CN100584860C - 一种改建的抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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本发明公开了一种改建的抗菌肽及其制备方法和应用，该抗菌肽为序列表中SEQ ID NO：1所示的改建的37肽抗菌肽rLL-37-1，该改建的抗菌肽能够增强LL-37杀菌力，降低溶血等副反应，并且易制备。

Description

一种改建的抗菌肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蛋白质信息及基因重组领域，特别是涉及一种改建的抗菌肽及其制备方法和用途。
背景技术
抗菌肽(Antibacterial Peptide)(又称杀菌肽、肽抗生素)是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，为一类广泛存在于许多生物中具有内源性杀菌活性的多肽，是机体天然免疫(Innate Immunity)的重要组成部分。1980年首先由Boman等学者从惜古比天蚕(H.cecropia)中分离得到，后来又陆续从鼠、猴等种属中分离到了结构与功能非常相似的抗菌肽，共计约百余种，并已证实它们对格兰氏阳性、阴性细菌、真菌等具有广谱杀菌力。
到目前为止，人体内抗菌肽分为防御素(Defensin)、组织蛋白酶抑制素(Cathelicidin)和富组蛋白(Histatin)三类，其中抗菌肽hCAP-18/LL-37为Cathelicidin家族中唯一存在于人体内的抗菌肽。编码hCAP-18/LL-37的基因位于3号染色体，有4个外显子，最早由Birgitta Agerberth等学者从人类骨髓cDNA文库中获得(命名为FALL-39)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，92(1)：195-199)。研究发现hCAP-18(human cationic antimicrobial protein 18)为170个氨基酸组成的多肽，本身无抗菌活性，但当hCAP-18被中性粒细胞等细胞释放到胞外，在蛋白酶III的水解作用下，在丙氨酸(Ala 103)和亮氨酸(Leu 104)间进行酶切，则hCAP-18多肽的C端104-140位肽链被切下，形成长为37个氨基酸残基的多肽LL-37(又称hCAP-18104-140)，LL-37肽链的氨基酸残基序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，为分子量4.5kDa的阳离子两性分子a-螺旋抗菌肽，具备抗细菌、真菌、病毒、原虫等广谱杀菌力。
研究发现LL-37可在中性粒细胞、睾丸、阴道、表皮细胞和角质细胞中表达，并在体表、口腔、呼吸道、消化道、生殖系统中发挥重要保护作用，特别是在新生儿的天然免疫中起重要作用。LL-37的主要生物学功能为：①抗微生物活性：对格兰氏阳性、阴性细菌、真菌、原虫等微生物有广谱抗微生物活性；②抗内毒素作用：与内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)结合，促进LPS被吞噬、降解，减轻LPS介导的全身损害效应；③趋化活性：通过FPRL1(Formyl peptide receptor-like 1)来诱导趋化中性粒细胞和单核细胞，通过Gi蛋白磷脂酶C信号途径(Gi protein-phosphlipase C signaling pathway)来诱导趋化肥大细胞，从而增强局部炎症反应，抵制细菌的播散，减轻细菌等病原体对机体的损害；④肿瘤细胞的抑制作用：对白血病等肿瘤细胞株具有一定的抑制、杀伤作用。
LL-37为两亲性螺旋结构(Amphipathic Helix)，即亲水氨基酸和疏水氨基酸分别位于螺旋的两侧，形成亲水区和疏水区，并且LL-37的N端富含碱性氨基酸残基，带有较强正电荷，C端含疏水区，它能直接插入细胞膜脂质双分子层，形成离子通道，通过“打洞”方式，造成细菌等病原体细胞膜结构的破坏，也可破坏部分类型肿瘤的细胞膜，LL-37的生物学功能的特点决定了它既不容易导致耐药菌株的产生，又具有抗广谱微生物的作用(正常人体细胞由于细胞膜拥有胆固醇保护及完善的细胞骨架系统，因此不会被抗菌肽破坏)。
Zhao C等学者从恒河猴中分离出与人LL-37高度同源性的抗菌肽RL-37(Antimicrob Agents Chemother，2001，45(10)：2695)，其净正电荷为+8，而LL-37为+5.8，RL-37的抗菌活性要高于LL-37，LL-37的抗菌力也较其它种属(猪、鼠等)来源的大多数同源抗菌肽的杀菌力弱。以往结构-活性关系(Structure-Activity Relationship，SAR)研究显示所有α-螺旋抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱与肽链中所带正电荷、疏水性氨基酸数目密切相关。通过分子改造增加LL-37肽链中正电荷的氨基酸和碱性氨基酸数目，而不改变其α-螺旋构象来提高LL-37抗菌活性是一种较好的途径。Nagaoka I等学者将LL-37的带负电荷的氨基酸残基全部进行替换，将LL-37的净电荷提高至+11，则杀菌力明显增强，并在175mmol/L NaCL的条件下保持相同的杀菌力，但失去了与LPS结合的能力，并易导致溶血的发生(Clin Diagn Lab Immunol，2002，9(5)：972)；Kuwahara-Arai K等学者通过增加LL-37肽链中正电性氨基酸和疏水氨基酸的数量来提高杀菌力和拮抗内毒素的能力，但对机体细胞产生剂量效应关系的细胞毒作用(Inflamm Res，2005，54(2)：66)。
在维持LL-37的α-螺旋空间构象、两亲性螺旋结构、蛋白质极性(亲水性、疏水性)尽可能不变的基础上，如何通过局部氨基酸的调整，来增强LL-37的杀菌力和LPS结合力，降低溶血等副反应，并且易制备，已成为现在的研究关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种改建的37肽抗菌肽LL-37，其在α-螺旋空间构象、两亲性螺旋结构、蛋白质极性(亲水性、疏水性)尽可能不变的基础上，通过局部氨基酸的调整，来增强LL-37的杀菌力和LPS结合力，降低溶血等副反应，并且易制备。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种改建的抗菌肽的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三在于提供一种改建的抗菌肽的应用。
为实现本发明目的而提供的一种抗菌肽，所述抗菌肽为序列表中SEQ IDNO：1所示的改建的37肽抗菌肽rLL-37-1。
为实现本明目的更进一步提供一种改建的抗菌肽的制备方法，所述制备方法为基因工程表达技术进行制备。
所述基因工程表达为原核工程表达菌BL21 Star(DE3)和原核表达载体pET-30a(+)表达。
为实现本发明目的更进一步提供了一种改建的抗菌肽的应用，所述的抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明的抗菌肽，在α-螺旋空间构象、两亲性螺旋结构、蛋白质极性(亲水性、疏水性)尽可能不变的基础上，通过局部氨基酸的调整，来增强LL-37的杀菌力和LPS结合力，降低溶血等副反应，并且易制备。
附图说明
图1A为天然LL-37的空间螺旋结构图；
图1B为天然LL-37的电荷分布图；
图2A为改建rLL-37-1的空间模拟结构图；
图2B为改建rLL-37-1的电荷模拟分布图；
图3A为天然LL-37的平面螺旋图；
图3B为改建rLL-37-1的平面螺旋图；
图4A为天然LL-37电荷图；
图4B为改建rLL-37-1的电荷图；
图5A为rLL-24-1空间模拟结构及电荷分布图；
图5B为rLL-24-1平面螺旋图；
图6A为rLL-18-1的空间模拟结构及电荷分布图；
图6B为rLL-18-1的平面螺旋图；
图7A为rLL-30-1的空间模拟结构及电荷分布图；
图7B为rLL-30-1的平面螺旋图；
图8为直接合成、纯化后rLL-24-1的Tricine-SDS-PAGE鉴定图；
图9为编码rLL-37的DNA基因序列模式图；
图10A为质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1酶切鉴定图；
图10B为质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1结构图；
