CN101679498A - 双甲硫氨酸组蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对包含作为第一和第二N末端氨基酸残基的经由肽键与成熟真核细胞组蛋白连接的两个甲硫氨酸残基的多肽进行编码的核酸分子。本发明此外还涉及包含所述核酸分子的载体、以所述载体转化的宿主、由所述核酸分子编码的多肽和药物组合物及诊断组合物。本发明还涉及本发明的核酸分子、载体、宿主和多肽在治疗疾病用组合物的制备中的应用。此外，本发明涉及检测所述核酸分子或多肽在样品中和对于试剂盒的存在的方法。

Description

双甲硫氨酸组蛋白
技术领域
本发明提供了对包含作为第一和第二N末端氨基酸残基的经由肽键与成熟真核细胞组蛋白连接的两个甲硫氨酸残基的多肽进行编码的核酸分子。本发明此外还涉及包含所述核酸分子的载体、以所述载体转化的宿主、由所述核酸分子编码的多肽和药物组合物及诊断组合物。本发明还涉及本发明的核酸分子、载体、宿主和多肽在治疗疾病用组合物的制备中的应用。此外，本发明涉及检测所述核酸分子或多肽在样品中和对于试剂盒的存在的方法。
在整个说明书中引用了多种文献。在此通过参考整体引入包括制造商手册的所述文献的公开内容。
背景技术
目前，对如组蛋白等重组蛋白的高水平生产有着巨大的经济兴趣。不仅对于为研究其性质和功能的研究提供足量的蛋白的目的，而且对于为治疗应用供给大量蛋白的目的，大量重组蛋白的生产都令人感兴趣。
对于重组蛋白的成功高水平生产和纯化已经考虑了大量的参数。重要参数包括表达条件、翻译调节和mRNA稳定性、蛋白靶向和降解(Makrides，S.，Microbiological Reviews，1996：512)。
为了改善重组蛋白的生产、检测和纯化，一种方法是使用各种各样的融合伴侣(Makrides，S.，Microbiological Reviews，1996：512)。已经发展出精细技术以便为纯化和检测重组蛋白而包含亲和标签。这类亲核标签结合了允许更有效的纯化而同时也允许基于所述标签的对重组蛋白的轻松检测的有利性质。然而，在许多情况下添加相当大的亲和标签可能由于在蛋白翻译、折叠和活性上的不良效果而是不利的。尤其是用于治疗应用时常常必须随后除去亲和标签，因而减弱了亲和标签赋予蛋白的一些正效果(例如，容易检测)(Gellissen，G.″Production of RecombinantProteins″，2005，WILEY-VCH Verlag GmbH&Co.，KgaA，Weinheim)。
在每条新生多肽的N末端的甲硫氨酸残基的加入构成了部分被原核细胞和真核细胞使用的通用翻译起始信号。在大肠杆菌中，通过胞质酶甲硫氨酸氨肽酶(map)可以实现将该N末端甲硫氨酸残基除去(Hirel等，Biochemistry，1989，86：8247)。
据显示产生于原核细胞中(例如，大肠杆菌中)的重组真核细胞蛋白的N末端甲硫氨酸残基的有效处理取决于与甲硫氨酸相邻的氨基酸。尽管相互矛盾的数据显示对某些氨基酸似乎有这样的一致性：对于小且不带电荷的氨基酸残基Ala、Gly、Pro、Ser、Val、Cys和Thr而言切割的可能性最高。大的侧链似乎对甲硫氨酸处理不利(Hirel等，Biochemistry，1989，86：8247；Frottin等，Mol.&Cell.Proteomics，2006，12：2336；Gellissen，G.″Production of Recombinant Proteins″，2005，WILEY-VCH VerlagGmbH&Co.，KgaA，Weinheim)。
据认为N末端甲硫氨酸的处理不仅对蛋白稳定性起到重要作用(Giglione等，EMBO J.，2003，1：13)而且对蛋白的正确功能也起着重要作用，例如对于MEF-2C、人血红蛋白、白细胞介素-2、RNA酶A同系物或蛙核糖核酸酶所示(Meierhans和Allemann，J.Biol.Chem.，1998，273：26052；Adachi，K.等，Protein Expr.Purif.，2000，20：37；Endo，S.等，Biochemistry，2001，40：914；Boix，E.等，J.MoI.Biol.，1996，257：992；Liao，Y.D.等，Nucleic Acids Res.，2003，31：5247；Varshavsky，A.，Proc，Natl.Acad.Sci.，1996，93：12142)。至于为何大自然保留了如此专门的酶体系来除去甲硫氨酸残基的额外理论是用于细胞甲硫氨酸池的回收以节约该必需氨基酸(Hirel等，Biochemistry，1989，86：8247)。
EP1254166描述了大肠杆菌中的组蛋白的重组生产。据认为这类人类蛋白重组生产对治疗应用有利而且与人或小牛胸腺制剂相比更加有效和节省成本。此外，蛋白的重组生产允许了生产过程中更好的品质控制。
Pyo等(Pyo，S.H.等，Protein Expr.Purif.，2001，1：38)描述了大肠杆菌中重组组蛋白H1.5的生产，其中利用了组蛋白的强碱性性质以开发用于大规模纯化重组蛋白的有效方法。
尽管在现有技术中已经显示出高水平的重组蛋白生产，却仍迫切需要找到检测所得重组蛋白的合适方法。如上所讨论，在本领域中广泛使用了如组氨酸标签等亲和标签，但这可能对用于治疗用途的蛋白生产造成问题。
发明内容
因此，本发明基本的技术问题是提供例如允许简化生产和检测的改良重组真核细胞多肽。
通过其特征描述于在权利要求的实施方式获得了对该技术问题的解决方案。
于是，本发明在第一实施方式中涉及一种核酸分子，所述核酸分子：(a)编码多肽，所述多肽由(aa)和(ab)组成，(aa)作为第一和第二N末端氨基酸残基的经由肽键与(ab)相连的两个甲硫氨酸残基，(ab)成熟真核细胞组蛋白；(b)编码多肽，所述多肽由(ba)和(bb)组成，(ba)作为第一和第二N末端氨基酸残基的两个甲硫氨酸残基的多肽，所述甲硫氨酸残基经由肽键与(bb)具有至少80％的与(a)的成熟真核细胞组蛋白的序列一致性并基本保留其生物活性的成熟真核细胞多肽相连；或(c)在严格条件下与编码(a)或(b)的多肽的核酸分子的互补链杂交，其中所述核酸分子编码至少具有上述两个N末端甲硫氨酸残基的多肽并基本保留(a)或(b)的多肽的生物活性。
根据本发明的核酸分子包括合成或半合成形式的DNA(如cDNA或基因组DNA)和RNA(例如，mRNA)、DNA或RNA的进一步合成或半合成衍生物(例如PNA或硫代磷酸酯)以及混合聚合物，上述核酸分子既可为正义链也可为反义链。本领域技术人员容易理解，它们可以包含额外的非天然或衍生化核苷酸碱基。在一个优选实施方式中核酸分子为DNA，包括基因组DNA。
出于本发明的目的，肽核酸(PNA)是聚酰胺型DNA类似物，并且腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的衍生物的单体单元可商购获得(Perceptive Biosystems)。如磷、磷氧化物或脱氧核糖衍生物等DNA的某些成分在PNA中不存在。如Nielsen等，Science 254：1497(1991)；和Egholm等，Nature 365：666(1993)所公开，PNA与互补DNA链特异性且紧密地结合并不被核酸酶降解。事实上，PNA比DNA自身更强力地与DNA结合。这有可能是由于在两条链间没有静电排斥，而且聚酰胺主链更有柔性。因此，PNA/DNA双链体比DNA/DNA双链体在更大范围的严格条件下结合，使其易于进行多重杂交。由于强结合与DNA相比可以使用更小的探针。另外，由于在PNA/DNA的15聚体中单错配使熔点(T.sub.m)降低8℃～20℃，相比之下在DNA/DNA的15聚体中单错配使熔点(T.sub.m)降低4℃～16℃，因此用PNA/DNA杂交更有可能确定单碱基错配。此外，PNA中不存在带电基团，这意味着杂交可以在低离子强度下进行并且可以减少分析过程中盐引起的可能干扰。
此处所用术语“多肽”描述了由多于30个氨基酸组成的一组分子。根据本发明，多肽组包括“蛋白”。多肽可以进一步形成二聚体、三聚体和更大的寡聚体，即由多于一个多肽分子组成。形成这类二聚体和三聚体等的多肽分子可以相同或不同。因此相应的更高级结构被称为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。同二聚体或异二聚体等也落在术语“蛋白”的定义下。多肽可以进一步为融合蛋白，其中融合伴侣在C末端与本发明的多肽相连。所述融合蛋白的成分不是此处如上定义的组蛋白序列或其片段或变异体，这些成分包括赋予如改进的/增强的稳定性、改进的/增强的溶解性和/或靶向一种或多种特定细胞类型的能力等所需性质或能够赋予不同的生物活性的氨基酸序列。例如，设想了带有对细胞表面标记特异的抗体或带有所述抗体的抗原识别片段的融合蛋白。此外，本发明还涵盖了其中氨基酸和/或肽键已被功能类似物替代的这类多肽的肽模拟物。所述功能类似物包括除20个基因编码的氨基酸以外的所有已知氨基酸，如硒代半胱氨酸。术语“多肽”和“蛋白”也指天然修饰的多肽/蛋白，其中所述修饰由例如糖基化、乙酰化和磷酸化等实现。这类修饰是本领域内公知的。
本发明的术语“甲硫氨酸”是本领域技术人员所公知的。甲硫氨酸是由标准遗传密码中的AUG密码子编码的非常重要的氨基酸。见于真核细胞中的所述甲硫氨酸有助于本发明的优选实施方式。原核细胞的N-甲酰甲硫氨酸也涵盖在术语甲硫氨酸的含义中并且有助于本发明的替代性实施方式。
此处所用的术语“第一和第二N末端氨基酸残基”是指见于本发明的多肽的1位和2位的氨基酸残基。在本领域中也将这些残基称为N末端处的终端残基和倒数第二残基。换言之，第一个甲硫氨酸残基被置于在其N末端自身含有甲硫氨酸的多肽的初始翻译产物的N末端。
此处所用的术语“肽键”是本领域技术人员所公知的并且指形成于两个氨基酸分子之间的化学键，其中一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基发生反应。
本发明的术语“成熟真核细胞组蛋白”是指缺乏其初始N末端甲硫氨酸的组蛋白。如本领域技术人员所公知，多肽使用通用翻译起始信号翻译，所述通用翻译起始信号导致将甲硫氨酸作为所翻译的多肽的N末端的初始氨基酸残基引入。在真核细胞以及部分原核细胞中，该N末端甲硫氨酸被切去从而导致多肽的“成熟”。
根据本发明，术语“组蛋白”是指包括核心组蛋白H2A(人H2A的Swiss-Prot编号是P02261)、H2B(人H2B的Swiss-Prot编号是P02278)、H3(人H3.1的Swiss-Prot编号是P16106)和H4(人H4的Swiss-Prot编号是P02304)以及H1接头组蛋白家族(Swiss-Prot编号见下)的一组蛋白。组蛋白通常已知是细胞核的结构成分，它们在细胞核中充当DNA在其周围缠绕的“线圈”并在基因调节中起着关键作用。然而，组蛋白展示出广泛的多功能性(Reichhart，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.1985，82：4871；Reichhart，R.等，FEBS 1985，188：63)。例如，已发现组蛋白系统性地充当激素和调节因子，并且是重要保护性功能的承载体。
由于其广泛的多功能性，组蛋白在许多治疗方法中已变得重要。例如，已发现组蛋白H1、H2A和H2B可刺激外周健康淋巴细胞(Cebecauer，L等，Rheumatologia 1991，5：107)。已发现组蛋白H1可通过刺激成肌细胞的增殖来改善肌肉再生(Henriquez，J.P等，J.Cell Sci.2002，115：2041)、调节带有淀粉样原纤维的疾病的状态(Duce，J.A.等，J.MoI.Biol.2006，361：493)和刺激干细胞(Semina等，Radiation Biology and Oncology，1994，34：544)。组蛋白H1还能用于诊断、预防和治疗溃疡性结肠炎及其临床亚型(Braun，J.等，美国专利第6,074,835号)。此外还发现组蛋白H1和核心组蛋白能转运生物活性物质通过血脑屏障(Pardridge.W.M.等，J.Pharmacol.Exp.Ther.1989，251：821)。此外，欧洲专利第0392315号显示了组蛋白H1及其亚型的激素或激素样活性。例如在欧洲专利第0532979号或专利申请WO 03/044054中已经显示了组蛋白在包括例如系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病中的作用。已显示组蛋白的额外功能包括抗生素功能(美国专利第6565854号和第6884423号)和抗病毒功能(WO2005/112975)。另外，已显示了组蛋白在预防血小板聚集(WO02/067907)或治疗血小板减少症(WO/2006/119912)中的应用。
还发现组蛋白在癌症治疗中起着关键作用。例如，Vani等(Vani，G等，Chemotherapy 2003，49：252)显示组蛋白H1改善了带有实验性乳腺癌的动物中的免疫状态和免疫响应。此外，已显示组蛋白H1增强了罹患癌症的个体中的抗氧化剂状态(Vani，G等，Chemotherapy 2005，51：57)。用组蛋白H1对人雌激素敏感乳腺癌细胞的治疗也据显示可减少雌激素受体的数目(Vani，G和Devi，CS.，Mol.Cell Biochem.2005，272：151)。在美国专利第5812257号中显示了用组蛋白H1或H2A：H2B对辐射诱导的白血病或癌症的治疗。组蛋白还有可能用于通过清除病原性胞外DNA和系统循环的病原性核小体来治疗癌症(Le Lann-Terrisse等，(1997)CancerImmunol Immunother，43：337)。
根据本发明，所述核酸分子还能编码包含作为第一和第二N末端氨基酸残基的经由肽键与成熟真核细胞多肽连接的两个甲硫氨酸残基的多肽，所述成熟真核细胞多肽具有至少80％、更优选为85％、更优选为90％的与(a)的成熟真核细胞组蛋白的序列一致性并基本保留其生物活性。更加优选的是所述核酸分子能编码包含作为第一和第二N末端氨基酸残基的经由肽键与成熟真核细胞多肽连接的两个甲硫氨酸残基的多肽，所述成熟真核细胞多肽具有至少95％且最优选为98％的与(a)的成熟真核细胞组蛋白的序列一致性并保留其生物活性。
根据本发明，术语“百分比(％)序列一致性”描述了与构成整个长度的两个以上经比对的核酸或氨基酸序列(或其整个受比较部分)的核苷酸或氨基酸残基数相比，所述核酸或氨基酸序列的相同核苷酸/氨基酸的匹配(“命中”)数。换言之，当比较和比对(子)序列在比较窗口上或用本领域内已知的序列比较算法测定的指定区域上的最大对应时，或手动比对并直观检查时，通过使用比对可以确定两个以上的序列或子序列的相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比(例如，80％或85％的一致性)。该定义也应用于测试序列的补体。本发明的优选核酸分子/多肽是这样的分子：在长度至少约为15～25个氨基酸或核苷酸的区域上，且更优选的是在长度约为50～100个氨基酸或核苷酸的区域上存在所述一致性。本领域技术人员知道如何例如用如基于CLUSTALW计算机程序(Thompson Nucl.Acids Res.2(1994)，4673-4680)或FASTA(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci，1988，85；2444)的算法等本领域已知算法来确定序列之间的百分比序列一致性。
