CN101186646B - 眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物的应用 - Google Patents

眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物，与其它天然来源小分子量蛋白酶抑制剂相比，具有结构简单、基因表达产量高、活性特殊的有益特点。本发明眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂的制备方法可以是从蛇毒粗毒进行分离纯化获得，也可以通过基因工程表达获得。本发明还提供眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物的应用，其具有同时抑制胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的双重抑制活性，且对二种蛋白酶的抑制常数基本在同一个数量级，还具有钠通道的抑制活性。

Description

眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物的应用
技术领域
本发明涉及一种眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物的应用，属生物医学领域。
背景技术
蛋白酶抑制剂是动植物及微生物体内广泛存在的一种对蛋白酶水解活性有抑制作用的蛋白质或小肽。蛋白酶抑制剂能与蛋白酶的活性部位和/或变构部位结合，从而抑制酶的催化活性和/或蛋白酶与天然底物的结合，阻止酶原转化为有活性的酶，因此在调节蛋白酶活性和物质代谢等方面起着重要的作用。在一系列生理病理过程中也起着关键性的调控作用。蛋白酶抑制剂具有能被开发成为有利于人类健康的新药的应用前景，在治疗艾滋病、胰腺炎、出血性疾病、手术中及创伤后出现的纤溶亢进性出血的防治等领域都表现出了很好的疗效。来自于人尿中分离纯化的尿胰蛋白酶抑制剂-乌司它丁(Ulinastatin)目前已被广泛应用于临床上对胰腺炎、肝病、烧伤、胰岛细胞移植等临床领域。乌司它丁属Kunitz型蛋白酶抑制剂，由143个氨基酸残基组成，受到翻译后加工的影响，使得它成为一个分子量约为67000道尔顿的大分子量糖蛋白。它的二个活性功能区均有很广的抑酶谱并且不完全重叠。同时，蛋白酶抑制剂在农业生产中也得到了广泛应用，其主要应用领域涉及抗虫基因工程。目前已有多种转蛋白酶抑制剂工程植株，这些转基因植株表现出了良好的抗虫效果，具有广阔的应用前景。
钠通道是分布于可兴奋性细胞膜上的一种重要的阳离子通道，其开放控制着动作电位的去极化相，并积极参与了细胞的兴奋、收缩、分泌和突触传递等高度有序的特异性功能。最近研究表明许多困扰人类的家族性遗传病就是因为钠通道发生了基因突变而引起的，包括高血钾周期性瘫痪症(Hyper PP)、钾恶性肌强直症(PAM)、先天性副肌强直症(PMC)、LQT3型综合症(LQT3)、Brugada综合症等(徐妍，肖玉成。钠通道及其相关疾病综合症。生物学通报2006 Vol.41，17-19)。
蛇毒毒液中富含多种生物活性物质，包括蛋白酶抑制剂。目前在蛇毒中已发现了多种Kunitz型蛋白酶抑制剂，它们能与胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶1∶1结合，只有一个作用位点。迄今为止，大多数Kunitz型蛋白酶抑制剂要么作用于胰蛋白酶，要么作用于胰凝乳蛋白酶，很少有同时作用于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的Kunitz型蛋白酶抑制剂。发明人从中国产眼镜王蛇蛇毒中得到了一个新颖的Kunitz型胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂，它能同时抑制胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶。同时，该蛋白酶抑制剂能作用于钠离子通道。将本发明的眼镜王蛇蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂的全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的眼镜王蛇蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂的编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
发明内容
本发明的一个目的是提供眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物，与其它天然来源小分子量蛋白酶抑制剂相比，具有结构简单、基因表达产量高、活性特殊的有益特点。本发明的另一个目的是提供眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物的应用，其具有同时抑制胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的双重抑制活性，且对二种蛋白酶的抑制常数基本在同一个数量级，还具有钠通道的抑制活性。
本发明涉及的蛇毒来源的小分子蛋白酶抑制剂，是从国产眼镜王蛇蛇毒中分离得到的，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO：1)：
GLy  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
编码本发明蛋白酶抑制剂前体的cDNA由411个核苷酸组成，该抑制剂cDNA的核苷酸序列与对应的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：9)：
     Met Gly Arg Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Thr Leu Trp Ala Glu Leu Thr Pro Val
1    ATG GGA CGT CTT CTT CTC CTG CTG GGA CTC CTC ACC CTC TGG GCA GAG CTG ACC CCC GTC
              -1 1                                   10
     Ser Gly Leu Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala Val Ser Gly Phe Cys Lys Ala
61   TCC GGC CTG GGC CGT CCA AAG TTC TGT GAA CTG CCT GCT GTA TCC GGA TTC TGC AAA GCC
             20                                      30
     Tyr Ile Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala Cys Gln Lys Phe Ile Tyr Gly
121  TAT ATA CCT TCC TTC TAC TAC AAC CCG GAT GCA AGT GCA TGC CAA AAG TTT ATT TAT GGT
             40                                      50
     Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Glu Glu Cys His Arg Thr Cys Val
181  GGC TGT GGG GGC AAT GCC AAC AAA TTT AAG ACC ATA GAA GAA TGC CAC CGC ACC TGT GTT
     58
     Gly end
241  GGA TGA CCAATGAGGA GACCCACCCA GAATGGATCC AATGTTCCAA CTTGACCCAA AGAC
301  CCTGCTTCTG CCCTGGACCA CTTGGAGACC CTCCTCCAAA CAACACCCTG GGCTCATTTC
361  TTTTTCTCTG CAATAAAGCT TTGGTTCCAG CTGCAAAAAA AAAAAAAAAA A
本发明的蛇毒蛋白酶抑制剂包括上述多肽中个别或多个氨基酸的取代、缺失或加入而得到的功能等同物的多肽。即衍生自上述的一个或多个氨基酸残基替代以及缺失且具有蛋白酶抑制活性的功能等同物，所述蛋白酶抑制剂具有下述序列表中的氨基酸序列：
SEQ ID NO：2
     Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    9
