CN102180973B - 靶向多功能防栓融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的靶向多功能防栓融合蛋白，还涉及编码该融合蛋白的基因、含有该基因的重组表达载体、含有该重组表达载体的转化体以及制备该融合蛋白的方法；本发明的融合蛋白将人源抗菌肽LL-37、水蛭肽Hirudin-12、AAP肽、RGD肽和人凝血因子Xa识别位点进行合理拼接，使靶向成分、抗菌成分、抗凝血酶成分和抗血小板聚集成分之间作用互补且协同增效，可以很好地在血栓部位发挥靶向抗炎和抗凝活性，还能同时修复血管内皮细胞，可从多个途径共同抑制血栓的形成及发展，可用于制备预防和治疗血栓性疾病的药物。

Description

靶向多功能防栓融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种融合蛋白，特别涉及一种靶向多功能防栓融合蛋白，还涉及利用基因工程技术制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在医药方面的应用。

背景技术

近年来，动脉粥样硬化、深静脉血栓等心脑血管血栓性疾病的发病率逐年上升，严重危害人类健康。由于血栓形成是这类疾病的重要致病因素，因此，预防和治疗这类疾病的核心就是抗血栓，包括抑制血栓形成和溶栓等。目前，临床上应用的抗血栓药物不同程度地存在组织特异性差、不良反应多等缺点，容易导致临床并发症的发生，加重患者病情甚至导致患者死亡。因此，提高抗血栓药物的组织特异性和血栓靶向性，使药物选择性地作用于血栓部位，减少药物的不良反应和临床并发症的发生，成为当前抗血栓药物亟待解决的问题。在抗血栓药物研究领域，要开发出一个全新的药物是非常困难的，目前的研究热点主要集中在对现有药物的改造和几种药物的优势组合方面。部分抗凝血、抗血小板聚集、溶栓等活性成分之间可能存在互补和协同增效作用，利用融合蛋白技术将其进行组合连接，所得融合蛋白可能较各成分单独或联合应用具有更好的复合活性或能够显著降低毒副作用，这已成为抗血栓药物发展的一个新方向。但长期以来，抗血栓研究多局限于溶血、抗凝血机制与血栓形成的研究，对于炎症、血管内皮细胞与血栓病理过程的关系探讨较少。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种靶向多功能防栓融合蛋白，优选靶向成分、抗菌成分、抗凝血酶成分、抗血小板聚集成分进行组合拼接，使这些成分之间作用互补且协同增效，可以很好地在血栓部位发挥靶向抗炎和抗凝活性，还能同时修复血管内皮细胞，从多个途径共同抑制血栓的形成及发展。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

靶向多功能防栓融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

该融合蛋白主要包括以下4种活性成分：人源抗菌肽LL-37、水蛭肽Hirudin-12、AAP肽（Agkistrodon acutus peptide）和RGD肽；各成分的连接方式如图1所示，人源抗菌肽LL-37的C末端与水蛭肽Hirudin-12的N末端通过人凝血因子Xa（FXa）识别位点相连，水蛭肽Hirudin-12的C末端与AAP肽的N末端直接相连，AAP肽的C末端与RGD肽的N末端通过亮氨酸（Leu）相连，RGD肽的C末端添加色氨酸（Trp）。

人源抗菌肽LL-37是人体内唯一的双亲性α螺旋结构的抗菌肽，具有广谱抗菌活性，以及调节凝血功能和炎症反应、增强免疫等多重生物学效应。

水蛭肽Hirudin-12（即水蛭素C端12肽）是水蛭素具有抗凝血酶功能的最小结构片段，能与纤维蛋白原竞争性地结合凝血酶，抑制凝血酶的活性，阻断纤维蛋白形成，效果明显优于肝素且无肝素诱导的血小板减少症，但出血副作用较强。当水蛭肽Hirudin-12的N末端被封闭时，其抗凝血酶活性丧失。