尽管FASTDB算法通常在其计算中不考虑序列中的内部非匹配缺失或添加，即空隙，可以对此手动校正以避免对％序列一致性的过高估计。然而，CLUSTALW在其一致性计算中考虑了序列空隙。本领域技术人员也可以利用BLAST和BLAST 2.0算法(Altschul，Nucl.Acids Res.，1977，25：3389)。用于核酸序列的BLASTN程序缺省使用词长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，且对两条链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序缺省使用词长(W)为3，期望值(E)为10。BLOSUM62评分矩阵(Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.，1989，89：10915)使用的比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，且对两条链进行比较。所有这些程序都可用于本发明的目的。所有上述程序都可根据本发明进行使用。
根据本发明，如果获得了上述条目(a)中叙述的对应成熟真核细胞组蛋白的至少20％的生物活性，则基本保留了活性。优选的是保留了至少50％的活性，如至少60％、至少75％或至少80％的活性。更优选的是保留了至少90％的生物活性，如至少95％的生物活性，再更优选的是保留了至少98％的生物活性，如至少99％的生物活性。最优选的是完全即100％地保留了生物活性。此外，与(a)中叙述的对应成熟真核细胞组蛋白相比具有增加的生物活性(即，大于100％的参照组蛋白的酶活性)的多肽也符合本发明。评估(多)肽的生物活性的方法是本领域技术人员所公知的并且包括但不限于对酶活性、细胞毒性、细胞因子释放、溶血或生物标记的表达的测定。特别地，细胞毒性测试是用由例如组蛋白等(多)肽处理的体外或体内细胞培养物进行的测试，其中在处理后用细胞检测方法确定了细胞的死亡率梯度。也可用ELISA测试确定生物活性，尤其是在抗体的情形中。
此处所用术语“杂交”是指将核酸分子和该核酸分子的(部分)互补链配对从而形成杂交体。
在本领域中公知如何用核酸分子进行杂交实验。相应地，本领域技术人员知道要进行成功杂交所必须使用的杂交条件。在如Sambrook和Russell，″Molecular Cloning，A Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.(2001)；Ausubel，″Current Protocols in Molecular Biology″，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)；或Higgins和Hames编著的″Nucleic acid hybridization，a practical approach″，IRLPress Oxford，Washington DC，(1985)等标准教材中提及了对合适的杂交条件的建立。在一个优选实施方式中，在严格条件下进行杂交。
“严格杂交条件”是指包括例如在65℃的4×SSC(600mM NaCl，60mM柠檬酸钠)中温育过夜接着在65℃的0.1×SSC中洗涤1小时的条件。作为另一种选择，杂交条件可以包括：在包含50％甲酰胺、5×SSC(750mMNaCl，75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μtg/ml经变性和剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中在42℃温育过夜，接着在约65℃的0.1×SSC中洗涤滤液。所述杂交条件也被本领域技术人员称作“高度严格杂交条件”。此外也考虑了在严格性更低的杂交条件下(“低严格性杂交条件”)与本发明的核酸分子杂交的核酸分子。主要通过对甲酰胺浓度(更低的甲酰胺百分比导致更低的严格性)、盐条件或温度的操作来完成对杂交的严格性和信号检测的改变。例如，较低严格性条件包括：在50℃的4×SSC中温育过夜或在包含6×SSPE(20×SSPE＝3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH 7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑鱼精子阻断DNA的溶液中在37℃温育过夜；接着在50℃用1×SSPE和0.1％SDS洗涤。另外，为了获得甚至更低的严格性，根据严格杂交进行的洗涤可以在更高的盐浓度(例如，5×SSC)下完成。值得注意的是可以通过加入和/或替代用于抑制杂交实验中的背景的替代性阻断试剂来实现上述条件中的变化。典型阻断试剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑鱼精子DNA和商购专有制剂。由于相容性的问题，特定阻断试剂的加入可能需要对上述杂交条件进行修改。这种修改通常可以由本领域技术人员毫不费力地进行。杂交复合物可能形成于溶液中(例如Cot或Rot分析)或存在于溶液中的一个核酸序列与固定于固相支持体(例如，已固定有例如细胞的膜、滤纸、芯片、针或载玻片)上的另一个核酸序列之间。优选的是，上文所述实施方式是指高度严格条件，且作为另一种选择是指低严格性条件。
除上以外，条目(c)中叙述的术语“在严格条件下与编码(a)或(b)的多肽的核酸分子的互补链杂交的核酸分子”优选是指显示出与上述条目(a)或(b)中所述的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、再更优选至少95％且最优选至少97％的序列一致性的序列。
如上所述，根据本发明优选能在(高度)严格杂交条件下与本发明的核酸分子或其部分杂交，即不与核苷酸序列不相关的核酸分子交叉杂交的核酸分子。根据上述条目(c)，本发明也涵盖了与条目(a)和(b)的核酸分子在序列上相关但不相同的核酸分子。另外，根据条目(c)，本发明包括(a)和(b)的核酸分子的片段。对于所有落在条目(c)中的实施方式，根据该实施方式至关重要的是由该核酸分子编码的多肽具有至少两个N末端甲硫氨酸残基并保留或基本保留了(a)或(b)的组蛋白的生物活性。
而且，在优选实施方式中，本发明还涉及与条目(a)或(b)的上述核酸分子的序列相比其序列是简并序列的核酸分子。当根据本发明使用时，术语“因遗传密码造成简并”是指因遗传密码的冗余而使不同的核苷酸序列编码相同的氨基酸。
尽管在本领域中已知由很多亲和标签可与多肽融合以允许更容易的生产和检测，但在治疗性应用中常常必须将这些标签除去。与这些亲和标签相反，本发明人惊讶地发现了显示出与其天然对应物相同的生物活性的双甲硫氨酸(Met)多肽，因此本发明的多肽可以用于治疗目的。由于本发明的多肽的功能性没有在可检测的程度、至少用本发明人采用的测试可检测的程度被改变，因而没有必要除去所述甲硫氨酸残基。此外，在生产期间没有发生甲硫氨酸残基的去除。如上所概述，N末端甲硫氨酸残基的切割很大程度上取决于第二氨基酸残基的尺寸。由于本发明的多肽包含额外的甲硫氨酸作为第二氨基酸残基，所观察到的一个效果是仅较低百分比(即在约20％的范围内)的大肠杆菌中的两个N末端甲硫氨酸残基被切去。在剩下的约80％的情况中，两个N末端甲硫氨酸残基没有被切去。当在如大肠杆菌等原核细胞中生产本发明的多肽期间，最终N末端甲硫氨酸可能也会被甲酰化。然而，根据质谱测试本发明人没有获得任何甲酰化产物。此外，无法观测到仅一个甲硫氨酸残基的切割。不欲受理论束缚，据假设第一个N末端甲硫氨酸残基的切割导致第二个N末端甲硫氨酸残基的快速除去，因而造成两个甲硫氨酸残基的切割。
在这点上，本发明的双Met组蛋白提供了在内源性组蛋白的存在下易于被检测的优点。例如，尽管可能无法通过不同模式的HPLC(RPC；SEC；IEX)或电泳(SDS-PAGE，CE)来将双Met组蛋白与其内源性对应物分离，可以通过电喷雾离子化(或串联)质谱(ESI-MS)例如相同的RP-HPLC组分(见实施例)来容易地区分双Met组蛋白。这使得能够在临床试验期间监测治疗性组蛋白的药代动力学而无须使用抵抗检验药物的同位素标记抗体或特殊抗体。
此外，令人吃惊地发现了含有两个甲硫氨酸残基作为其第一和第二N末端氨基酸残基的组蛋白在重组生产中显示出有利性质。因而，本发明人发现导入两个甲硫氨酸残基后能够获得显著更高的组蛋白水平。尽管在发酵后的细菌细胞中的双Met组蛋白产量并非显著更高，但令人吃惊地发现双Met组蛋白在下游处理的第一个关键步骤中的行为显著不同。尽管双Met组蛋白可以在预期盐度被洗脱，但缺乏额外的甲硫氨酸残基的重组组蛋白除了在极高盐度以外无法从Macroprep High S柱上被洗脱并且无法以有效方式被进一步纯化。因此双Met组蛋白在Macroprep HighS柱上展示出优异的行为从而允许有效和高产的纯化过程。
具体实施方式
于是，本发明基于组蛋白N末端处的两个甲硫氨酸残基的存在提供了在内源性组蛋白的存在下提供简单检测的可能性的双Met组蛋白并允许有效的重组蛋白生产的新发现。
在一个优选实施方式中，组蛋白选自由H1.0、H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5和H1t Testis组成的组。
人组蛋白H1亚型的Swiss-Prot登录号为：H1.0——P07305，H1.1——Q02539，H1.2——P16403，H1.3——P16402，H1.4——P10412，H1.5——Q14529和H1t——P22492。人组蛋白H1.2的核酸和氨基酸序列显示于SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中。人组蛋白H1.3的核酸和氨基酸序列显示于SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中。人组蛋白H1.4的核酸和氨基酸序列显示于SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中。人组蛋白H1.5的核酸和氨基酸序列显示于SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13中。
在另一个实施方式中，本发明提供了与本发明的核酸分子互补的核酸分子。
如果核酸分子在许可的盐和温度条件下通过碱基配对彼此天然结合，则它们“互补”。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。根据本发明，“互补”是指在本发明的核酸分子的整个长度上核苷酸的完全碱基配对。因而，如果选择适当的杂交和洗涤条件，则与本发明的核酸分子不完全互补的以可检测标记进行标记的核酸分子不会产生可检测的信号。这种互补核酸分子可以例如用作RNA或DNA制备物的Northern或Southern印迹分析的探针。
在另一方面，本发明提供了本发明的核酸分子的反义寡核苷酸或反义多核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与编码本发明的组蛋白的两个N末端甲硫氨酸残基的核苷酸三联体互补的核苷酸并具有10个核苷酸的最小长度。
所述反义寡核苷酸可以例如用作测序测试的引物或用作RNA或DNA制备物的Northern或Southern印迹分析的探针。本发明的反义寡核苷酸优选包含至少10个，优选为至少15个连续核苷酸，如至少25个连续核苷酸。本发明的反义多核苷酸在长度上更优选包含至少100个，更优选为至少200个且最优选为至少500个核苷酸。这种核酸分子也可用作例如RNA酶保护测试中的探针，或用作抑制本发明的组蛋白表达的反义探针。本领域技术人员熟悉所述探针的制备和使用(见例如，Sambrook和Russel″Molecular Cloning，A Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.(2001))。
在另一个替代实施方式中，本发明提供了包含本发明的核酸分子的载体。所述载体优选为质粒、黏粒、病毒、噬菌体或例如基因工程中常规使用的另一个载体。在另一个实施方式中，本发明提供了包含本发明的互补核酸分子或反义寡核苷酸的载体。
可以将本发明的核酸分子插入数种商购载体中。非限制性实例包括如pUC系列、pBluescript(Stratagene)、包括pETduet载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)的pET系列表达载体等原核质粒载体和如pREP(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)、pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)等哺乳动物细胞中表达的相容载体。适于巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)的质粒载体的实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(均为Invitrogen)。
上文提到的本发明的核酸分子还可被插入载体内从而产生与另一个核酸分子的翻译融合物。所述另一个核酸分子可以编码可能例如增加融合蛋白的溶解性和/或促进纯化的蛋白。非限制性实例包括pET32、pET41和pET43。所述载体也可含有编码促进正确蛋白折叠的一种或多种侣伴蛋白的额外的可表达核酸分子。合适的细菌表达宿主包括例如源自BL21的菌株(如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE)或
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对于载体修饰技术，见上Sambrook等。通常，载体可以含有一个或多个复制起点(ori)和克隆或表达用遗传系统、一个或多个用于宿主中选择的标记(例如，抗生素抵抗)以及一个或多个表达盒。合适的复制起点(ori)包括例如，Col E1、SV40病毒和M 13复制起点。插入载体中的编码序列可以例如通过标准方法合成或分离自天然来源。可以用已确立的方法进行所述编码序列与转录调节元件和/或与其它氨基酸编码序列的连接。保证原核细胞或真核细胞中的表达的转录调节元件(表达盒的一部分)是本领域技术人员所公知的。这些元件包括保证转录起始的调节序列(例如，翻译起始密码子、启动子、增强子和/或隔离子)、内部核糖体进入位点(IRES)(Owens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)，1471-1476)以及可选的保证转录终止和转录物的稳定的聚A信号。另外的调节元件可以包括转录及翻译增强子和/或天然相关的或异源启动子区。本发明的核酸分子优选与允许在原核细胞或真核细胞中表达的表达控制序列可操作性相连。所述载体还可以包含编码分泌信号的核苷酸序列作为进一步的调节元件。这类序列是本领域技术人员所公知的。此外，根据所用表达系统，可以在本发明的核酸分子的编码序列中加入能将表达的多肽导向细胞区室的前导序列。这类前导序列是本领域内所公知的。
保证转录起始的调节元件的可能实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子(劳氏肉瘤病毒)、lacZ启动子、gai10启动子、人类延伸因子1α启动子、CMV增强子、CaM激酶启动子、苜蓿尺蠖多核型多角体病毒(AcMNPV)多角体启动子或SV40增强子。对于在原核细胞中的表达，已经对包括例如tac-lac启动子、lacUV5或trp启动子的大量启动子进行了描述。原核细胞和真核细胞中的其它调节元件的实例包括核酸分子下游的转录终止信号，如SV40聚A位点或tk聚A位点或者SV40、lacZ和AcMNPV多角体聚腺苷酸化信号。