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    19
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    29
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    39
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    49
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              57
SEQ ID NO：3
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Lys  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
SEQ ID NO：4
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Leu    10
Arg  Ile  Gly  Phe  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
SEQ ID NO：5
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Pro  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
SEQ ID NO：6
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Gln  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
SEQ ID NO：7
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Lys  Arg  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
SEQ ID NO：8
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Lys  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
本发明提供的蛇毒蛋白酶抑制剂，其制备方法可以通过生物化学分离纯化方法，由眼镜王蛇蛇毒中得到；本发明提供的蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物也可以将蛇毒蛋白酶抑制剂的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种。宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞，包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞等。制备的蛇毒蛋白酶抑制剂可通过质谱鉴定。
上面所述眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物在临床治疗上的应用。
上面所述眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物在农业生产中、特别是抗虫植物基因工程中的应用。
下面以制备的具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的蛋白酶抑制剂进行说明：
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
利用BAEE以及BTEE作为底物分别检测该抑制剂对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制活性。结果表明本发明天然纯化蛇毒蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制常数Ki值均在10-7-10-8M数量级，揭示它对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶均具有很高的抑制活性。
同样对多肽中氨基酸缺失、突变衍生物也进行了制备与蛋白酶抑制剂功能生物活性测定，结果表明这些蛋白酶抑制剂也具有较好的蛋白酶抑制活性。
将本发明蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物与目前已被广泛应用于临床的人尿中分离纯化的尿胰蛋白酶抑制剂-乌司它丁进行比较，结果表明蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物与乌司它丁均能抑制胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的活性，揭示本发明蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物有潜在的临床应用前景。
根椐上述内容，本发明提供的这种蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物。蛇毒蛋白酶抑制剂本身可方便地采用常规生物化学分离纯化方法由眼镜王蛇粗毒进行制备，蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物的制备可通过将抑制剂的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞中表达后获得。天然来源的蛋白酶抑制剂在临床治疗上有广泛的应用、特别是在艾滋病治疗中已有较广泛的应用，钠通道阻断剂有着较好的临床应用前景。同时，天然来源的蛋白酶抑制剂在农业生产中、特别是抗虫植物基因工程中也有较大的应用前景。
本发明的有益效果在于：蛇毒来源的蛋白酶抑制剂具有同时抑制胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的双重抑制活性，且对二种蛋白酶的抑制常数基本在同一个数量级，本发明的蛋白酶抑制剂同时具有钠通道的抑制活性。与其它天然来源小分子量蛋白酶抑制剂相比，该蛇毒蛋白酶抑制剂具有结构简单、基因表达产量高、活性特殊的有益特点。
附图说明
图1为本发明眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂的G-50分子筛层析图。
图2为本发明眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂的胰蛋白酶亲和柱层析图。
图3为本发明眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂的HPLC反相C18柱层析图。
图4为本发明眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂基因的核苷酸序列。
图5为本发明眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂成熟分子的氨基酸序列。
图6为基因表达本发明眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂的质谱图。
图7为本发明眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物与胰蛋白酶相互作用的表面等离子共振图谱。
图8为本发明眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物与胰凝乳蛋白酶相互作用的表面等离子共振图谱。
图9为基因表达本发明眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂对牛蛙坐骨神经的作用图谱。
具体实施方式
实施例1：眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂的分离纯化及活性测定
1、分离纯化
分离纯化过程中检测对胰蛋白酶和对胰凝乳蛋白酶的抑制活性来跟踪：
第一步，分子筛Sephadex G-50凝胶过滤：眼镜王蛇粗毒0.5g溶解于3ml磷酸缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4，pH 5.8，含0.1M NaCl)中，过Sephadex G-50凝胶。G-50IV峰具有对胰蛋白酶和对胰凝乳蛋白酶的双重抑制活性，附图1箭头峰。
第二步，胰蛋白酶亲和层析进一步分离纯化G-50IV峰。在盐酸洗脱峰中具有对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的双重抑制活性，附图2箭头峰。
