CN102660565A - 尖吻蝮蛇血凝酶基因及其表达载体、宿主细胞和重组蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

尖吻蝮蛇血凝酶基因及其表达载体、宿主细胞和重组蛋白的制备方法，属于生物医学。本发明血凝酶成熟蛋白为含236个氨基酸残基，分子量36000±3000Da，等电点6.59的单链糖蛋白，该蛋白氨基酸全序为SEQNO：1；编码该蛋白的基因为783个核苷酸组成的序列SEQNO：2。该酶具有精氨酸酯酶活性和纤维蛋白原水解活性，能优先降解纤维蛋白原Aα链。本发明所述基因能应用于基因工程制备，提供了利用该基因构建表达载体及用宿主细胞获得重组该血凝酶蛋白的方法，并重述了分子生物学获得该基因的方法。

Description

尖吻蝮蛇血凝酶基因及其表达载体、宿主细胞和重组蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）的血凝酶（haemocoagulase HCA）基因及其应用。

背景技术

在蛇毒众多复杂的活性成分当中，其中一类丝氨酸蛋白酶，具有精氨酸酯酶活性，能使纤维蛋白原特定部位Arg-Gly肽键断裂，释放出血纤肽而转换为纤维蛋白，作用与血浆凝血酶十分相似，称之为类凝血酶。大多数蛇毒类凝血酶只能裂解纤维蛋白原的Aα链或Bβ链，释放出血纤肽A（FPA）或B（FPB），并形成非交联的纤维蛋白单体。蛇毒类凝血酶在体外所起凝血作用与凝血酶相似，可不通过体内各种凝血因子直接使纤维蛋白原凝聚，但在体内，由于生成的非交联的纤维蛋白凝块较脆弱，极易被血液中的纤溶系统降解而从血液循环中清除。虽然类凝血酶在体外都能使血浆和血纤维蛋白原凝固，但在体内，不同的类凝血酶却表现为截然相反的两种药理作用：一种为具有抗凝作用的类凝血酶，以来自马来红口蝮(Calloselasma rhodostoma) 的 Ancrod为代表，因其能有效降低血液的纤维蛋白原水平而广泛应用于治疗各种血栓疾病当中；另一种为具有止血作用的类凝血酶，也称蛇毒血凝酶，以来自巴西矛头蝮（Bothrops atrox）的巴曲酶（Batroxobin）为代表, 体内注射后能够加速出血部位的血液凝结，减少伤口的出血时间，因而在各种外科手术和治疗各种出血性疾病当中得到广泛的应用。

由于人凝血酶直接入血易导致血栓形成，除局部外用外，不能用于体内出血性疾病的治疗。因此，用蛇毒血凝酶替代人凝血酶一直是止血药物技术领域研究的重点，目前应用最广泛的是立止血。立止血中包含两种成分：巴曲酶和微量的凝血因子X脂依赖性激活剂(FXA)，巴曲酶是分离自巴西矛头蝮蛇毒的单链糖蛋白，其分子量为43KD。国内已有临床使用的蛇毒血凝酶是白眉蝮蛇毒血凝酶，该酶由3种组分构成，其组分的相对分子量分别为54000±5000 Da、34000±5000 Da和15000±3000Da，相对百分含量为7.0%～12.0%, 76.0%～82.0%和7.0%～12.0% ，由类凝血酶和类凝血激酶组成。另一种由尖吻蝮(Agkistrodon acutus）蛇毒提取的血凝酶，该酶分子量为30KDa，由A、B两个亚基构成，A链由135个氨基酸组成，B链由126个氨基酸组成。

本发明人此前曾提出“尖吻蝮蛇毒36KD单链血凝酶及其制备方法”（发明专利ZL200610048673X），其分离纯化方法为DEAE-Sepharose XK50/60；Metal Sepharose F.F XK50/30柱；Superdex 75 XK50/100柱和Sephacryl S－100 XK50/100柱层析。

以下HCA含义为尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）的血凝酶（haemocoagulase）的英文缩写。

发明内容

本发明的目的是基于上述理论研究和技术，提供一种尖吻蝮蛇血凝酶基因及其氨基酸的全序列结构，该基因表达的蛋白具有在体内出血处快速止血的效果，其核苷酸序列既可以通过分子生物学方法从尖吻蝮蛇毒腺中获得，也可通过人工合成方法获得。

本发明的目的还包括了利用该基因构建表达载体，利用宿主细胞获得重组尖吻蝮蛇毒36KD单链血凝酶的方法。

本发明的目的通过如下方法实现：

（一）36KDa单链尖吻蝮蛇血凝酶基因

该基因自5’端至3’端由783个核苷酸编码组成，DNA序列为SEQ ID NO：2；该基因编码的单链糖蛋白的成熟蛋白含236个氨基酸残基，氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其中含24个氨基酸残基的信号肽部分；该基因编码的单链糖蛋白的分子量为36±3 KDa，等电点为6.59。（SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2如氨基酸和核苷酸序列表所示。）