此外，优选本发明的载体包含选择性标记。选择性标记的实例包括抗新霉素、抗氨苄青霉素和抗潮霉素、抗卡那霉素等等。特别设计的载体允许DNA在如细菌-真菌细胞或细菌-动物细胞等不同宿主之间(例如，可获自Invitrogen的
Figure A20088001489400181
系统)穿梭。
本发明的表达载体能引导本发明的核酸分子和编码的多肽的复制和表达。包含所述调节元件的合适的表达载体是本领域内已知的，如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-Vitrogene，如后附实施例中所用)、pSPORT1(GIBCO BRL)或pGEMHE(Promega)、或如λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1或优选的pET载体(Novagen)等原核表达载体。
可以将上文所述的本发明的核酸分子设计来直接导入细胞或通过脂质体、噬菌体载体或病毒载体(例如，腺病毒载体、逆转录病毒载体)导入细胞。另外，可以将杆状病毒系统或基于痘苗病毒或塞姆利基森林病毒的系统用作本发明的核酸分子的真核表达系统。
典型的哺乳动物表达载体含有介导mRNA转录起始的启动子元件、蛋白编码序列以及终止转录和使转录物聚腺苷酸化所需信号。而且，还可包含如复制起点、耐药性基因、调节子(作为诱导型启动子的一部分)等元件。Lac启动子是可用于原核细胞的典型诱导型启动子，可以用乳糖类似物异丙基巯基-b-D-半乳糖苷(“IPTG”)对其诱导。为了进行重组表达和分泌，可以将感兴趣的核酸分子连接于例如将重组蛋白连接于导入外周胞质的PelB前导信号与称为pHEN4的噬菌粒中的基因III(描述于Ghahroudi等，1997，FEBS Letters 414：521-526中)之间。额外的元件可以包括增强子、Kozak序列和由RNA剪接用供体和受体位点旁侧包围的间插序列。用来自SV40的早期和后期启动子、来自逆转录病毒(例如，RSV、HTLVI、HIVI)的长末端重复序列(LTR)以及巨细胞病毒(CMV)的早期启动子可以实现高效转录。然而，也可使用细胞元件(例如，人肌动蛋白启动子)。用于实践本发明的合适的表达载体包括例如，如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC 67109)等载体。可用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela、293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos 1、Cos 7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。作为另一种选择，可以将重组多肽表达在含有整合于染色体内的基因构建体的稳定细胞系内。与如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素等选择性标记的共转染使得可对经转染的细胞进行鉴定和分离。也可将经转染的核酸扩增以表达大量的所编码的多肽。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于发展带有数百甚至数千个拷贝的感兴趣的基因的细胞系。另一个有用的选择标记是酶谷氨酸合成酶(GS)(Murphy等，1991，Biochem J.227：277-279；Bebbington等，1992，Bio/Technology 10：169-175)。使用这些标记使哺乳动物细胞生长于选择性培养基中并选择带有最高抵抗性的细胞。如上所述，表达载体优选包含至少一个选择标记。这类标记包括二氢叶酸还原酶、G418或真核细胞培养物用抗新霉素以及用于大肠杆菌和其它细菌中的培养的抗四环素、抗卡那霉素或抗氨苄青霉素基因。
另外，本发明还涉及用本发明的核酸分子或本发明的载体进行遗传工程化的宿主。所述宿主可以通过将所述核酸分子或载体导入宿主内来产生，所述核酸分子或载体在存在时介导本发明的多肽的表达。
宿主可为任何原核细胞或真核细胞。合适的原核细胞/细菌是常用于克隆的那些原核细胞/细菌，如大肠杆菌(例如，大肠杆菌菌株BL21(DE3)、HB101、DH5a、XL1 Blue、Y1090和JM101)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。合适的真核宿主可以为如CHO、COS、293和Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞、两栖动物细胞、鱼细胞、如果蝇S2和甜菜夜蛾Sf9细胞等昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞、转基因非人动物或转基因植物。
在本发明的一个优选实施方式中，宿主为细菌、酵母菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。用于上述宿主的适当的培养基和条件是本领域内所公知的。
在一个优选实施方式中，待以本发明的核酸分子或载体进行遗传工程化的宿主是大肠杆菌，例如源自BL21(如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE)的菌株或
在另一个实施方式中，本发明还涉及用于产生能表达本发明的多肽的细菌或真核细胞的方法，所述方法包括用本发明的载体对细菌或真核细胞进行遗传工程化。术语“遗传工程化”是指将遗传信息带入细胞或修饰细胞的遗传信息的过程。这通常通过用核酸分子转染或转化宿主细胞来完成。可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导转染、阳离子脂质介导转染、电穿孔、转导、感染或其它方法来实现将构建体导入宿主细胞。在许多标准实验室手册中描述了这些方法，如上文引用的Sambrook等。导入宿主细胞内的所述核酸分子包含编码本发明的多肽的开放阅读框架。
在再一个实施方式中，本发明涉及产生本发明的多肽的方法，所述方法包括在适当条件下培养本发明的宿主并分离出产生自所述宿主或培养物的本发明的多肽。
在本领域中存在大量的在适当宿主中产生多肽的适合方法。如果宿主是如原核生物等单细胞生物、哺乳动物或昆虫细胞，则本领域技术人员能返回到许多培养条件上。方便的是，通过已确立的技术从培养基、培养的生物的裂解物或从隔离的(生物)膜收集产生的蛋白。在多细胞生物的情形中，宿主可以为作为生物的一部分或源自生物的一部分的细胞，例如所述宿主细胞可以为可收集的植物部分。优选方法涉及如上所述在宿主中重组生成蛋白。例如，可以通过PCR合成包含本发明的核酸分子的核酸序列并将其插入表达载体中。随后可以用所述表达载体转化合适的宿主。其后，培养所述宿主以产生所需多肽，并将该多肽其分离并纯化。这些方法是本领域内公知的(见例如，Sambrook等，见上)。
用于产生本发明的多肽的替代方法是体外翻译mRNA。用于本发明的合适的无细胞表达系统包括兔网状细胞裂解物、小麦胚芽提取物、犬胰腺微粒体膜、大肠杆菌S30提取物和如TNT系统(Promega)等偶联转录/翻译系统。这些系统使得在添加包含编码区和适当的启动子元件的克隆载体、DNA片段或RNA序列时可以表达重组多肽。
除了重组产生以外，可以合成产生本发明的多肽(蛋白)、蛋白片段或融合蛋白，例如，通过使用固相技术的直接肽合成(参见Stewart等，(1969)Solid Phase Peptide Synthesis；Freeman Co，San Francisco；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85(1963)，2149-2154)。
可以采用手动技术或自动进行合成蛋白的合成。自动合成可以通过例如使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer，Foster City CA)根据制造商提供的使用说明来进行。可以将不同片段分别进行化学合成并用化学方法合并以产生全长分子。如上所述，可以使用如Houghton所述固相法(Proc.Natl.Acad.Sci.，1985，82：5131)等化学合成。此外，本发明的多肽(蛋白)、蛋白片段或融合蛋白可以半合成产生，例如通过重组和合成生产的组合。不论获取他们所用的生产方法如何，具有经由肽键与(a)成熟真核细胞组蛋白；(b)具有与成熟真核细胞组蛋白至少80％的序列一致性并基本保留其生物活性的成熟真核细胞多肽；或(c)如上所述的本发明的任何其它多肽连接的作为第一和第二N末端氨基酸残基的两个甲硫氨酸残基的所有多肽(蛋白)以及多肽(蛋白)片段和融合蛋白都落在本发明的范围内。这是因为所有这些蛋白的氨基酸序列(也)由本发明的核酸分子编码。
可以通过数种已知技术的任何一种实现蛋白的分离和纯化，例如但不限于离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱、高压液相色谱(HPLC)、反相HPLC、疏水相互作用色谱和制备型圆盘凝胶电泳。蛋白分离/纯化技术可能需要用常规方法对本发明的多肽进行修饰。例如，可以在蛋白中进而加入组氨酸标签以使得能够在镍柱上进行纯化。其它修饰可能造成更高或更低的活性、允许更高水平的蛋白生产或简化蛋白的纯化。
在一个替代性实施方式中，本发明提供了由本发明的核酸分子编码或通过本发明的方法产生的多肽。
本发明还提供了包含本发明的核酸分子、载体、宿主或多肽的组合物。必要时，在所述组合物中还包含下文进一步说明的本发明的抗体、适体或噬菌体。
本发明所用的术语“组合物”涉及包含至少一种所叙述的化合物的组合物。它在必要时包含能改变本发明的化合物的特征从而例如抑制、稳定、阻断、调节和/或激活其功能的其它分子。所述组合物可以为固体、液体或气体形式且尤其可为粉末、药片、溶液或气溶胶的形式。
在一个优选实施方式中，本发明的组合物还包含成熟真核细胞组蛋白。
优选这类组合物包含与成熟真核细胞组蛋白混合的本发明的多肽(双Met组蛋白)。因此，所述组合物可以包含在N末端含有两个甲硫氨酸残基的组蛋白和缺乏两个甲硫氨酸残基的组蛋白的混合物。优选所述混合物在90％的本发明的多肽：10％的成熟真核细胞组蛋白的范围内。所述混合物更优选在80％∶20％的范围内，更优选为70％∶30％。再更优选的是范围为50％∶50％、30％∶70％或20％∶80％的混合物。最优选所述混合物在10％的本发明的多肽：90％的成熟真核细胞组蛋白的范围内。这种混合物可能因宿主生物的甲硫氨酸氨肽酶的活性不足而导致甲硫氨酸被从双Met组蛋白部分切割。作为另一种选择，可以将成熟真核细胞组蛋白添加到本发明的双Met组蛋白中以获得所述混合物。优选所述混合物中的组蛋白为如H1或H2A等相同亚型。
在另一个优选实施方式中，所述组合物是必要时可再包含药物可接受运载体和/或稀释剂的药物组合物。
根据本发明，术语“药物组合物”是指用于对患者且优选为人类患者施用的组合物。本发明的药物组合物包含上述化合物。本发明的药物组合物可以在必要时额外地包含药物可接受运载体。“药物可接受运载体”是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填料、稀释剂、胶囊化材料或制剂辅助剂。合适的药物运载体的实例是本领域内所公知的并且包括氯化钠溶液、磷酸盐缓冲氯化钠溶液、水、如油/水乳状液等乳状液、各类润湿剂、无菌溶液、包括DMSO等的有机溶剂。所述运载体优选为胃肠外运载体，更优选为与接受者的血液等渗的溶液。所述运载体适当含有少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。这些材料在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其它有机酸及其盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基的)多肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它糖类，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；反荷离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如聚山梨酸酯、泊洛沙姆(poloxamer)或PEG。此处所用术语“胃肠外”是指包括静脉内、肌内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用模式。
包含这些运载体的组合物可以通过公知的常规方法进行配制。通常，通过使药物组合物的成分与液体运载体或细分固体运载体或这两者一起均匀并紧密地接触来制备所述制剂。然后在必要时将产物成形为所需制剂。
可以将这些药物组合物以合适的剂量对受试对象施用。给药方案可以通过主治医师和临床因素来确定。如医学领域内所公知，对于任一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其它药物。对于给定情况的治疗有效量可以通过常规实验容易地确定并且处于普通临床医师或医师的技能和判断之内。通常，作为药物组合物的定期施用的方案应为1μg单位/日～20g单位/日。然而，更优选的剂量可为0.01mg单位/日～100mg单位/日，再更优选为0.01mg单位/日～50mg单位/日且最优选为0.01mg单位/日～10mg单位/日。
待用于治疗性施用的药物组合物的成分必须无菌。通过透过无菌滤膜(例如，0.2微米膜)进行过滤易于实现无菌。
药物组合物的成分通常会作为水溶液或重建用冻干制剂储存在单位剂量或多剂量容器(例如，密封的安瓿或小瓶)中。作为冻干制剂的实例，在10ml瓶中充入5ml经无菌过滤的1％(重量/体积)水溶液，并将所得混合物冻干。通过用抑菌注射用水重建所述冻干化合物来制备输注溶液。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，所述药物组合物根据其预期用途可以包含其它试剂。
所述药物组合物可能特别可用于治疗疾病、优选选自上文所述的那些疾病，包括例如癌症、血小板减少症、如细菌、病毒或真菌感染等感染、如系统性红斑狼疮(SLE)或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病、溃疡性结肠炎或如阿尔茨海默症(AD)和帕金森症(PD)等带有淀粉样原纤维的疾病、利什曼病、某些形式的肌病或与血栓性事件有关的心血管病。
本发明所述癌症是指特征为不受控制的细胞分裂和这些细胞通过经侵入在相邻组织内直接生长或通过经转移植入远处位点(其中癌细胞经血流或淋巴系统转运)而扩散的能力的一类疾病或病症。
本发明所述血小板减少症是指血液中存在相对较少的血小板，而正常血小板计数通常在140,000/mm3～400,000/mm3的范围内。
本发明所述感染是外来物种对宿主生物的有害建群。在感染中，感染性生物试图利用宿主的资源以进行繁殖(通常以宿主为代价)。宿主对感染的响应为炎症。
本发明所述细菌感染包括但不限于细菌性脑膜炎、霍乱、白喉、李斯特菌病、百日咳(whooping cough)、肺炎球菌肺炎、沙门氏菌病、破伤风、斑疹伤寒、结核或尿路感染。
