JP2014209909A - Ｂｉｓ−ｍｅｔヒストン - Google Patents

Abstract

【課題】製造および検出を簡単にすることが可能な改良された組換え真核生物ポリペプチドの提供。【解決手段】ペプチド結合により成熟真核生物ヒストンに連結された第１及び第２のＮ末端アミノ酸残基として２つのメチオニン残基から構成されるポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、前記ベクターによりトランスフォームされた宿主、前記核酸分子によりコードされるポリペプチド、前記ポリペプチドを含む医薬及び診断用組成物、前記核酸分子、ベクター、宿主及びポリペプチドの疾病の治療用組成物の製造における使用、及びサンプル中の核酸分子又はポリペプチドの存在を試験する方法及びキット。【選択図】なし

Description

本発明は，ペプチド結合により成熟真核生物ヒストンに連結されている第１および第２のＮ末端アミノ酸残基として２つのメチオニン残基から構成されるポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明はさらに，前記核酸分子を含むベクター，前記ベクターでトランスフォームされた宿主，核酸分子によりコードされるポリペプチド，および医薬および診断用組成物に関する。本発明はまた，本発明の核酸分子，ベクター，宿主およびポリペプチドの，疾病の治療用の組成物の製造における使用に関する。さらに本発明は，サンプル中の核酸分子またはポリペプチドの存在を試験する方法およびキットに関する。

本明細書の全体にわたり種々の文献が引用される。前記文献および製造元の指針の開示内容は，その全体が本明細書に参照として取り込まれる。

現在，組換え蛋白質，例えばヒストンの高レベル生産に多大な経済的興味がもたれている。大量の組換え蛋白質の製造は，その特性および機能を研究するために十分な量の蛋白質を提供するという目的のみならず，治療用途に大量の蛋白質を提供する点でも興味がもたれている。

組換え蛋白質の高レベルの製造および精製を首尾良く行うためには，非常に多くのパラメータを考慮しなければならない。重要なパラメータとしては，発現条件，翻訳制御およびｍＲＮＡ安定性，蛋白質のターゲティングおよび分解が挙げられる（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９６：５１２）。

組換え蛋白質の製造，検出および精製を改良するための１つのアプローチは，広範な種類の融合パートナーを使用することである（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９６：５１２）。組換え蛋白質の精製および検出のためにアフィニティータグを付ける精巧な手法が開発されている。そのようなアフィニティータグは，より効率的な精製を可能とし，一方で，組換え蛋白質のタグに基づく簡便な検出を可能とする，有利な特性を組み合わせて持つ。しかし，多くの場合，比較的大きいアフィニティータグの付加は，蛋白質の翻訳，フォールディングおよび活性に望ましくない影響を与えるため，不利である場合もある。特に，治療用途に用いる場合には，後にアフィニティータグを除去することがしばしば必要であり，したがって，アフィニティータグが蛋白質に与える有利な効果のいくつか（例えば検出の容易さ）が軽減される（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，２００５，ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．，ＫｇａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。

それぞれの発生期ポリペプチドのＮ末端におけるメチオニン残基の取り込みは，原核生物ならびに真核生物により用いられる万能の翻訳開始シグナルを構成する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいては，このＮ末端メチオニン残基の除去は，細胞質酵素であるメチオニンアミノペプチダーゼ（ｍａｐ）により行われる（Ｈｉｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，８６：８２４７）。

原核生物，例えばＥ．ｃｏｌｉにおいて産生された組換え真核生物蛋白質のＮ末端メチオニン残基の効率的なプロセシングは，メチオニンに隣接するアミノ酸に依存することが示されている。いくつかのアミノ酸については矛盾するデータがあるが，切断の可能性は小さくかつ荷電されていないアミノ酸残基であるＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｖａ
ｌ，ＣｙｓおよびＴｈｒについて最も高いことについては意見が一致しているようである。より大きい側鎖はメチオニンプロセシングには不利であるようである（Ｈｉｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，８６：８２４７；Ｆｒｏｔｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．＆Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００６，１２：２３３６；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，２００５，ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．，ＫｇａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。

Ｎ末端メチオニンのプロセシングは蛋白質の安定性（Ｇｉｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２００３，１：１３）のみならず，蛋白質の正しい機能にも重要な役割を果たすと考えられており，これは例えば，ＭＥＦ−２Ｃ，ヒトヘモグロビン，インターロイキン−２，ＲＮａｓｅＡホモログまたはカエルリボヌクレアーゼについて示されている（Ｍｅｉｅｒｈａｎｓ ａｎｄ Ａｌｌｅｍａｎｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３：２６０５２；Ａｄａｃｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２０００，２０：３７；Ｅｎｄｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４０：９１４；Ｂｏｉｘ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，２５７：９９２；Ｌｉａｏ，Ｙ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００３，３１：５２４７；Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９６，９３：１２１４２）。メチオニン残基を除去するために自然が何故このような特別の酵素系を維持してきたかについての別の理論は，細胞メチオニンプールをリサイクルして，この必須のアミノ酸を節約するためであるというものである（Ｈｉｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，８６：８２４７）。

ＥＰ１２５４１６６は，Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒストン蛋白質の組換え製造を記載する。このようなヒト蛋白質の組換え製造は，治療用途に，ならびにヒトまたは仔ウシ胸腺調製物と比較してより効率的かつ費用効果が高い点で，利点があると考えられる。さらに，蛋白質の組換え製造は，製造プロセスの間のより優れた品質管理を可能とする。

Ｐｙｏら（Ｐｙｏ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００１，１：３８）は，Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えヒストンＨ１．５の製造を記載しており，ヒストンの強い塩基性の特性を用いて，組換え蛋白質の大規模精製の効率的な方法を開発した。

組換え蛋白質の高レベルの製造は従来技術でも示されているが，得られた組換え蛋白質を検出するための適当な方法の必要性はなお高い。上述したように，アフィニティータグ，例えばｈｉｓ−ｔａｇの使用は，当該技術分野において広く用いられているが，治療用途のための蛋白質の製造においては問題があるかもしれない。

したがって，本発明の基礎をなす技術的課題は，例えば，製造および検出を簡単にすることが可能な改良された組換え真核生物ポリペプチドを提供することであった。

この技術的課題は，特許請求の範囲において特定される態様により解決される。

したがって，第１の態様においては，本発明は，
（ａ）成熟真核生物ヒストン（ａｂ）にペプチド結合により連結されている第１および第２のＮ末端アミノ酸残基として２つのメチオニン残基（ａａ）からなるポリペプチドをコ
ードする；
（ｂ）（ａ）の成熟真核生物ヒストンと少なくとも８０％の配列同一性を有し，その生物学的活性を本質的に保持する成熟真核生物ポリペプチド（ｂｂ）にペプチド結合により連結されている第１および第２のＮ末端アミノ酸残基として２つのメチオニン残基（ｂａ）からなるポリペプチドをコードする；または
（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする核酸分子の相補鎖にハイブリダイズし，ここで，前記核酸分子は，２つのＮ末端メチオニン残基を少なくとも有し，かつ（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの生物学的活性を本質的に保持するポリペプチドをコードする，
核酸分子に関する。

図１は，精製方法の概要を示す。 図２は，Ｂ１，Ｍ−Ｈ１Ａ−Ｐ０２臨床バッチのＱＴＯＦマススペクトルを示す。 図３は，Ｂ２，Ｍ−Ｈ１Ａ−Ｐｏｏｌ０１臨床バッチのＱＴＯＦマススペクトルを示す。

本発明においては，核酸分子には，センスおよびアンチセンス鎖の両方について，ＤＮＡ，例えば，ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ，ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ），合成または半合成の形の分子，さらに，ＤＮＡまたはＲＮＡの合成または半合成の誘導体（例えば，ＰＮＡまたはホスホロチオエート），および混合ポリマーが含まれる。当業者には容易に理解されるように，これらは，追加の非天然ないし誘導化したヌクレオチド塩基を含むことができる。好ましい態様においては，核酸分子はＤＮＡ，例えばゲノムＤＮＡである。

本発明の目的のためには，ペプチド核酸（ＰＮＡ）はポリアミドタイプのＤＮＡ類似体であり，誘導体用のアデニン，グアニン，チミンおよびシトシンのモノマーユニットは市販されている（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＤＮＡのある成分，例えば，リン，酸化リン，またはデオキシリボース誘導体はＰＮＡには存在しない。Ｎｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７（１９９１））およびＥｇｈｏｌｍら（Ｎａｔｕｒｅ ３６５：６６６（１９９３））に開示されているように，ＰＮＡは，相補的ＤＮＡ鎖に特異的に強く結合し，ヌクレアーゼにより分解されない。実際，ＰＮＡは，ＤＮＡそれ自体よりも強くＤＮＡに結合する。これはおそらく，２つの鎖の間に静電気的反発がないため，およびポリアミド骨格はよりフレキシブルであるためであろう。このため，ＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックスは，ＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックスより広い範囲のストリンジェンシーの条件下で結合し，マルチプレックスハイブリダイゼーションを行うのが容易である。結合が強いため，ＤＮＡの場合よりも小さいプローブを用いることができる。さらに，ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションにより１塩基ミスマッチを判定することができると考えられる。これは，ＰＮＡ／ＤＮＡ１５−ｍｅｒにおける１つのミスマッチは融点（Ｔ_ｍ）を８℃−２０℃低下させ，これに対しＤＮＡ／ＤＮＡ１５−ｍｅｒデュープレックスの場合には４℃−１６℃であるためである。また，ＰＮＡ中に荷電基がないということは，ハイブリダイゼーションを低いイオン強度で行うことができ，分析の間に塩による干渉の可能性を低減しうることを意味する。

本明細書において用いる場合，“ポリペプチド”との用語は，３０を越えるアミノ酸から構成される分子群を記述する。本発明においては，このポリペプチドの群は，“蛋白質”を含む。ポリペプチドはさらに，２以上のポリペプチド分子から構成されるダイマー，トリマーおよびより高次のオリゴマーを形成してもよい。そのようなダイマー，トリマー等を形成するポリペプチド分子は，同一であっても，非同一であってもよい。したがって
，対応する高次構造は，ホモダイマーまたはヘテロダイマー，ホモトリマーまたはヘテロトリマー等と称される。ホモダイマーまたはヘテロダイマー等も“蛋白質”の定義に包含される。ポリペプチドはまた，本発明のポリペプチドのＣ末端側に融合パートナーが結合している融合蛋白質であってもよい。前記融合蛋白質の，本明細書において定義されるヒストン配列，またはそのフラグメントもしくはバリアントではない成分としては，所望の特性，例えば，改変された／増強された安定性，改変された／増強された溶解性，および／または１またはそれ以上の特定の細胞タイプにターゲティングする能力を与えるか，または異なる生物学的活性を与えることができるアミノ酸配列が挙げられる。例えば，細胞表面マーカーに特異的な抗体，または前記抗体の抗原認識フラグメントを有する融合蛋白質が想定される。さらに，そのようなポリペプチドのアミノ酸および／またはペプチド結合の１またはそれ以上が機能的類似体で置き換えられているペプチド模倣体もまた本発明に包含される。そのような機能的類似体としては，遺伝子にコードされる２０種のアミノ酸以外のすべての既知のアミノ酸，例えば，セレノシステインなどが挙げられる。“ポリペプチド”および“蛋白質”との用語はまた，グリコシル化，アセチル化，ホスホリル化等により修飾が生ずる，天然に修飾されたポリペプチド／蛋白質も表す。そのような修飾は当該技術分野においてよく知られている。