FXa识别位点能够被FXa特异地识别并切除其下游片段，而FXa在血栓部位的活性显著高于其它部位，在水蛭肽Hirudin-12的N末端添加FXa识别位点，则在融合蛋白到达血栓部位前，水蛭肽Hirudin-12的N末端被封闭，无抗凝血酶活性，可避免全身出血副作用的发生；在融合蛋白到达血栓部位后，水蛭肽Hirudin-12的N末端因FXa切除而开放，发挥高效抗凝血酶活性，可达到靶向抗凝血的目的。此外，水蛭肽Hirudin-12的释放量受血栓部位FXa数量和活性的控制，可以实现融合蛋白作用强度的自我调节。

AAP肽是从黄山尖吻蝮蛇蛇毒中提取出的一种具有抗凝血活性的三肽（Pyr-Asn-Trp），能够延长小鼠的凝血时间且不增加其出血时间，对由二磷酸腺苷引起的血小板聚集有显著的抗性。文献报道，在AAP肽的C末端添加疏水性越强的氨基酸，其抗血小板聚集的活性越强。

血小板表面活化的GPIIb/IIIa受体特异性识别纤维蛋白原上的RGD序列（Arg-Gly-Asp）而与纤维蛋白原结合，是血小板聚集和血栓形成的最后共同通路。人工合成的RGD肽及其类似物可以竞争性地抑制血小板与纤维蛋白原的结合，从而抑制血小板的聚集。文献报道，与RGD序列相连的第4位氨基酸对其活性影响较大，以疏水性氨基酸为佳，疏水性越强，其抑制血小板与纤维蛋白原结合的能力越强。

本发明将靶向成分（FXa识别位点）、抗炎成分（人源抗菌肽LL-37）、抗凝血酶成分（水蛭肽Hirudin-12）和抗血小板聚集成分（AAP肽-亮氨酸+RGD肽-色氨酸）进行组合拼接，所得融合蛋白经实验证实可以很好地在血栓部位发挥靶向抗炎和抗凝活性，还能同时修复血管内皮细胞，可从多个途径共同抑制血栓的形成及发展。

本发明的目的之二在于提供一种利用基因工程技术制备所述靶向多功能防栓融合蛋白的方法，制备方法简便，产物易纯化。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、编码所述靶向多功能防栓融合蛋白的基因。

根据靶向多功能防栓融合蛋白的氨基酸序列和基因工程宿主细胞的密码子偏好性，本领域技术人员可以容易地确定编码靶向多功能防栓融合蛋白的基因序列。

在本发明中，为了便于靶向多功能防栓融合蛋白的分离纯化，优选在融合蛋白的N末端添加组氨酸标签（6×His-Tag）；同时，为了便于在融合蛋白纯化后去除添加的组氨酸标签，优选在融合蛋白和组氨酸标签之间引入肠激酶（EK）酶切位点。此外，本发明优选采用毕赤酵母表达系统制备靶向多功能防栓融合蛋白。因此，根据上述设计方案和毕赤酵母的密码子偏好性，本发明中编码靶向多功能防栓融合蛋白的基因序列优选如SEQ ID NO.2所示。

2．包含靶向多功能防栓融合蛋白编码基因的重组表达载体。

采用本领域常规技术手段，将编码靶向多功能防栓融合蛋白的基因序列插入表达载体的多克隆位点之间，可以构建靶向多功能防栓融合蛋白基因重组表达载体。

在本发明中，所述表达载体优选毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K。

3．包含靶向多功能防栓融合蛋白基因重组表达载体的转化体。

采用本领域常规技术手段，将靶向多功能防栓融合蛋白基因重组表达载体转入宿主细胞中，可以获得转化体即靶向多功能防栓融合蛋白基因工程细胞。

在本发明中，所述宿主细胞优选毕赤酵母GS115。

4．靶向多功能防栓融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

a．融合蛋白LHAD基因的合成：采用重叠延伸PCR（SOE PCR）法合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白LHAD基因，并根据毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点特征，在基因两端分别添加EcoRI和NotI酶切位点；

b．融合蛋白LHAD基因重组表达载体的构建：将步骤a所得两端分别添加有EcoRI和NotI酶切位点的融合蛋白LHAD基因用EcoRI和NotI双酶切，再与同样经EcoRI和NotI双酶切的表达载体pPIC9K连接，获得融合蛋白LHAD基因重组表达载体；