图11为不同时相点表达融合蛋白质CPM-rLL-37-1的Tricine-SDS-PAGE鉴定图；
图12为用TALON(针对6xHis)对pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1所表达的融合蛋白质CPM-rLL-37-1进行亲和纯化结果图；
图13为以强离子交换柱芯Macro-Prep High S对已进行FXa裂解的CPM-rLL-37-1进行离子交换纯化结果图；
图14为融合肽CPM-rLL-37-1及其FXa裂解、纯化后蛋白质片段的Tricine-SDS-PAGE鉴定图；
图15为杀菌肽动物体内保护测试生化指标关系图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明的人源抗菌肽及其制备用途进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明涉及蛋白质信息工程(蛋白质三维结构分析、理化分析)、基因重组工程，特别是利用原核系统表达经基因改建的人源抗菌肽rLL-37(为含37氨基酸残基多肽)和利用氨基酸合成仪固相化学法合成改建的rLL-37(13-36)(为含24氨基酸残基多肽)、rLL-37(18-32)(为含18氨基酸残基多肽)的制备方法和用途。
实施例一：
如图1A和图1B所示，其中图1A为天然LL-37的空间螺旋结构图，图1B为天然LL-37的电荷分布图。将天然LL-37进行了核磁共振三维结构检测，则可以获得了LL-37的空间结构，得到LL-37中每一个氨基酸残基及其每一个原子在空间的位置，原子间的连接键、角度、长度等数据，可以准确地获得了LL-37的空间螺旋结构和其电荷分布图，在LL-37的结构基础上，将LL-37及其功能活性区进行改建，制备改建后的抗菌肽rLL-37，即rLL-37-1～rLL-37-17，rLL-24-1～rLL-24-8，rLL-18-1～rLL-18-1，rLL-30-1～rLL-30-10。序列表如下：
(1)改建的37肽抗菌肽序列(rLL-37)：
rLL-37-1：
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-2：
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-3：
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-4：
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Asn Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-5：
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-6：
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Asn Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-7：
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Asn Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-8：
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Asn Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-9：
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Asn Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Asn Ser
rLL-37-10：
Leu Leu Gly Lys Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-11：
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Lys Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-12：
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Lys Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-13：
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Lys Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-14：
Leu Leu Gly Lys Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-15：
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Gln Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-37-16：
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Asn Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Gln Ser
rLL-37-17：
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Asn Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Gln Ser
如图2A和图2B所示，其中，图2A为改建rLL-37-1的空间模拟结构图，图2B为改建rLL-37-1的电荷模拟分布图。可见与图1A和图1B比较，rLL-37-1的空间螺旋结构不变，但带正电荷增加。
并且，从图3A和图3B所示，可见改建的rLL-37-1与天然LL-37相比较，两亲性螺旋结构未发生改变。其中，图3A为天然LL-37的平面螺旋图；图3B为改建rLL-37-1的平面螺旋图。
如图4A所示为天然LL-37电荷图；图4B所示为改建rLL-37-1的电荷图；可见等电点由pHi＝11升高到pHi＝12，pH 7.4时的净电荷由5.9升高到7.9，其pHi和净电荷都有升高。
(2)改建的24肽抗菌肽系列(rLL-24)序列：
rLL-24-1：
Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Lys Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr
Glu
rLL-24-2：
Ile Gly Lys Arg Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr
Glu
rLL-24-3：
Ile Gly Lys Lys Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr
Glu
rLL-24-4：
Ile Gly Lys E Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr
Lys
rLL-24-5：
Ile Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Lys Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr
Glu
rLL-24-6：
Ile Gly Lys Lys Gly Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr
Glu
rLL-24-7：
Ile Gly Lys Lys Gly Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Gly Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr
Glu
rLL-24-8：
Ile Gly Lys E Phe Lys E Ile Val Lys Arg Ile Lys Arg Phe Leu Arg Glu Leu Val Arg Pro Leu Arg
