtgga cgaagaaggc 1200

actgaggctg ccgctgcgac cagcgtcgtc gccgtcaacc gcatcggaag cgagccgttc 1260

cgcttcaccg ccgaccaccc gttcctcttc ttcatccgca acacgctcac acatgagatc 1320

ttcttcgccg ggcagctcaa caggctctga acggagggcc gcacttttta cagtcgggga 1380

ttcggaaaag gctcagcctt tcttccaatt tcttcgaacc tcattttcat cga 1433

<210> 2

<211> 399

<212> PRT

<213> 长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)

<400> 2

Met Lys Leu Val Thr Ala Leu Gly Ala Ile Leu Ala Val Gly Cys Phe

1 5 10 15

Arg Ser Ser Leu Gly Leu Thr Asp Lys Glu Ala Lys Leu Ile Ala Ala

20 25 30

Asn Asn Asp Phe Ala Val Arg Leu Leu Lys Val Leu Pro Ser Arg Leu

35 40 45

Asp Glu Asn Val Phe Phe Ser Pro Tyr Ser Leu Ser Val Ala Leu Gly

50 55 60

Met Ala Tyr Ala Gly Ala Arg Gly Glu Thr Leu Gln Gln Leu Ser Glu

65 70 75 80

Gly Leu Gly Tyr Gln Ala Ala Gly Leu Ala Pro Thr Asp Val His Asp

85 90 95

Ala Phe Ala Val Gln Asn Ser Arg Leu Gln Ser Gln Ala Ser Arg Ser

100 105 110

Gly Leu Glu Val Ala Asn Ser Ala Ala Val Gln Glu Gly Phe Asp Val

115 120 125

Leu Asp Thr Tyr Tyr Ala Val Leu Asn His Thr Phe Asn Ala His Val

130 135 140

Phe Ser Val Asp Phe Glu Asn Ala Ala Gln Gln Ala Val Asp Thr Ile

145 150 155 160

Asn Ala Trp Val Lys Gln Ala Thr His Gly Lys Ile Asp Glu Leu Phe

165 170 175

Ala Glu Pro Leu Asp Thr Ser Thr Arg Leu Val Leu Thr Asn Gly Ile

180 185 190

Val Phe Lys Gly Leu Trp Ala Arg Gln Phe Arg Pro Glu Leu Thr Gln

195 200 205

Lys Arg Pro Phe Tyr Asn Val Gly Thr Gln Pro Thr Gln Val Asp Met

210 215 220

Met Phe Gln Gln Leu Gln Ala Asn Arg Ala Phe Ser Glu Glu Leu Gln

225 230 235 240

Ala Ser Val Leu Glu Leu Pro Tyr Arg Glu Gly Asp Tyr Ser Met Leu

245 250 255

Ile Val Leu Pro Thr Glu Arg Asp Gly Val Glu Ala Leu Lys Gln Val

260 265 270

Leu Thr Ile Gly Lys Ile Glu Ala Ala Val Ala Ser Leu Arg Asn Leu

275 280 285

Thr Ala Ala Val Ser Leu Pro Lys Phe Gln Leu Asp Lys Leu Tyr Gln

290 295 300

Leu Lys Asp Thr Leu Arg Gly Leu Gly Leu Glu Lys Met Phe Ser Asp

305 310 315 320

Gly Ala Asp Leu Ser Gly Ile Thr Gly Ser Arg Asn Leu Val Val Ser

325 330 335

Asp Val Val Gln Arg Ala Val Val Lys Val Asp Glu Glu Gly Thr Glu

340 345 350

Ala Ala Ala Ala Thr Ser Val Val Ala Val Asn Arg Ile Gly Ser Glu

355 360 365

Pro Phe Arg Phe Thr Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Phe Ile Arg Asn

370 375 380

Thr Leu Thr His Glu Ile Phe Phe Ala Gly Gln Leu Asn Arg Leu

385 390 395

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)

<400> 3

Gly Thr Glu Ala Ala Ala Ala Thr Ser Val Val Ala Val Asn Arg Ile

1 5 10 15

Gly Ser Glu Pro

20

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 5

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Thr Glu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Thr Ser Val Val Ala Val Asn Arg Ile Gly Ser Glu

20 25 30

Pro

Claims (10)