c．融合蛋白LHAD基因工程菌的构建：将步骤b所得融合蛋白LHAD基因重组表达载体用SalI酶切使线性化，再电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞，用含有不同浓度G418的YPD固体培养基进行抗性筛选，MD和MM固体培养基进行表型筛选，获得融合蛋白LHAD基因工程菌；

d．融合蛋白LHAD的诱导表达与纯化：将步骤c所得融合蛋白LHAD基因工程菌用甲醇进行诱导表达，表达产物用镍柱亲和层析纯化，获得融合蛋白LHAD；

e．靶向多功能防栓融合蛋白的制备：将步骤d所得融合蛋白LHAD用肠激酶酶切去除N末端的组氨酸标签和EK酶切位点，即得靶向多功能防栓融合蛋白。

进一步，步骤a具体包括以下步骤：

a1．合成以下6条PCR引物：LS-1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；LR-1，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；LS-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；LR-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；LS-3，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；LR-3，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

a2．三轮PCR重叠延伸合成融合蛋白基因：第一轮PCR，分别以引物LS-1和LR-1、LS-2和LR-2、LS-3和LR-3为上下游引物进行PCR扩增，获得基因片段L1、L2和L3；第二轮PCR，以基因片段L1和L2为模板，以引物LS-1与LR-2为上下游引物进行PCR扩增，获得基因片段L4；第三轮PCR，以基因片段L4和L3为模板，以引物LS-1与LR-3为上下游引物进行PCR扩增，即得两端分别添加有EcoRI和NotI酶切位点的融合蛋白LHAD基因。

本发明的目的之三在于提供所述靶向多功能防栓融合蛋白在制药方面的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

靶向多功能防栓融合蛋白在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用。

研究结果显示，本发明的靶向多功能防栓融合蛋白可以很好地在血栓部位发挥靶向抗炎和抗凝活性，还能同时修复血管内皮细胞，可从多个途径共同抑制血栓的形成及发展。因此，有效量的靶向多功能防栓融合蛋白可以单独或者与其它生物活性物质组成复方，制备预防和治疗血栓性疾病的药物。

本发明的有益效果在于：本发明将人源抗菌肽LL-37、水蛭肽Hirudin-12、AAP肽、RGD肽和FXa识别位点进行合理拼接，使靶向成分、抗菌成分、抗凝血酶成分和抗血小板聚集成分之间作用互补且协同增效，所得融合蛋白经实验证实可以很好地在血栓部位发挥靶向抗炎和抗凝活性，还能同时修复血管内皮细胞，可从多个途径共同抑制血栓的形成及发展；本发明利用基因工程技术制备上述融合蛋白，方法简便，产物易纯化；本发明的融合蛋白可用于制备预防和治疗血栓性疾病的药物，能够为血栓性疾病的预防和治疗提供更多高效、安全的备选药物，满足临床的多方面需求。

附图说明

图1为靶向多功能防栓融合蛋白的结构示意图。

图2为SOE PCR法合成融合蛋白LHAD基因的流程图。

图3为融合蛋白LHAD基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中1和2为融合蛋白LHAD基因，M为DNA分子量标准。

图4为融合蛋白LHAD基因工程菌的PCR鉴定图，其中1~4为引物α-S/AOX1-R扩增，5~9为引物LS-1/LR-3扩增，M为DNA分子量标准。

图5为融合蛋白LHAD基因工程菌诱导表达产物的SDS-PAGE图，其中1为未诱导对照，2~4分别为诱导表达72小时、84小时和96小时的产物，M为蛋白质分子量标准。

图6为融合蛋白LHAD的Western Blot鉴定图，其中1为未诱导对照，2为未纯化的诱导表达产物，3为纯化的融合蛋白LHAD溶液，M为蛋白质分子量标准。

图7为抑菌试验结果，其中LHAD为融合蛋白LHAD，EK为经EK完全酶切的融合蛋白LHAD即靶向多功能防栓融合蛋白，FXa为经EK和FXa完全酶切的融合蛋白LHAD，Amp为氨苄青霉素，H₂O为无菌水，buffer为缓冲液。