其中，如图5A所示为rLL-24-1空间模拟结构及电荷分布图；图5B所示为rLL-24-1平面螺旋图。可见其与图1A、图1B，图2A、图2B比较，其空间螺旋结构和两亲性螺旋结构得以较好的保留。
(3)改建的18肽抗菌肽系列(rLL-18)序列：
rLL-18-1：
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Asn Leu Val
rLL-18-2：
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
其中，如图6A所示为rLL-18-1的空间模拟结构及电荷分布图；如图6B所示为rLL-18-1的平面螺旋图。与图1A、图1B，图2A、图2B相比较，可见其空间螺旋结构和两亲性螺旋结构得以较好的保留，并且两亲性螺旋结构中的疏水区得以加强，增加了杀菌肽的疏水性，增加了与LPS的结合力。
(4)改建的30肽抗菌肽系列(rLL-30)序列：
rLL-30-1：
Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Asn Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Asn Arg Ala Glu Ser
rLL-30-2：
Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Gly Glu Ser
rLL-30-3：
Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Ala Glu Ser
rLL-30-4：
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Val Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Thr Arg Thr Glu Ser
rLL-30-5：
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Val Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-30-6：
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Val Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Thr Arg Gly Glu Ser
rLL-30-7：
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Val Lys Arg Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
rLL-30-8：
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Arg Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Gly Glu Ser
rLL-30-9：
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Arg Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Thr Arg Gly Glu Ser
rLL-30-10：
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Val Lys Arg Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Gly Arg Gly Glu Ser
其中，如图7A所示为rLL-30-1的空间模拟结构及电荷分布图；如图7B所示为rLL-30-1的平面螺旋图。
在本发明实施例中，特别需要说明的是对于rLL-24-1～8；rLL-18-1～2，rLL-30-1～rLL-30-10也是三组改建后的rLL-37，其中rLL-24-1～8为改建13～36共24氨基酸残基多肽的序列；而rLL-18-1～2为改建18～32共18氨基酸残基多肽的序列。
实施例二：
为制备所述改建后的rLL-37肽抗菌肽，本发明还合成了一组带负电荷的存载蛋白质序列(Carrier protein molecule，CPM)，该存载蛋白质序列是根据所需蛋白质应具有的负电荷、高水溶性而设计的，其在Gene Bank上检测，并无相同基因序列。
(1)所述存载蛋白质的基因序列为：
GAA GTT TGG AAC GCA CTT GAT GCA CTG GAG CTG GTA ATCCAA CAA GAG GAG GGT TCT AAT GGT ACT TCT ACT GGA TCC GAGGGC
(2)存载蛋白质的氨基酸序列为：
Glu Val Trp Asn Ala Leu Asp Ala Leu Glu Leu Val Ile Gln Gln Glu Glu GlySer Asn Gly Thr Ser Thr Gly Ser Glu Gly
(3)承载蛋白质的电荷为：pHi＝2.7；pH 7.4时，电荷-6.0
实施例三：
24肽系列抗菌肽及18肽系列抗菌肽的制备：
抗菌肽序列相对较短，虽然带有较强的阳电荷，通过适当提高合成液的pH值至8.35，可适当降低短肽所带的电荷，从而可采用固相化学法直接合成。
(1)rLL-24-1制备：
采用固相化学合成法合成rLL-24-1多肽合成在美国PE公司生产的ABI 431A型多肽合成仪上进行。采用标准Fmoc方案方法，采用精氨酸两次偶联而得到。
首先，选用0.25mmol HMP树脂(羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂，PE公司生产)，按照多肽序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸。
多肽合成后，将合成物在冰浴条件下混合于10ml切割液中，使肽链从树脂上切割下来，同时去除多种保护基团，并将反应后混合物经G4玻砂漏斗过滤以去除树脂，所得液体进行低温浓缩，即为肽抗生素粗制品。
将肽抗生素粗制品用DMSO(二甲基亚砜，Demethyl sulfoxide)溶解，采用Source 25RPC(Pharmacia公司生产)制备柱，以乙氰溶液(含0.1％三氯醋酸(TFA)为流动相，以10％～60％乙氰溶液洗脱，进行高压液相质谱梯度纯化，收集主峰、脱盐、低温冻干，再进行质谱分子量、纯度测定。
所制备的抗菌肽rLL-24-1其rLL-24-1峰面积占所有峰面积的93.75％。收集主峰，经质谱分析，测得分子量为2967.58，
采用与上述相同的固相化学合成法，成功合成了rLL-24-2～8多肽和rLL-18-1～2多肽，它们的纯度约为92.0％～95.2％。
图7为直接合成、纯化后rLL-24-1的Tricine-SDS-PAGE鉴定图，其中，1：蛋白质标记(97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3KD)；2：杀菌肽rLL-24-1。
采用固相化学法直接合成，具有合成效率高，易于纯化，并且不易带入对人体有害的杂质，容易获得高纯度、无污染、无害的抗菌肽。
实施例四：
37肽序列较长，所带的阳电荷更高，由于现阶段仪器合成技术的限制，无法采用固相化学法等方法直接合成，所以采用基因工程表达技术进行制备。
由于真核细胞表达系统(昆虫细胞、人源细胞、酵母细胞等)表达周期长、表达量较低、细胞培养成本高，因此选用原核工程表达菌BL21 Star(DE3)，(该原核菌BL21 Star(DE3)为现有菌株，购自美国Invitrogen公司)和原核表达载体pET-30a(+)(该载体pET-30a(+)购自美国Novagen公司)进行表达。
pET-30a(+)为T7表达系统，含有Sac I、HindIII等酶切位点，易于放入外源目的基因序列，并在IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的诱导下高效表达；而BL21 Star(DE3)因缺少RNA核酸内切酶(RnaseE)，使得细胞内表达目的蛋白的mRNA序列降解较慢，从而有利于抗菌肽的大量表达。