本发明所述病毒感染包括但不限于单核细胞增多症、AIDS、水痘、普通感冒、巨细胞病毒感染、登革热、埃博拉出血热、手足口病、肝炎、流行性感冒、腮腺炎、脊髓灰质炎、狂犬病、天花、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎或黄热病。
本发明所述真菌感染包括但不限于曲霉病、芽生菌病、念珠菌病、球孢子菌病、隐球菌病、组织胞浆菌病、组织胞浆菌病或足癣。
本发明所述自身免疫性疾病是指因身体对体内正常存在的物质和组织过于活跃的免疫响应而产生的疾病。自身免疫性疾病是本领域技术人员所公知的并且包括但不限于红斑狼疮、急性播散性脑脊髓炎、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、糖尿病、多发性硬化、视神经炎或类风湿性关节炎。
本发明所述红斑狼疮是指其中免疫系统变得过度活跃并攻击正常组织的慢性(持久性)自身免疫性疾病。这种攻击造成炎症并带来症状。红斑狼疮是“非器官特异”类型的自身免疫性疾病。
本发明所述类风湿性关节炎是致使身体免疫系统攻击骨关节的自身免疫性疾病。
本发明所述溃疡性结肠炎是一种炎症性肠病(IBD)。溃疡性结肠炎是一种结肠炎(一种肠疾病、特别是大肠或结肠疾病)，它包括结肠中的特征性溃疡或开疮。活性疾病的主要症状通常为逐渐开始的带血腹泻。然而，溃疡性结肠炎是影响肠外许多身体部分的系统性疾病。
本发明所述带有淀粉样原纤维的疾病是共享这样的共同特征的疾病：通常可溶的肽淀粉样-β或蛋白α-突触核蛋白积聚在通常造成增加的氧化性损伤、兴奋性毒性和改变的细胞周期的有序原纤维结构内。带有淀粉样原纤维的疾病包括但不限于阿尔茨海默症(AD)和帕金森症(PD)。
阿尔茨海默症是特征为进行性认知退化伴随减少的日常生活活动和神经精神症状或行为变化的神经变性疾病。它是最常见的痴呆症类型。
帕金森症是常常损害患病者的运动技能和语言能力的中枢神经系统退化性病症。
利什曼病是由利什曼虫种引起的锥虫病，利什曼虫是原生动物锥虫属的寄生生物。利什曼病由某些沙蝇物种的叮咬而传播，且症状为皮肤疮以及发烧、脾脏和肝脏损害及贫血。
肌病是肌纤维不起作用而造成肌肉乏力的神经肌肉疾病。已知有数类肌病并且包括但不限于例如肌肉萎缩症、先天性肌病、线粒体肌病或炎性肌病。
本发明所述与血栓性事件有关的心血管病涉及的病症包括但不限于深层静脉血栓或心肌梗死。特别优选涉及由γ-凝血酶介导的血栓性事件的心血管病。
在另一个优选实施方式中，本发明的组合物是诊断组合物。
根据本发明，术语“诊断组合物”涉及用于对个体患者对本发明的药物组合物的可能响应或由本发明的药物组合物的治愈可能性进行诊断的组合物。本发明的诊断组合物包含上述化合物。所述诊断组合物还可包含适当的缓冲液以及如逆转录酶和热稳定聚合酶等酶。所述诊断组合物可以被包装在一个或多个容器中。
本发明还提供了治疗和/或预防疾病的方法，所述疾病选自癌症、血小板减少症、如细菌、病毒或真菌感染等感染、如系统性红斑狼疮(SLE)或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病、溃疡性结肠炎或如阿尔茨海默症(AD)和帕金森症(PD)等带有淀粉样原纤维的疾病、肌病或与血栓性事件有关的心血管病，所述方法包括对有需要的受试对象施用本发明的药物组合物。
本发明还提供了本发明的核酸分子、载体、非人类宿主或多肽在制备用于治疗和/或诊断目的的组合物中的应用。
在一个优选实施方式中，所述治疗目的是治疗癌症、血小板减少症、如细菌、病毒或真菌感染等感染、如系统性红斑狼疮(SLE)或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病、溃疡性结肠炎或如阿尔茨海默症(AD)和帕金森症(PD)等带有淀粉样原纤维的疾病、肌病或与血栓性事件有关的心血管病。
在另一个实施方式中，本发明提供了特异性地与本发明的核酸分子或多肽结合但不与相应的成熟真核细胞组蛋白结合的抗体、适体或噬菌体。
所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
术语“抗体”包括与所述肽或多肽特异性结合的单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或其片段，也包括双特异性抗体、合成抗体、如Fab、F(ab2)’、Fv或scFv片段等抗体片段或任何这些抗体的化学修饰衍生物。单克隆抗体可以例如通过最初描述于
Figure A20088001489400261
和Milstein，Nature 256(1975)，495及Galfré，Meth.Enzymol.73(1981)，3中的技术来制备，所述技术包括将小鼠骨髓瘤细胞与带有由现有技术发展的修饰的源自经免疫的哺乳动物的脾细胞融合。此外，抗上述肽的抗体或其片段可以通过使用例如Harlow和Lane″Antibodies，A Laboratory Manual″，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中所述方法获得。当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可以使用在BIAcore系统中采用的表面等离子共振以增加与本发明的肽或多肽的表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。嵌合抗体的产生描述于例如WO89/09622中。根据本发明可利用的另一种抗体来源是所谓的异种抗体。在小鼠中如人类抗体等异种抗体的产生的一般原理描述于例如WO 91/10741、WO94/02602、WO 96/34096和WO 96/33735中。本发明待采用的抗体或其对应免疫球蛋白链可以使用本领域内已知的常规技术进行进一步修饰，例如，通过单独或组合使用氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或本领域内已知的任何其它修饰。用于在作为免疫球蛋白链的氨基酸序列的基础的DNA序列中导入这类修饰的方法是本领域技术人员所公知的；见例如，Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989。
术语“单克隆”或“多克隆抗体”(见Harlow和Lane，(1988)，见上引)还涉及保留或基本保留了所述抗体的结合特异性的所述抗体的衍生物。尽管下文进一步说明了所述衍生物的特别优选的实施方式，这类抗体的其它优选衍生物是包含例如小鼠或大鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。
术语“scFv片段”(单链Fv片段)是本领域内公知的，且因其较小的尺寸和重组生产这类片段的可能性而受到优选。
优选的是，本发明的抗体、适体、片段或其衍生物特异性地结合靶标蛋白、多肽或片段或其存在或缺失待受监测的表位。
本发明所用术语“特异性结合”是指抗体等与相似结构的多肽或不带两个N末端甲硫氨酸残基的成熟真核细胞多肽不交叉反应或基本不交叉反应。处在研究中的一组抗体等的交叉反应性可以例如通过评估所述抗体等的组在常规条件下(见例如，Harlow和Lane，(1988)，见上引)与感兴趣的多肽以及大量或多或少(在结构和/或功能上)紧密相关的多肽的结合来进行测试。只有与感兴趣的多肽/蛋白结合但不或基本不与优选由与所述感兴趣的多肽相同的组织表达的任何其它多肽结合的那些抗体被认为对所述感兴趣的多肽/蛋白特异并且选用于根据本发明的方法的进一步研究。
在本发明的方法的一个特别优选实施方式中，所述抗体或抗体结合部分是或源自人类抗体或人源化抗体。根据本发明，术语“人源化抗体”是指源自非人类的抗体，其中至少一个如CDR3等可变区中的互补决定区(CDR)且优选所有6个CDR由具有所需特异性的人源抗体的CDR替代。必要时，所述抗体的非人类恒定区已由人类抗体的恒定区替代。用于产生人源化抗体的方法描述于例如EP-A1 0 239 400和WO90/07861中。
适体是基于其结合其它分子的能力选自随机库的DNA或RNA分子。已选择了结合核酸、蛋白、小有机化合物甚至整个生物的适体。在http://aptamer.icmb.utexas.edu/维护有适体数据库。
更具体而言，适体可以被分为DNA或RNA适体或者肽适体。前者由寡核苷酸链(通常为短链)组成，而后者由两端都与蛋白支架相连的短可变肽域组成。
核酸适体是已通过重复轮次的体外选择或同等的SELEX(通过指数式富集的配体系统进化)进行工程化以便结合如小分子、蛋白、核酸等各种分子靶标甚至细胞、组织和生物的核酸物种。
肽适体是被设计来干扰细胞内的其它蛋白相互作用的蛋白。它们由两端都与蛋白支架相连的可变肽环组成。这种双重结构性约束使所述肽适体的结合亲和力极大增加至相当于抗体的水平(纳摩尔范围)。可变环的长度通常包含10～20个氨基酸，且所述支架可以是任何具有良好溶解性的蛋白。目前，细菌蛋白硫氧还蛋白A是最常用的支架蛋白，可变环被插入野生蛋白中的还原活性位点-Cys-Gly-Pro-Cys-环内，两个半胱氨酸侧链能形成二硫键。可以用不同系统进行肽适体选择，但目前最常用的是酵母菌双杂交系统。
由于适体提供了匹敌常用生物分子特别是抗体的分子识别性质，因而它们提供了生物技术和治疗应用的功用。除了其区别性识别以外，由于能完全在试管中工程化、易于通过化学合成产生、拥有理想的储存性质并且在治疗应用中几乎或完全不引起免疫原性，适体提供了超越抗体的优点。
未经修饰的适体被从血流中以数分钟至数小时的半衰期快速清除，这主要是由于核酸酶降解和通过肾脏从体内清除，这是适体固有的低分子量的结果。未修饰适体的应用目前集中于治疗如血凝结等临时病况或在可以进行局部输送时治疗如眼等器官。这种快速清除在如体内诊断成像等应用中可能是优点。可以用如2’-氟取代嘧啶和聚乙二醇(PEG)连接等几种科技工作者可利用的修饰来使适体的半衰期容易地增加至日甚至周的时间规模。
本发明所述噬菌体是指重组噬菌体并且是本领域所公知且描述于例如Griffiths，A.D.等：EMBO J.1994，13：3245中。噬菌体可以将带有对本发明的多肽的期望结合特异性的免疫球蛋白片段或衍生物作为融合蛋白携带于其表面，其中融合伴侣是噬菌体的表面分子。
在本发明的方法的一个优选实施方式中，将所述抗体、适体或噬菌体可检测地进行标记。优选用3H或32P或如上所述的荧光标记来对适体进行放射性标记，而可以例如以相应的方式(以131I作为优选放射性标记)或用如His标签、FLAG标签或myc标签等标签来对噬菌体或抗体进行标记。
在一个替代性实施方式中，本发明提供了包含所述抗体、适体和/或噬菌体的诊断组合物。所述组合物还可包含适当的缓冲物和如逆转录酶和热稳定聚合酶等酶。
所述诊断组合物可以被用来测试在例如使用本发明的抗体的免疫测试中本发明的多肽的存在。此处所用术语“免疫测试”包含如免疫沉淀、免疫印迹、ELISA、RIA和间接免疫荧光实验等方法。这类技术是本领域内公知的并且描述于例如见上Harlow和Lane中。
在一个替代性实施方式中，本发明提供了用于测试本发明的核酸分子或多肽的存在的方法，所述方法包括测试得自受试对象的样品中所述核酸分子或多肽的存在。
用于测试样品中本发明的核酸分子的存在的方法包括但不限于核酸扩增、测序或杂交测试。
核酸扩增测试的实例和进行这些测试的方法包括但不限于PCR(包括嵌套式PCR、RT-PCR、PCR扩展测试、核酸序列碱基扩增(NASBA)、单链构象多态性(SSCP)PCR)、扩增受阻突变系统(ARMSTM)和扩增受阻突变系统线性扩展(ALEXTM)测试。这些方法的细节可见于本领域中，见例如，Newton等，Nucleic Acids Res.17(1989)2503-2516；Agrawal编著的″Protocols for Oligonucleotides and Analogs：Synthesis and Properties(Methods in Molecular Biology，20)″，Humana Press，1993；Haque等，Diagn.Mol.Pathol.7(1998)248-252；Innis等编著的″PCR Applications：Protocolsfor Functional Genomics″，Academic Press，1999；Chen和Janes编著的″PCRCloning Protocols：From Molecular Cloning to Genetic″，第二版，HumanaPress，2002；Pissardet等，Clin.Chem.48(2002)769-772；Steemers等；Nature Meth.3(2006)31-33；Kakavas等，J.Clin.Lab.Anal.20(2006)1-7。
测序测试的实例包括但不限于通过直接测序、自动DNA测序仪中的荧光SSCP和焦磷酸测序的序列分析方法。这些程序常见于本领域中，见例如Adams等编著的″Automated DNA Sequencing and Analysis″，Academic Press，1994；Alphey，″DNA Sequencing：From ExperimentalMethods to Bioinformatics″，Springer Verlag Publishing，1997；Ramon等，J.Transl.Med.1(2003)9；Meng等，J.Clin.Endocrinol.Metab.90(2005)3419-3422。
杂交测试的实例包括但不限于Northern和Southern印迹测试、异源双链体分析、通过序列特异性寡核苷酸杂交的突变检测、DNA芯片上的等位基因特异性寡核苷酸杂交、基于
Figure A20088001489400301
技术的测试、基于
Figure A20088001489400302
技术的测试，见例如，Barnes等，Nucleic Acids Res.33(2005)5914-5923；Fan等，Biotechniques 39(2005)583-588；Shen等，Mutat.Res.-Fund.Mol.M.573(2005)70-82；Steemers和Gunderson，Pharmacogenomics，6(2005)777-782。
基于蛋白检测的测试的实例包括但不限于如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、反向HPLC、圆盘凝胶电泳、毛细管电泳、Western印迹分析、免疫沉淀、氨基酸测序、光谱方法(UV、CD、IR、Fluoreszenz)和质谱(例如，MS-QTOF)等方法步骤，见例如，Soejima和Koda，Transfusion 45(2005)1934-1939；Yeh等，Anesth.Analg.101(2005)1401-1406；Chou等，Am.J.Clin.Pathol..124(2005)330-338。
上述测试是本领域内已知的，例如来自如Lottspeich，Engel″Bioanalytik″Spektrum Akademischer Verlag(2006)；Sambrook，Russell″Molecular Cloning，A Laboratory Manual″，Gold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)；Ausubel，″Current Protocols in Molecular Biology″，GreenPublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)；Higgins和Hames编著的″Nucleic acid hybridization，a practical approach″IRL Press Oxford，Washington DC，(1985)；Nollau等，Clin.Chem.43(1997)，1114-1128等标准教材；在后附实施例中描述了某些所述测试的应用。