图8为抗血小板聚集活性测定结果，其中PS为生理盐水对照，EK为经EK完全酶切的融合蛋白LHAD即靶向多功能防栓融合蛋白，FXa为经EK和FXa完全酶切的融合蛋白LHAD。

图9为PT、APPT测定结果，其中EK为经EK完全酶切的融合蛋白LHAD即靶向多功能防栓融合蛋白，PFXa为经EK完全酶切和FXa部分酶切的融合蛋白LHAD，FXa经EK和FXa完全酶切的融合蛋白LHAD，HV为天然水蛭素对照。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、靶向多功能防栓融合蛋白的制备

1、融合蛋白LHAD基因的合成

（1）融合蛋白LHAD基因及其PCR引物设计

靶向多功能防栓融合蛋白的结构示意图如图1所示，人源抗菌肽LL-37的C末端与水蛭肽Hirudin-12的N末端通过FXa识别位点（Ile-Glu-Gly-Arg）相连，水蛭肽Hirudin-12的C末端与AAP肽的N末端直接相连，AAP肽的C末端与RGD肽的N末端通过亮氨酸（Leu）相连，RGD肽的C末端添加色氨酸（Trp）。在采用基因工程技术制备靶向多功能防栓融合蛋白时，本发明设计在靶向多功能防栓融合蛋白的N末端添加6×His-Tag以便于目标蛋白的分离纯化，同时，设计在6×His-Tag和靶向多功能防栓融合蛋白之间进一步引入EK酶切位点（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）以便在目标蛋白纯化后通过EK酶切去除6×His-Tag。本发明中，将添加了6×His-Tag和EK酶切位点的靶向多功能防栓融合蛋白命名为融合蛋白LHAD。

本发明优选采用毕赤酵母表达系统制备靶向多功能防栓融合蛋白。因此，根据上述融合蛋白LHAD设计方案和毕赤酵母的密码子偏好性，本发明优选融合蛋白LHAD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。同时，本发明的表达载体优选毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K。为了便于构建融合蛋白LHAD基因重组表达载体，依照载体pPIC9K的多克隆位点特征，本发明优选在融合蛋白LHAD基因的两端分别添加EcoRI和NotI酶切位点。为此，本发明设计了6条PCR引物，以便于采用SOE PCR法合成两端分别添加有EcoRI和NotI酶切位点的融合蛋白LHAD基因。6条PCR引物均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。其中，LS-1的5’端下划线部分为EcoRI酶切位点，LR-3的5’端下划线部分为NotI酶切位点。

LS-1：5'-cggaattccatcatcatcatcatcatgatgatgatgataagttgttgggtga -3'（SEQ ID NO.3）；

LR-1：5'-cttaccaatcttttccttagactttctaaaaaaatcacccaacaactta-3'（SEQ ID NO.4）；

LS-2：5'-gaaaagattggtaaggaatttaagagaattgttcaaagaattaaggattttttgaga-3'（SEQ ID NO.5）；

LR-2：5'-aatctctaccttcaatagattcagttcttggaaccaagtttctcaaaaaatcctt-3'（SEQ ID NO.6）；

LS-3：5'-ctattgaaggtagagattttgaaccaattccagaagatgcttacgatgaatac-3'（SEQ ID NO.7）；

LR-3：5'-taagcggccgcttaccaatcacctctcaaccagttgtattcatcgtaagc-3'（SEQ ID NO.8）。

（2）SOE PCR法合成融合蛋白LHAD基因

采用上述6条引物，通过三轮PCR重叠延伸合成融合蛋白LHAD基因，流程图如图2所示。

第一轮PCR：分别以引物LS-1和LR-1、LS-2和LR-2、LS-3和LR-3为上下游引物进行PCR扩增，获得基因片段L1、L2和L3；扩增循环参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。

第二轮PCR：以第一轮PCR所得基因片段L1和L2为模板，以引物LS-1与LR-2为上下游引物进行PCR扩增，获得基因片段L4；扩增循环参数与第一轮PCR相同。

第三轮PCR：以第二轮PCR所得基因片段L4和第一轮PCR所得基因片段L3为模板，以引物LS-1与LR-3为上下游引物进行PCR扩增，即得两端分别添加有EcoRI和NotI酶切位点的融合蛋白LHAD基因；扩增循环参数与第一轮PCR相同。