（二）一种克隆36KDa单链尖吻蝮蛇血凝酶基因的方法

包括步骤：

（1）活体尖吻蝮蛇提取尖吻蝮蛇毒腺总RNA；

（2） cDNA第一链合成（mRNA）反转录

在DEPC处理的PCR管中加入以下溶液：

Total RNA	0.2~2mg
		Oligo (dT)15 (20mM)	1mL
dNTP Mixture (10mM each)	1mL
		5×M-Mulv RT Buffer	4mL
M-Mulv反转录酶（200u/mL）	1mL
		Rnase Inhibitor (40 u/mL)	0.5mL
Rnase Free H2O	Up to 20 mL

PCR反转录反应条件：30℃ 5min，42℃ 30~40min，95℃ 5min，产物4℃保存；

（3） PCR扩增类凝血酶基因

以反转录cDNA产物作为扩增尖吻蝮蛇类凝血酶基因序列的模板，引物如下：

TLE-ZQ（ SEQ ID NO：3）

5'-GCAGAGTTGAAGCTATGGT-3'；

TLE-P4 （SEQ ID NO：4）

5'-AAGGCAGTCCTATTTGAGTCTAA-3'；

采用Ex Taq PCR聚合酶（购自大连宝生物公司）按照该酶的使用说明书进行扩增，PCR扩增条件：94℃3 min; 94℃ 0.5min, 60℃ 0.5min，72℃ 4min或2min，35个循环，72℃延伸10min；TLE-ZQ和TLE-P4是根据不同来源蛇毒类凝血酶的5’端和3’端保守序列而设计的。

（4）筛选36KDa-HCA基因克隆

使用引物F1 （SEQ ID NO：5）：5'-GGAGGTAATGAATGTGACAC-3'和R1（SEQ ID NO：6）：5'-GAGTCTAAAAAAAGCTTACTG-3'进行菌落PCR，筛选血凝酶36KDa-HCA基因克隆；F1是根据36Kd-HCA的N末端氨基酸序列“GGNECDT”而设计的特异性引物，R1是根据不同来源蛇毒类凝血酶的3'端保守序列而设计.

PCR条件94℃3 min; 94℃ 0.5min, 60℃ 0.5min，72℃ 4min或2min，35个循环，72℃延伸10min。 

（三）一种尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶基因的原核表达方法

包括以下步骤：

（1）表达载体的构建

血凝酶36KDa-HCA cDNA克隆作为模板，引物EX1（SEQ ID NO：7）：5-GCGAATTCATGGTCATTGGAGGTGATGAATG-3和EX2（SEQ ID NO：8）：5-TACTCGAGTCACGGGGGGCAGGTTGCATC-3扩增目的片段，EcoRI和Xho I双酶切后，与同样双酶切的载体pET-28a进行连接，得到表达载体；

（2）表达质粒的转化

连接好的表达载体通过热击转化到BL21表达菌株上，涂布于含有50mg/mL卡那霉素的平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆；

（3）诱导表达

阳性克隆接种到含有卡那霉素的液体培养基试管内，摇菌过夜后按1%接种量扩大培养，当菌液 OD₆₀₀值达到0.6~0.8时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，使IPTG终浓度达到1mmol/L后继续培养2～6小时；

（4）包涵体纯化

取培养菌液经3000～8000rpm离心，收集沉淀即菌体，冻融三次后，将得到的菌体按1：10悬于0.05mol/L，pH7.5～8.5Tris-HCl缓冲液，冰浴超声破碎，再离心，取沉淀，即得pET-28a-36KDa包涵体；

（5）表达蛋白的变性、复性及纯化

表达获得的pET-28a-36KDa包涵体加入裂解液，搅拌过夜后离心，取上清，即为包涵体变性液；

将包涵体变性液加入到复性缓冲液(10mmol/LPB，pH8.0)中，蛋白终浓度为0.05mg/mL，4℃复性12h～30h；

复性液经Ni^2＋-NTA琼脂糖柱纯化后，经SDS-PAGE电泳检测，其分子量为36±3KDa，纯度97.6%；经western-blot检测与兔抗血凝酶抗体呈阳性反应，即为原核表达纯化的尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶。

（四）一种尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶基因的真核表达方法

包括以下步骤：

（1）pPIC9K-36KDa-HCA表达载体的构建

血凝酶36KDa-HCA cDNA克隆作为模板，引物EX3（SEQ ID NO：9）：5-GCGAATTCATGGTCATTGGAGGTGATGAATG-3和EX2（SEQ ID NO：8）：5-TACTCGAGTCACGGGGGGCAGGTTGCATC-3扩增该血凝酶基因，PCR扩增条件：94℃3 min; 94℃ 0.5min, 57℃ 0.5min，72℃ 4min或2min，35个循环；72℃延伸10min；