第三步，HPLC-RP-C18疏水层析对胰蛋白酶亲和层析洗脱峰的纯化。纯化的主峰具有对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。该主峰合并收集，冻干保存于-20℃。该主峰被命名为OH-TCI，附图3箭头峰。
2、活性测定
胰蛋白酶抑制剂活性检测：底物BAEE溶解于Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH8.0，含有0.2％CaCl2)中。胰蛋白酶(trypsin)溶解于0.001N的盐酸中，终浓度为1mg/ml。胰蛋白酶和待检测的样品(该样品溶解于上述Tris-HCl缓冲液中)在25℃孵育10分钟后，加入到底物溶液中起始反应，在253nm下持续监测反应2分钟。酶-抑制剂复合物的Ki常数根据Lineweaver-Burk作图法求得。
胰凝乳蛋白酶抑制剂活性检测：底物BTEE溶解于Tris-HCl缓冲液(0.08M，pH7.8，含有0.1M CaCl2)中。胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)溶解于0.001N的盐酸中，终浓度为1mg/ml。胰凝乳蛋白酶和待检测的样品(该样品溶解于所述Tris-HCl缓冲液中)在25℃孵育10分钟后，加入到底物溶液中起始反应，在256nm下持续监测反应2分钟。酶-抑制剂复合物的Ki常数根据Lineweaver-Burk作图法求得。
结果表明：天然纯化的眼镜王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制常数Ki分别为1.895X10-8M和1.698X10-7M。天然纯化的眼镜王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂显示了对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶相似的高抑制活性，在本发明中，我们将眼镜王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂命名为OH-TCI。
实施例2：眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂的结构测定及分子克隆
1、结构测定：
N-末端部分氨基酸序列的测定
纯化得到的主峰蛋白在全自动蛋白质序列测定仪(476A型，美国应用生物系统公司产品)上经Edman降解法，测定了该主峰蛋白的N-端20个氨基酸残基的序列。
基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测
纯化得到的主峰蛋白采用MALDI-TOF-MS(Bunker)确定其精确分子量。
2、分子克隆：
眼镜王蛇毒腺cDNA文库的构建
1)眼镜王蛇毒腺总RNA的提取：活体眼镜王蛇取毒三天后，投入液氮中4小时后剥离毒腺组织，称重，取30mg毒腺组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCO/BRL产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟，加入等体积的酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为眼镜王蛇毒腺总RNA。
2)眼镜王蛇毒腺mRNA的纯化：采用美国PROMEGA公司的mRNA分离纯化试剂盒，取眼镜王蛇毒腺总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加入3μl Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液，磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加入0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，弃上清，最后加入0.1ml 0.5×SSC，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1ml 1×SSC洗涤四次，最后弃上清，加入0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管，纯化的眼镜王蛇毒腺mRNA即含于上清中。加入1/10体积的pH5.2的3M乙酸钠，等体积的异戊醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶于10μl DEPC水中。
3)眼镜王蛇毒腺eDNA文库的构建：采用美国GIBCO/BRL公司的SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒，但操作方法有改进。cDNA第一链合成(mRNA反转录)，于1.5ml试管中加入2μl NotI引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl 5X第一链合成缓冲液，2μl 0.1M DTT，1μl 10mM dNTP混合物，再加入1μlSuperScript II反转录酶，于37℃保温1小时后放入冰浴。cDNA第二链合成，在第一链合成试管中加入：95μl DEPC水，30μl 5X第二链合成缓冲液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μl T4DNA多聚酶继续保温5分钟。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移到干净试管中，加入70μl 7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。Sal I adapter的连接，上述沉淀溶于25μlDEPC水中，加入10μl 5×T4DNA连接酶缓冲液，10μl Sal I adapter，5μl T4DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μl DEPC水中。Not I酶切，于cDNA溶液中加入5μl酶切缓冲液，4μl Not I酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μlTEN缓冲液中。将cDNA样品过DNA分级分离柱(试剂盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的组分合并，体积为20μl，加入5μl酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸铵，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μl TEN缓冲液中。合成的cDNA连接酶缓冲液，1μl pSPORT1质粒(Not I-Sal I酶水解，50ng)，4μl 5×T4DNA连接酶，反应体积20μl，室温反应3小时，可准备转化大肠杆菌HB101感受态细胞。感受态细胞的制备，挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液540nm O.D.值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl2重悬，分装后置冰浴内备用。连接产物的转化：取上述连接产物5μl加入50μl感受态细胞冰浴20分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.4ml，37℃培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿(15cm直径)，37℃培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10％甘油冻存构建的cDNA大约含4×105个单独克隆。
4)眼镜王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂的基因克隆：在对所构建眼镜王蛇毒腺cDNA文库的随机测序中。通过提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystem 373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为SP6和T7通用引物，SP6引物序列：5-’CATACGATTTAGGTGACACTATAG 3-，T7引物序列：5-’TAATACGACTCTATAGGGA 3-。我们得到了编码眼镜王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂的cDNA全序列(SEQ IDN0：9)，见附图4。眼镜王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂的cDNA序列长度：411个核苷酸，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直线链状，序列种类：cDNA，来源：眼镜王蛇毒腺cDNA文库，序列特征：编码成熟眼镜王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂为第70-244位核苷酸，其氨基酸序列见附图5(SEQ ID NO：1)。