本発明においては，“メチオニン”との用語は，当業者によく知られている。メチオニンは，必須アミノ酸であり，標準的な遺伝コードではコドンＡＵＧによりコードされる。前記メチオニンは，真核生物において見いだされる場合，本発明の好ましい態様に寄与する。また，メチオニンとの用語の意味には，そして本発明の別の態様に寄与するものには，原核生物のＮ−ホルミルメチオニンが含まれる。

本明細書において用いる場合，“第１および第２のＮ末端アミノ酸残基”との用語は，本発明のポリペプチドの１位および２位において見いだされるアミノ酸残基を表す。これらの残基はまた，当該技術分野において，Ｎ末端の最も末端および末端から２番目の残基とも称される。別の用語では，最初のメチオニン残基はポリペプチドの最初の翻訳産物のＮ末端に位置しており，これはそれ自体，メチオニンをそのＮ末端に含む。

本明細書において用いる場合，“ペプチド結合”との用語は，当業者によく知られており，１つのアミノ酸のカルボキシル基が別のアミノ酸のアミノ基と反応して，２つのアミノ酸分子の間に形成される化学結合を表す。

本発明においては，“成熟真核生物ヒストン”との用語は，その開始Ｎ末端メチオニンを欠いたヒストンを表す。当業者にはよく知られるように，ポリペプチドは，万能翻訳開始シグナルを用いて翻訳され，このため，翻訳されたポリペプチドのＮ末端の最初のアミノ酸残基としてメチオニンが取り込まれる。真核生物において，および原核生物の一部においても，このＮ末端メチオニンが切断されて，ポリペプチドは“成熟”する。

本発明においては，“ヒストン”との用語は，コアヒストンＨ２Ａ（ヒトＨ２ＡのＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号はＰ０２２６１である），Ｈ２Ｂ（ヒトＨ２ＢのＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号はＰ０２２７８である），Ｈ３（ヒトＨ３．１のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号はＰ１６１０６である）およびＨ４（ヒトＨ４のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号はＰ０２３０４である），およびＨ１リンカーヒストンファミリー（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号については下記を参照）を含む一群の蛋白質を表す。ヒストンは，細胞核の構造成分として伝統的に知られており，その周りにＤＮＡが巻き付く“スプール”として作用し，遺伝子制御において鍵となる役割を果たす。しかし，ヒストンは，広範な多機能を示す（Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８５，８２：４８７１；Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ １９８５，１８８：６３）。例えば，ヒストンは，全身でホルモンおよび制御因子として作用することが見いだされ
ており，また，重要な保護機能の担体でもある。

ヒストンは，その広範な多機能のため，多くの治療用のアプローチにおいて重要になってきた。例えば，ヒストンＨ１，Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂは，末梢の健康なリンパ球を刺激することが見いだされている（Ｃｅｂｅｃａｕｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｉａ １９９１，５：１０７）。ヒストンＨ１は，筋芽細胞の増殖を刺激することにより筋肉再生を改善すること（Ｈｅｎｒｉｑｕｅｚ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００２，１１５：２０４１），アミロイド様線維をもつ疾病の状態を調節すること（Ｄｕｃｅ，Ｊ．Ａ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６，３６１：４９３），および幹細胞を刺激すること（Ｓｅｍｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９９４，３４：５４４）が見いだされている。ヒストンＨ１はまた，潰瘍性大腸炎およびその臨床的サブタイプの診断，予防および治療に用いることができる（Ｂｒａｕｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，米国特許６，０７４，８３５）。ヒストンＨ１ならびにコアヒストン類はさらに，血液脳関門を越えて生物学的に活性な物質を輸送することができることが見いだされている（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９８９，２５１：８２１）。さらに，欧州特許０３９２３１５は，ヒストンＨ１およびそのサブタイプのホルモンまたはホルモン様活性を示す。自己免疫疾患，例えば，全身性狼瘡（ＳＬＥ）におけるヒストンの役割が示されている（例えば，欧州特許０５３２９７９または国際出願ＷＯ０３／０４４０５４）。これまでに示されているヒストンのさらに別の機能には，抗生剤機能（米国特許６５６５８５４および６８８４４２３）および抗ウイルス機能（ＷＯ２００５／１１２９７５）が含まれる。さらに，血小板凝集の予防（ＷＯ０２／０６７９０７）または血小板減少症の治療（ＷＯ／２００６／１１９９１２）におけるヒストンの使用が示されている。

また，ヒストンは，癌の治療において重要な役割を果たすことが見いだされている。Ｖａｎｉら（Ｖａｎｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２００３，４９：２５２）は，例えば，ヒストンＨ１が実験的乳癌腫をもつ動物において免疫状態および免疫応答を改善することを示す。また，癌に罹患した個人における抗酸化状態は，ヒストンＨ１により増強されることが示されている（Ｖａｎｉ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２００５，５１：５７）。ヒストンＨ１でヒトエストロゲン感受性乳癌細胞を処理すると，エストロゲンレセプターの数が減少することが示されている（Ｖａｎｉ，Ｇ．ａｎｄ Ｄｅｖｉ，Ｃ．Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５，２７２：１５１）。ヒストンＨ１またはＨ２Ａ：Ｈ２Ｂを用いる放射線誘導性白血病または癌腫の治療が米国特許５８１２２５７に示されている。ヒストンはまた，病原性の細胞外ＤＮＡおよび全身を循環する病原性ヌクレオソームを除去することにより癌を治療するのに有用である可能性がある（ＬｅＬａｎｎ−Ｔｅｒｒｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ；４３：３３７）。

本発明においては，核酸分子はまた，（ａ）の成熟真核生物ヒストンに対して少なくとも８０％の配列同一性，より好ましくは８５％，より好ましくは９０％の配列同一性を有し，本質的にその生物学的活性を保持する成熟真核生物ポリペプチドにペプチド結合により結合した第１および第２のＮ末端アミノ酸残基として２つのメチオニン残基から構成されるポリペプチドをコードすることができる。さらにより好ましくは，核酸分子は，（ａ）の成熟真核生物ヒストンに対して少なくとも９５％の配列同一性，最も好ましくは９８％の配列同一性を有し，その生物学的機能を保持している成熟真核生物ポリペプチドにペプチド結合により連結された第１および第２のＮ末端アミノ酸残基として２つのメチオニン残基から構成されるポリペプチドをコードすることができる。

本発明においては，“パーセント配列同一性”との用語は，２またはそれ以上のアライ
メントした核酸またはアミノ酸配列の，核酸またはアミノ酸配列の全体（またはその比較する部分の全体）の長さを構成するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数と比較した，同一のヌクレオチド／アミノ酸のマッチ（“ヒット”）の数を記述する。別の用語では，２またはそれ以上の配列またはサブ配列についてアラインメントを用いて，（サブ）配列を比較し，比較ウインドウにわたって，または当該技術分野において知られる配列比較アルゴリズムを用いて比較して，指定された領域にわたって最大対応についてアラインメントしたときの，または手動でアラインメントして肉眼で調たときの，同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージ（例えば，８０％または８５％の同一性）を決定することができる。この定義は，試験配列の相補体にも適用される。本発明にしたがう好ましい核酸分子／ポリペプチドは，少なくとも約１５−２５アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって，より好ましくは，約５０−１００アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって，上記の同一性が存在するものである。当業者は，例えば，当該技術分野において知られるように，ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２（１９９４），４６７３−４６８０）またはＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８８，８５；２４４４）等のアルゴリズムを用いて，配列の間のパーセント配列同一性をどのようにして求めるかを理解している。

ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは，典型的にはその計算において配列中の内部非マッチ欠失または付加，すなわちギャップを考慮しないが，％配列同一性の過大評価を防ぐために手動で修正することができる。しかし，ＣＬＵＳＴＡＬＷは，その同一性の計算において配列ギャップを考慮しない。また，当業者に入手可能なものとして，ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９７７，２５：３３８９）がある。核酸配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムは，デフォルトとして，言長（Ｗ）１１，除外（Ｅ）１０，Ｍ＝５，Ｎ＝４，および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については，ＢＬＡＳＴＰプログラムは，デフォルトとして，言長（Ｗ）３，および除外（Ｅ）１０を使用する。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８９，８９：１０９１５）は，アラインメント（Ｂ）５０，除外（Ｅ）１０，Ｍ＝５，Ｎ＝４，および両方の鎖の比較を使用する。これらのプログラムはすべて本発明の目的のために用いることができる。上述のプログラムはすべて本発明にしたがって使用することができる。

本発明においては，（ａ）として上に記載される対応する成熟真核生物ヒストンの生物学的活性の少なくとも２０％が得られる場合，活性は本質的に保持されている。好ましくは，活性の少なくとも５０％，例えば，少なくとも６０％，少なくとも７５％または少なくとも８０％が保持される。より好ましくは，生物学的活性の少なくとも９０％，例えば少なくとも９５％，さらにより好ましくは少なくとも９８％，例えば少なくとも９９％が保持される。最も好ましくは，生物学的活性は完全に，すなわち１００％保持される。また，本発明においては，ポリペプチドは（ａ）に記載される対応する成熟真核生物ヒストンと比較して増加した生物学的活性，すなわち，参照ヒストンの１００％を越える酵素活性を有する。（ポリ）ペプチドの生物学的活性を評価する方法は当該技術分野においてよく知られており，例えば，限定されないが，酵素活性，細胞毒性，サイトカイン放出，溶血またはバイオマーカーの発現の測定が挙げられる。特に，細胞毒性試験は，例えば，（ポリ）ペプチド，例えばヒストンにより処理したインビトロまたはインビボ細胞培養物を用いる試験であり，処理後に細胞検出方法で細胞の死亡率の勾配を求める。また，特に抗体の場合には，生物学的活性はＥＬＩＳＡ試験により判定することができる。

本明細書において用いる場合，“ハイブリダイズ／ハイブリダイズする”との用語は，核酸分子と，この核酸分子の（部分的な）相補鎖とが対を形成し，このことによりハイブリッドを形成することを表す。

核酸分子を用いてハイブリダイゼーション実験をどのようにして実施するかは当該技術分野においてよく知られている。したがって，当業者は，ハイブリダイゼーションの成功のためにはどのようなハイブリダイゼーション条件を用いなければならないかを理解している。適当なハイブリダイゼーション条件の確立は，標準的な教科書，例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），またはＨｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ（Ｅｄｓ．）"Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ"ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，（１９８５）
を参照することができる。１つの好ましい態様においては，ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行う。

"ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件"とは，例えば，４ｘＳＳＣ（６００ｍＭＮａＣｌ，６０ｍＭクエン酸ナトリウム）で６５℃で一晩インキュベーションし，次に０．１ｘＳＳＣで６５℃で１時間洗浄することを含む。あるいは，ハイブリダイゼーション条件は，以下を含むことができる：，５０％ホルムアミド，５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭＮａＣｌ，７５ｍＭクエン酸ナトリウム），５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６），５ｘデンハルト溶液，１０％デキストラン硫酸，および２０μｇ／ｍｌの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃一晩インキュベーションし，次にフィルターを０．１ｘＳＳＣで約６５℃で洗浄する。ハイブリダイゼーションの前記条件は，当業者には，“高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件”として知られる。また，低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（“ハイブリダイゼーションの低いストリンジェンシー条件”）で本発明の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子も包含される。ハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出のストリンジェンシーの変更は，主として，ホルムアミド濃度（より低いパーセンテージのホルムアミドはより低いストリンジェンシーを与える），塩条件，または温度を操作することにより行う。例えば，低いストリンジェンシー条件は，４ｘＳＳＣ中で５０℃で一晩インキュベーションし，または６ＸＳＳＰＥ（２０ＸＳＳＰＥ＝３ＭＮａＣｌ；０．２ＭＮａＨ_２ＰＯ４；０．０２ＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４），０．５％ＳＤＳ，３０％ホルムアミド，１００μｇ／ｍｌブロッキングサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃で一晩インキュベーションし，次に，１ＸＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳで５０℃で洗浄することを含む。さらに，より低いストリンジェンシーを得るためには，ストリンジェントなハイブリダイゼーション後の洗浄をより高い塩濃度（例えば５ＸＳＳＣ）で行うことができる。ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑制するために用いられる代替のブロッキング試薬を含めるか，および／または置き換えることにより，上述の条件を改変することができることに注意すべきである。典型的なブロッキング試薬としては，デンハルト試薬，ＢＬＯＴＴＯ，ヘパリン，変性サケ精子ＤＮＡ，および市販の独自処方物が挙げられる。特別のブロッキング剤を含める場合には，互換性の問題のため，上述のハイブリダイゼーション条件を改変することが必要である。そのような改変は，一般に，当業者によって，追加の労力なしに行うことができる。ハイブリダイゼーション複合体は，溶液で（例えば，ＣｏｔまたはＲｏｔ分析），または溶液中に存在する１つの核酸配列と，固体支持体（例えば，細胞等が固定された膜，フィルター，チップ，ピンまたはガラススライド等）上に固定化された別の核酸配列との間の間に形成される。上述の態様は，好ましくは高度にストリンジェントな条件を表すが，あるいはより低いストリンジェンシーの条件を表してもよい。

上述に加えて，（ｃ）に記載される"ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）
のポリペプチドをコードする核酸分子の相補鎖にハイブリダイズする核酸分子"との用語
は，（ａ）または（ｂ）に記載されるヌクレオチド配列と，好ましくは少なくとも７０％，好ましくは少なくとも８０％，より好ましくは少なくとも９０％，さらにより好ましくは少なくとも９５％，最も好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を示す配列を表す。

上述したように，本発明において好ましいものは，（高度に）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で，本発明の核酸分子またはその一部にハイブリダイズしうる，すなわち，ヌクレオチド配列中の無関係の核酸分子にクロスハイブリダイズしない核酸分子である。上述の（ｃ）によれば，（ａ）および（ｂ）の核酸分子と関連するが配列は同一ではない核酸分子もまた本発明に包含される。さらに，（ｃ）によれば，本発明は，（ａ）および（ｂ）の核酸分子のフラグメントを含む。（ｃ）に含まれるすべての態様について，この態様においては，この核酸分子によりコードされるポリペプチドが，少なくとも２つのＮ末端メチオニン残基を有し，（ａ）または（ｂ）のヒストンの生物学的活性を保持しているかまたは本質的に保持していることが必須である。

より好ましい態様においては，本発明はまた，上述の（ａ）または（ｂ）の核酸分子の配列と比較してその配列が縮重している核酸分子に関する。本発明において用いる場合，“遺伝コードの結果縮重している”との用語は，遺伝コードの縮重のため，異なるヌクレオチド配列が同じアミノ酸をコードすることを意味する。

ポリペプチドに融合させて製造および検出を容易にすることができる多数のアフィニティータグが当該技術分野において知られているが，治療用途において用いるためには，しばしばこれらのタグを除去しなければならない。これらのアフィニティータグとは異なり，本発明者らは，驚くべきことに，ｂｉｓ−ｍｅｔポリペプチドがその天然の対応物と同じ生物学的特性を示し，したがって，本発明のポリペプチドを治療目的に用いることができることを見いだした。本発明のポリペプチドの機能は，少なくとも本発明者らの用いた試験で検出できるほど変化していないため，メチオニン残基の除去は不要である。さらに，メチオニン残基の除去は，製造の間には生じない。上で概要を説明したように，Ｎ末端メチオニン残基の切断は，２番目のアミノ酸残基のサイズに大きく依存する。本発明のポリペプチドは，２番目のアミノ酸残基としてもう一つのメチオニンを含むため，観察された１つの効果は，２つのＮ末端メチオニン残基の低いパーセンテージ，すなわち，約２０％の範囲のみがＥ．ｃｏｌｉ中で切断されることである。この場合，残りの約８０％では，２つのＮ末端メチオニン残基は切断されない。原核生物，例えばＥ．ｃｏｌｉにおける本発明のポリペプチドの製造の間，最もＮ末端のメチオニンもホルミル化されうる。しかし，本発明者らは，質量分析で調べたところ，ホルミル化された生成物は得られなかった。また，１つのメチオニン残基のみの切断は観察することができなかった。理論に拘束されることを望むものではないが，最初のＮ末端メチオニン残基の切断は２番目のＮ末端メチオニンの迅速な除去につながり，したがって，両方のメチオニン残基が切断されると推測される。

この点において，本発明のｂｉｓ−ｍｅｔヒストンは，内因性ヒストンの存在下で容易に検出可能であるという利点を提供する。例えば，ｂｉｓ−ｍｅｔヒストンは，種々のモードのＨＰＬＣ（ＲＰＣ；ＳＥＣ；ＩＥＸ）または電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ＣＥ）によって内因性の対応物から分離することはできないかもしれないが，例えば同じＲＰ−ＨＰＬＣ画分で，ｂｉｓ−ｍｅｔヒストンのエレクトロスプレーイオン化（またはタンデム）質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により容易に区別することができる（実施例を参照）。このことにより，臨床試験の間の治療用ヒストンの薬物動態を，同位体標識または試験する薬剤に対する特別の抗体を用いる必要なく，モニターすることが可能となる。

さらに，驚くべきことに，２つのメチオニン残基をその第１および第２のＮ末端アミノ
酸残基として含むヒストンは，組換え製造において有益な特性を示すことが見いだされた。すなわち，本発明者らは，２つのメチオニン残基を導入すると顕著に高いレベルのヒストンを得ることができることを見いだした。ｂｉｓ−ｍｅｔヒストンの発酵後の細菌細胞の収率は有意に高くはないが，驚くべきことに，ｂｉｓ−ｍｅｔヒストンの挙動は，下流のプロセシングの最初の鍵となる段階において著しく異なることが見いだされた。ｂｉｓ−ｍｅｔヒストンは予測された塩分濃度で溶出されることができるが，追加のメチオニン残基を欠いた組換えヒストンは非常に高い塩分濃度でなければＭａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカラムから溶出されることができず，効率よくさらに精製することができない。以上のように，ｂｉｓ−ｍｅｔヒストンは，Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカラム上で優れた挙動を示し，効率的かつ高収率の精製プロセスを可能とする。

したがって，本発明は，ヒストンのＮ末端における２つのメチオニン残基の存在は，内因性ヒストンの存在下における簡単な検出の可能性を提供し，効率的な組換え蛋白質製造を可能とするｂｉｓ−ｍｅｔヒストンを与えるという新たな知見に基づく。

好ましい態様においては，ヒストンは，ヒストンＨ１．０，Ｈ１．１，Ｈ１．２，Ｈ１．３，Ｈ１．４，Ｈ１．５およびＨ１ｔＴｅｓｔｉｓからなる群より選択される。

ヒトヒストンＨ１サブタイプのＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号は次のとおりである：Ｈ１．０−Ｐ０７３０５，Ｈ１．１−Ｑ０２５３９，Ｈ１．２−Ｐ１６４０３，Ｈ１．３−Ｐ１６４０２，Ｈ１．４−Ｐ１０４１２，Ｈ１．５−Ｑ１４５２９およびＨ１ｔ−Ｐ２２４９２。ヒトヒストンＨ１．２の核酸およびアミノ酸配列は配列番号６および７に示される。ヒトヒストンＨ１．３の核酸およびアミノ酸配列は配列番号８および９に示される。ヒトヒストンＨ１．４の核酸およびアミノ酸配列は配列番号１０および１１に示される。ヒトヒストンＨ１．５の核酸およびアミノ酸配列は配列番号１２および１３に示される。

別の態様においては，本発明は，本発明の核酸分子に相補的な核酸分子を提供する。

核酸分子は，許容性の塩および温度条件下で塩基対形成により自然に互いに結合する場合，“相補的”である。例えば，配列“Ａ−Ｇ−Ｔ”は，相補的配列“Ｔ−Ｃ−Ａ”に結合する。本発明においては，“相補的”とは，本発明の核酸分子の長さ全体にわたるヌクレオチドの完全な塩基対形成を表す。すなわち，適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を選択すれば，検出可能な標識で標識した，本発明の核酸分子に正確に相補的ではない核酸分子は，検出可能なシグナルを生成しない。そのような相補的核酸分子は，例えば，ＲＮＡまたはＤＮＡ調製物のノザンまたはサザンブロット分析におけるプローブとして用いることができる。

別の観点においては，本発明は，本発明の核酸分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを提供し，ここで，オリゴヌクレオチドは，本発明のヒストンの２つのＮ末端メチオニン残基をコードするヌクレオチドトリプレットに相補的なヌクレオチドを含み，最少長さ１０ヌクレオチドを有する。

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは，例えば，シークエンシングアッセイ用のプライマーとして，またはＲＮＡまたはＤＮＡ調製物のノザンまたはサザンブロット分析におけるプローブとして用いることができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは，好ましくは，少なくとも１０個，好ましくは少なくとも１５個，例えば少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを含む。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは，より好ましくは少なくとも１００，より好ましくは少なくとも２００，最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドの長さを有する。

そのような核酸分子はまた，例えば，ＲＮａｓｅ保護アッセイにおけるプローブとして，または本発明のヒストンの発現を阻害するためのアンチセンスプローブとして用いることもできる。当業者は，前記プローブの調製および使用に精通している（例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）を参照）。

さらに別の態様においては，本発明は，本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。好ましくは，ベクターは，プラスミド，コスミド，ウイルス，バクテリオファージまたは遺伝子工学において一般に用いられる別のベクターである。さらに別の態様においては，本発明は，本発明の相補的核酸分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むベクターを提供する。

本発明の核酸分子は，いくつかの市販のベクターに挿入することができる。非限定的例としては，原核生物プラスミドベクター，例えば，ｐＵＣ−シリーズ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＥＴ−シリーズの発現ベクター，例えば，ｐＥＴｄｕｅｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＣＲＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），および哺乳動物細胞における発現に適合したベクター，例えば，ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐＢＰＶ−１，ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ，ｐＲＳＶｇｐｔ，ｐＲＳＶｎｅｏ，ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ，ｐＩＺＤ３５，ｐＬＸＩＮ，ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＥＡＫ−１０（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｐＴｒｉＥｘ−Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに適したプラスミドベクターの例としては，例えば，プラスミドｐＡＯ８１５，ｐＰＩＣ９ＫおよびｐＰＩＣ３．５Ｋ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。