37肽抗菌肽具有较强的阳电荷，对杆菌有直接杀伤作用，因此本发明合成存载蛋白质(CPM)，用于制备所述改建37肽抗菌肽，它亲水性强，并带有负电荷，将CPM通过凝血酶酶切位点与改建的抗菌肽共同以融合肽的形式表达，则融合肽所带电荷低，不会对表达的宿主菌BL21 Star(DE3)产生伤害，当以凝血酶FXa(凝血因子X)把CPM切下后，rLL-37肽则恢复其杀菌力。
基因重组人37肽抗菌肽(rLL-37)的制备方法，即rLL-37-1～17的制备方法：
①DNA序列建立：
以人LL-37的原始cDNA序列为模板，将其中为原核细胞的稀有密码子替换为原核细胞所偏爱的密码子，并以改建的rLL-37的氨基酸序列为标准，对部分碱基密码子进行替换，即进行原核细胞所偏爱密码子的替换，但不改变所编码氨基酸的替换为：CGG7→CGT7、GGC14→GGT14、AGA19→CGC19、GTC21→GTA21、AGA23→CGT23、GAT26→GAC26、CGG29→CGC29、AAT30→AAC30、CCC33→CCA33、AGG34→CGT34；进行氨基酸替换的密码子替换为：GAT4→AAT4，对应氨基酸改变为：Asp4→Asn4；采用DNA合成仪(美国应用生物系统公司3400型DNA合成仪)，直接合成含有：酶切位点、编码承载蛋白(CPM)、编码凝血酶酶切位点、编码rLL-37的DNA基因序列，DNA序列模式如图8所示。
②表达质粒建立：
将DNA序列与pMD19-T Simple Vector(pMD19-T Simple Vector为已有商品载体，购自日本Takara公司)连接，测序鉴定正确的DNA序列可构建表达质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37，将表达质粒电转入感受态BL21 star(DE3)菌，并鉴定。
如图9A和图9B所示，其中，图9A为质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1酶切鉴定图；图9B所示为质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1结构图。
其中，在图9A中，1为DNA标记(15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)；2为重组质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1(从菌体内抽出，含线型、环型、超螺旋3种状态)；3为重组质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1以Sac I、HindIII进行消化，切下长约240bp的片段。
③含rLL-37融合肽的表达、纯化：
BL21 star(DE3)菌以IPTG诱导表达，菌体反复冻融、溶菌酶处理及超声粉碎，采用TALON纯化柱芯(亲和纯化柱芯)进行亲合纯化融合肽。融合肽模拟序列为：“…6×His…CPM…FXa…rLL-37…FXa…6×His…”。
图10为不同时相点表达融合蛋白质CPM-rLL-37-1的Tricine-SDS-PAGE(一种有效的分离1kDa分子量环脂肽的电泳方法)鉴定。其中，1：蛋白质标记(66、45、35、27、20、14.4、9.5、6.5、4.1KD)；2：空BL21以IPTG诱导表达后的全菌蛋白；2～5：含pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1的BL21star以IPTG诱导表达3、6、9、12h的全菌体蛋白。
可见菌体内均含有约12kDa的蛋白质带，其中以表达9h的条带占全菌蛋白的比例最大。
图11为用TALON(针对6xHis)对pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1所表达的融合蛋白质CPM-rLL-37-1进行亲和纯化的结果图。
用150mmol/L的咪唑洗下一个宽大的B峰，其内证明含有融合蛋白CPM-rLL-37-1。
曲线“901”为280nm下的蛋白质吸收曲线，曲线“902”为洗脱液中电导强度。
④具有杀菌活性rLL-37的制备、纯化：
将融合肽以FXa酶切，切后rLL-37肽采用Macro-Prep High S强阳离子交换柱芯(Macro-Prep High S强阳离子交换柱芯为现有商品，购自美国Bio-Rad Laboratories公司)进行梯度纯化，则获得高纯度、具杀菌力的rLL-37抗菌肽。
图12为以强离子交换柱芯Macro-Prep High S对已进行FXa裂解的CPM-rLL-37-1进行离子交换纯化的结果图。
可见220mmol/L Nacl(氯化钠)洗下一个宽大的B峰，经鉴定含有抗菌肽rLL-37-1片段
其中，曲线“1001”为280nm下的蛋白质吸收曲线，“1002”为洗脱液中电导强度。
图13为融合肽CPM-rLL-37-1及其FXa裂解、纯化后蛋白质片段的Tricine-SDS-PAGE鉴定图。
其中，1：蛋白质标记(66、45、35、27、20、14.4、9.5、4.1KD)；2：以CPM-rLL-37-1为主的蛋白质；3：CPM-rLL-37-1以FXa进行裂解后；4：CPM-rLL-37-1以FXa进行裂解后，通过Macro-Prep High S纯化获得的B峰(含高纯度rLL-37-1)。
本制备方法所述的原核表达载体是pET系列载体表达系统、T7表达系统，所述的双酶酶切是通过Sac I和HindIII双酶切位点，所述的原核表达载体是pET30a(+)，构建的表达载体为pET-30a(+)-CPM-rLL-37，所述的层析方法是CO2+鏊合层析和Macro-Prep High S强阳离子交换层析。
实施例五：
根据实施例四的基因重组人37肽抗菌肽(rLL-37)的制备方法而对rLL-37-1的详细制备过程如下：
即这是上述实施例四37肽抗菌肽(rLL-37)的制备方法中rLL-37-1的详细制备方法过程。
(1)合成如下DNA序列：
GAGCTCGAAGTTTGGAACGCACTTGATGCACTGGAGCTGGTAATCCAACAAGAGGAGGGTTCTAATGGTACTTCTACTGGATCCGAGGGCATCGAGGGTCGCCTGCTGGGTAATTTCTTCCGTAAATCTAAAAACAAGATTGGTAAAGAGTTTAAACGCATTGTACAGCGTATCAAGGACTTTTTGCGCAACCTTGTACCACGTACAGAGTCCATTGAGGGTCGCAAGCTT
其中：GAGCTC编码Sac I酶切位点；AAGCTT编码HindIII酶切位点；ATCGAGGGTCGC和ATTGAGGGTCGC编码FXa蛋白质酶切位点。
DNA序列对应的氨基酸序列为ELEVWNALDALELVIQQEEGSNGTSTGSEGIEGRLLGNFFRKSKNKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTESIEGRKL，其中IEGR为FXa蛋白酶识别位点。
(2)采用DNA合成仪直接合成以上DNA双链序列，并将其通过T4DNA连接酶(T4DNA连接酶为现有商品，购自日本TAKARA公司)，与pMD19-TSimple Vector连接，转入感受态DH-5a菌(为一种现有的菌种，广泛应用于生物工程中，本发明实施例中DH-5a菌为高感受性菌)中，于LB培养板(X-gal0.04g/L、IPTG 0.024g/L、Amp 10mg/L)行蓝白斑筛选。挑取白色菌落扩增、抽提质粒并进行基因测序鉴定，序列正确的质粒进行Sac I、HindIII双酶切，并将目的片段与相同酶切的表达载体pET-30a(+)相连接，构建质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1，转入感受态DH-5a菌中，于LB培养板进行抗kanamycin(卡那霉素)筛选(浓度50mg/L)。单克隆细菌扩增，抽提质粒，进行PCR(基因扩增)(引物：T7 Promoter primer、T7 terminator primer)及DNA序列测定，无DNA序列突变、移码错位，并且阅读框架正确的质粒电转入BL21 Star(DE3)菌中；
其中，电转条件为：电压1800V、电击杯槽宽0.1cm、电容25μF、平行电阻100Ω。
(3)将含目的质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37-1的BL21Star(DE3)菌于LB培养基扩增，在OD6000.8时，以IPTG 1mmol/L诱导，寻找最佳表达时间点。分别收集表达菌体，反复冻融、溶菌酶处理、超声破碎提取其可溶性蛋白质及包涵体，然后以6×His TALON柱芯(购自美国Clontech公司)亲和纯化；