根据眼镜王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂N-末端已测定20个氨基酸残基的序列，以及MALDI-TOF-MS精确分子量的测定结果，证明了所得到克隆编码眼镜王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂。该克隆成熟肽N-末端推导的20个氨基酸残基与天然纯化抑制剂的N-末端一致。推导的眼镜王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂由58个氨基酸残基组成。该家族蛋白酶抑制剂的6个半胱氨酸形成3对二硫键，因此，其理论单同位素分子量[M+H]+为：6339.95道尔顿，MALDI-TOF-MS精确分子量的测定结果表明纯化抑制剂的单同位素分子量[M+H]+为6339道尔顿(附图6)。以上结果充分证明从我们构建的眼镜王蛇蛇毒腺cDNA文库中得到的眼镜王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂cDNA编码纯化得到的天然眼镜王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂。
实施例3：重组眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂的原核表达
重组蛋白在大肠杆菌中的表达
1、克隆得到的眼镜王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂(OH-TCI)经PCR扩增，所用5’-端引物对应成熟多肽的N-术端，3’-引物对应成熟多肽的C-末端，含限制性内切酶Hind III剪切位点以及保护核苷酸。PCR扩增采用高保真DNA聚合酶Pyrobest，宝生物工程(大连)有限公司产品。产物回收后进行限制性内切酶Hind III酶切，然后与经限制性内切酶Xmn I和Hind III剪切的表达载体(pMAL-p2X)进行平头-粘性末端的连接，转化入大肠杆菌DH5α细胞中。表达载体pMAL-p2X购自New England Biolabs公司，该表达载体可使表达产物进入大肠杆菌周质，大肠杆菌周质中含有二硫键异构酶，可帮助表达产物二硫键形成正确折叠。
2、挑选阳性克隆，测定其DNA序列。
3、筛选具有正确序列的克隆，接种于LB培养基(加有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，37℃过夜培养。按1∶100的比例，将过夜培养物加到RB培养基(加有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，37℃振荡培养至O.D.600nm为0.4-0.5时，加入IPTG至终浓度为0.3mM，在25℃诱导表达。冷渗法提取表达的融合蛋白。
4、表达的融合蛋白质经胰蛋白酶亲和柱纯化。纯化蛋白质冻干浓缩后溶解成浓度为2.5mg/ml，对第X因子(Factor Xa)工作液透析24小时。
5、融合蛋白与Factor Xa按质量比100∶1的比例于室温下进行剪切，剪切6小时。
6、剪切结束后，以RP-HPLC-C4纯化目的蛋白-重组的OH-TCI。
7、表达蛋白的鉴定。Edman测序法测定纯化后的目的蛋白的N-末端的氨基酸残基；MALDI-TOF-MS确定重组蛋白的精确分子量。
8、表达蛋白的活性鉴定。按照实施例一的方法测定表达的重组蛋白对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。
结果表明：重组OH-TCI对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制常数Ki分别为3.388X10-8M和1.841X10-7M。重组OH-TCI对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制活性基本等同于天然纯化的OH-TCI。MALDI-TOF-MS确定重组蛋白的精确分子量结果表明重组OH-TCI分子量为6339道尔顿，因此，在大肠杆菌表达系统中，重组OH-TCI的二硫键形成了正确折叠，天然以及重组OH-TCI均具有对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶相似的抑制活性。按照本实施例所述方法，1升培养基可得到重组OH-TCI约10mg。
实施例4：眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂的真核表达
重组蛋白在酵母细胞Pichia pastoris GS115中的表达
1、克隆得到的眼镜王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂(OH-TCI)经PCR扩增，所用5’-端引物对应成熟多肽的N-末端，在成熟多肽的N-末端人工引入第X因子剪切位点IleGlu Gly Arg位点以及内切酶Eco R1位点，3’-引物对应成熟多肽的C-末端，含限制性内切酶Not I剪切位点。PCR扩增采用高保真DNA聚合酶Pyrobest，宝生物工程(大连)有限公司产品。产物回收后进行A-tailing反应以使产物3’-末端加上腺苷氨酸。
2、A-tailing反应产物与克隆载体pGEM-T(Promega产品)连接后转化大肠杆菌JM109。挑选阳性克隆，测定其DNA序列。
3、筛选具有正确序列的克隆，接种于LB培养基(加有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，37℃过夜培养。按常规方法抽提质粒后进行Eco R1与Not I的双酶切反应，回收目的条带并与限制性内切酶Eco R1与Not I剪切的表达载体(pPIC9K)进行连接。表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司。
4、将上述连接液转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，利用PCR方法鉴定插入片段并测定其DNA序列。筛选具有正确序列的克隆进行质粒的纯化备用。
5、在100ml灭菌三角瓶内放10ml YEPD培养基，接种酵母宿主菌GS115单菌落，30℃振荡培养过夜，按1∶1000的比例，将过夜培养物加到200ml YEPD培养基30℃振荡培养至O.D.600nm为1.3-1.5时，4℃，3000rpm离心5min，分别用100ml及50ml预冷的无菌水洗涤2次，用25ml预冷的1M山梨醇溶液洗涤1次，离心后尽可能去除上清液，最后用200μl预冷的1M山梨醇溶液重悬菌体，获得酵母感受态细胞。
6、将第4步制备的阳性重组质粒pPIC9K-OH-TCI用Sal I酶切线性化，约10-20μg质粒DNA与80μl冷的酵母感受态细胞混合。混合液转移到预冷的0.2cm电转移杯，冰浴预冷5min后，于1500V、25μF、200条件下电击，然后迅速加入1ml冷的1M山梨醇溶液，混匀，涂布于MD选择平板上，30℃培养2-3天，至转化子(pPIC9K-OH-TCI/GS115)长出。
7、依次用含G418浓度为1、2、3、4mg/ml的YEDP平板对转化子进行筛选。最终得到的对G418抗性最高的阳性克隆单菌落对应地接种于MD和MM平板，30℃培养3-5天，观察克隆生长情况。最终得到的生长情况良好、对G418抗性高的克隆进行插入片段的PCR方法鉴定并测定其DNA序列。
8、接种上一步经鉴定正确的、对G418抗性高的单菌落于100ml BMGY培养基，30℃振荡培养至O.D.600nm为2.0-4.0，3000rpm离心5min，弃去上清液，用1000ml BMMY培养基重悬菌体，使菌体浓度约为O.D.600nm＝1.0。每24小时补充甲醇一次，使其浓度保持在1％。第72小时时将菌液于4℃，8000rpm离心20min，收集上清液，此上清液中含有表达的重组蛋白。
9、上清液含有的表达融合蛋白质经胰蛋白酶亲和柱纯化。纯化蛋白质冻于浓缩后溶解成浓度为2.5mg/ml，对第X因子(Factor Xa)工作液透析24小时。
10、融合蛋白与Factor Xa按质量比100∶1的比例于室温下进行剪切，剪切6小时。