上述した本発明の核酸分子はまた，別の核酸分子との翻訳融合が生成するように，ベクター中に挿入してもよい。別の核酸分子は，例えば，溶解性を増加させるか，および／または融合蛋白質の精製を容易にする蛋白質をコードすることができる。非限定的例としては，ｐＥＴ３２，ｐＥＴ４１，ｐＥＴ４３が挙げられる。ベクターはまた，正しい蛋白質フォールディングを容易にするために，１またはそれ以上のシャペロンをコードする追加の発現可能な核酸分子を含んでいてもよい。適当な細菌発現宿主としては，例えば，ＢＬ２１に由来する株（例えば，ＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ，ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ，ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＡＲＥ）またはＲｏｓｅｔｔａ（登録商標）が挙げられる。

ベクターの改変の手法については，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）を参照。一般に，ベクターは，１またはそれ以上の複製起源（ｏｒｉ）およびクローニングまたは発現用の固有のシステム，宿主における選択用の１またはそれ以上のマーカー，例えば，抗生物質耐性，および１またはそれ以上の発現カセットを含むことができる。適当な複製起源（ｏｒｉ）としては，例えば，ＣｏｌＥ１，ＳＶ４０ウイルスおよびＭ１３の複製起源が挙げられる。

ベクター中に挿入されるコーディング配列は，例えば，標準的な方法により合成してもよく，または天然起源から単離してもよい。コーディング配列の転写制御要素への，および／または他のアミノ酸コーディング配列へのライゲーションは，確立された方法を用いて行うことができる。原核生物または真核生物細胞における発現を確実にする転写制御要
素（発現カセットの一部）は当業者によく知られている。これらの要素には，転写の開始を確実にする制御配列（例えば，翻訳開始コドン，プロモーター，エンハンサー，および／またはインシュレータ），内部リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｏｗｅｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８（２００１），１４７１−１４７６），および任意に転写の終止および転写産物の安定化を確実にするためのポリＡシグナルが含まれる。さらに別の制御要素としては，転写ならびに翻訳エンハンサー，および／または天然に付随するかまたは異種のプロモーター領域が挙げられる。好ましくは，本発明の核酸分子はそのような発現制御配列に動作可能なように連結されて，原核生物または真核生物細胞における発現を可能とする。ベクターはさらに別の制御要素として分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。そのような配列は当業者にはよく知られている。さらに，用いる発現系によって，発現されたポリペプチドを細胞コンパートメントに向かわせるリーダー配列を本発明の核酸分子のコーディング配列に付加してもよい。そのようなリーダー配列は当該技術分野においてよく知られている。

転写の開始を確実にするための制御要素の例としては，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター，ＳＶ４０−プロモーター，ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス），ｌａｃＺプロモーター，ｇａｉ１０プロモーター，ヒト伸張因子１α−プロモーター，ＣＭＶエンハンサー，ＣａＭ−キナーゼプロモーター，Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）多角体プロモーターまたはＳＶ４０エンハンサーが挙げられる。原核生物における発現用には，多数のプロモーター，例えば，ｔａｃ−ｌａｃ−プロモーター，ｌａｃＵＶ５またはｔｒｐプロモーターが記載されている。原核生物および真核生物細胞におけるさらに別の制御因子の例としては，核酸分子の下流に，転写終止シグナル，例えば，ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位またはＳＶ４０，ｌａｃＺおよびＡｃＭＮＰＶ多角体のポリアデニル化シグナルが挙げられる。

さらに，本発明のベクターは選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーの例としては，ネオマイシン，アンピシリンおよびハイグロマイシン，カナマイシン耐性等が挙げられる。特別に設計されたベクターは，ＤＮＡを異なる宿主間で，例えば，細菌−真菌細胞間または細菌−動物細胞間でシャトルすることを可能とする（例えば，Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）システム，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

本発明にしたがう発現ベクターは，複製，および本発明の核酸分子およびコードされるポリペプチドの発現を指示することができる。上述の制御因子を含む適当な発現ベクターは当該技術分野において知られており，例えば，オカヤマバーグｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐｃＤＮＡ１，ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，とりわけ，下記の実施例において用いられる），ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）またはｐＧＥＭＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ），または原核生物発現ベクター，例えば，ラムダｇｔ１１，ｐＪＯＥ，ｐＢＢＲ１−ＭＣＳ−シリーズ，ｐＪＢ８６１，ｐＢＳＭｕＬ，ｐＢＣ２，ｐＵＣＰＫＳ，ｐＴＡＣＴ１または，好ましくは，ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）が挙げられる。

本明細書に記載される本発明の核酸分子は，細胞に直接導入するよう，またはリポソーム，ファージベクターまたはウイルスベクター（例えばアデノウイルス，レトロウイルス）を介して導入するよう設計することができる。さらに，バキュロウイルスシステムまたはワクチニアウイルスまたはセムリキ森林熱ウイルス系のシステムも，本発明の核酸分子の真核生物発現システムとして用いることができる。

典型的な哺乳動物発現ベクターは，ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーター要素，蛋白質コーディング配列，および転写の終結および転写産物のポリアデニル化に必要な
シグナルを含む。さらに，複製起源などの要素，薬剤耐性遺伝子，レギュレータ（誘導性プロモーターの一部として）を含んでいてもよい。ｌａｃプロモーターは原核生物細胞について有用な典型的な誘導性プロモーターであり，ラクトース類似体であるイソプロピルチオール−ｂ−Ｄ−ガラクトシド（"ＩＰＴＧ"）を用いて誘導することができる。組換え発現および分泌のためには，目的とする核酸分子を，例えば，組換え蛋白質をペリプラズムに向かわせるＰｅｌＢリーダーシグナルと，ｐＨＥＮ４と称されるファージミド中の遺伝子ＩＩＩ（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ，１９９７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４：５２１−５２６に記載される）との間にライゲーションすることができる。さらに別の要素としては，エンハンサー，Ｋｏｚａｋ配列，およびＲＮＡスプライシングのドナー部位とアクセプタ部位に挟まれた介在配列が挙げられる。効率の高い転写は，ＳＶ４０の初期および後期プロモーター，レトロウイルス，例えば，ＲＳＶ，ＨＴＬＶＩ，ＨＩＶＩの長末端反復（ＬＴＲ），およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いることにより達成することができる。しかし，細胞要素を用いることもできる（例えば，ヒトアクチンプロモーター）。本発明を実施するのに適した発現ベクターとしては，例えば，ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ），ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ３７１５２），ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）およびｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ６７１０９）等のベクターが挙げられる。用いることができる哺乳動物宿主細胞としては，ヒトＨｅｌａ，２９３，Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞，マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞，Ｃｏｓ１，Ｃｏｓ７およびＣＶ１，ｑｕａｉｌＱＣ１−３細胞，マウスＬ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。あるいは，組換えポリペプチドは，染色体中にインテグレートされた遺伝子コンストラクトを含む安定な細胞株において発現させることができる。選択マーカー，例えば，ｄｈｆｒ，ｇｐｔ，ネオマイシン，ハイグロマイシンとともにコトランスフェクションすることにより，トランスフェクションした細胞を同定および単離することができる。また，トランスフェクションした核酸を増幅させて，コードされるポリペプチドを大量に発現させることができる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは，数百またはさらに数千コピーの目的とする遺伝子を含有する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカーは酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ
ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５）である。これらのマーカーを用いて，哺乳動物細胞を選択培地上で成長させ，最も耐性の高い細胞を選択する。上述したように，発現ベクターは好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。そのようなマーカーとしては，真核生物細胞の培養用にはジヒドロ葉酸レダクターゼ，Ｇ４１８またはネオマイシン耐性が，Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌の培養については，テトラサイクリン，カナマイシンまたはアンピリシン耐性遺伝子が挙げられる。

さらに，本発明は，本発明の核酸分子または本発明のベクターで遺伝子工学処理された宿主に関する。前記宿主は，前記核酸分子またはベクターを，これらの存在により本発明のポリペプチドの発現が媒介されるような宿主に導入することにより製造することができる。

宿主は任意の原核生物または真核生物細胞であることができる。適当な原核生物／細菌は，一般にクローニングに用いられているものであり，例えば，Ｅ．ｃｏｌｉ（例えばＥｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３），ＨＢ１０１，ＤＨ５a，ＸＬ１Ｂｌｕｅ，Ｙ１０９０お
よびＪＭ１０１株），Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓである。適当な真核生物宿主は，動物細胞，例えば，ＣＨＯ，ＣＯＳ，２９３およびボウズ・メラノーマ細胞，両生類細胞，魚細胞，
昆虫細胞，例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞，真菌細胞，植物細胞，トランスジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物であることができる。

本発明の好ましい態様においては，宿主は，細菌，酵母細胞，昆虫細胞，真菌細胞，哺乳動物細胞または植物細胞である。上述の宿主細胞に適した培地および培養条件は当該技術分野においてよく知られている。好ましい態様においては，本発明の核酸分子またはベクターで遺伝子工学処理すべき宿主はＥ．ｃｏｌｉ．であり，例えば，ＢＬ２１（例えば，ＢＬ２１（ＤＥ３），ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ，ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ，ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＡＲＥ）またはＲｏｓｅｔｔａ（登録商標）に由来する株である。

さらに別の態様においては，本発明はまた，本発明のポリペプチドを発現することができる細菌または真核生物細胞を製造する方法に関し，この方法は，本発明のベクターで細菌または真核生物細胞を遺伝子工学処理することを含む。

"遺伝子工学処理”との用語は，細胞に遺伝的情報を持ち込むか，または細胞の遺伝的
情報を改変するプロセスを表す。これは一般に，宿主細胞を核酸分子でトランスフェクトまたはトランスフォームすることにより行うことができる。コンストラクトの宿主細胞への導入は，リン酸カルシウムトランスフェクション，ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション，カチオン性脂質媒介性トランスフェクション，エレクトロポレーション，トランスダクション，感染または他の方法により行うことができる。このような方法は，多くの標準的な実験室マニュアルに，例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）に記載されている。宿主細胞中に導入された前記核酸分子は，本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。

さらに別の態様においては，本発明は，本発明のポリペプチドを製造する方法に関し，この方法は，本発明の宿主を適当な条件下で培養し，産生された本発明のポリペプチドを前記宿主または培地から単離することを含む。

当該技術分野には，ポリペプチドを適当な宿主中で製造するための多数の適当な方法が存在する。宿主が原核生物，哺乳動物または昆虫細胞等の単細胞生物である場合，当業者は種々の培養条件を参照することができる。簡便には，産生された蛋白質を培地，培養した生物の溶解物，または単離された（生物学的）膜から，確立された手法により回収する。多細胞生物の場合，宿主は，生物の一部であるか，一部に由来する細胞であってもよく，例えば，前記宿主細胞は，植物の収穫可能な一部であってもよい。好ましい方法は，上述したように，宿主における蛋白質の組換え製造を含む。例えば，本発明の核酸分子を含む核酸配列をＰＣＲにより合成し，発現ベクターに挿入する。次に，適当な宿主を発現ベクターでトランスフォームする。その後，宿主を培養して，所望のポリペプチドを産生させ，これを単離して精製する。このような方法は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）を参照）。