条件为：5mmol/L的咪唑洗涤杂蛋白，然后用洗脱B、C、D液分别为含的梯度洗脱目的蛋白。各个洗脱蛋白质峰分别回收、脱盐、冻干并进行SDS-PAGE电泳(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和Western-bloting(免疫印记法)鉴定，证明150mmol/L咪唑洗脱B峰中含有分子量约为12kDa的融合肽CPM-rLL-37-1。
(4)融合肽CPM-rLL-37-1用FXa蛋白酶切，酶切后产物装入透析袋(滤过分子量为500Da)于1X PB液(含Na2HPO4/NaH2PO4 5mmol/L pH 8.4)进行脱盐，低温浓缩后以1X PBS液(含Nacl 10mmol/L pH 8.4)调酸碱度，再以强离子交换柱芯Macro-Prep High S进行梯度纯化；
条件为：平衡液1X PBS液(含Nacl 10mmol/L pH 8.4)，洗脱A、B、C、D液分别为含Nacl 220、350、500及1000mmol/L的1X PBS液。各个洗脱蛋白质峰分别回收、脱盐、冻干并进行SDS-PAGE电泳等鉴定，证明220mmol/L Nacl洗脱B峰中含有分子量约为4kDa的抗菌肽rLL-37-1。
rLL-37-2～17的制备方法与rLL-37-1的制备方法相同，简要说明如下：按相同的方法合成编码rLL-37-2～17的DNA序列，分别放入载体pMD19-TSimple Vector中，扩增后切下目的片段构建表达质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37-2～17，将质粒电转入BL21 star(DE3)中，经IPTG诱导，BL21 star(DE3)菌融合表达目的蛋白CPM-rLL-37-2～17，融合蛋白经TALON亲和纯化、FXa酶切、Macro-Prep High S离子交换纯化后生成高纯度目的杀菌肽rLL-37-2～17，纯度约93.5％～96.3％。
实施例六：
改建抗菌肽系列的应用：
(1)rLL-37、rLL-24具有广谱杀菌力，可用于格兰氏阴性细菌、格兰氏阳性细菌感染的治疗，rLL-37、rLL-24与LPS具有结合力，可显著抑制LPS导致的感染性休克的发生。rLL-37、rLL-24具有一定的肿瘤细胞生长抑制性，可较好的应用于化疗中的肿瘤患者，在防止细菌感染的同时，可进行辅助抗肿瘤细胞的作用。
下面列举rLL-37-1、rLL-24-1的抗菌活性，通过将rLL-37-1等与原始LL-37、氨苄青霉素(AMP)、左氧氟沙星进行比较，说明rLL-37、rLL-24具有一定的肿瘤细胞生长抑制性，可较好的应用于化疗中的肿瘤患者。
rLL-37-1、rLL-24-1和AMP、左氧氟沙星
对2种临床常见致病菌株的MIC、MBC比较表
Figure C20071007812000181
MIC指最低抑菌浓度，即Minimal Inhibitive Concentration
MBC指最低杀菌浓度，即Minimal Bacteric Concentration
结果：rLL-37-1、rLL-24-1对杆菌较敏感，球菌稍次，AMP对球菌敏感，左氧氟沙星对杆菌较敏感，球菌稍次。
(2)rLL-18与LPS具有较好的结合力，可显著抑制LPS导致的感染性休克的发生，并同时抑制细菌的生长。
(3)应用途径包括：静脉注射、口服(直接杀胃内杆菌)，雾化(直接作用于上下呼吸道、肺等)、外涂、外敷、浸泡的局部外用，肌肉注射，皮下注射，皮内注射。
实施例七：
本发明实施例中所使用的金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、粪肠球菌(ATCC29212)等为标准菌株，该标准菌株可以在市场上购得。在本发明实施例中检测的标准菌株为申请人所保存的标准菌株。
杀菌活性的测定方法，测定杀菌活性的方法如下：
1、将rLL-37、rLL-37-1等杀菌肽和对比研究所需的抗生素(AMP、左氧氟沙星)进行倍比稀释，它们的终浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1ug/ml。
2、检测菌的制备：细菌培养扩增，采用LB培养基稀释待测菌至5×105CFU/ml。
3、接种：取倍比稀释的rLL-37、rLL-37-1等或AMP、左氧氟沙星各10ul，分别加入90ul稀释好的待测菌，设LB培养基及稀释好的待测菌为对照孔，混匀后置37℃孵育18-20h后观察结果，并用酶标仪以LB培养基空白对照调零，采用酶标仪测定各测试孔A450nm值。
4、MIC(最低抑菌浓度minimal inhibitive concentration)的测定：测试孔A450nm值与空白对照孔A450nm值有显著差异(P＜0.05)的最低抗生素浓度为rLL-37、rLL-37-1等或AMP和左氧氟沙星对该测试菌的MIC。
5、MBC(最低杀菌浓度minimal bacteric concentration)的测定：取比MIC浓度高，并且未见浑浊的高浓度2孔，吸出培养液，分别用灭菌后的玻棒，在超净台下均匀涂布LB琼脂平板，37℃培养16-18h，对平板计数。记数小于5CFU/平板的培养液孔的浓度为抗生素对该测试菌的MBC。)
(61)rLL-37-1多肽抗菌肽活性检测：
①抑菌圈试验：将1.5％的底层营养琼脂培养基充分融化后取10ml倒入无菌平皿中，待冷却凝固。在紫外线灯下照射30min后，取0.7％的温度为45℃的琼脂培养基12ml，加入对数生长期的细菌(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)旋涡振荡(终浓度3×105-4×105)，快速覆盖在底层胶上，待冷却凝固后，在上层琼脂上打直径为3mm的圆孔，把一定浓度的rLL-37多肽10ul滴入孔中，将有培养基面朝上放置在37℃孵育约半小时后，再将培养皿倒置，37℃孵育过夜。抑菌活力以抑菌圈直径(mm)表示。同时取生理盐水及临床常用抗生素如氨苄青霉素、左氧氟沙星等作对照，如表2所示，通过抑菌圈试验证明其抗菌力。
rLL-37-1、rLL-24-1和AMP、左氧氟沙星等抗生素
对2种临床常见致病菌株的抑菌圈试验
Figure C20071007812000201
其中，抑菌圈直径＞16mm为高度敏感，14～16mm为敏感，12～14mm为中度敏感，＜12mm为不敏感
结果：rLL-37-1、rLL-24-1对杆菌较敏感，球菌稍次，AMP对球菌敏感，左氧氟沙星对杆菌较敏感，克林霉素对杆菌较敏感，球菌稍次。
②抑菌实验：将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接种于3毫升LB培养基中，37℃振荡培养12小时，6000g离心5分钟，去上清，沉淀用1X PB液(含Na2HPO4/NaH2PO4 10mmol/L pH7.4)洗两次，稀释成1×103个菌落(CPU)/mL，20微升不同浓度的rLL-37-1混入180微升的菌悬液中，37℃振荡培养1小时，取100微升上述混合物平铺于LB平板上，培养16小时，计数每毫升菌落总数(CFU)。研究证明rLL-37-1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，其EDco小于5微克/毫升，其中rLL-24-2的抑菌作用作用略弱于rLL-37-1，但强于rLL-18-1。
改建杀菌肽rLL-37-1～17、rLL-24-1～8和rLL-18-1～2，它们每一种杀菌肽的抗菌活性是不一样，部分杀菌肽抗菌力更强，而部分杀菌肽与LPS结合的力更强。
实施例八：
改建的抗菌肽与LPS结合力实验：
①生物传感器技术：以LPS标疏水性(hydrophobic)传感板，以不同浓度rLL-37-1、rLL-24-1rLL-18-1分别与非极性传感板结合，采用光生物传感器Affinity sensors(由BIORAD公司生产)进行检测，通过IASYS 4 Software(生物传感器软件)分析它们与LPS的结合力：rLL-24-1与LPS结合的峰值(peak value)为103.5±9.6rad/s，rLL-18-1与LPS结合的峰值为98.4±8.2rad/s，LL-37与LPS结合的峰值为87.1±6.3rad/s，rLL-37-1与LPS结合的峰值为81.5±7.2rad/s，按与LPS结合力从大到小排序为：rLL-24-1＞rLL-18-1＞LL-37＞rLL-37-1，说明rLL-24-1与LPS的结合力最强。