11、剪切结束后，以RP-HPLC-C4纯化目的蛋白-重组的OH-TCI。
12、表达蛋白的鉴定。Edman测序法测定纯化后的目的蛋白的N-末端的氨基酸残基；MALDI-TOF-MS确定重组蛋白的精确分子量。
13、表达蛋白的活性鉴定。按照实施例一的方法测定表达的重组蛋白对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。
结果表明：重组OH-TCI对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制常数Ki分别为2.34X10-8M和1.701X10-7M。重组OH-TCI对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制活性基本等同于天然纯化的OH-TCI。MALDI-TOF-MS确定重组蛋白的精确分子量结果表明重组OH-TCI分子量为6339道尔顿，因此，在酵母表达系统中，重组OH-TCI的二硫键形成了正确折叠，天然以及重组OH-TCI均具有对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶相似的抑制活性。按照本实施例所述方法，1升培养基可得到重组OH-TCI约50mg。
实施例5：眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂功能等同物的研究
为深入了解眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂结构-功能关系，根据结构模拟，我们沿OH-TCI的β-折叠环构建了六个点突变体以及一个N-末端缺失突变体，这些突变体包括缺失、点突变以及多个氨基酸的替换。突变体的制备采用PCR方法，按照实施例三所述方法进行原核表达后纯化得到，表达目的产物通过质谱进行鉴定。所构建突变体的序列如下：
OH-TCI E7K(SEQ ID NO：3)
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Lys  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
OH-TCI AVS-LRI(SEQ ID NO：4)
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Leu    10
Arg  Ile  Gly  Phe  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
OH-TCI F14P(SEQ ID NO：5)
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Pro  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
OH-TCI K16N(SEQ ID NO：6)
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Gln  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
OH-TCI A17R(SEQ ID NO：7)
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Lys  Arg  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
OH-TCI D27K(SEQ ID NO：8)
Gly  Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    10
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    20
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Lys  Ala  Ser  Ala    30
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    40
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    50
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              58
OH-TCI 57(SEQ ID NO：2)
     Arg  Pro  Lys  Phe  Cys  Glu  Leu  Pro  Ala    9
Val  Ser  Gly  Phe  Cys  Lys  Ala  Tyr  Ile  Pro    19
Ser  Phe  Tyr  Tyr  Asn  Pro  Asp  Ala  Ser  Ala    29
Cys  Gln  Lys  Phe  Ile  Tyr  Gly  Gly  Cys  Gly    39
Gly  Asn  Ala  Asn  Lys  Phe  Lys  Thr  Ile  Glu    49
Glu  Cys  His  Arg  Thr  Cys  Val  Gly              57
本实施例中，抑制剂与胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的相互作用通过表面等离子共振(SPR，Biacore 3000，瑞典Uppsala产品)进行测定(附图7，8)。具体实验方法为：分别将高纯度的胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶(Sigma产品)偶联到CM5芯片上，用不同浓度的抑制剂溶液流经芯片表面。选用BIA数据处理软件自动处理所得数据，可得到不同抑制剂与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在系统温度为25℃，缓冲液pH7.8为的条件下的解离常数KD，该数值反映了抑制剂与酶结合能力的大小。
实验结果表明：天然纯化与原核表达OH-TCI对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶均具有很高的抑制作用，且对二种酶的解离常数KD值极为接近，进一步证明本发明所用原核表达体系可使表达产物形成正确的空间构像。缺失、点突变以及多个氨基酸的替换突变体实验数据揭示这些位点对OH-TCI的胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的双重抑制作用影响不大。值得注意的是，当P1位点16位氨基酸残基由天然的Lys变为Gln时，它丧失了对胰蛋白酶的抑制活性，同时对胰凝乳蛋白酶的抑制活性也有微弱的降低，具体实验结果见表1。
表1不同抑制剂对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶抑制活性的比较
  Chymotrypsin K<sub>D</sub>(M)   Trypsin K<sub>D</sub>(M)
  OH-TCI-天然纯化   5.99×10<sup>-10</sup>   4.57×10<sup>-11</sup>
  OH-TCI-原核表达   4.62×10<sup>-10</sup>   7.49×10<sup>-11</sup>
  OH-TCI E7K   2.43×10<sup>-10</sup>   8.84×10<sup>-11</sup>
  OH-TCI AVS-LRI   2.20×10<sup>-10</sup>   3.02×10<sup>-11</sup>
  OH-TCI F14P   3.16×10<sup>-9</sup>   2.29×10<sup>-11</sup>
  OH-TCI K16N   9.81×10<sup>-9</sup>   无抑制活性
  OH-TCI A17R   8.87×10<sup>-8</sup>   6.40×10<sup>-10</sup>
  OH-TCI D27K   6.75×10<sup>-10</sup>   9.49×10<sup>-11</sup>
  OH-TCI 57   6.02×10<sup>-10</sup>   8.24×10<sup>-11</sup>
上表中的解离常数KD值越小，则表明其蛋白酶抑制活性越强。
实施例6：眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂对钠离子通道的作用