在本发明的方法的另一个优选实施方式中，样品是血液、血清、血浆、胎儿组织、唾液、尿液、粘膜组织、粘液、阴道组织、获自阴道的胎儿组织、皮肤、毛发、毛发毛囊或其它人类组织。样品优选为血液、血清、血浆、唾液、尿液、粘膜组织、粘液。
本发明还涉及在一个或多个容器中包含本发明的核酸分子、载体、非人类宿主、多肽或抗体、适体和/或噬菌体的试剂盒。
附图说明
图1：纯化过程的示意性概况；
图2：B1，M-H1A-P02临床批次的QTOF质谱；
图3：B2，M-H1A-Pool01临床批次的QTOF质谱。
实施例
现在通过参考以下实施例对本发明进行描述，所述实施例仅为说明性而不应被解释为是对本发明的范围的限制。
实施例1：hH1.3构建体的克隆
质粒载体pEGT1-rH1.3S1的构建
如SEQ ID NO：1所示，组蛋白展示出因很高含量的赖氨酸残基造成的强正电荷。由于赖氨酸的密码子使用在大肠杆菌和人类之间差别很大，进行密码子优化以便使人类组蛋白H1.3序列适应于大肠杆菌的密码子使用。
生成其序列作为SEQ ID NO：2给出的合成基因。所述人造序列被两个限制位点即BspH1和BamH1旁侧包围以允许随后导入pEGT1表达载体。将翻译起始密码子ATG加入Nco1限制位点CCATGG内。起始ATG被加倍，这提供了其粘性末端CATG与Nco1相容的BspH1位点TCATGA。因而，在第一个甲硫氨酸残基后加入了第二个甲硫氨酸残基。将另一个BamH1位点GGATCC导入终止密码子TAA之后。由该人造基因编码的氨基酸序列在SEQ ID NO：3中给出。
通过用BspH1和BamH1消化将经优化的基因从其质粒上切下并插入由NCO1和BamH1根据标准方案线性化的pEGT1表达载体内以产生质粒pEGT1-rH13S1。
使用标准方案通过电穿孔将连接载体pEGT1-rH13S1导入电感受态大肠杆菌菌株BL21[DE3]内并在补充有卡那霉素的LB板上选取转化细胞。选取一个克隆体并验证编码所述组蛋白的插入物的序列与SEQ IDNO：2的完美匹配。
质粒载体pEGT1-rH1.3S2的构建
为了抑制第二个甲硫氨酸插入rH13S1构建体，使用了第二种合成基因。将编码丝氨酸的第二个原始密码子TCC变为也编码丝氨酸的AGC以保证与BspH1位点的相容性。DNA序列作为SEQ ID NO：4给出，且由该人造基因编码的重组蛋白以SEQ ID NO：5给出。由于SEQ ID NO：4的人造基因被BspH1限制位点TCATGA在起始密码子处且由终止密码子后BamH1 CCATGG一对碱基对旁侧包围，故采用与上文概述的pEGT1-rH13S1克隆策略相同的克隆策略。
通过用BspH1和BamH1消化将经优化的基因从其质粒上切下并插入由NCO1和BamH1根据标准方案线性化的pEGT1表达载体内以产生质粒pEGT1-rH13S2。
使用标准方案通过电穿孔将连接载体pEGT1-rH13S2导入电感受态大肠杆菌菌株BL21[DE3]内并在补充有卡那霉素的LB板上选取转化细胞。选取一个克隆体并验证编码所述组蛋白的插入物的序列与SEQ IDNO：4的完美匹配。
实施例2：组蛋白H1.3的重组制备
菌株
用于制备rh1.3S的细菌是大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pEGT1/H1.3S。将所述构建体用于转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。选取3个克隆体以进行表达筛选并选择1个克隆体作为预主种子(pre-Master Seed)(Pre-MS-05L23-H1B)。
用Pre-MS-05L23-H1B制备主种子(Master Seed)(MS-06D05-H1B)并用该主种子制备工作种子(Working Seed)(WS-06D06-H1B)。
种子培养
各以100μl工作种子(WS-06D06-H1B)接种到2个各含500ml YES培养基(30g/l酵母菌提取物，5g/l NaCl)的2升摇瓶中。在37℃将培养物在270rpm搅拌下温育5h00(+/-0.5小时)以达到超过1.5的O.D(600nm)。
发酵
用100升NRJ18培养基准备100升发酵罐。将发酵罐在123℃消毒30分钟。在消毒后且接种前，无菌添加50ml SAG 471(消泡剂)。用种子培养物接种发酵罐以便在600nm达到8.75×10-7的理论初始光密度。将计算好的接种物体积加入含500ml YES培养基的转移瓶中。
在37℃过夜进行发酵。在发酵过程中，通过周期性添加4M的NaOH和2.24M的HNO3来将pH值维持在pH 7.0±0.2。通过搅拌将溶解的氧气反馈调节在30％。
当培养物达到15～20的OD600时，用1mM IPTG溶液(23.8g溶解于500ml高纯水中)诱导培养物。
1h30诱导后，OD600大于24并将发酵罐冷却至低于16℃。pH调节维持在7.0±0.2。在冷却过程中，除将压力降至300豪巴并将搅拌降至200rpm以外，保持其它参数恒定。
当培养基温度低于16℃时，对培养物的体积进行估计。用装配有JLA8.1000转子(±6L/离心机)的2个Beckman离心机JA10离心整个培养物：5200RPM-4℃-20分钟。
收集细胞沉淀并在离心步骤期间逐渐储存在-20℃。
高压均质器中的细胞破碎
在细胞破碎前一天，将相当于100升培养物的浓缩细胞在室温融化。
破碎当天，将细胞沉淀在20mM pH 7.0的Na2HPO4·12H2O中稀释为250g/l并将悬浮液的温度升至30℃。
然后在Heidolph R2R2100螺旋桨下均质化。然后将细胞在高压均质器PONY(800巴)中裂解。通过该细胞均质器将细胞悬浮液处理2次。
实施例3：蛋白纯化
所有步骤都在发酵罐的总体积(即，100l)上进行。
1.用2.5％高氯酸沉淀和8M脲萃取
将1/7体积的20％HClO4(最终浓度：2.5％)加入收集的细胞物质。将悬浮液均质化然后在Pony均质器中在250巴进行第三次循环。在室温将溶液继续温和搅拌1小时。然后将悬浮液离心15分钟(12,200g～7,000rpm，4℃)。收集上清液，用10M NaOH将pH值调节为4.0±0.1并透过0.45/0.22μm Sartopore 2膜(2000cm2)过滤至无菌袋内。
添加脲以在双倍最终体积中获得8M的浓度，体积由20mM pH 7.0的Na2HPO4缓冲液调节。在室温温和搅拌下将溶液保持过夜。然后用37％HCl或10M NaOH将pH值调节至4.0±0.1。
2.Q Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱(QSFF)——负模式
该步骤的目的是减少内毒素和DNA含量。阴离子交换色谱用填装于Moduline 350/500柱(Millipore BioProcess Division目录号86351211)中的Q Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences目录号17-0510-05)进行。
所述柱装于洗脱流速为120cm/h(115.4l/h)的高纯水中。填装柱床的尺寸为：直径25em，横截面积＝961cm2，床＝18cm，填装体积＝17.314±0.962l。用1.5～2.5柱体积(CV)的1M NaOH+2M NaCl在96.2l/h(100cm/h，1603ml/min)的流速下以2小时的接触时间将柱消毒。所有色谱步骤都在约100cm/h(+96.2l/h)的线性流速下进行。用1～2CV的pH 4.0的50mM乙酸铵+1M NaCl稳定pH值。然后用3.5～5CV的pH 4.0的50mM乙酸铵+8M脲使柱平衡。
用pH 4.0的50mM乙酸铵+8M脲将来自脲萃取物的溶液(见第1部分)稀释约1.5倍以获得低于10mS/cm的电导率。在同一时间仅加载8CV的脲萃取溶液(稀释前)。H1蛋白被收集在流通液中，用1.5～2.5CV的pH 4.0的50mM乙酸铵+8M脲进行平衡-洗脱。
洗脱后，用1.5～2.5CV的pH 4.0的50mM乙酸铵+1M NaCl清洁柱。在1M NaCl中的洗脱允许消除DNA和内毒素。然后用1.5～2.5CV的1M NaOH+2M NaCl将柱消毒(2h)并于室温储存在20mM NaOH中。
3.Macroprep High S阳离子交换色谱(MHS-E)——正模式
阳离子交换色谱用装填于Vantage 180/500柱(Millipore BioProcessDivision目录号87018001)中的Macroprep High S(Bio-Rad Laboratories目录号156-0033)进行。所述柱装于洗脱流速为260cm/h(66.1l/h)的高纯水中。填装柱床的尺寸为：直径18cm，横截面积＝254.4cm2，床＝36em，填装体积＝9.16±0.25l。
用1.5～2.5CV的1M NaOH+2M NaCl在40l/h(157cm/h)的流速下以2小时的接触时间将柱消毒。最大流速可为250cm/h。用1.5～2.5CV的pH 2.0的50mM乙酸铵+2M NaCl稳定pH值。然后用4～5.5CV的pH 2.0的50mM乙酸铵使柱平衡。
用37％HCl将QSFF-FT组分(见第2部分)的pH值调节至2.0。将该溶液不用预先稀释而以125cm/h(±31.8l/h)的流速加样。凝胶的结合能力是5mg/ml～15mg/ml基质。加样后，用2～3CV的pH 2.0的50mM乙酸铵在157cm/h(40l/h)的流速下使柱平衡。最大流速为200cm/h。
用pH 2.0的50mM乙酸铵和pH 2.0的50mM乙酸铵+2M NaCl以10CV上25％(0.5M NaCl)～75％(1.5M NaCl)的导电性线性梯度进行洗脱。洗脱在157cm/h(40l/h)的流速下进行。最大流速为200cm/h。将洗脱峰收集在2升组分中，在汇集前通过SDS-PAGE分析该组分。汇集后，将MHS-E汇集物在下次纯化步骤前储存于-20℃，或如果在24小时内使用则储存于2℃～8℃。
然后用1.5～2.5CV的1M NaOH+2M NaCl将柱消毒(2h)并在室温下储存在20mM NaOH中。
4.浓缩——渗滤
用两个Sartocon盒(0.6m2，截留5kDa)Hydrosart Sartorius膜(Sartopore目录号302 144 2906 E-SG)进行浓缩。将膜安装在连接至Proflux M12系统(Millipore Bioprocess Division)的保持器中。将膜用注射用水(WFI)清洗。通过60分钟0.5M NaOH的连续再循环进行消毒。然后用pH 7.0的20mM Na2HPO4·12H2O清洗膜直至渗透液pH＝7.0±0.1。然后用pH 7.4的PBS(NaC18g/l，KH2PO40.19g/l，Na2HPO42.38g/l)使膜平衡直至渗透液pH＝7.4±0.1。
将输入压和输出压分别设定为1.5巴±0.1巴和1.2巴±0.1巴。
将数次Macroprep High S洗脱液汇集在一起并根据蛋白总量浓缩至对应于30mg/ml的理论浓度的体积。浓缩后，将滞留物用10体积的pH 7.4的PBS(NaC18g/l，KH2PO40.19g/l，Na2HPO42.38g/l)渗滤。收集滞留物并对膜进行7次洗涤，每次以相同的过程参数用150ml pH 7.4的PBS(NaC18g/l，KH2PO40.19g/l，Na2HPO42.38g/l)洗涤3分钟。洗涤过程中关闭渗透管。
对滞留物和各个单独洗涤组分进行BCA蛋白测试。将滞留物与选定的洗涤组分汇集以获得大于12mg/ml的总浓度和如果可能时大于90％的产率。
用WFI清洗膜。通过60分钟0.5M NaOH的连续再循环进行消毒。然后将膜储存在0.1M NaOH中。
5.无菌过滤
在室温的1000cm2 0.45/0.22 Sartopore 2过滤器(Sartorius目录号544-1307-H8-00)上进行滞留物和选定洗涤组分的无菌过滤。使用前将膜用约500ml pH 7.4的PBS(NaC18g/l，KH2PO40.19g/l，Na2HPO42.38g/l)清洗。
用蠕动泵在约100ml/分钟的流速下进行过滤，将滤液收集于无菌和无热原的5L或10L一次性瓶中。
根据在滤出本体上进行的BCA测试，用通过过滤添加的pH 7.4的PBS(NaC18g/l，KH2PO40.19g/l，Na2HPO42.38g/l)将浓度调节至10mg/ml。取样后，将无菌本体等分于PETG 2000ml Nalgene瓶中(±1500mi/瓶～1700ml/瓶)。将无菌本体储存于-20℃。图1中提供了制备步骤的示意性总结。
实施例4：hH1.3和双Met hH1.3纯化效率
通过在总裂解细胞的系列稀释液上的SDS-PAGE分析的评估，50L发酵罐中的BL21[DE3]-双Met rH1.3培养物在收集时给出至少600mg/L培养物的产量。完全纯化过程后的最终产量为超出500mg/L的纯化双Met rH1.3。
通过在总裂解细胞的系列稀释液上的SDS-PAGE分析的评估，50L发酵罐中的BL21[DE3]-hH1.3培养物在收集时给出至少600mg/L培养物的产量。将细胞根据标准方案通过均质化和用HClO4沉淀进行处理。所获结果符合预期。也照常进行MacroPrep High-S上的加样，然而，用10mMNaCH3COO pH 2.0和10mM NaCH3COO+2M NaCl pH 2.0以10CV上30％(0.6M NaCl)～75％(1.5M NaCl)的导电性线性梯度无法将rhH1.3蛋白从柱上洗脱。尽管在2M NaC1将rhH1.3蛋白洗脱，该步骤没有允许足够的纯化且所述蛋白不能被进一步处理。因而，只能认为纯化失败。从两次不同发酵进行的两个独立纯化试验证实了这一失败。
实施例5：双Met组蛋白H1.3的体外效果
抑制区测试
为测定重组组蛋白作为抗菌剂和抗病毒剂的效果，根据标准方法进行了抑制区测试。此外，还测试了重组组蛋白作为抗真菌剂的效果。细菌和真菌在根据上文概述的方法产生的双Met组蛋白H1.3的存在下生长，并确定平均区域直径(见表1)。
如表1所示，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及真菌均被有效消除。
表1：抑制区测试
Figure A20088001489400381
细胞毒性测试
该细胞测试检测组蛋白在组蛋白敏感白血病细胞系(例如，U-937)上的毒性效果。通过AlamarBlue测试基于对氧化还原指示剂的荧光的观测来监测在不同组蛋白浓度下温育后的白血病癌细胞的活力，所述氧化还原指示剂的荧光响应于细胞活力的变化而变化。组蛋白抗癌活性由IC50表征，IC50对应于观察到50％癌细胞活力时的组蛋白浓度。用于细胞毒性测试以及临床试验的批次总结于表2中。如表1所示，不论H1.3和双Met(参见表3)的含量如何不同，所有受测样品都显示出相似的对肿瘤细胞系U-937的高细胞毒性。
表2：用于临床试验中的批次的细胞毒性
Figure A20088001489400382