将第三轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图3所示，可见在约238 bp的位置出现特异性DNA条带，与融合蛋白LHAD基因的预期大小相符。

2、融合蛋白LHAD基因重组表达载体的构建

将两端分别添加有EcoRI和NotI酶切位点的融合蛋白LHAD基因用EcoRI和NotI双酶切，再与同样经EcoRI和NotI双酶切的表达载体pPIC9K连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，用表达载体引物α-S/AOX1-R［α-S：5'-tactattgccagca-ttgctgc-3’（SEQ ID NO.9）；AOX1-R：5'-gcaaatggcattctgacatcc-3’（SEQ ID NO.10）］进行菌落PCR检测，所得阳性重组子委托英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序验证，即得融合蛋白LHAD基因重组表达载体。

3、融合蛋白LHAD基因工程菌的构建

将融合蛋白LHAD基因重组表达载体用SalI酶切使线性化。取线性化的融合蛋白LHAD基因重组表达载体10μL与毕赤酵母GS115感受态细胞90μL混匀，冰浴5分钟；再转移至预冷的0.1 cm型电转化杯中进行电击，电压1.5 KV，电阻400 Ω，电容25μF。电击完成后，迅速加入预冷的浓度为1 M的山梨醇溶液0.9 mL，轻轻混匀，再每次取300μL均匀涂于MD固体培养基上，正面放置至表面半干，再30℃倒置培养。将MD固体培养基上长出的菌落分别接种至含有不同浓度（0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2 mg/mL）G418的YPD固体培养基上，并同时分别接种至MD和MM固体培养基上，30℃倒置培养。挑取在G418-YPD固体培养基上正常生长，而在MD和MM固体培养基上生长差别不大的高抗G418的Mut⁺转化子单菌落，用无菌水10μL重悬后，浸入液氮中冷冻5分钟，再100℃水浴加热3分钟，重复冷冻-热处理操作2次以裂解酵母细胞，所得溶液作为PCR模板，分别用引物α-S/AOX1-R和引物LS-1/LR-3进行菌落PCR检测，结果如图4所示，可见在约238 bp的位置出现特异性DNA条带，表明所得高抗G418的Mut⁺转化子的质粒中含有融合蛋白LHAD基因，融合蛋白LHAD基因工程菌构建成功。

4、融合蛋白LHAD的诱导表达与纯化

挑取PCR检测正确的高抗G418的Mut⁺转化子（即融合蛋白LHAD基因工程菌）单菌落，接种至含有BMGY液体培养基10 mL的50 mL三角瓶中，250rpm、30℃培养16小时；再4000 rpm离心5分钟，弃上清，用MM液体培养基（约20 mL）重悬菌体至OD600≈1.0，置250 mL三角瓶中，250 rpm、30℃分别培养72小时、84小时、96小时，每24小时向培养基中添加无菌甲醇至最终体积分数为1.0%；再13000 rpm离心5分钟，收集上清，超滤离心（浓缩、脱盐并更换缓冲液），所得超滤产物用HiTrap™ prepacked columns（Pharmacia公司）进行亲和层析纯化，即得纯化的融合蛋白LHAD溶液，用BCA蛋白定量试剂盒（北京天泰生物公司）测定其浓度为0.14 g/L。

分别取培养72小时、84小时、96小时的菌液1 mL，13000 rpm离心5分钟，收集上清进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色30分钟，过夜脱色后观察。结果如图5所示，可见在约9 KD的位置出现特异性蛋白条带，与融合蛋白LHAD的预期大小相符，表明融合蛋白LHAD表达成功；同时发现，随着诱导时间的延长，融合蛋白LHAD的表达量降低，其原因可能在于菌体死亡释放了体内酶，从而导致了融合蛋白LHAD的降解，故优选诱导表达时间为72小时。