PCR产物与pPIC9K空质粒分别经Xho I和Xba I双酶切后连接，转化大肠杆菌JM109, 涂布于含25μg/mL 的氨苄抗性的大肠杆菌培养基2×YT平板上, 16 h后, 挑选阳性克隆即为重组的pPIC9K-36KDa -HCA质粒； 

（2）重组质粒的转化

重组的pPIC9K-36KDa-HCA质粒以Bgl II酶切线性化后，用浓度为1μg/μL灭菌去离子水溶解，取5uL溶解液与80μL GS115感受态酵母菌混合进行电转化，转化后涂于酵母培养基MD平板，挑取阳性克隆接种于含有G418质量浓度分别为0.25、0.50、0.75和1mg / mL的YPD平板上，筛选出耐受高浓度G418的转化子；

（3）培养

将筛选的转化子接种到10mlYPG培养基过夜，以10%的接种量转接到酵母发酵基础盐BSM无机培养基中，摇瓶30℃、旋转培养36～52 h，加入甲醇诱导，甲醇终浓度在0.5%～1.0%，80～100小时后停止发酵, 培养液离心后取上清，上清即含有目的蛋白。

本发明具有显著的技术进步和突出的实质性特点，其效果和意义是：

（1）本发明从尖吻蝮蛇毒中分离纯化到一种新的单链蛇毒血凝酶，并获得其基因全序。该酶分子量大小为36±3KDa，N端25个氨基酸序列测定为:      

VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWT。

根据cDNA序列推导的成熟蛋白质序列含有236个氨基酸残基，以上结果与蛋白质N端测序结果完全一致，分子量36±3KDa，等电点6.59。

通过NCBI蛋白质数据库进行检索比对，发明人未发现与本发明的尖吻蝮蛇血凝酶全序列氨基酸结构相同的蛋白。

（2）本发明的单链蛇毒血凝酶能够应用于基因工程制备尖吻蝮蛇36000±3000Da单链血凝酶。因此，本发明在具体实施方式中再次重述了“尖吻蝮蛇毒36KD单链血凝酶及其制备方法”（发明专利ZL200610048673X）的分离纯化方法，以从尖吻蝮蛇毒中获得血凝酶。另一方面，本发明提供了将该血凝酶的编码基因克隆到载体上，然后转化至宿主细胞中表达，以制备血凝酶的方法。以上两种方法所制备的血凝酶均可通过N端测序鉴定。

（3）本发明血凝酶具有精氨酸酯酶活性，在20-50℃和pH 6.0-10.0的条件下较稳定，在温度高于60℃和pH低于5.0或高于10.0时，活性下降，精氨酸酯酶活性7 0℃下降40～45%、80℃活性下降45～55%、90℃活性下降50～60%，精氨酸酯酶活性在pH2.0、3.0、11.0条件下分别为pH7.4时的40～45%、45～55%和65～75%。Zn²⁺ 、Cu²⁺、PMSF、β-巯基乙醇、抑肽酶和苯甲脒能够抑制36KDa-HCA的精氨酸酯酶活性，其中Zn²⁺ 和PMSF的抑制率分别为35～40%和90～98%。该酶具有纤维蛋白原水解活性，能够优先降解纤维蛋白原的Aα链，水解活性呈剂量和时间依赖性。

（4）本发明血凝酶具有精氨酸酯酶活性不仅显示了作为一种新的蛇毒类凝血酶，因其成分单一，止血作用确切而具有的良好应用前景，同时也使该血凝酶成为了研究蛇毒血凝酶止血机制的极好材料。按照我们以往的大量试验可以推论：该酶具有体内注射后快速在出血部位止血，神经毒、异常毒性、出血毒性符合国家相关质量标准要求的特点。

附图说明

图1为本发明36KDa-HCA基于精氨酸酯酶活性的稳定性 (1 mM TAME为

底物，0.25 μg 36KDa-HCA为对照，活性定义为100%) 。（A）温度对活性的影响。（B）pH对活性的影响（C）二价阳离子对活性的影响（D）抑制剂对活性的影响。图柱表示%精氨酸酯酶活性的平均值±标准差（n=3）；“*”号表示相对于对照差异显著（p<0.05）