本实施例采用大肠杆菌表达的重组OH-TCI进行实验。重组OH-TCI神经毒活性(阻断钠离子通道)通过对蛙类坐骨神经复合动作电位的阻断来测定。实验方法参照Stys等(Stys PK，Ransom BR，Waxman SG.Compound action potential of nerve recorded by suction electrode：a theoretical and experimental analysis.Brain Research 1991，Vol.546，18-32)。取无损伤的牛蛙两腿坐骨神经丛(长5厘米左右)作为实验材料，两端固定于神经屏蔽盒中，用Ringer溶液湿润防止其干燥。采用成都仪器厂的RM6240生物信号采集处理系统进行实验，分别将刺激电极和记录电极与坐骨神经两端相连，按照标准药理学实验(神经干动作电位)参数给予坐骨神经刺激(采用单刺激模式，刺激幅度为0.5V，采样频率40kHz，波宽0.3ms，延时1ms，连续记录)，并记录分析。试验前，预平衡15分钟，采用普鲁卡因(procaine)和PBS作为阳性和阴性对照，共记录60分钟。根据记录数据，分析计算药物对坐骨神经的去极化和复极化时间的影响。
实验结果表明：重组OH-TCI以及普鲁卡因均能以时间依赖的方式降低牛蛙坐骨神经的收缩活性。普鲁卡因作为一种局部麻醉剂，主要通过抑制电压门控钠离子通道而起作用。重组OH-TCI引起的牛蛙坐骨神经的收缩活性的降低程度要弱于普鲁卡因。本实施例的结果揭示眼镜王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂能作用于钠离子通道(附图9)。
实施例7：眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂与乌司它丁对人胰蛋白酶以及人胰凝乳蛋白酶抑制活性的比较
本实施例采用大肠杆菌表达的重组OH-TCI以及实施例5所述OH-TCI AVS-LRI突变体进行实验。注射用乌司它丁(10万单位/瓶)购自广东天普生化医药股份有限公司。胰蛋白酶抑制剂活性以及胰凝乳蛋白酶抑制活性按照实施例1方法进行。所用试剂均为Sigma公司产品。
实验结果表明：重组OH-TCI，OH-TCI AVS-LRI以及注射用乌司它丁均能剂量依赖地抑制胰蛋白酶活性以及胰凝乳蛋白酶活性，它们在各自相同的剂量下对胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制活性基本在同一数量级。其中，1μg OH-TCI＝11.63单位乌司它丁，证明眼镜王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶双功能抑制剂及其衍生物与乌司它丁对实验所用酶的作用类似，可望应用于临床。
序列表-修改[1].SEQ
<110>中国科学院昆明动物研究所
<120>蛇毒蛋白酶抑制剂及其衍生物的应用
<160>16
<210>1
<211>58
<2i2>PRT
<213>眼镜王蛇(Opiophagus hannah)
<400>1
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala Val Ser Gly Phe Cys Lys
1           5             10             15
Ala Tyr Ile Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala Cys Gln
        20              25             30
Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr
    35               40             45
Ile Glu Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly
    50            55
<210>2
<211>57
<212>PRT
<213>眼镜王蛇(Opiophagus hannah)
<400>2
Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala Val Ser Gly Phe Cys Lys Ala
1           5            10              15
Tyr Ile Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala Cys Gln Lys
         20             25            30
Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile
      35             40             45
Glu Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly
   50             55
<210>3
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Lys Leu Pro Ala Val Ser Gly Phe Cys Lys
1           5             10             15
Ala Tyr Ile Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala Cys Gln
         20             25             30
Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr
     35              40             45
Ile Glu Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly
    50             55
<210>4
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Leu Arg Ile Gly Phe Cys Lys
1           5             10             15
Ala Tyr Ile Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala Cys Gln
         20             25             30
Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr
     35              40             45
Ile Glu Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly
    50             55
<210>5
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala Val Ser Gly Pro Cys Lys
1           5             10             15
Ala Tyr Ile Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala Cys Gln
         20             25             30
Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr
     35              40             45
Ile Glu Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly
    50             55
<210>6
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala Val Ser Gly Phe Cys Gln
1           5             10             15
Ala Tyr Ile Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala Cys Gln
         20             25             30
Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr
     35              40             45
Ile Glu Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly
    50             55
<210>7
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala Val Ser Gly Phe Cys Lys
1           5             10             15
Arg Tyr Ile Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala Cys Gln
         20             25             30
Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr
     35              40             45
Ile Glu Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly
    50             55
<210>8
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala Val Ser Gly Phe Cys Lys
1           5             10             15
Ala Tyr Ile Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Lys Ala Ser Ala Cys Gln
         20             25             30
Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr
     35             40             45
Ile Glu Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly
    50             55
<210>9
<211>411
<212>DNA
<213>眼镜王蛇(Opiophagus hannah)
<400>9
atgggacgtc ttcttctcct gctgggactc ctcaccctct gggcagagct gacccccgtc  60
tccggcctgg gccgtccaaa gttctgtgaa ctgcctgctg tatccggatt ctgcaaagcc  120
tatatacctt ccttctgcta caacccggat gcaagtgcat gccaaaagtt tatttatggt  180
ggctgtgggg gcaatgccaa caaatttaag accatagaag aatgccaccg cacctgtgtt  240
ggatgaccaa tgaggagacc cacccagaat ggatccaatg ttccaacttg acccaaagac  300
cctgcttctg ccctggacca cttggagacc ctcctccaaa caacaccctg ggctcatttc  360
tttttctctg caataaagct ttggttccag ctgcaaaaaa aaaaaaaaaa a           411
<210>10
<211>174
<212>DNA
<213>眼镜王蛇(Opiophagus hannah)
<400>10
cgtccaaagt tctgtgaact gcctgctgta tccggattct gcaaagccta tataccttcc  60
ttctactaca acccggatgc aagtgcatgc caaaagttta tttatggtgg ctgtgggggc  120
aatgccaaca aatttaagac catagaagaa tgccaccgca cctgtgttgg atga        174
<210>11
<211>177
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ggccgtccaa agttctgtaa actgcctgct gtatccggat tctgcaaagc ctatatacct  60
tccttctact acaacccgga tgcaagtgca tgccaaaagt ttatttatgg tggctgtggg  120
ggcaatgcca acaaatttaa gaccatagaa gaatgccacc gcacctgtgt tggatga     177
<210>12
<211>177
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ggccgtccaa agttctgtga actgcctctt cgcatcggat tctgcaaagc ctatatacct  60
tccttctact acaacccgga tgcaagtgca tgccaaaagt ttatttatgg tggctgtggg  120
ggcaatgcca acaaatttaa gaccatagaa gaatgccacc gcacctgtgt tggatga     177
<210>13
<211>177
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
ggccgtccaa agttctgtga actgcctgct gtatccggac catgcaaagc ctatatacct  60
tccttctact acaacccgga tgcaagtgca tgccaaaagt ttatttatgg tggctgtggg  120
ggcaatgcca acaaatttaa gaccatagaa gaatgccacc gcacctcgtgt tggatga    177
<210>14
<211>177
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ggccgtccaa agttctgtga actgcctgct gtatccggat tctgcaatgc ctatatacct  60
tccttctact acaacccgga tgcaagtgca tgccaaaagt ttatttatgg tggctgtggg  120
ggcaatgcca acaaatttaa gaccatagaa gaatgccacc gcacctgtgt tggatga     177
<210>15
<211>177
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ggccgtccaa agttctgtga actgcctgct gtatccggat tctgcaaacg ctatatacct  60
tccttctact acaacccgga tgcaagtgca tgccaaaagt ttatttatgg tggctgtggg  120
ggcaatgcca acaaatttaa gaccatagaa gaatgccacc gcacctgtgt tggatga     177
<210>16
<211>177
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
ggccgtccaa agttctgtga actgcctgct gtatccggat tctgcaaagc ctatatacct  60
tccttctact acaacccgaa agcaagtgca tgccaaaagt ttatttatgg tggctgtggg  120
ggcaatgcca acaaatttaa gaccatagaa gaatgccacc gcacctgtgt tggatga     177

Claims (10)

1.一种眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂，其特征在于所述蛋白酶抑制剂为下述序列表中的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala    10
Val Ser Gly Phe Cys Lys Ala Tyr Ile Pro    20
Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala    30
Cys Gln Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly    40
Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Glu    50
Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly            58