②ELISA技术：以LPS标96孔板，以不同浓度rLL-37-1、rLL-24-1、LL-18-1分别与酶标板的小孔结合，并用人血白蛋白作为阴性对照。倒去结合液，加入封闭液，洗去封闭液后加入HRP-鼠抗LPS单克隆抗体，洗净后加入TMB显色，当A450nm值为阴性对照的1/2以下时则为阳性，证明可与LPS结合(阻断试验)。在结合力实验中，发现rLL-24-1与LPS结合力最强，rLL-18-1其次，rLL-37-1稍差：以LL-37与LPS的结合力为1，则rLL-24-1与LPS结合力为1.4，rLL-18-1与LPS结合力为1.1，rLL-37-1与LPS结合力为0.7，说明rLL-24-1与LPS结合力最强，rLL-18-1其次，rLL-37-1稍差。
实施例九：
抗菌肽毒性实验：
将rLL-37-1、rLL-24-1、rLL-18-1以浓度2mg/1Kg分别注入昆明系小鼠(购自第三军医大学动物研究所，体重25.0±0.5g，雌雄各半)，分成生理盐水对照组(生理盐水100ul/25g，腹腔注入；抗菌肽体内作用组(rLL-37-1、rLL-24-1、rLL-18-1分别腹腔注入，3mg/kg体重)，注射3天后断头取血及组织标本)，观察动物肝功、血常规、炎症介质、重要脏器的改变。观察时间3天发现它们无明显溶血现象，对肝、肾、脑等重要脏器无明确损害。
实施例十：
以下是杀菌肽体内保护测试，并与AMP进行对比：将昆明小鼠(25.0±0.5g，按雌雄各半分为八组，每组5只；分别为①生理盐水对照组(100ul/25g，腹腔注射)、②rLL-37实验组(3mg/kg体重，腹腔注射)、③接种金葡菌后生理盐水假治组(小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌2×109CFU/ml，100ul/25g)、④接种金葡菌后AMP治疗组(3mg/kg体重)、⑤接种金葡菌后rLL-37-1治疗组(3mg/kg体重)、⑥接种大肠杆菌后生理盐水假治组(小鼠腹腔注射BL21大肠杆菌2×109CFU/ml 100ul/25g)、⑦接种大肠杆菌后AMP治疗组(3mg/kg体重)、⑧接种大肠杆菌后rLL-37治疗组(3mg/kg体重)。动物损伤3天后断头取血，测血清生化指标的变化。如图14所示杀菌肽动物体内保护测试生化指标关系图，结果显示rLL-37-1可以保护小鼠免受大肠杆菌和金葡菌的损害，特别是对大肠杆菌感染的保护作用更佳。
在图14中，其中，1：生理盐水对照组；2：rLL-37-1实验组；3：接种金葡菌后生理盐水假治组；4：接种金葡菌后AMP治疗组；5：接种金葡菌后rLL-37-1治疗组；6：接种大肠杆菌后生理盐水假治组；7：接种大肠杆菌后AMP治疗组；8：接种大肠杆菌后rLL-37-1治疗组。
本发明的抗菌肽，在α-螺旋空间构象、两亲性螺旋结构、蛋白质极性(亲水性、疏水性)尽可能不变的基础上，通过局部氨基酸的调整，来增强LL-37的杀菌力和LPS结合力，降低溶血等副反应，并且易制备。
本实施例是为了更好地理解本发明进行的详细的描述，并不是对本发明所保护的范围的限定，因此，本领域普通技术人员不脱离本发明的主旨未经创造性劳动而对本明所做的改变在本发明的保护范围内。
序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
<120>一种改建的抗菌肽及其制备方法和应用
<160>38
<170>PatentIn Version 3.1
<210>1
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-1
<400>1
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>2
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-2
<400>2
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>3
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-3
<400>3
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>4
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-4
<400>4
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Asn
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>5
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-5
<400>5
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>6
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-6
<400>6
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Asn
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>7
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-7
<400>7
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Asn
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>8
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-8
<400>8
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Asn
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>9
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-9
<400>9
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Asn
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Asn Ser
        35
<210>10
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-10
<400>10
Leu Leu Gly Lys Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>11
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-11
<400>11
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Lys Lys Ile Gly Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>12
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-12
<400>12
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Lys
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>13
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-13
<400>13
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Lys Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>14
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-14
<400>14
Leu Leu Gly Lys Phe Phe Arg Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>15
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-15
<400>15