图2为本发明36Kd-HCA的纤维蛋白原水解活性。（A）不同量的36KDa-HCA和10 μL 2 mg/ml的牛纤维蛋白原于37 ℃ 作用 1 h。图中，1、对照20 μg牛纤维蛋白原；2、0.1 μg酶；3、0.2 μg酶；4、0.4 μg酶；5、0.6 μg 酶；6、0.8 μg酶；7、1.0 μg酶。（B）0.5 μg Da-36与10 μL 2 mg/ml牛纤维蛋白原于37 ℃孵育不同时间。图中，1、对照20 μg牛纤维蛋白原；2、15 min；3、30 min；4、1 h；5、2 h；6、4 h； 7、 6 h。

图3为本发明36Kd-HCA western-blot检测结果。图中，1、MK（DL5000）； 2、 36KDa-HCA- BL21原核表达产物；3、36KDa-HCA- GS115真核表达产物。

图4为本发明36Kd-HCA基因全长序列DNA电泳检测结果。

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

以下说明包括但不限制本发明的保护范围，例如，表达载体可以是质粒或病毒中的一种而不限于实施例所使用的表达载体。同样，宿主细胞可以是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等原核细胞中的一种，宿主细胞也可以是酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞等真核细胞中的一种。

具体实施方式

（一）36KDa单链尖吻蝮蛇血凝酶基因克隆

1.1尖吻蝮蛇毒腺总RNA的提取，包括以下步骤：

(1)活体尖吻蝮蛇断头取毒腺，将蛇腺在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1mL 总RNA提取缓冲液（Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品），用匀浆仪进行处理，用移液器反复吹吸，室温孵育5min。

(2)每使用1mL Trizol，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3min后10000g 4℃离心15min，取上清。

(3)上清1mL加入500-700uL异丙醇，室温孵育10min。10000g 4℃离心10min后弃上清，沉淀加1mL 75%乙醇（DEPC处理过的水配制）洗涤一次后晾干，管底沉淀物即为尖吻蝮蛇毒腺总RNA。

(4)沉淀溶于50-100μL 无RNA酶水中，55℃-60℃孵育10min，保存于-70℃以备长期使用。

1.2 cDNA第一链合成（mRNA）反转录

在DEPC处理的PCR管中加入以下溶液：

Total RNA	0.2~2 μg
		Oligo (dT)15 (20 μM)	1 μL
dNTP Mixture (10mM each)	1 μL
		5×M-Mulv RT Buffer	4 μL
M-Mulv反转录酶（200u/μL）	1 μL
		Rnase Inhibitor (40 u/μL)	0.5 μL
Rnase Free H2O	Up to 20 μL

在PCR仪上按进行反转录反应：30℃ 5min，42℃ 30~40min，95℃ 5min，产物保存于4℃。

1.3 PCR扩增类凝血酶基因

以反转录cDNA产物做为扩增尖吻蝮蛇类凝血酶基因序列的模板，使用的引物为TLE-ZQ（5’-GCAGAGTTGAAGCTATGGT-3’）和TLE-P4（5’-AAGGCAGTCCTATTTGAGTCTAA-3’）。TLE-ZQ和TLE-P4是根据不同来源蛇毒类凝血酶的5’端和3’端保守序列而设计的。PCR采用宝生物的 Ex Taq酶进行扩增，条件如下：94℃ 3 min; 94℃ 0.5 min, 60℃ 0.5 min，72℃1min，35个循环; 72℃延伸10 min。

扩增产物进行1%琼脂糖电泳，EB染色，使用胶回收试剂盒（百泰克公司）回收目的条带。PCR回收产物连接pMD19-T载体（宝生物公司），然后热击转化DH5a感受态细胞。

1.4 筛选36Kd-HCA基因克隆

使用引物F1（5'-GGAGGTAATGAATGTGACAC-3'）和R1（5'-GAGTCTAAAAAAAGCTTACTG-3'）进行菌落PCR筛选血凝酶36Kd-HCA基因克隆。PCR条件同1.3。阳性克隆样品送上海生工生物科技有限公司进行测序。

扩增的36Kd-HCA基因 cDNA序列全长783 bp，根据cDNA序列推导的蛋白序列全长260 aa，成熟蛋白236 aa，推导的氨基酸序列与蛋白质N端测序结果完全一致。

1.5 尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶基因序列测定结果

阳性克隆进行基因核苷酸序列测定，测序结果表明编码该尖吻蝮蛇血凝酶的基因由783个核苷酸组成，自5’端至3’端序列如氨基酸和核苷酸序列表图1所示，编码尖吻蝮蛇36KDa血凝酶成熟蛋白的为该序列73-783位核苷酸，该序列如氨基酸和核苷酸序列表图2所示。该基因能够应用于基因工程制备尖吻蝮蛇36000±3000Da单链血凝酶。