本発明のポリペプチドを製造する別の方法は，ｍＲＮＡのインビトロ翻訳である。本発明にしたがって用いるのに適した無細胞発現系としては，ウサギ網状赤血球溶血液，小麦胚芽抽出物，イヌ膵臓ミクロソーム膜，Ｅ．ｃｏｌｉＳ３０抽出物，およびカップリングした転写／翻訳システム，例えば，ＴＮＴ−システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。これらの系により，コーディング領域を含むクローニングベクター，ＤＮＡフラグメント，またはＲＮＡ配列および適当なプロモーター要素を加えると，組換えポリペプチドの発現が可能である。

組換え製造に加えて，本発明のポリペプチド（蛋白質），蛋白質のフラグメントまたは
融合蛋白質は，例えば，固相手法を用いる直接ペプチド合成により合成的に製造することができる（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９６９）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１９６３），２１４９−２１５４を参照）。

合成蛋白質は，手動の手法により，または自動化装置により合成することができる。自動化合成は，例えば，ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ ＣｉｔｙＣＡ）を，製造元の指針にしたがって用いることにより行うことができる。種々のフラグメントを別々に化学合成し，化学的方法を用いて組み合わせて，全長分子を製造してもよい。上述したように，化学合成，例えば，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８５，８２：５１３１）に記載される固相法を用いることができる。さらに，本発明のポリペプチド（蛋白質），蛋白質のフラグメントまたは融合蛋白質は，半合成的に，例えば，組換え製造と合成的製造の組み合わせにより製造してもよい。ペプチド結合を介して，（ａ）成熟真核生物ヒストン；（ｂ）成熟真核生物ヒストンに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し，本質的にその生物学的活性を保持している成熟真核生物ポリペプチド；または（ｃ）上述した本発明の任意の別のポリペプチドならびにポリペプチド（蛋白質）および融合蛋白質のフラグメントに結合している２つのメチオニン残基を第１および第２のＮ末端アミノ酸残基として有するすべてのポリペプチド（蛋白質）は，これを取得する製造方法にかかわらず，本発明の範囲内である。これは，これらの蛋白質のすべてのアミノ酸配列も本発明の核酸分子によりコードされるためである。

蛋白質の単離および精製は，いくつかの既知の手法，例えば，限定されないが，イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ），逆相ＨＰＬＣ，疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび調製用ディスクゲル電気泳動の任意のものを用いて行うことができる。蛋白質の単離／精製の手法は，本発明のポリペプチドを慣用の方法を用いて修飾することを必要とする場合がある。例えば，さらに蛋白質にヒスチジンタグを付加して，ニッケルカラムによる精製を可能としてもよい。別の修飾は，より高いまたは低い活性を引き起こすか，より高いレベルの蛋白質産生を可能とするか，または蛋白質の精製を簡単にすることができる。

別の態様においては，本発明は，本発明の核酸分子によりコードされるか，または本発明の方法により製造されるポリペプチドを提供する。

本発明はまた，本発明の核酸分子またはベクターまたは宿主またはポリペプチドを含む組成物を提供する。任意に，以下にさらに記載される本発明の抗体，アプタマーまたはファージも，前記組成物中に含まれていてもよい。

本発明において用いる場合，“組成物”との用語は，記載される化合物の少なくとも１つを含む組成物に関する。これは，任意に，本発明の化合物の特性を変更しうるさらに別の分子を含んでいてもよく，このことにより，例えば，その機能を抑制，安定化，ブロッキング，調節，および／または活性化することができる。組成物は，固体，液体または気体状の形であってもよく，とりわけ，粉末，錠剤，溶液またはエアロゾルの形であってもよい。

好ましい態様においては，本発明の組成物はさらに成熟真核生物ヒストンを含む。

好ましくは，そのような組成物は，成熟真核生物ヒストンとの混合物中に本発明のポリペプチド（ｂｉｓ−ｍｅｔヒストン）を含む。したがって，組成物は，Ｎ末端に２つのメチオニン残基を含むヒストンと，両方のメチオニン残基を欠いたヒストンとの混合物を含んでいてもよい。好ましくは，混合物は，９０％の本発明のポリペプチド対１０％の成熟真核生物ヒストンの範囲である。より好ましくは，混合物は８０％−２０％の範囲，より好ましくは７０％−３０％の範囲である。さらに好ましくは，混合物の５０％−５０％，３０％−７０％または２０−８０％の範囲である。最も好ましくは，混合物は，１０％の本発明のポリペプチド対９０％の成熟真核生物ヒストンの範囲である。そのような混合物は，宿主生物のメチオニンアミノペプチダーゼの不十分な活性による，ｂｉｓ−ｍｅｔヒストンからのメチオニンの部分的切断から生じてもよい。あるいは，成熟真核生物ヒストンを本発明のｂｉｓ−ｍｅｔヒストンに加えて，前記混合物を得ることができる。好ましくは，混合物中のヒストンは，同じサブタイプ，例えば，Ｈ１またはＨ２Ａのものである。

別の好ましい態様においては，組成物は薬学的に許容しうる担体および／または希釈剤をさらに任意に含む医薬組成物である。

本発明においては，“医薬組成物”との用語は，患者，好ましくはヒト患者に投与するための組成物を表す。本発明の医薬組成物は，上述の化合物を含む。本発明の医薬組成物は，任意にかつ追加的に，薬学的に許容しうる担体を含む。“薬学的に許容しうる担体”とは，非毒性の，固体，半固体または液体の増量剤，希釈剤，カプセル化材料または任意のタイプの製剤助剤を意味する。適当な薬学的担体の例は，当該技術分野においてよく知られており，例えば，塩化ナトリウム溶液，リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液，水，油／水エマルジョン等のエマルジョン，種々のタイプの湿潤剤，滅菌溶液，ＤＭＳＯ等の有機溶媒が挙げられる。好ましくは，担体は非経口担体であり，より好ましくはレシピエントの血液と等張の溶液である。担体は適宜，少量の添加剤，例えば，等張性および化学的安定性を高める物質を含む。そのような物質は，用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して無毒性であり，例えば，リン酸，クエン酸，コハク酸，酢酸および他の有機酸またはその塩等のバッファー；アスコルビン酸等の抗酸化剤；ポリアルギニンまたはトリペプチド等の低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン，ゼラチン，またはイムノグロブリン等の蛋白質；ポリビニルピロリドン等の疎水性ポリマー；グリシン，グルタミン酸，アスパラギン酸，またはアルギニン等のアミノ酸；単糖類，二糖類，および他の炭水化物，例えば，セルロースまたはその誘導体，グルコース，マンノース，またはデキストリン；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール類；ナトリウム等のカウンターイオン；および／またはポリソルベート，ポロキサマーまたはＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。

本明細書において用いる場合，“非経口”との用語は，静脈内，筋肉内，腹腔内，胸骨内，皮下および関節内注射および注入等の投与のモードを表す。

そのような担体を含む組成物は，よく知られる慣用の方法により製剤することができる。一般に，製剤は，医薬組成物の成分を，液体担体と，または微粉化した固体担体またはその両方と，均一にかつ密接に接触させることにより製造することができる。次に，必要であれば，生成物を所望の製剤の形態に成形する。

これらの医薬組成物は，適当な投与量で被験者に投与することができる。投与計画は，担当医師および臨床因子により決定される。医療の分野ではよく知られるように，任意の患者についての投与量は，多くの因子によって異なり，これには例えば，患者のサイズ，体表面積，年齢，投与すべき特定の化合物，性別，投与の時間および経路，一般的健康状態，および同時に投与される他の薬剤が含まれる。所定の状況における治療上有効量は，
日常的な実験により容易に決定することができ，通常の能力を有する臨床医または医師の能力および判断の範囲内である。一般に，医薬組成物の定期的投与としての投与計画は，１日あたり１μｇ−２０ｇユニットの範囲であるべきである。しかし，より好ましい投与量は，１日あたり，０．０１ｍｇ−１００ｍｇ，さらにより好ましくは０．０１ｍｇ−５０ｍｇ，最も好ましくは０．０１ｍｇ−１０ｍｇであってもよい。

治療的投与に用いられる医薬組成物の成分は，無菌でなければならい。無菌性は，滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンの膜）を通した濾過により容易に達成することができる。

医薬組成物の成分は，通常は，単位または多数回用量の容器，例えば，密封したアンプルまたはバイアル中に，水性溶液としてまたは再構成用凍結乾燥製剤として保存する。凍結乾燥した製剤の例として，１０ｍｌのバイアルに５ｍｌの滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）水性溶液を入れ，得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は，凍結乾燥した化合物を静菌性注射用水で再構成することにより調製する。保存剤および他の添加物，例えば，抗微生物剤，抗酸化剤，キレート剤，および不活性ガス等が存在していてもよい。さらに，医薬組成物は，医薬組成物の意図される用途によって，さらに別の薬剤を含んでいてもよい。

医薬組成物は，疾病，好ましくは本明細書に記載される疾病から選択される疾病の治療に特に有用である。これには，例えば，癌，血小板減少症，細菌，ウイルスまたは真菌感染等の感染，全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患，潰瘍性大腸炎または，アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）等のアミロイド様線維をともなう疾病，リーシュマニア症，ある種の形のミオパシー，または血栓事象に関連した心臓血管疾患が含まれる。

本発明においては，癌とは，細胞の制御されない分裂，および浸潤により隣接する組織に直接成長することにより，または転移（癌細胞が血流またはリンパ系を通って運搬される）によって遠位の部位に移植されることによりこれらが広がる能力により特徴づけられる，一群の疾病または疾患を表す。

本発明においては，血小板減少症とは，血液中の血小板の存在が比較的少ないことを表し，ここで，正常な血小板数は一般に１４０，０００−４００，０００ｐｅｒｍｍ^３の範囲内である。

本発明においては，感染とは，外来種による宿主生物の有害なコロニー形成である。感染においては，感染生物は繁殖のために（通常は宿主の犠牲によって）宿主の資源を利用しようとする。感染に対する宿主の応答は炎症である。

本発明にしたがう細菌感染としては，限定されないが，細菌性髄膜炎，コレラ，ジフテリア，リステリア症，百日咳（Ｗｈｏｏｐｉｎｇ Ｃｏｕｇｈ），肺炎球菌性肺炎，サルモネラ症，破傷風，チフス，結核または尿路感染が挙げられる。

本発明にしたがうウイルス感染としては，限定されないが，単核球症，ＡＩＤＳ，水痘，風邪，サイトメガロウイルス感染，デング熱，エボラ出血熱，手足および口疾患，肝炎，インフルエンザ，ムンプス，ポリオウイルス，狂犬病，天然痘，脳炎ウイルス，胃腸炎ウイルス，脳炎ウイルス，髄膜炎ウイルス，肺炎ウイルスまたは黄熱病が挙げられる。

本発明にしたがう真菌感染としては，限定されないが，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ，Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ，Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ，Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ，Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ，Ｈｉｓｔｏ
ｐｌａｓｍｏｓｉｓまたはＴｉｎｅａｐｅｄｉｓが挙げられる。