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Gln
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Glu Ser
        35
<210>16
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-16
<400>16
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Asn
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Gln Ser
        35
<210>17
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-37-17
<400>17
Leu Leu Gly Asn Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Asn
1               5                   10                  15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asn Phe Leu Arg Asn Leu Val
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Gln Ser
        35
<210>18
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-24-1
<400>18
Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Lys Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu
            20
<210>19
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-24-2
<400>19
Ile Gly Lys Arg Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu
            20
<210>20
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-24-3
<400>20
Ile Gly Lys Lys Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu
            20
<210>21
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-24-4
<400>21
Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Lys
            20
<210>22
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-24-5
<400>22
Ile Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Lys Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu
            20
<210>23
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-24-6
<400>23
Ile Gly Lys Lys Gly Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu
            20
<210>24
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-24-7
<400>24
Ile Gly Lys Lys Gly Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Gly Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu
            20
<210>25
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-24-8
<400>25
Ile Gly Lys Glu Phe Lys Glu Ile Val Lys Arg Ile Lys Arg Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Glu Leu Val Arg Pro Leu Arg
            20
<210>26
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-18-1
<400>26
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Leu Lys Phe Leu Arg Asn
1               5                   10                  15
Leu Val
<210>27
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-18-2
<400>27
Lys Leu Phe Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Leu Asp Phe Leu Arg Asn
1               5                   10                  15
Leu Val
<210>28
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-30-1
<400>28
Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Asn Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
1               5                   10                  15
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Asn Arg Ala Glu Ser
            20                  25                  30
<210>29
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-30-2
<400>29
Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
1               5                   10                  15
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Gly Glu Ser
            20                  25                  30
<210>30
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-30-3
<400>30
Lys Ser Lys Asn Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
1               5                   10                  15
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Ala Glu Ser
            20                  25                  30
<210>31
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-30-4
<400>31