（二）尖吻蝮蛇毒36KDa单链血凝酶的分离纯化

称取尖吻蝮蛇蛇毒冻干品10g加50ml无菌注射用水， 4℃去离子水透析过夜，8000rpm，15min，4℃离心，取上清用1M Tris-HCl(PH8.0)调节电导至3.5ms/cm后，上预先用0.05M Tris-HCl(PH8.0)平衡好的Metal Sepharose F.F XK50/30柱（GE Healthcare公司产品），1M NH₄Cl进行阶段洗脱，收集穿透峰；穿透峰上平衡好的DEAE-Sepharose XK50/60柱（GE Healthcare公司产品），0.05M Tris-HCl(PH8.0)零洗1倍柱床体积后，用0.05M Tris-HCl + 1.0MNaCl(PH8.0)做梯度洗脱，在紫外280nm检测下收集洗脱5峰，活性峰脱盐冻干。冻干品溶解于10－20ml 0.05M Tris-HCl(PH7.5)+ 0.1M KCl，上预先用0.05M Tris-HCl(PH7.5)+ 0.1M KCl平衡好的Superdex 75 XK50/100柱（GE Healthcare公司产品）,上述缓冲液进行洗脱，收集第二峰；活性组分脱盐冻干后再上0.05M Tris-HCl(PH7.5)+ 0.1M KCl平衡好的Sephacryl S－100 XK50/100柱（GE Healthcare公司产品）,上述缓冲液进行洗脱，收集第二峰；活性峰Sephadex G-25 XK50/100柱脱盐，进行质量检测、HPLC和SDS-PAGE检测，电泳纯度达到98.5％，还原性电泳为分子量在36000±3000Da的单一区带；比活2560U/mg，出血毒50U/ml小鼠皮下无出血；0.22um膜过滤除菌后冻干保存，共得到血凝酶7026U。

纯化的36KDa单链血凝酶经SDS-PAGE 测定确定分子量为36±3Kd，纯度在98%以上后, 将电泳胶置于电转系统,在100 V条件下电转1 h至PVDF膜。将该PVDF膜染色脱色后，切取目标条带, 以Edman降解法在Procise 491蛋白质测序仪上测序,共测定N端25个氨基酸残基序列。

经测定N端二十五个氨基酸序列为VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWT。获得的36KDa单链血凝酶基因推导的氨基酸序列N端与之完全符合。

（三）尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶的酶学性质检测

3.1 精氨酸酯酶活性

1 mL 1 mM 精氨酸甲酯（TAME）或者精氨酸乙酯（BAEE）（溶于10 mM Tris–HCl, pH 7.4）中加入10 μL 36KDa-HCA（0.025 mg/mL，溶于10 mM Tris–HCl, pH 7.4），在室温下测定反应的前10分钟247 nm的吸光值。1个精氨酸酯酶活性单位定义为每分钟水解底物使吸光值增加0.01的酶量，用TAME或者BAEE U/mg蛋白表示。36KDa-HCA的稳定性研究采用TAME作为底物，0.25 μg 36KDa-HCA在不同pH（2.0-11.0）、温度（20-90℃）下孵育30 min，或者10 mM不同的二价离子（CaCl₂, MgCl₂, CuSO₄, ZnSO₄, MnCl₂）、10 mM不同的抑制剂（PMSF, β-巯基乙醇, EDTA, 2.0mM 抑肽酶, 苯甲脒）与0.25 μg 36KDa-HCA 室温孵育1 h，然后按上述步骤测定精氨酸酯酶活性。

36 Kd-HCA水解TAME和BAEE的活性分别为158435 U/mg和332518 U/mg。0.25 μg 36KDa-HCA在不同pH和温度下孵育30 min，以TAME为底物测定精氨酸酯酶活性，结果显示36KDa-HCA在20-50℃和pH 6.0-10.0的条件下较稳定（结果见图 1A，B），在温度高于60℃和pH低于5.0或高于10.0时，活性迅速下降，在温度70、80、90℃下活性分别为55%、53%和47%，在pH2.0、3.0、11.0条件下分别为43%、49%和72%（图 1A，B）。Zn²⁺ 、Cu²⁺、PMSF、β-巯基乙醇、抑肽酶和苯甲脒能够抑制36KDa-HCA的精氨酸酯酶活性，其中Zn²⁺ 和PMSF的抑制率分别为37%和94%（图 1C，D）