除表1中所示细菌和真菌以外，通过如本文概述的任何方法等本领域已知方法可以方便地对其它细菌、真菌和病毒进行测试。非限制性实施例包括爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr-Virus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、肠球菌(Enterococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)和沙门氏菌(Salmonella)。
实施例6：临床数据
在患复发性或顽固性AML的患者和拒绝化学疗法或不合化学疗法资格的患者中进行I/II期剂量递增试验以评估重组人类组蛋白H1.3(rhH1.3)的最大耐受量(MTD)。患者包括标准是：已签署知情同意书、任何种族、任何性别、至少18岁、带有至少20％骨髓胚胞的经细胞学证实的AML、标准化学疗法后失败、不适宜或拒绝标准化学疗法、适当的行为表现状态(Kamowsky指数＞60％)和至少30天的期望寿命。导致将患者排除的标准是重大器官缺陷、已知HIV感染、已知丙肝病毒或乙肝病毒感染、妊娠或哺乳、其它恶性肿瘤、循环抗H1抗体、第一次就诊前两周期间或研究参与期间的肝素治疗、如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)以及酒精和/或药物滥用等已知可能干扰rhH1.3治疗的活性医疗状况。
研究设计
患者连续3周每周接受3次输注。起始剂量为38mg/m2。所用剂量递增表如表3所示。
表3：剂量递增表
Figure A20088001489400391
在Homburg的Saarland University Hospital对AML(急性骨髓性白血病)患者进行I/II期临床试验。在该试验中使用的药物产品批次为：B1、B2、B3和B4。这4个批次和毒理学研究中所用一个GLP批次的特征如下表4中所示：
表4：研究中所用多肽批次的特征
Figure A20088001489400401
*用于毒性研究，未用于临床试验
AL：接受极限值
MS峰：22221Da    H1.3     无Met
      22481Da    双Met    N末端Met-Met
6.1初步评估
表5总结了用重组人类组蛋白H1.3(rhH1.3，“Oncohist”)以递增剂量水平(所谓的斐波那契表)治疗的前22位AML患者的初步临床结果。
患者WW13和WW27各自接受了2个治疗周期(一个周期包括3周内每周3次输注，共9次)。WW27在每个周期中采用了剂量递增，即5-5-6：两周剂量水平为5，第三周剂量水平为6，且类似地在第二个周期中剂量水平为：6-6-7。
表5：初步评估中获得的用重组人类组蛋白H1.3(“Oncohist”)治疗的AML患者的临床结果
Figure A20088001489400411
初步分析：
PR：部分缓解
TTI：暂时血小板增加
TN；血小板水平正常
TLI：暂时白细胞增加
NSE：无副作用
H1.3：成熟重组人类组蛋白H1.3；双Met：N-Met-Met-H1.3
从表5中显而易见，药物副作用仅作为内毒素污染的结果而出现(也见表3)。就效能的临床征象而言，天然存在的组蛋白H1.3和“双Met”衍生物都显示出相似的性质。
免疫原性
在治疗之前、期间和之后对所有患者筛选抗组蛋白H1.3自身抗体的存在。没有受治疗患者在治疗期间发展出自身抗体，接受一个治疗周期和接受两个治疗周期的患者都没有发展出自身抗体。组蛋白H1是在进化中非常保守的蛋白，既未预期也未证实其为免疫原性。临床数据确认了使用天然存在的组蛋白H1.3或“双Met”衍生物时均未观察到免疫原活性。
治疗效果
约50％的患者显示出血小板增加且其中一部分还显示出白细胞增加，两者均为非常关键的AML生物标记。3位患者得到部分缓解(肿瘤细胞减少至少于50％的初始值)。患者WW13显示出血小板增加至正常水平(210×109/l)长达18个月。在用Oncohist治疗前其血小板计数等于47×109/l。
6.2临床结果的最终评估
表6总结了在对用重组人类组蛋白H1.3(rhH1.3，“Oncohist”)以递增剂量水平(所谓的斐波那契表)治疗的22位AML患者进行更详细分析后获得的临床结果。
如上所述，患者WW13和WW27各自接受了2个治疗周期(一个周期包括3周内每周3次输注，共9次)。WW27在每个周期中采用了剂量递增，即5-5-6：两周剂量水平为5，第三周剂量水平为6，且类似地在第二个周期中剂量水平为：6-6-7。
表6：最终评估中用重组人类组蛋白H1.3(“Oncohist”)治疗的AML患者的临床结果
Figure A20088001489400431
*初步分析
**9次输注中的一次后AE，恢复
***在最后一次输注期间SAE，74岁患者心房纤颤，相关性可疑
PR：部分缓解
TI：血小板增加
TN；血小板水平正常
TL：白细胞增加
AE：副反应，SAE：严重副反应
H1.3：成熟重组人类组蛋白H1.3；双Met：N-Met-Met-H1.3
治疗效果
根据最终评估，22位患者中的7位显示出血小板增加且其中一部分还显示出白细胞增加，两者均为非常关键的AML生物标记。3位患者得到部分缓解(肿瘤细胞减少至少于6％～25％且伴有其它血液值的改善)。患者WW13显示出血小板增加至正常水平(210×109/l)长达18个月。在用Oncohist治疗前其血小板计数等于47×109/l。
安全性评估
临床研究报告显示，rhH1.3(Oncohist)在目前为止的治疗剂量是安全的。没有观察到严重的副作用，除了一次rhH1.3输注下的心房纤颤，这被认为可能与研究药物有关。17位患者完成了一个治疗疗程(8～9次施用)，且2位有响应的患者接受了第二个疗程而没有副作用。没有观察到剂量限制毒性且在628mg/m2未达到最大耐受剂量。
最重要的是，与细胞抑制剂相反，患者对纯净的无内毒素的研究药物耐受良好，即无副作用。该结果与临床前研究相符，显示出重组人类组蛋白H1.3衍生物没有损害健康血细胞且没有造成抵抗。
实施例7：样品中双Met hH1.3的存在的评估
通过MS可以容易地将“双Met”组蛋白hH1.3与内源性组蛋白H1区分开。这可以用ESI-QTOF对原始未处理的rhH1.3药物产品溶液进行检测或采用RP-HPLC色谱分离和随后的ESI-MS检测的RP-HPLC-ESI-MS过程来直接分析。如图2中可见，批次B1含有组蛋白H1.3和N-Met-Met衍生物两者。图3显示出3个批次之一(B2)，其主要由N-Met-Met-H1.3组成。不同的批次不依赖于组成而显示出相当的抗白血病细胞的细胞毒性活性(表3)。
下列谱图通过串联质谱(QTOF，四极杆和飞行时间谱在单个仪器中的组合)获得。如图2中可见，批次B1含有组蛋白H1.3和N-Met-Met衍生物两者。图3显示出3个批次之一(B2)，其主要由N-Met-Met-H1.3组成。不同的批次不依赖于组成而显示出相当的抗白血病细胞的细胞毒性活性(表3)。
序列表
<110>西姆拜奥泰克生物技术领域研究开发有限责任公司
     米歇尔·特里
<120>双Met组蛋白
<130>N1720 PCT
<150>EP 07 00 7200.4
<151>2007-04-05
<150>EP 07 01 8956.8
<151>2007-09-26
<160>13
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>220
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Ser Glu Thr Ala Pro Leu Ala Pro Thr Ile Pro Ala Pro Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Thr Ala Gly Lys
            20                  25                  30
Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys Lys
    50                  55                  60
Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg Ile
65                  70                  75                  80
Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln Thr
                85                  90                  95
Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala Ala
            100                 105                 110
Ser Gly Glu Gly Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala Lys Pro
        115                 120                 125
Arg Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly Ala
    130                 135                 140
Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val Lys Lys
145                 150                 155                 160
Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys Lys
                165                 170                 175
Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys Ala
            180                 185                 190
Lys Ala Pro Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys Pro Lys
        195                 200                 205
Val Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Lys
    210                 215                 220
<210>2
<211>678
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<221>来源
<223>/注释＝″人造序列的说明：双Met组蛋白rH1.3″
<400>2
tcatgatgtc cgaaaccgct ccgctggctc cgaccatccc ggctccggct gaaaaaaccc   60
cggttaagaa aaaggctaaa aaagctggtg ctaccgctgg taaacgtaaa gcttccggtc  120
cgccggtttc cgaactgatc accaaagctg ttgctgcttc caaagaacgt tccggtgttt  180
ccctggctgc tctgaaaaaa gctctggctg ctgctggtta cgacgttgag aaaaacaact  240
cccgtatcaa actgggtctg aaatccctgg tttccaaagg caccctggtt cagaccaaag  300
gcaccggtgc ttccggttcc ttcaaactga acaaaaaagc tgcttccggt gaaggtaaac  360
cgaaagctaa gaaagcgggt gcggctaaac cgcgtaaacc ggctggtgct gctaaaaaac  420
cgaaaaaagt tgctggtgct gctaccccga aaaaatccat caagaaaacc ccgaaaaaag  480
ttaaaaaacc ggctaccgct gctggcacca aaaaagttgc taaatccgct aaaaaagtta  540
aaaccccgca gccgaaaaaa gctgctaaat ccccggctaa agctaaagct ccgaaaccga  600
aagctgctaa accgaaatcc ggtaaaccga aagttaccaa agctaaaaag gctgctccga    660
aaaagaaata atggatcc                                                  678
<210>3
<211>222
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<221>来源
<223>/注释＝″人造序列的说明：双Met组蛋白rH1.3″
<400>3
Met Met Ser Glu Thr Ala Pro Leu Ala Pro Thr Ile Pro Ala Pro Ala
1               5                   10                  15
Glu Lys Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Lys Lys hla Gly Ala Thr Ala
            20                  25                  30
Gly Lys Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys
        35                  40                  45
Ala Val Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu
    50                  55                  60
Lys Lys Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser
65                  70                  75                  80
Arg Ile Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val
                85                  90                  95
Gln Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys
            100                 105                 110
Ala Ala Ser Gly Glu Gly Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala
        115                 120                 125