本発明においては，自己免疫疾患とは，通常体内に存在する物質および組織に対する身体の過剰な免疫応答から生ずる疾病を表す。自己免疫疾患は，当業者にはよく知られており，例えば，限定されないが，全身性エリトマトーデス，急性播種性脳脊髄炎，再生不良性貧血，自己免疫性肝炎，糖尿病，多発性硬化症，視神経炎または慢性関節リウマチが挙げられる。

本発明においては，エリテマトーデスとは，免疫系が過剰反応性となり，正常な組織を攻撃する，慢性の（長期にわたる）自己免疫疾患を表す。この攻撃により，炎症が生じ，症状が現れる。エリテマトーデスは，"臓器非特異的"なタイプの自己免疫疾患である。

本発明においては，慢性関節リウマチとは，身体の免疫系が関節を攻撃する自己免疫疾患である。

本発明においては，潰瘍性大腸炎とは，炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の一形態である。潰瘍性大腸炎は大腸炎，すなわち腸，特に大腸および結腸の疾患の一形態であり，結腸における特徴的な潰瘍または開放性びらんを含む。活動性疾患の主な症状は，通常は徐々に始まる血液の混じった下痢である。しかし，潰瘍性大腸炎は，腸以外の身体の多くの部分に影響を与える全身性疾患である。

本発明においては，アミロイド様線維をともなう疾病とは，通常は可溶性のペプチドであるアミロイドβまたは蛋白質αシヌクレインが凝集して規則正しい線維状の構造をとるという共通の特徴を有する疾病であり，典型的には，酸化的障害の増加，興奮毒性および細胞サイクルの変化が生ずる。アミロイド様線維をともなう疾病としては，限定されないが，アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）が挙げられる。

アルツハイマー病は，日常生活の活動の低下および精神神経的症状または挙動の変化をともなう進行性の認識低下により特徴づけられる神経変性性疾患である。これは痴呆の最も一般的なタイプである。

パーキンソン病は，中枢神経系の変性性疾患であり，しばしば罹患者の運動および言語能力を失わせる。

リーシュマニア症は，ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ ｐｒｏｔｏｚｏａ属の寄生性生物であるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種により引き起こされるトリパノソーマ性疾患である。リーシュマニア症は，ある種のサシチョウバエに刺されることにより伝染し，症状は，皮膚びらん，ならびに発熱，脾臓および肝臓の障害，および貧血である。

ミオパシーは，筋肉線維が機能せず，筋肉の脆弱化が生ずる神経筋の疾病である。いくつかの種類のミオパシーが知られており，例えば，限定されないが，筋ジストロフィー，先天性ミオパシー，ミトコンドリアミオパシーまたは炎症性ミオパシーが挙げられる。

本発明においては，血栓事象に関連する心臓血管疾患とは，例えば，限定されないが，深部静脈血栓症または心筋梗塞等の疾患に関連する。特に好ましいものは，γ−トロンビンにより媒介される血栓事象に関連する心臓血管疾患である。

別の好ましい態様においては，本発明の組成物は診断用組成物である。

本発明においては，“診断用組成物”との用語は，本発明の医薬組成物に対する潜在的
応答または治癒可能性について個々の患者を診断するための組成物に関する。本発明の診断用組成物は，上述の化合物を含む。診断用組成物はさらに，適当なバッファおよび酵素，例えば，リバーストランスクリプターゼ，熱安定性ポリメラーゼ等を含んでいてもよい。診断用組成物は，１つの容器または複数の容器に包装することができる。

本発明はまた，癌，血小板減少症，細菌，ウイルスまたは真菌感染等の感染，全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）または慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患，潰瘍性大腸炎，またはアミロイド様線維をともなう疾病，例えばアルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ），ミオパシー，または血栓事象に関連する心臓血管疾患から選択される疾病を治療および／または予防する方法を提供し，この方法は，本発明の医薬組成物をこれを必要とする被験者に投与することを含む。

本発明はまた，治療目的および／または診断目的で組成物を製造するための，本発明の核酸分子またはベクター，または非ヒト宿主またはポリペプチドの使用を提供する。

好ましい態様においては，治療目的は，癌，血小板減少症，感染，例えば細菌，ウイルスまたは真菌感染，自己免疫疾患，例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または慢性関節リウマチ，潰瘍性大腸炎，またはアミロイド様線維をともなう疾病，例えばアルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ），ミオパシーまたは血栓事象に関連する心臓血管疾患の治療である。

さらに別の態様においては，本発明は，本発明の核酸分子またはポリペプチドに特異的に結合するが，対応する成熟真核生物ヒストンには結合しない抗体またはアプタマーまたはファージを提供する。

前記抗体は，モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。

“抗体”との用語には，モノクローナル抗体，ポリクローナル抗体，一本鎖抗体，または前記ペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合するそれらのフラグメントが含まれ，また，二重特異性抗体，合成抗体，抗体フラグメント，例えば，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ_２）’，ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメント等，またはこれらのいずれかの化学的に修飾した誘導体も含まれる。モノクローナル抗体は，例えば，Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６（１９７５），４９５，およびＧａｌｆｒｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１），３に元々記載された手法により製造することができる。この方法は，マウスミエローマ細胞を免疫した哺乳動物に由来する脾臓細胞と融合させることを含み，当該技術分野において開発された改変を有する。さらに，上述のペプチドに対する抗体またはそのフラグメントは，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ"Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８に記載される方法を用いて得ることができる。前記抗体の誘導体をファージディスプレイ手法により得る場合には，ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて用いられる表面プラスモン共鳴を用いて，本発明のペプチドまたはポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の効力を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７−１３）。キメラ抗体の製造は，例えば，ＷＯ８９／０９６２２に記載されている。本発明にしたがって用いるべき抗体のさらに別の起源は，いわゆる異種（ゼノジェニック）抗体である。ゼノジェニック抗体，例えばマウスにおけるヒト抗体の製造の一般的原理は，例えば，ＷＯ９１／１０７４１，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９６／３４０９６およびＷＯ９６／３３７３５に記載されている。本発明にしたがって用いられるべき抗体およびその対応するイムノグロブリン鎖はさらに，当該技術分野において知られる慣用の手法を
用いて，例えば，アミノ酸の欠失，挿入，置換，付加，および／または組換え，および／または当該技術分野において知られる他の任意の修飾を単独でまたは組み合わせて用いて修飾することができる。例えば，イムノグロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列中にそのような修飾を導入する方法は当業者によく知られている。例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照。

“モノクローナル抗体”または“ポリクローナル抗体”（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，（１９８８）（上掲）を参照）との用語はまた，その生物学的特異性を保持しているかまたは本質的に保持している前記抗体の誘導体に関連する。前記誘導体の特に好ましい態様は下記で詳細に説明するが，そのような抗体の他の好ましい誘導体は，例えば，マウスまたはラットの可変領域とヒト定常領域とを含むキメラ抗体である。

"ｓｃＦｖフラグメント"（一本鎖Ｆｖフラグメント）との用語は，当該技術分野においてよく理解されており，サイズが小さく，そのようなフラグメントを組換え的に製造しうるため好ましい。

好ましくは，本発明にしたがう抗体，アプタマー，フラグメントまたは誘導体は，その存在または非存在をモニターすべき標的蛋白質，ポリペプチドまたはフラグメント，またはそれらのエピトープに特異的に結合する。

本明細書において用いる場合，"特異的に結合する"との用語は，抗体等が，類似する構造のポリペプチドと，またはＮ末端の２つのメチオニン残基を有しない成熟真核生物ポリペプチドと交叉反応しないかまたは本質的に交叉反応しないことを意味する。試験する抗体等のパネルの交叉反応性は，例えば，抗体等の前記パネルの，慣用の条件下（例えば，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，（１９８８）（上掲）を参照）における，目的とするポリペプチド，ならびに程度の差はあれ多数の（構造的におよび／または機能的に）密接に関連するポリペプチドへの結合を評価することにより，試験することができる。目的とするポリペプチド／蛋白質に結合するが，好ましくは目的とするポリペプチドと同じ組織で発現される他のポリペプチドのいずれにも結合しないかまたは本質的に結合しない抗体のみが，目的とするポリペプチド／蛋白質に特異的であると考えられ，本発明の方法にしたがって選択され，さらなる研究に用いられる。

本発明の方法の特に好ましい態様においては，前記抗体または抗体結合部分は，ヒト抗体またはヒト化抗体であるか，またはこれらに由来するものである。本発明においては，"ヒト化抗体"との用語は，ヒト以外の起源の抗体であって，可変領域中の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ），例えばＣＤＲ３，好ましくは６個すべてのＣＤＲが所望の特異性をもつヒト起源の抗体のＣＤＲで置き換えられている抗体を意味する。任意に，抗体の非ヒト定常領域は，ヒト抗体の定常領域により置き換えられていてもよい。ヒト化抗体の製造方法は，例えば，ＥＰ−Ａ１０２３９４００およびＷＯ９０／０７８６１に記載されている。

アプタマーとは，他の分子に結合するその能力に基づいてランダムプールから選択されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。核酸，蛋白質，低分子有機化合物，さらに生物全体に結合するアプタマーが選択されている。アプタマーのデータベースは，ｈｔｔｐ：／／ａｐｔａｍｅｒ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／で維持されている。

より詳細には，アプタマーは，ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー，またはペプチドアプタマーに分類することができる。前者は（通常は短い）オリゴヌクレオチドの鎖から構成さ
れるが，後者は両末端で蛋白質スキャフォールドに結合している短い可変ペプチドドメインから構成される。

核酸アプタマーは，インビトロ選択の繰り返し，または同等のＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）により工学処理された，種々の分子標的，例えば小分子，蛋白質，核酸，さらには細胞，組織および生物等に結合する核酸種である。ペプチドアプタマーは，細胞内で他の蛋白質相互作用を干渉するよう設計された蛋白質である。これは，両末端で蛋白質スキャフォールドに結合した可変ペプチドループから構成される。この二重構造束縛は，ペプチドアプタマーの結合親和性を，抗体に匹敵するレベルまで（ナノモルの範囲）非常に高める。

可変ループの長さは，典型的には１０−２０アミノ酸を含み，スキャフォールドは，優れた溶解特性を有する任意の蛋白質であることができる。現在のところ，細菌の蛋白質チオレドキシンＡが最も用いられているスキャフォールド蛋白質であり，可変ループが還元活性部位に挿入されており，これは野生型蛋白質では−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループであり，２つのシステイン側鎖はジスルフィド架橋を形成することができる。ペプチドアプタマーの選択は，種々のシステムを用いて行うことができるが，現在最も用いられているものは，酵母ツーハイブリッドシステムである。

アプタマーは，一般に用いられている生物分子，特に抗体に匹敵する分子認識特性を提供するため，バイオテクノロジーおよび治療用途において有用性を提供する。アプタマーは，その弁別認識に加えて，完全に試験管内で工学処理することができ，化学合成により容易に製造することができ，所望の保存特性を有しており，治療用途において免疫源性をほとんどまたは全く示さないため，抗体より利点がある。