3.2 纤维蛋白原水解活性

牛纤维蛋白原溶于10 mM Tris-HCl, pH 7.4，配成2 mg/ml，取10 μL牛纤维蛋白原加入10 μL不同浓度的36KDa-HCA（0.01 mg/mL-0.1mg/mL），37 ℃ 作用 1 h。加入5 μL 250 mM Tris–HCl缓冲液, pH 6.8, 内含50% (v/v)甘油, 5% (v/v) β-巯基乙醇, 10% (m/v) SDS, 0.05% (m/v)溴酚蓝，沸水煮5 min终止反应，样品上10% SDS-PAGE胶分析。另取10 μL 0.05 mg/mL 36KDa-HCA与10 μL 2 mg/ml牛纤维蛋白原于37 ℃孵育不同时间（15 min-6 h），然后按上述步骤上10% SDS-PAGE胶分析。36KDa-HCA能够快速（15min内）纤维蛋白原的Aα链，且降解优先降解纤维蛋白原的Aα链。结果见附图2。

（四）尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶的原核表达

4.1 表达载体的构建

以血凝酶36KDa-HCA cDNA克隆作为模板，引物EX1（5-GCGAATTCATGGTCATTGGAGGTGATGAATG-3）和EX2（5-TACTCGAGTCACGGGGGGCAGGTTGCATC-3）扩增目的片段，或将含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列加上EcoRI和Xho I酶切位点后由专业基因合成公司人工合成；PCR或人工合成产物经EcoRI和Xho I双酶切后，回收目的片段，与同样双酶切的载体pET-28a（购自novagen公司）进行连接，得到表达载体。

4.2 表达质粒的转化

连接好的表达载体通过热击转化到BL21（购自博凌科公司）表达菌株上，涂布于含有50mg/mL卡那的平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆。

4.3 诱导表达

阳性克隆接种到含有卡那霉素的4ml液体培养基试管内，摇菌过夜后分别取3mL菌液转接到300mL新的培养基中（卡那的浓度为50mg/mL），37℃条件下震荡培养，再按1%接种量扩大培养。当菌液 OD₆₀₀值达到0.6~0.8时，加入异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，使终浓度达到1mmol/L，之后继续培养4h。

4.4 包涵体纯化

将3L菌液经8000rpm离心15分钟，收集菌体，冻融三次。然后将得到的菌体按1：10悬于Tris-HCl（0.05mol/L, pH7.5～8.5）缓冲液，冰浴超声破碎，然后8000rpm离心15分钟，弃去上清，即得pET-28a-36KDa包涵体粗品。

包涵体粗品用4mol/L Urea, 50 mmol/L Tris-HC1 pH 8.0洗涤3次。9000r/min，离心15分钟，沉淀即纯化后的包涵体。

4.5 表达蛋白的变性、复性及纯化

纯化后的包涵体加入8mo1/L尿素+50mmol/L Tris+1 mmol/L EDTA+10mmol/L DTT的裂解液中（pH11），搅拌过夜。然后12000rpm，离心30min，取上清（即包涵体变性液），将包涵体变性液加入到复性缓冲液(10mmol/LPB，pH8.0)中，蛋白终浓度为0.05mg/mL，4℃复性24h。

取5mL Ni^2＋-NTA琼脂糖(每ml树脂可吸附5～10mg 6×His融合蛋白)装柱，用Binding buffer(5mmol/L imidazole，0.5mol/L NaCl，1mmol/L PMSF， 20mmol/L Tris-C1，pH8.0)平衡。透析液缓慢过柱后，用10ml的Binding buffer洗柱，再用6ｍL的Wash buffer (0.5mol/L NaCl，60mmol/L imidazole，20mmol/L Tris-HCl，pH 7.9) 洗柱，最后用6ｍL Elute Buffer (1mol/L imidazole，0.5 mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH7.9) 洗脱，洗脱蛋白即为纯化的尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶。

纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测，分子量为36±3 Kd，纯度97.6%。经Western-blot检测与本实验室制备的兔抗血凝酶抗体呈阳性反应。

（五）尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶的真核表达

5.1 pPIC9K-36KDaHCA表达载体的构建

血凝酶36KDa-HCA cDNA克隆作为模板，引物EX3（5-GCGAATTCATGGTCATTGGAGGTGATGAATG-3）和EX2（5-TACTCGAGTCACGGGGGGCAGGTTGCATC-3）扩增目的片段，PCR扩增条件：94℃3 min; 94℃ 0.5min, 57℃ 0.5min，72℃ 4min或2min，35个循环; 72℃延伸10min；Xho I和Xho I双酶切后，回收目的片段（回收试剂盒购自北京百泰克公司），与同样双酶切的真核表达载体pPIC9K（购自Invitrogen公司）进行连接，转化大肠杆菌JM109, 涂布于含25μg/mL 的氨苄（AMP）抗性的大肠杆菌培养基2×YT（1.6% 蛋白胨+ 1%酵母粉+ 1% NaCl, pH 值7.0)平板上, 16 h后, 挑选阳性克隆做质粒的酶切鉴定，得到表达载体。