Lys Pro Arg Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala
    130                 135                 140
Gly Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val
145                 150                 155                 160
Lys Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala
                165                 170                 175
Lys Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala
            180                 185                 190
Lys Ala Lys Ala Pro Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys
        195                 200                 205
Pro Lys Val Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Lys
    210                 215                 220
<210>4
<211>675
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<221>来源
<223>/注释＝″人造序列的说明：组蛋白rH1.3″
<400>4
tcatgagcga aaccgcgccg ctggcgccga ccattccggc gccggcggaa aaaaccccgg   60
ttaaaaaaaa agcgaaaaaa gccggtgcga ccgcgggtaa acgtaaagcg agcggtccgc  120
cggttagcga actgattacc aaagcggttg cggcgagcaa agaacgtagc ggtgttagcc  180
tggcggcgct gaaaaaagcg ctggcggcgg cgggttatga tgtggaaaaa aacaacagcc  240
gcatcaaact gggtctgaaa agcctggtta gcaaaggcac cctggttcag accaaaggca  300
ccggtgcgag cggtagcttt aaactgaaca aaaaagcggc gagcggtgaa ggtaaaccga  360
aagccaaaaa agcgggcgcg gcgaaaccgc gtaaaccggc gggtgcggcg aaaaaaccga  420
aaaaagttgc gggtgcggcc accccgaaaa aaagcatcaa aaaaaccccg aaaaaagtga  480
aaaaaccggc caccgcggcg ggcaccaaaa aagtggcgaa aagcgcgaaa aaagttaaaa  540
ccccgcagcc gaaaaaagcg gccaaaagcc cggcgaaagc gaaagcgccg aaaccgaaag  600
cggccaaacc gaaaagcggt aaaccgaaag ttaccaaagc gaaaaaagcg gcgccgaaaa  660
aaaaataatg gatcc                                                   675
<210>5
<211>221
<212>PRT
<213>人造序列
<220>
<221>来源
<223>/注释＝″人造序列的说明：组蛋白rH1.3″
<400>5
Met Ser Glu Thr Ala Pro Leu Ala Pro Thr Ile Pro Ala Pro Ala Glu
1               5                   10                  15
Lys Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Thr Ala Gly
            20                  25                  30
Lys Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala
        35                  40                  45
Val Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys
    50                  55                  60
Lys Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg
65                  70                  75                  80
Ile Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln
                85                  90                  95
Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala
            100                 105                 110
Ala Ser Gly Glu Gly Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala Lys
        115                 120                 125
Pro Arg Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly
    130                 135                 140
Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val Lys
145                 150                 155                 160
Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys
                165                 170                 175
Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys
            180                 185                 190
Ala Lys Ala Pro Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys Pro
        195                 200                 205
Lys Val Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Lys
    210                 215                 220
<210>6
<211>642
<212>DNA
<213>智人
<400>6
atgtccgaga ctgctcctgc cgctcccgct gccgcgcctc ctgcggagaa ggcccctgta   60
aagaagaagg cggccaaaaa ggctgggggt acgcctcgta aggcgtccgg tcccccggtg  120
tcagagctca tcaccaaggc tgtggccgcc tctaaagagc gtagcggagt ttctctggct  180
gctctgaaaa aagcgttggc tgccgccggc tatgatgtgg agaaaaacaa cagccgtatc  240
aaacttggtc tcaagagcct ggtgagcaag ggcactctgg tgcaaacgaa aggcaccggt  300
gcttctggct cctttaaact caacaagaag gcagcctccg gggaagccaa gcccaaggtt  360
aaaaaggcgg gcggaaccaa acctaagaag ccagttgggg cagccaagaa gcccaagaag  420
gcggctggcg gcgcaactcc gaagaagagc gctaagaaaa caccgaagaa agcgaagaag  480
ccggccgcgg ccactgtaac caagaaagtg gctaagagcc caaagaaggc caaggttgcg  540
aagcccaaga aagctgccaa aagtgctgct aaggctgtga agcccaaggc cgctaagccc  600
aaggttgtca agcctaagaa ggcggcgccc aagaagaaat ag                     642
<210>7
<211>213
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Pro Ala Glu
1               5                   10                  15
Lys Ala Pro Val Lys Lys Lys Ala Ala Lys Lys Ala Gly Gly Thr Pro
            20                  25                  30
Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys Lys
    50                  55                  60
Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg Ile
65                  70                  75                  80
Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln Thr
                85                  90                  95
Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala Ala
            100                 105                 110
Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Val Lys Lys Ala Gly Gly Thr Lys Pro
        115                 120                 125
Lys Lys Pro Val Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Ala Gly Gly
    130                 135                 140
Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys
145                 150                 155                 160
Pro Ala Ala Ala Thr Val Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Pro Lys Lys
                165                 170                 175
Ala Lys Val Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Ala Ala Lys Ala
            180                 185                 190
Val Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Val Val Lys Pro Lys Lys Ala
        195                 200                 205
Ala Pro Lys Lys Lys
    210
<210>8
<211>666
<212>DNA
<213>智人
<400>8
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aagaaaaagg cgaagaaggc aggcgcaact gctgggaaac gcaaagcatc cggaccccca    120
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atcaagcttg gcctcaagag cttggtgagc aaaggtactc tggtgcagac caaaggtacc    300
ggtgcttctg gctccttcaa actcaacaag aaagcggctt ccggggaagg caaacccaag    360
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aagtga                                                               666
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<211>220
<212>PRT
<213>智人
<400>9
Met Ser Glu Thr Ala Pro Leu Ala Pro Thr Ile Pro Ala Pro Ala Glu
1               5                   10                  15
Lys Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Thr Ala Gly
            20                  25                  30
Lys Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala
        35                  40                  45
Val Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys
    50                  55                  60
Lys Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg
65                  70                  75                  80
Ile Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln
                85                  90                  95
Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala
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Ala Ser Gly Glu Gly Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala Lys
        115                 120                 125
Pro Arg Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly
    130                 135                 140
Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val Lys
145                 150                 155                 160
Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys
                165                 170                 175
Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys
            180                 185                 190
Ala Lys Ala Pro Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys Pro
        195                 200                 205
Lys Val Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys
    210                 215                 220
<210>10
<211>660
<212>DNA
<213>智人
<400>10
atgtccgaga ctgcgcctgc cgcgcccgct gctccggccc ctgccgagaa gactcccgtg   60
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<211>219
<212>PRT
<213>智人
<400>11
Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Glu
1               5                   10                  15
Lys Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Arg Lys Ser Ala Gly Ala Ala Lys
            20                  25                  30
Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys Lys
    50                  55                  60
Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg Ile
65                  70                  75                  80
Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln Thr
                85                  90                  95
Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala Ala
            100                 105                 110
Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala Lys Ala
        115                 120                 125
Lys Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Thr Gly Ala
    130                 135                 140
Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys
145                 150                 155                 160
Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ala Lys Lys Ala Lys Ser Pro Lys Lys Ala
                165                 170                 175
Lys Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala Pro Lys Ser Pro Ala Lys Ala Lys
            180                 185                 190
Ala Val Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Thr Ala Lys Pro Lys Ala
        195                 200                 205
Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys Lys
    210                 215
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<212>DNA
<213>智人
<400>12
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<213>智人
<400>13
Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Glu Thr Ala Thr Pro Ala Pro Val Glu
1               5                   10                  15
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65                  70                  75                  80
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            100                 105                 110
Lys Ala Ala Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala
        115                 120                 125
Ala Lys Ala Lys Lys Pro Ala Gly Ala Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys
    130                 135                 140
Ala Ala Gly Ala Lys Lys Ala Val Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys
145                 150                 155                 160
Lys Pro Ala Ala Ala Gly Val Lys Lys Val Ala Lys Ser Pro Lys Lys
                165                 170                 175
Ala Lys Ala Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala Thr Lys Ser Pro Ala Lys
            180                 185                 190
Pro Lys Ala Val Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro
        195                 200                 205
Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ala Ala Lys Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys
    210                 215                 220
Lys Lys
225

Claims (21)

1.一种核酸分子，所述核酸分子
a)编码多肽，所述多肽由(aa)和(ab)组成，
(aa)作为第一和第二N末端氨基酸残基的两个甲硫氨酸残基，所述甲硫氨酸残基经由肽键与(ab)相连，
(ab)成熟真核细胞组蛋白；
b)编码多肽，所述多肽由(ba)和(bb)组成，
(ba)作为第一和第二N末端氨基酸残基的两个甲硫氨酸残基，所述甲硫氨酸残基经由肽键与(bb)相连，
(bb)具有至少80％的与(a)的成熟真核细胞组蛋白的序列一致性并基本保留其生物活性的成熟真核细胞多肽；或
c)在严格条件下与编码(a)或(b)的多肽的核酸分子的互补链杂交，其中所述核酸分子编码至少具有上述两个N末端甲硫氨酸残基的多肽并基本保留(a)或(b)的多肽的生物活性。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其中，所述组蛋白选自由组蛋白H1.0、H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5和H1t组成的组。
3.一种与权利要求1或2所述的核酸分子互补的核酸分子。
4.一种如权利要求1或2所述的核酸分子的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸包含与编码(aa)、(bb)或(c)的上述两个N末端甲硫氨酸残基的核苷酸三联体互补的核苷酸并具有10个核苷酸的最小长度。
5.一种包含权利要求1或2所述的核酸分子的载体。
6.一种以权利要求5所述的载体转化的宿主，其中，所述宿主不是人类并且不是人类胚胎。
7.如权利要求6所述的宿主，所述宿主为细菌、酵母菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。
8.一种生成多肽的方法，所述方法包括在适当条件下培养权利要求6或7所述的宿主并分离生成的多肽。
9.一种多肽，所述多肽由权利要求1或2所述的核酸分子编码或由权利要求8所述的方法生成。
10.一种组合物，所述组合物包含权利要求1或2所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6或7所述的宿主或者权利要求9所述的多肽。
11.如权利要求10所述的组合物，所述组合物还包含成熟真核细胞组蛋白。
12.如权利要求10或11所述的组合物，所述组合物是在必要时还包含药物可接受运载体和/或稀释剂的药物组合物。
13.如权利要求10或11所述的组合物，所述组合物是诊断组合物。
14.一种治疗和/或预防疾病的方法，所述疾病选自癌症、血小板减少症、如细菌、病毒或真菌感染等感染、如系统性红斑狼疮(SLE)或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病、溃疡性结肠炎或如阿尔茨海默症(AD)和帕金森症(PD)等带有淀粉样原纤维的疾病、利什曼病、肌病或与血栓性事件有关的心血管病，所述方法包括对有需要的受试对象施用权利要求12所述的组合物。
15.权利要求1或2所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6或7所述的宿主或者权利要求9所述的多肽在用于治疗和/或诊断目的的组合物的制备中的应用。
16.如权利要求15所述的应用，其中，所述治疗目的是治疗癌症、血小板减少症、如细菌、病毒或真菌感染等感染、如系统性红斑狼疮(SLE)或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病、溃疡性结肠炎或如阿尔茨海默症(AD)和帕金森症(PD)等带有淀粉样原纤维的疾病、利什曼病、肌病或与血栓性事件有关的心血管病。
17.一种抗体、适体或噬菌体，所述抗体、适体或噬菌体特异性地识别权利要求1或2所述的核酸分子或者权利要求9所述的多肽但不与相应的成熟真核细胞组蛋白结合。
18.一种诊断组合物，所述诊断组合物包含权利要求17所述的抗体、适体和/或噬菌体。
19.一种用于检测权利要求1或2所述的核酸分子或者权利要求9所述的多肽的存在的方法，所述方法包括测试获自受试对象的样品中所述核酸分子或多肽的存在。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述样品是血液、血清、血浆、唾液、尿液、粘膜组织、粘液。
21.一种试剂盒，所述试剂盒在一个或多个容器中含有权利要求1～3中任一项所述的核酸分子、权利要求4所述的反义寡核苷酸、权利要求5所述的载体、权利要求6或7所述的宿主、权利要求9所述的多肽或者权利要求17所述的抗体、适体和/或噬菌体。
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