修飾していないアプタマーは，血流から迅速に排出され，数分間から数時間の半減期をもつ。これは主として，アプタマー固有の低分子量の結果，ヌクレアーゼ分解および腎臓による体内からの排出のためである。未修飾アプタマーの用途は，現在のところ，過渡的状態，例えば，血液凝固の治療，または局所デリバリーが可能な眼などの臓器の治療に焦点が当てられている。この急速な排出は，インビボ診断イメージングなどの用途において利点がある。いくつかの修飾，例えば，２’−フルオロ置換ピリミジン，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合等が研究者に利用可能であり，これを用いて，アプタマーの半減期を日または週の時間スケールで容易に増加させることができる。

本発明においては，ファージとは，組換えファージを表し，これは当該技術分野においてよく知られており，例えば，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．：ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４，１３：３２４５に記載されている。ファージは，その表面に融合蛋白質として，本発明のポリペプチドに対して所望の結合特異性を有するイムノグロブリンフラグメントまたは誘導体を含有していてもよく，ここで，融合パートナーはファージの表面分子である。

本発明の方法の好ましい態様においては，前記抗体またはアプタマーまたはファージを検出可能なように標識する。アプタマーは好ましくは^３Ｈまたは^３２Ｐで放射性標識するか，または上述したような蛍光マーカーで標識し，一方ファージまたは抗体は，同様にして標識してもよく（放射性標識としては^１３１Ｉが好ましい），またはＨｉｓタグ，ＦＬＡＧタグまたはｍｙｃタグ等のタグを用いて標識してもよい。

別の態様においては，本発明は，前記抗体，アプタマーおよび／またはファージを含む診断用組成物を提供する。前記組成物はさらに，適当なバッファおよび酵素，例えば，リバーストランスクリプターゼ，熱安定性ポリメラーゼ等を含んでいてもよい。

前記診断用組成物は，例えば，本発明の抗体を用いるイムノアッセイにおいて，本発明のポリペプチドの存在を試験するために用いることができる。本明細書において用いる場合，"イムノアッセイ"との用語は，例えば，免疫沈殿，免疫ブロッティング，ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，間接的免疫蛍光実験等の方法を含む。このような手法は当該技術分野においてよく知られており，例えば，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（上掲）に記載されている。

別の態様においては，本発明は，本発明の核酸分子またはポリペプチドの存在を試験する方法を提供し，この方法は，被験者から取得したサンプルを，前記核酸分子またはポリペプチドの存在についてアッセイすることを含む。

本発明の核酸分子の存在についてサンプルを試験する方法としては，限定されないが，核酸増幅，シークエンシングまたはハイブリダイゼーションアッセイが挙げられる。

核酸増幅アッセイの例およびこれを実施する手段としては，限定されないが，ＰＣＲ（ネステッドＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ，ＰＣＲ伸張アッセイ，核酸配列塩基増幅（ＮＡＳＢＡ），一本鎖確認多型（ＳＳＣＰ）ＰＣＲ），増幅耐性変異システム（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ：ＡＲＭＳＴＭ）および増幅耐性変異システム直線伸張（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｌｉｎｅａｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：ＡＬＥＸＴＭ）アッセイを含む）が挙げられる。これらの方法の詳細は，当該技術分野において見いだすことができる。例えば，Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１９８９）２５０３−２５１６；Ａｇｒａｗａｌ（Ｅｄ．），“Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０）”，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９３；Ｈａｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．７（１９９８）２４８−２５２；Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄ．），“ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｊａｎｅｓ（Ｅｄ．），“ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ”，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２；Ｐｉｓｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８（２００２）７６９−７７２；Ｓｔｅｅｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈ．３（２００６）３１−３３；Ｋａｋａｖａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．２０（２００６）１−７を参照。

シークエンシングアッセイの例としては，限定されないが，直接シークエンシングによる配列分析のアプローチ，自動化ＤＮＡシークエンサーにおける蛍光ＳＳＣＰ，およびピロシークエンシングが挙げられる。これらの手法は当該技術分野において一般的であり，例えば，Ａｄａｍｓｅｔａｌ．（Ｅｄ．），“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９４；Ａｌｐｈｅｙ，“ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｆｒｏｍ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９７；Ｒａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１（２００３）９；Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９０（２００５）３４１９−３４２２を参照。

ハイブリダイゼーションアッセイの例としては，限定されないが，ノザンおよびサザン
ブロットアッセイ，ヘテロデュープレックス分析，配列特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによる変異の検出，ＤＮＡチップによるアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション，Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）技術に基づくアッセイ，Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（登録商標）技術に基づくアッセイが挙げられる。例えば，Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）５９１４−５９２３；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３９（２００５）５８３−５８８；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．−Ｆｕｎｄ．Ｍｏｌ．Ｍ．５７３（２００５）７０−８２；Ｓｔｅｅｍｅｒｓ ａｎｄ Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，６（２００５）７７７−７８２を参照。

蛋白質の検出に基づくアッセイの例としては，限定されないが，イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，逆相ＨＰＬＣ，ディスクゲル電気泳動，キャピラリー電気泳動，ウエスタンブロット分析，免疫沈殿，アミノ酸シークエンシング，分光学的方法（ＵＶ，ＣＤ；ＩＲ，Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚ）および質量分析（例えばＭＳ−ＱＴＯＦ）等の方法が挙げられる。例えば，Ｓｏｅｊｉｍａ ａｎｄ Ｋｏｄａ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ４５（２００５）１９３４−１９３９；Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｅｓｔｈ．Ａｎａｌｇ．１０１（２００５）１４０１−１４０６；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．．１２４（２００５）３３０−３３８を参照。

上述のアッセイは，標準的な教科書等から当該技術分野において知られており，例えば，Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｅｎｇｅｌ“Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ”Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（２００６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎ
ｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ（Ｅｄｓ．）"Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ"ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ
，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，（１９８５）；Ｎｏｌｌａｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（１９９７），１１１４−１１２８が挙げられる。記載されるアッセイのいくつかの使用は，下記の実施例において説明される。

本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記サンプルは，血液，血清，血漿，胎児組織，唾液，尿，粘膜組織，粘液，膣組織，膣から得られる胎児組織，皮膚，頭髪，毛包または他のヒト組織である。好ましくは，サンプルは，血液，血清，血漿，唾液，尿，粘膜組織，粘液である。

本発明はまた，本発明の核酸分子，ベクター，非ヒト宿主，ポリペプチドまたは抗体，アプタマーおよび／またはファージを１またはそれ以上の容器中に含むキットに関する。

以下に実施例を参照して本発明を説明するが，これは単に例示であって，本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。

実施例１：ｈＨ１．３コンストラクトのクローニング
プラスミドベクターｐＥＧＴ１−ｒＨ１．３Ｓ１の構築
配列番号１に示されるように，ヒストンは，リジン残基の含有量が非常に高いため，強い正の電荷を示す。リジンのコドン使用頻度はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとヒト
との間で大きく異なるため，ヒトヒストンＨ１．３配列をＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に適合させるために，コドン最適化を行った。

配列番号２に示される配列の合成遺伝子を製造した。人工配列は２つの制限部位，すなわち，ＢｓｐＨ１およびＢａｍＨ１で挟んで，続いてｐＥＧＴ１発現ベクターに導入できるようにした。翻訳開始コドンＡＴＧはＮｃｏ１制限部位ＣＣＡＴＧＧに取り込ませた。最初のＡＴＧは二重にして，ＢｓｐＨ１部位ＴＣＡＴＧＡとした。この粘着末端ＣＡＴＧはＮｃｏ１と適合性である。すなわち，第２のメチオニン残基を第１の残基の後に取り込ませた。追加のＢａｍＨ１部位ＧＧＡＴＣＣを終止コドンＴＡＡの後に取り込ませた。この人工的遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は配列番号３に示される。

ＢｓｐＨ１およびＢａｍＨ１で切断することにより最適化した遺伝子をプラスミドから切り出し，標準的なプロトコルにしたがってＮＣＯ１およびＢａｍＨ１で線状にしたｐＥＧＴ１発現ベクターに挿入して，プラスミドｐＥＧＴ１−ｒＨ１３Ｓ１を得た。

ライゲーションしたベクターｐＥＧＴ１−ｒＨ１３Ｓ１を，標準的なプロトコルを用いて，エレクトロコンピテントのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１［ＤＥ３］株にエレクトロポレーションにより導入し，トランスフォームした細胞を，カナマイシンを補充したＬＢプレートで選択した。１個のクローンを選択し，ヒストンをコードする挿入物の配列が配列番号２と完全にマッチすることを確認した。

プラスミドベクターｐＥＧＴ１−ｒＨ１．３Ｓ２の構築
ｒＨ１３Ｓ１コンストラクト中に第２のメチオニンが挿入されることを抑制するため，第２の合成遺伝子を用いた。セリンをコードする２番目の元のコドンＴＣＣをやはりセリンをコードするＡＧＣに変更して，ＢｓｐＨ１部位との適合性を確実にした。ＤＮＡ配列は配列番号４に示され，この人工的遺伝子によりコードされる組換え蛋白質は配列番号５に示される。配列番号４の人工的遺伝子は，開始コドンにおけるＢｓｐＨ１制限部位ＴＣＡＴＧＡと終止コドンの１塩基対前のＢａｍＨ１制限部位ＣＣＡＴＧＧにより挟まれているため，ｐＥＧＴ１−ｒＨ１３Ｓ１について上述したものと同じクローニング戦略を用いた。

ＢｓｐＨ１およびＢａｍＨ１で消化することにより最適化した遺伝子をプラスミドから切り出し，標準的なプロトコルにしたがって，ＮＣＯ１およびＢａｍＨ１で線状にしたｐＥＧＴ１発現ベクターに挿入して，プラスミドｐＥＧＴ１−ｒＨ１３Ｓ２を得た。

ライゲーションしたベクターｐＥＧＴ１−ｒＨ１３Ｓ２を，標準的なプロトコルを用いてエレクトロポレーションによりエレクトロコンピテントのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１［ＤＥ３］株に挿入し，トランスフォームした細胞をカナマイシンを補充したＬＢプレート上で選択した。１つのクローンを選択し，ヒストンをコードする挿入物の配列が配列番号４と完全にマッチすることを確認した。

実施例２：ヒストンＨ１．３の組換え生産
株
ｒｈ１．３Ｓを調製するために用いた細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＧＴ１／Ｈ１．３Ｓの組換え株である。このコンストラクトを用いてＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）株をトランスフォームした。３つのクローンを選択して，発現スクリーニングを行い，１つのクローンを選択して，プレマスターシード（Ｐｒｅ−ＭＳ−０５Ｌ２３−Ｈ１Ｂ）を行った。

マスターシード（ＭＳ−０６Ｄ０５−Ｈ１Ｂ）はＰｒｅ−ＭＳ−０５Ｌ２３−Ｈ１Ｂを
用いて製造し，作用シード（ＷＳ−０６Ｄ０６−Ｈ１Ｂ）はマスターシードを用いて製造した。

シード培養
それぞれ５００ｍｌのＹＥＳ培地（３０ｇ／ｌ酵母エキス，５ｇ／ｌＮａＣｌ）を入れた２つの２リットル振盪フラスコに，１００μｌの作業シード（ＷＳ−０６Ｄ０６−Ｈ１Ｂ）を植菌した。培養物を２７０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で５ｈ００（＋／−０，５ｈｏｕｒ）インキュベーションすると，Ｏ．Ｄ（６００ｎｍ）は１，５より高くなった。