5.2 重组质粒的转化

将JM109 接种在含有AMP 的培养基2×YT中, 37℃培养过夜, 参照Promega DNA Purification System 质粒提取试剂盒说明提取质粒，重组质粒以Bgl II酶切线性化后纯化, 用灭菌去离子水溶解使浓度在1μg/μL 左右, 取5ul与80μL GS115感受态酵母菌（购自Invitrogen公司）混合进行电转化, 转化后涂于酵母培养基MD（1.34%YNB（购于genmed公司）+ 0.5%甲醇+ 生物素+ 1.5%琼脂粉）平板上, 29℃ 培养36h，将阳性克隆点接在含G418 的质量浓度分别为0.25, 0.50, 0.75, 1mg / mL 的YPD（1%酵母粉+ 2%蛋白胨+ 2% 葡萄糖)平板上, 30 ℃培养一周，筛选出耐受G418 的高拷贝转化子。

5.3 培养

将筛选的高拷贝转化子接种到10mlYPG（1% 酵母粉+ 2% 蛋白胨+3%甘油）培养基过夜，以10% 的接种量转接到BSM无机培养基中( 250mL 带挡板摇瓶) , 30 ℃, 200r/ min 旋转培养48 h 左右加入100%甲醇至终浓度为0.5%～1.0%进行诱导, 此后每隔6h 补加一定量的甲醇, 96 h 停止发酵, 培养液离心后取上清。

BSM无机培养基配方：

85%H3PO4	26.7ml/L
		CaSO4·2H2O	0.93g/L
K2SO4	18.2g/L
		MgSO4·2H2O	14.9g/L
KOH	4.13g/L
		甘油	40g/L
PMT1	4.0ml/L

PMT1（1L）配方：

CuSO4·5H2O	6.0g/L
		KI	0.088g/L
MnSO4·H2O	3.0g/L
		Na2MoO4·2H2O	0.2g/L
H3BO3	0.02g/L
		CoCL2·6H2O	0.5g/L
ZnCL2	20.0g/L
		FeSO4·7H2O	65.0g/L
Biotin	0.2g/L
		浓H2SO4	5.0ml

5.4 检测

将上清进行SDS-PAGE后进行Western-blot检测，36±3 Kd处与本实验室制备的兔抗血凝酶抗体呈阳性条带，转化空质粒的阳性对照没有阳性条带。

Claims (5)

1.36KDa单链尖吻蝮蛇血凝酶基因，其特征是该基因自5’端至3’端由783个核苷酸编码组成，DNA序列为SEQ ID NO：2；该基因编码的单链糖蛋白的成熟蛋白含236个氨基酸残基，氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其中含24个氨基酸残基的信号肽部分；该基因编码的单链糖蛋白的分子量为36±3 KDa，等电点为6.59。

2.根据权利要求1所述的血凝酶基因，其特征是该基因具有以下特征：

（1）精氨酸酯酶活性

该基因编码的蛋白（36KDa-HCA）能水解精氨酸甲酯（TAME）和精氨酸乙酯（BAEE），活性分别为158435 U/mg和332518 U/mg；

以TAME为底物测定36KDa-HCA精氨酸酯酶活性，该酶在温度20℃～50℃和pH 6.0-10.0的条件下较稳定；在温度高于60℃时活性下降，70℃下降40～45%、80℃活性下降45～55%、90℃活性下降50～60%；

在pH2.0、3.0、11.0条件下，活性分别为pH7.4时的40～45%、45～55%和65～75%；

Zn²⁺、Cu²⁺、苯甲基磺酰氟（PMSF）、β-巯基乙醇、抑肽酶和苯甲脒能够抑制该基因蛋白的精氨酸酯酶活性，其中，Zn²⁺ 和PMSF的抑制率分别为35～40%和90～98%；

（2） 纤维蛋白原水解活性

该36KDa-HCA在15min内优先降解牛纤维蛋白原的Aα链，且水解活性呈剂量与时间依赖性关系。

3.一种克隆如权利要求1所述的36KDa单链尖吻蝮蛇血凝酶基因的方法，其特征是：

（1）活体尖吻蝮蛇提取尖吻蝮蛇毒腺总RNA；

（2） cDNA第一链合成（mRNA）反转录

在DEPC处理的PCR管中加入以下溶液：

Total RNA 0.2~2mg Oligo (dT)15 (20mM) 1mL dNTP Mixture (10mM each) 1mL 5×M-Mulv RT Buffer    4mL M-Mulv反转录酶（200u/mL）    1mL Rnase Inhibitor (40 u/mL)    0.5mL Rnase Free H₂O Up to 20 mL