取纯化的融合蛋白LHAD溶液进行SDS-PAGE，电泳完毕后电转移至PVDF膜上，封闭，PBST洗膜，加入一抗(鼠抗人6×His Tag抗体)，4℃孵育1小时，PBST洗膜，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗（羊抗鼠抗体），4℃孵育1小时，PBST洗膜，最后D-AB显色液显色，进行Western Blot鉴定。结果如图6所示，可见大小约9 KD的融合蛋白LHAD条带，且纯化的融合蛋白LHAD溶液较未纯化的诱导表达产物中融合蛋白LHAD的浓度明显升高。

5、靶向多功能防栓融合蛋白的制备

将纯化的融合蛋白LHAD溶液40μL、EK 0.5μL、10×buffer 5.0μL和ddH₂O 4.5μL混匀，23℃水浴酶切30分钟，即得靶向多功能防栓融合蛋白。

二、靶向多功能防栓融合蛋白的活性检测

根据靶向多功能防栓融合蛋白所含组分的基础功能，分别采用抑菌试验检测人源抗菌肽LL-37的抗菌活性；抗凝血酶活性及比活性试验检测水蛭肽Hirudin-12的抗凝血酶活性；抗血小板聚集试验检测AAP肽和RGD肽的抗血小板聚集活性；再采用血浆凝血酶原时间（PT）、部分凝血激酶时间（APTT）试验检测靶向多功能防栓融合蛋白的整体活性。

1、抗菌活性检测

分别挑取-80℃保存的E.coli菌株DH5α（作为革兰氏阴性菌的代表）和B.subtilis（作为革兰氏阳性菌的代表）的菌液，在LB固体培养基上划线，复苏，37℃培养16小时；再分别挑取DH5α和B.subtilis单菌落接种于10 mL LB液体培养基中，250 rpm、37℃活化培养16小时；再分别吸取200μL DH5α和B.subtilis活化培养菌液加至20 mL LB液体培养基中，250 rpm、37℃扩大培养至OD600为0.4；再分别吸取200μL DH5α和B.subtilis扩大培养菌液加至融化后冷却至50℃的LB固体培养基中，迅速混匀，倒板；在所得LB平板中形成多个小孔，每孔加入10μL样品，样品分别为融合蛋白LHAD、经EK完全酶切的融合蛋白LHAD即靶向多功能防栓融合蛋白、经EK和FXa完全酶切的融合蛋白LHAD（将经EK完全酶切的融合蛋白LHAD 40μL、FXa 2.5μL、10×buffer 5.0μL和ddH₂O 2.5μL混匀，23 ℃水浴酶切30分钟，即得），以氨苄青霉素（Amp）、无菌水和缓冲液作为对照；37℃正放培养，观察抑菌圈。

结果如图7所示，可见靶向多功能防栓融合蛋白具有良好的抑菌活性，说明LL-37的抑菌活性并没有因制成融合蛋白而丧失，同时间接说明了靶向多功能防栓融合蛋白中的LL-37还保留有其本身具有的其它活性，例如调节凝血功能和炎症反应、增强免疫等。

2、抗凝血酶活性检测

将凝血酶分别稀释制成浓度为40、100、200、500、1000 NIH/mL的溶液，在37℃水浴条件下对浓度为0.1 mg/mL的样品进行滴定，样品分别为经EK完全酶切的融合蛋白LHAD即靶向多功能防栓融合蛋白、经EK和FXa完全酶切的融合蛋白LHAD，同时以天然水蛭素为对照，5μL为一个滴定体积即0.1ATU，计算样品的抗凝血酶活性及比活性。

结果如表1所示，可见靶向多功能防栓融合蛋白因水蛭肽的N末端被封闭，抗凝血酶活性丧失，而当靶向多功能防栓融合蛋白被FXa完全酶切使水蛭肽的N末端被释放后，抗凝血酶活性恢复，且活性强于天然水蛭素。