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Val Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
1               5                   10                  15
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Thr Arg Thr Glu Ser
            20                  25                  30
<210>32
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-30-5
<400>32
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Val Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
1               5                   10                  15
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
            20                  25                  30
<210>33
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-30-6
<400>33
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Val Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
1               5                   10                  15
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Thr Arg Gly Glu Ser
            20                  25                  30
<210>34
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-30-7
<400>34
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Val Lys Arg Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
1               5                   10                  15
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser
            20                  25                  30
<210>35
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-30-8
<400>35
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Arg Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
1               5                   10                  15
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Gly Glu Ser
            20                  25                  30
<210>36
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-30-9
<400>36
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Arg Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
1               5                   10                  15
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Thr Arg Gly Glu Ser
            20                  25                  30
<210>37
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<214>CHAIN of rLL-30-10
<400>37
Lys Ser Lys Glu Lys Ile Val Lys Arg Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg
1               5                   10                  15
Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Gly Arg Gly Glu Ser
            20                  25                  30
<210>38
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<214>编码存载蛋白质(Carrier protein molecule，CPM)的核苷酸序列
<400>38
GAA GTT TGG AAC GCA CTT GAT GCA CTG GAG CTG GTA ATC CAA CAA GAG  48
Glu Val Trp Asn Ala Leu Asp Ala Leu Glu Leu Val Ile Gln Gln Glu
1               5                   10                  15
GAG GGT TCT AAT GGT ACT TCT ACT GGA TCC GAG GGC                  84
Glu Gly Ser Asn Gly Thr Ser Thr Gly Ser Glu Gly
            20                  25

Claims (4)

1、一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽为序列表中SEQ ID NO：1所示的改建的37肽抗菌肽rLL-37-1。
2、一种如权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法为基因工程表达技术进行制备。
3、根据权利要求2所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述基因工程表达为原核工程表达菌BL21Star(DE3)和原核表达载体pET-30a(+)表达。
4、一种如权利要求1所述的抗菌肽的应用，其特征在于，所述抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的药物中的应用。
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Evolution of the Primate Cathelicidin. Igor Zelezetsky et al.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.281 No.29. 2006
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改良人源LL-37杀菌肽的融合表达及其杀菌活性. 杨艳丽，葛晓冬等.第四军医大学学报，第27卷第11期. 2006 *
改良人源杀菌肽LL-37的两种构建及表达方法的对比研究. 杨艳丽，葛晓冬等.第三军医大学学报，第28卷第20期. 2006
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