2.衍生自权利要求1所述的蛋白酶抑制剂的一个或多个氨基酸残基替代以及缺失且具有蛋白酶抑制活性的功能等同物，其特征在于所述蛋白酶抑制剂的功能等同物为下述序列表中的氨基酸序列：
SEQ ID NO：2
    Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala    9
Val Ser Gly Phe Cys Lys Ala Tyr Ile Pro    19
Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala    29
Cys Gln Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly    39
Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Glu    49
Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly            57
SEQ ID NO：3
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Lys Leu Pro Ala    10
Val Ser Gly Phe Cys Lys Ala Tyr Ile Pro    20
Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala    30
Cys Gln Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly    40
Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Glu    50
Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly            58
SEQ ID NO：4
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Leu    10
Arg Ile Gly Phe Cys Lys Ala Tyr Ile Pro    20
Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala    30
Cys Gln Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly    40
Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Glu    50
Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly            58
SEQ ID NO：5
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala    10
Val Ser Gly Pro Cys Lys Ala Tyr Ile Pro    20
Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala    30
Cys Gln Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly    40
Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Glu    50
Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly            58
SEQ ID NO：6
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala    10
Val Ser Gly Phe Cys Gln Ala Tyr Ile Pro    20
Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala    30
Cys Gln Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly    40
Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Glu  50
Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly          58
SEQ ID N0：7
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala  10
Val Ser Gly Phe Cys Lys Arg Tyr Ile Pro  20
Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Ala Ser Ala  30
Cys Gln Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly  40
Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Glu  50
Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly          58
SEQ ID N0：8
Gly Arg Pro Lys Phe Cys Glu Leu Pro Ala  10
Val Ser Gly Phe Cys Lys Ala Tyr Ile Pro  20
Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Lys Ala Ser Ala  30
Cys Gln Lys Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Gly  40
Gly Asn Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Glu  50
Glu Cys His Arg Thr Cys Val Gly          58
3.权利要求1所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于：是从眼镜王蛇蛇毒中分离得到。
4.权利要求1所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂或权利要求2所述的功能等同物的制备方法，其特征在于：将编码所述蛋白酶抑制剂的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得所述蛋白酶抑制剂。
5.根据权利要求4所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其功能等同物的制备方法，其特征在于：所述的载体是质粒或病毒中的一种。
6.根据权利要求4所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其功能等同物的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞是原核细胞，它是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
7.根据权利要求4所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及其功能等同物的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞是真核细胞，它是酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
8.权利要求1所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂或权利要求2所述的功能等同物的应用，其特征在于：所述蛋白酶抑制剂及其功能等同物用于制备临床治疗的药物。
9.权利要求1所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂或权利要求2所述的功能等同物的应用，其特征在于：所述蛋白酶抑制剂及其功能等同物在农业生产的应用。
10.权利要求9所述的眼镜王蛇毒蛋白酶抑制剂及功能等同物的应用，其特征在于：所述蛋白酶抑制剂及其功能等同物在抗虫植物基因工程中的应用。
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