表1 抗凝血酶活性检测结果

3、抗血小板聚集活性检测

取健康成年男性静脉血3 mL，按体积比为9∶1加入质量分数为3.8%的枸橼酸钠溶液，700 rpm离心10分钟，收集上清，得富血小板血浆（PRP），剩余部分再4000 rpm离心15分钟，收集上清，得贫血小板血浆（PPP）；用PPP稀释PRP至血小板数量为25×10⁴~30×10⁴/μL，作为PRP试剂；取PRP试剂200μL，加入终浓度分别为0.1、1.0、5.0、10.0、50.0μg/mL的样品，样品分别为经EK完全酶切的融合蛋白LHAD即靶向多功能防栓融合蛋白、经EK和FXa完全酶切的融合蛋白LHAD，同时以生理盐水为对照，室温静置15分钟，再加入预热至37℃的浓度为200μmol/L的二磷酸腺苷5μL，用血小板聚集仪测定聚集率。

结果如图8所示，靶向多功能防栓融合蛋白具有良好的抗血小板聚集活性，但当其被FXa完全酶切后，抗血小板聚集活性进一步增强，其原因可能在于靶向多功能防栓融合蛋白的长度较长，其空间结构阻碍了AAP肽和RGD肽的抗血小板聚集活性的发挥。

4、PT、APTT测定

取健康成年男性静脉血10 mL，按体积比为9∶1加入质量分数为3.8%的枸橼酸钠溶液，4000 rpm离心15分钟，收集上清，得贫血小板血浆（PPP）；用PPP稀释样品至终浓度分别为0.1、1.0、5.0、10.0、50.0μg/mL，样品分别为经EK完全酶切的融合蛋白LHAD即靶向多功能防栓融合蛋白、经EK完全酶切和FXa部分酶切的融合蛋白LHAD（将经EK完全酶切的融合蛋白LHAD 40μL、FXa 0.25μL、10×buffer 5.0μL和ddH₂O 4.75μL混匀，23 ℃水浴酶切30分钟，即得）、以及经EK和FXa完全酶切的融合蛋白LHAD，同时以天然水蛭素为对照，室温静置15分钟，用多功能智能血液凝集仪分别测定PT、APPT。

结果如图9所示，靶向多功能防栓融合蛋白随着FXa酶切程度的加大，抗凝活性逐渐增强，经FXa完全酶切后抗凝活性达到最强。本实验可以简单模拟向血液中输入靶向多功能防栓融合蛋白后的体内凝血过程：起初，抑制凝血酶活性以浓度较高的靶向多功能防栓融合蛋白为主；之后随着FXa含量增加，靶向多功能防栓融合蛋白因被逐渐酶切浓度减小，水蛭肽的N末端被逐渐释放而成为抑制凝血酶活性的主力；当靶向多功能防栓融合蛋白被FXa完全酶切，即水蛭肽的N末端被完全释放后，抑制凝血酶活性达到最大值，此时其PT、APPT略大于天然水蛭素，原因可能在于LL-37参与了凝血过程并起到了促进作用。

实验与临床研究表明，炎症是血栓性疾病的重要组成部分，炎症反应与凝血系统激活之间的相互促进是导致局部血栓形成的重要原因，多种炎症介质不仅直接损伤内皮细胞促进凝血反应，同时还能诱导凝血系统表达炎症因子，从而扩大炎症反应和促进凝血过程；此外，内皮细胞损伤是多种疾病损害的早期病变及基本动因，且其处于炎症反应和凝血反应的中心位置，当其受损时，不仅表达促炎因子参与炎性反应，同时其表面抗凝-促凝平衡被打破，导致局部血栓形成。因此，只有同时进行抗炎、抗凝和保护血管内皮细胞的综合治疗，才能打断炎性反应-凝血反应的恶性循环。血小板作为一个炎症细胞，被激活后会释放出大量细胞因子，在血栓形成和炎症反应中均发挥着重要作用。因此，血小板也可以作为炎症治疗的靶点，抗炎药物在抗炎的同时也有可能发挥抗血小板作用，而对血小板活化具有抑制作用的药物，也可能具有一定的抗炎活性。

综合上述实验结果，可以得出如下结论：本发明的靶向多功能防栓融合蛋白可以很好地在血栓部位发挥靶向抗炎和抗凝作用，还能同时修复血管内皮细胞，可以从多个途径共同抑制血栓的形成及发展。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 重庆大学

<120> 靶向多功能防栓融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 10

<210> 1

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶向多功能防栓融合蛋白

<400> 1

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys

1 5 10 15

Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn

20 25 30

Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser Ile Glu Gly Arg Asp Phe Glu Pro