1.一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的cDNA序列为：

CTTGGGGAAAGCGCGACGCTCAAGTCACCCACTCGTCCAGTGAGTGCAAGAGGTCAAGTTTACTCGACTTGGCAACCGTCACGGTCAGCCTCGGCAGATTGAAGAGCGATTTCGCGGCGTCAAGGAGGGCCACACCAGTGCGAAGGCGTGATGAAGTTGGTGACAGCGCTGGGCGCCATTCTGGCGGTGGGATGTTTCCGCTCCTCCTTGGGCCTCACGGACAAGGAAGCGAAGCTCATCGCGGCGAACAACGACTTCGCCGTGAGGCTCCTAAAGGTGCTTCCCAGCCGGCTGGACGAGAACGTGTTCTTCTCGCCCTACAGTCTCTCTGTCGCGCTTGGCATGGCTTACGCCGGCGCCCGCGGGGAAACTCTGCAGCAGTTGTCCGAAGGGCTCGGCTATCAGGCTGCTGGACTCGCCCCCACCGACGTCCACGATGCATTCGCCGTCCAGAACAGCCGGCTGCAGTCCCAAGCGTCCCGTTCGGGCCTGGAGGTCGCCAACAGCGCAGCGGTTCAGGAAGGTTTCGACGTTCTCGACACCTACTACGCTGTCCTGAACCACACCTTCAACGCACACGTGTTCTCGGTGGACTTCGAAAACGCTGCCCAGCAGGCCGTGGACACGATCAACGCGTGGGTCAAGCAGGCGACGCACGGCAAGATCGACGAGCTGTTCGCAGAGCCGCTGGACACCAGCACCCGACTGGTCCTGACCAATGGCATCGTCTTCAAGGGGCTCTGGGCGCGCCAGTTCCGACCTGAGCTGACGCAAAAGCGGCCCTTCTACAACGTTGGCACGCAGCCCACCCAGGTGGACATGATGTTCCAGCAACTCCAGGCCAACCGCGCCTTCTCGGAAGAGCTGCAGGCGAGCGTCTTGGAACTGCCATACCGCGAAGGCGACTACAGCATGTTAATCGTGCTGCCGACGGAGAGGGACGGCGTGGAAGCCCTCAAGCAGGTCCTCACCATCGGCAAGATCGAAGCGGCCGTCGCGTCGCTGAGGAACCTCACTGCAGCCGTGTCCCTACCCAAGTTCCAGCTGGACAAGCTGTACCAGCTGAAAGACACGCTGAGGGGTCTGGGCCTGGAGAAGATGTTCAGCGACGGCGCAGACTTGTCGGGCATCACGGGGAGCCGCAACCTGGTCGTGTCCGACGTCGTCCAGCGGGCAGTGGTCAAGGTGGACGAAGAAGGCACTGAGGCTGCCGCTGCGACCAGCGTCGTCGCCGTCAACCGCATCGGAAGCGAGCCGTTCCGCTTCACCGCCGACCACCCGTTCCTCTTCTTCATCCGCAACACGCTCACACATGAGATCTTCTTCGCCGGGCAGCTCAACAGGCTCTGAACGGAGGGCCGCACTTTTTACAGTCGGGGATTCGGAAAAGGCTCAGCCTTTCTTCCAATTTCTTCGAACCTCATTTTCATCGA。

2.根据权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA来源于长角血蜱中。

3.根据权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的蛋白表达过程为：(1)克隆丝氨酸蛋白酶抑制剂SA基因到原核表达载体pGEX-6P-2中；(2)大肠杆菌重组表达丝氨酸蛋白酶抑制剂SA；(3)柱层析的方法纯化重组的丝氨酸蛋白酶抑制剂SA蛋白。

4.根据权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA对组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、木瓜蛋白酶和凝血X因子具有活性抑制作用。

5.一种如权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂SA在制备细菌内毒素脂多糖LPS刺激的BMDMs或BMDCs中抑制炎症因子表达的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂SA在制备治疗类风湿性关节炎疾病的药物中的应用。

7.一种丝氨酸蛋白酶抑制剂的最小功能片段，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂SA的最小功能片段SA-RCL的序列为：GTEAAAATSVVAVNRIGSEP。

8.根据权利要求7所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂的最小功能片段，其特征在于，所述最小功能片段SA-RCL对组织蛋白酶G具有活性抑制作用。

9.一种根据权利要求7所述的最小功能片段SA-RCL在制备细菌内毒素脂多糖LPS刺激的BMDMs中抑制炎症因子表达的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的最小功能片段SA-RCL在制备治疗类风湿性关节炎疾病的药物中的应用。

Images