PCR反转录反应条件：30℃ 5min，42℃ 30~40min，95℃ 5min，产物4℃保存；

（3） PCR扩增类凝血酶基因

以反转录cDNA产物作为扩增尖吻蝮蛇类凝血酶基因序列的模板，引物如下：

TLE-ZQ（ SEQ ID NO：3）

5'-GCAGAGTTGAAGCTATGGT-3'；

TLE-P4 （SEQ ID NO：4）

5'-AAGGCAGTCCTATTTGAGTCTAA-3'；

采用Ex Taq PCR聚合酶进行扩增，PCR扩增条件：94℃3 min; 94℃ 0.5min, 60℃ 0.5min，72℃ 4min或2min，35个循环，72℃延伸10min；

（4）筛选36KDa-HCA基因克隆

使用引物F1 （SEQ ID NO：5）：5'-GGAGGTAATGAATGTGACAC-3'和R1（SEQ ID NO：6）：5'-GAGTCTAAAAAAAGCTTACTG-3'进行菌落PCR，筛选血凝酶36KDa-HCA基因克隆；

PCR条件94℃3 min; 94℃ 0.5min, 60℃ 0.5min，72℃ 4min或2min，35个循环，72℃延伸10min。

4.一种如权利要求1所述的尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶基因的原核表达方法，包括以下步骤：

（1）表达载体的构建

血凝酶36KDa-HCA cDNA克隆作为模板，引物EX1（SEQ ID NO：7）：5-GCGAATTCATGGTCATTGGAGGTGATGAATG-3和EX2（SEQ ID NO：8）：5-TACTCGAGTCACGGGGGGCAGGTTGCATC-3:扩增目的片段，EcoRI和Xho I双酶切后，与同样双酶切的载体pET-28a进行连接，得到表达载体；

（2）表达质粒的转化

连接好的表达载体通过热击转化到BL21表达菌株上，涂布于含有50mg/mL卡那霉素的平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆；

（3）诱导表达

阳性克隆接种到含有卡那霉素的液体培养基试管内，摇菌过夜后按1%接种量扩大培养，当菌液 OD₆₀₀值达到0.6~0.8时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，使IPTG终浓度达到1mmol/L后继续培养2～6小时；

（4）包涵体纯化

取培养菌液经3000～8000rpm离心，收集沉淀即菌体，冻融三次后，将得到的菌体按1：10悬于0.05mol/L，pH7.5～8.5Tris-HCl缓冲液，冰浴超声破碎，再离心，取沉淀，即得pET-28a-36KDa包涵体；

（5）表达蛋白的变性、复性及纯化

表达获得的pET-28a-36KDa包涵体加入裂解液，搅拌过夜后离心，取上清，即为包涵体变性液；

将包涵体变性液加入到复性缓冲液(10mmol/LPB，pH8.0)中，蛋白终浓度为0.05mg/mL，4℃复性12h～30h；

复性液经Ni^2＋-NTA琼脂糖柱纯化后，经SDS-PAGE电泳检测，其分子量为36±3KDa，纯度97.6%；经western-blot检测与兔抗血凝酶抗体呈阳性反应，即为原核表达纯化的尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶。

5.一种表达如权利要求1所述的尖吻蝮蛇36KDa单链血凝酶的真核的方法，包括以下步骤：

（1）pPIC9K-36KDaHCA表达载体的构建

血凝酶36KDa-HCA cDNA克隆作为模板，引物EX3（SEQ ID NO：9）：5-GCGAATTCATGGTCATTGGAGGTGATGAATG-3和EX2（SEQ ID NO：8）：5-TACTCGAGTCACGGGGGGCAGGTTGCATC-3扩增该血凝酶基因，PCR扩增条件：94℃3 min; 94℃ 0.5min, 57℃ 0.5min，72℃ 4min或2min，35个循环；72℃延伸10min；

PCR产物与pPIC9K空质粒分别经Xho I和Xba I双酶切后连接，转化大肠杆菌JM109, 涂布于含25μg/mL 的氨苄抗性的大肠杆菌培养基2×YT平板上, 16 h后, 挑选阳性克隆即为重组的pPIC9K-36KDaa -HCA质粒； 

（2）重组质粒的转化

重组的pPIC9K-36KDaa-HCA质粒以Bgl II酶切线性化后，用浓度为1μg/μL灭菌去离子水溶解，取5uL溶解液与80μL GS115感受态酵母菌混合进行电转化，转化后涂于酵母培养基MD平板，挑取阳性克隆接种于含有G418质量浓度分别为0.25、0.50、0.75和1mg / mL的YPD平板上，筛选出耐受高浓度G418的转化子；

（3）培养

将筛选的转化子接种到10mlYPG培养基过夜，以10%的接种量转接到酵母发酵BSM无机培养基中，摇瓶30℃、旋转培养36～52 h，加入甲醇诱导，甲醇终浓度在0.5%～1.0%，80～100小时后停止发酵, 培养液离心后取上清，上清即含有目的蛋白。

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