35 40 45

Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Tyr Asn Trp Leu Arg Gly Asp

50 55 60

Trp

<210> 2

<211> 216

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码靶向多功能防栓融合蛋白的基因

<400> 2

catcatcatc atcatcatga tgatgatgat aagttgttgg gtgatttttt tagaaagtct 60

aaggaaaaga ttggtaagga atttaagaga attgttcaaa gaattaagga ttttttgaga 120

aacttggttc caagaactga atctattgaa ggtagagatt ttgaaccaat tccagaagat 180

gcttacgatg aatacaactg gttgagaggt gattgg 216

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物LS-1

<400> 3

cggaattcca tcatcatcat catcatgatg atgatgataa gttgttgggt ga 52

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物LR-1

<400> 4

cttaccaatc ttttccttag actttctaaa aaaatcaccc aacaactta 49

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物LS-2

<400> 5

gaaaagattg gtaaggaatt taagagaatt gttcaaagaa ttaaggattt tttgaga 57

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物LR-2

<400> 6

aatctctacc ttcaatagat tcagttcttg gaaccaagtt tctcaaaaaa tcctt 55

<210> 7

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物LS-3

<400> 7

ctattgaagg tagagatttt gaaccaattc cagaagatgc ttacgatgaa tac 53

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物LR-3

<400> 8

taagcggccg cttaccaatc acctctcaac cagttgtatt catcgtaagc 50

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物α-S

<400> 9

tactattgcc agcattgctg c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物AOX1-R

<400> 10

gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims (10)

1.靶向多功能防栓融合蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述靶向多功能防栓融合蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：以毕赤酵母表达载体pPIC9K为骨架。

6.包含权利要求4所述重组表达载体的转化体。

7.根据权利要求6所述的转化体，其特征在于：以毕赤酵母GS115为宿主细胞。

8.权利要求1所述靶向多功能防栓融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a．融合蛋白编码基因的扩增：采用重叠延伸PCR法扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的融合蛋白编码基因并在基因两端分别添加EcoRI和NotI酶切位点；

b．含有融合蛋白编码基因的重组表达载体的构建：将步骤a所得两端分别添加有EcoRI和NotI酶切位点的融合蛋白编码基因用EcoRI和NotI双酶切，再与同样经EcoRI和NotI双酶切的表达载体pPIC9K连接，获得含有融合蛋白编码基因的重组表达载体；

c．含有融合蛋白编码基因的工程菌的构建：将步骤b所得含有融合蛋白编码基因的重组表达载体用SalI酶切使线性化，再电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞，用含有不同浓度G418的YPD固体培养基进行抗性筛选，MD和MM固体培养基进行表型筛选，获得含有融合蛋白编码基因的工程菌；

d．融合蛋白的诱导表达与纯化：将步骤c所得含有融合蛋白编码基因的工程菌用甲醇进行诱导表达，表达产物用镍柱亲和层析纯化，获得融合蛋白；

e．靶向多功能防栓融合蛋白的制备：将步骤d所得融合蛋白用肠激酶酶切，即得权利要求1所述靶向多功能防栓融合蛋白。

9.根据权利要求8所述靶向多功能防栓融合蛋白的制备方法，其特征在于：步骤a具体包括以下步骤：

a1．合成以下6条PCR引物：LS-1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；LR-1，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；LS-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；LR-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；LS-3，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；LR-3，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

a2．三轮PCR重叠延伸扩增融合蛋白编码基因：第一轮PCR，分别以引物LS-1和LR-1、LS-2和LR-2、LS-3和LR-3为上下游引物进行PCR扩增，获得基因片段L1、L2和L3；第二轮PCR，以基因片段L1和L2的混合物为模板，以引物LS-1与LR-2为上下游引物进行PCR扩增，获得基因片段L4；第三轮PCR，以基因片段L4和L3的混合物为模板，以引物LS-1与LR-3为上下游引物进行PCR扩增，即得两端分别添加有EcoRI和NotI酶切位点的融合蛋白编码基因。

10.权利要求1所述靶向多功能防栓融合蛋白在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用。

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