発酵
１００リットルの発酵槽に１００リットルのＮＲＪ１８培地を入れた。発酵槽を１２３℃で３０分間滅菌した。滅菌後植菌前に，５０ｍｌのＳＡＧ４７１（消泡剤）を無菌的に加えた。６００ｎｍの理論的開始光学密度が８．７５ｘ１０^−７となるように，発酵槽にシード培養物を植菌した。計算上の植菌量を５００ｍｌのＹＥＳ培地を含む移行瓶に加えた。

発酵は３７℃で一晩行った。発酵プロセスの間，ｐＨは，ＮａＯＨ，４ＭおよびＨＮＯ_３２，２４Ｍを断続的に加えることによりｐＨ７．０±０．２に維持した。溶存酸素は撹拌により３０％にフィードバック制御した。

培養物のＯＤ_６００が１５から２０の間になったとき，１ｍＭ ＩＰＴＧ（２３．８ｇを５００ｍｌの高純水に溶解）の溶液で培養物を誘導した。

１時間３０分の誘導後，ＯＤ_６００は２４を越え，発酵槽を１６℃以下に冷却した。ｐＨを制御して７．０±０．２に維持した。冷却の間，他のパラメータは一定に保ち，ただし，圧力は３００ｍｂａｒｓに下げ，振盪を２００ｒｐｍに下げた。

培地の温度が１６℃未満になったとき，培養物の容量を測定した。培養物全てをＪＬＡ８．１０００ローター（±６Ｌ／１回の遠心）を備えた２ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｓ ＪＡ１０で，５２００ＲＰＭ，４℃で２０分間遠心分離した。

細胞ペレットを回収し，遠心工程の間から徐々にー２０℃まで冷却して保存した。

高圧ホモジナイザーによる細胞の破壊
細胞破壊の前日に，１００リットルの培養物に対応する濃縮した細胞を室温で溶解した。

破壊した日に，細胞ペレットを２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４．１２Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７．０）で２５０ｇ／ｌに希釈し，懸濁液の温度を３０℃に上昇させた。

次に，懸濁液をＨｅｉｄｏｌｐｈ Ｒ２Ｒ ２１００プロペラでホモジナイズした。次に細胞を高圧ホモジナイザーＰＯＮＹ（８００ｂａｒｓ）で溶解した。細胞懸濁液は細胞ホモジナイザーで２回処理した。

実施例３：蛋白質の精製
精製のすべての工程は，発酵槽の総容量（すなわち１００Ｌ）について行った。

１．２．５％過塩素酸による沈殿および８Ｍ尿素抽出
回収した細胞に，１／７容量のＨＣｌＯ_４２０％（最終濃度２．５％）を加えた。懸濁液を３番目のサイクルの前にＰｏｎｙホモジナイザーで２５０ｂａｒｓでホモジナイズし
た。溶液を穏やな振盪下で室温で１時間維持した。次に，懸濁液を１５分間遠心分離した（１２，２００ｇ−７，０００ｒｐｍ，４°Ｃ）。上清を回収し，１０ＭＮａＯＨでｐＨを４．０±０．１に調節し，０．４５／０．２２μｍ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２膜（２０００ｃｍ²）を通して濾過して滅菌バッグに入れた。

尿素を加えて最終容量の２倍で濃度８Ｍとし，２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４ｐＨ７，０バッファを用いて容量を調節した。溶液は室温で穏やかに振盪しながら一晩維持した。次に，３７％ＨＣｌまたは１０ＭＮａＯＨでｐＨを４．０±０．１に調節した。

２．Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗアニオン交換クロマトグラフィー（ＱＳＦＦ）−ネガティブモード
この工程の目的は，エンドトキシンおよびＤＮＡの含有量を低下させることである。Ｍｏｄｕｌｉｎｅ３５０／５００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｏ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃａｔ＃８６３５１２１１）に充填したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔ．＃１７−０５１０−０５）でアニオン交換クロマトグラフィーを行った。

カラムを，高度に精製した水で溶出流速１２０ｃｍ／ｈ（１１５．４ｌ／ｈ）で充填した。充填カラムベッドのサイズは次のとおりである：直径２５ｃｍ，断面積＝９６１ｃｍ^２，ベッド＝１８ｃｍ，充填容量＝１７．３１４±０．９６２ｌ．カラムを１．５−２．５カラム容量（ＣＶ）の１ＭＮａＯＨ＋２ＭＮａＣｌで，接触時間２時間，流速９６．２ｌ／ｈ（１００ｃｍ／ｈ−１６０３ｍｌ／ｍｉｎ）で消毒した。

クロマトグラフィーのすべての工程は線状流速約１００ｃｍ／ｈ（±９６．２ｌ／ｈ）で実施した。ｐＨは１−２ＣＶの５０ｍＭ酢酸アンモニウム＋１ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．０）で一定にした。次にカラムを３，５−５ＣＶの５０ｍＭ酢酸アンモニウム＋８Ｍ尿素ｐＨ４．０で平衡化した。

１０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を得るために，尿素抽出（セクション１を参照）からの溶液を，５０ｍＭ酢酸アンモニウム＋８Ｍ尿素ｐＨ４．０で約１．５倍に希釈した。８ＣＶのみの尿素抽出溶液（希釈前）を同時に負荷した。Ｈ１蛋白質はフロースルーに回収され，平衡化−溶出は，１，５−２，５ＣＶの５０ｍＭ酢酸アンモニウム＋８Ｍ尿素ｐＨ４．０で行った。

溶出後，カラムを１，５−２，５ＣＶの５０ｍＭ酢酸アンモニウム＋１ＭＮａＣｌ（ｐＨ４．０）で清浄にした。１ＭＮａＣｌ中のこの溶出により，ＤＮＡおよびエンドトキシンが排除される。次に，カラムを１．５−２．５ＣＶの１ＭＮａＯＨ＋２ＭＮａＣｌで消毒し（２ｈ），２０ｍＭＮａＯＨ中で室温で保存した。

３．Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＨＳ−Ｅ）−ポジティブモード：
カチオン交換クロマトグラフィーは，Ｖａｎｔａｇｅ １８０／５００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃａｔ＃８７０１８００１）を充填したＭａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｃａｔ．＃１５６−００３３）を用いて行った。カラムは高度に精製した水で溶出流速２６０ｃｍ／ｈ（６６．１ｌ／ｈ）で充填した。充填したカラムベッドの寸法は次のとおりである：直径１８ｃｍ，断面積＝２５４．４ｃｍ^２，ベッド＝３６ｃｍ，充填容量＝９．１６±０．２５ｌ。

カラムを１．５−２．５ＣＶの１ＭＮａＯＨ＋２ＭＮａＣｌで接触時間２時間，流速４
０ｌ／ｈ（１５７ｃｍ／ｈ）で消毒した。最大流速は２５０ｃｍ／ｈとすることができる。ｐＨは１，５−２，５ＣＶの５０ｍＭ酢酸アンモニウム＋２ＭＮａＣｌ（ｐＨ２．０）で一定にした。次にカラムを４から５．５ＣＶの５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ２．０で平衡化した。

ＱＳＦＦ−ＦＴ画分（セクション２を参照）のｐＨは，３７％ＨＣｌで２．０に調節した。この溶液を希釈せずに流速１２５ｃｍ／ｈ（±３１．８ｌ／ｈ）で負荷した。ゲルの結合能力は５−１５ｍｇ／ｍｌマトリクスである。負荷後，カラムを２−３ＣＶの５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ２．０で流速１５７ｃｍ／ｈ（４０ｌ／ｈ）で平衡化した。最大流速は２００ｃｍ／ｈである。

溶出は，１０ＣＶの５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ２．０）中２５％（０．５ＭＮａＣｌ）から７５％（１．５ＭＮａＣｌ），および５０ｍＭ酢酸アンモニウム＋２ＭＮａＣｌ（ｐＨ２．０）で，電導率直線勾配で実施した。溶出は，流速１５７ｃｍ／ｈ（４０ｌ／ｈ）で行った。最大流速は２００ｃｍ／ｈである。溶出されたピークを回収して２リットルの画分とし，これをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した後，プールした。プールした後，ＭＨＳ−Ｅプールを次の精製工程まで−２０℃で，または２４時間以内に用いる場合には２−８℃で保存した。

次に，カラムを１．５−２．５ＣＶの１ＭＮａＯＨ１Ｍ＋２ＭＮａＣｌ（２ｈ）で消毒し，２０ｍＭＮａＯＨ中で室温で保存した。

４．濃縮−膜分離
濃縮は，２つのＳａｒｔｏｃｏｎカセット（０．６ｍ^２，カットオフ５ｋＤａ）Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ膜（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ｃａｔ＃３０２１４４２９０６Ｅ-ＳＧ）を用いて行った。膜をＰｒｏｆｌｕｘ Ｍ１２システム（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）に接続したホルダーにマウントした。膜を注射用水（ＷＦＩ）ですすいだ。消毒は，０．５ＭＮａＯＨの６０分間の連続再循環により行った。次に，膜をＮａ_２ＨＰＯ_４．１２Ｈ_２Ｏ，２０ｍＭｐＨ７．０で，通過物がｐＨ＝７．０±０．１となるまですすいだ。次に，膜をＰＢＳｐＨ７．４（ＮａＣｌ８ｇ／ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４０，１９ｇ／ｌ，Ｎａ_２ＨＰＯ_４２，３８ｇ／ｌ）で通過物がｐＨ＝７．４±０．１となるまで平衡化した。入口圧および出口圧は，それぞれ１．５±０．１ｂａｒおよび１．２±０．１ｂａｒに設定した。

数回分のＭａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓ溶出物を一緒にプールし，蛋白質の総量にしたがって，理論的濃度３０ｍｇ／ｍｌに対応する容量に濃縮した。濃縮後，残留物を，１０倍容量のＰＢＳｐＨ７．４（ＮａＣｌ８ｇ／ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４０，１９ｇ／ｌ，Ｎａ_２ＨＰＯ_４２，３８ｇ／ｌ）に対して透析濾過した。残留物を回収し，膜を７回洗浄した。洗浄はそれぞれ，１５０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＮａＣｌ８ｇ／ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４０，１９ｇ／ｌ，Ｎａ_２ＨＰＯ_４２，３８ｇ／ｌ）で３分間，同じプロセスパラメータで行った。洗浄の間，通過のラインは閉じた。

残留物およびそれぞれの洗浄画分についてＢＣＡ蛋白質アッセイを行った。残留物を選択された洗浄画分とともにプールして，１２ｍｇ／ｍｌより高い合計濃度を，可能であれば９０％より高い収率で得た。膜をＷＦＩで洗浄した。浄化は，０．５ＭＮａＯＨを６０分間連続して循環させることにより行った。次に膜を０．１ＭＮａＯＨ中で保存した。

５．滅菌濾過
残留物＋選択された洗浄画分の滅菌濾過は１０００ｃｍ²の０．４５／０．２２ Ｓａ
ｒｔｏｐｏｒｅ２フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｃａｔ＃５４４−１３０７−Ｈ８−
００）で室温で行った。膜は，使用前に約５００ｍｌのＰＢＳｐＨ７．４（ＮａＣｌ８ｇ／ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４０，１９ｇ／ｌ，Ｎａ_２ＨＰＯ_４２，３８ｇ／ｌ）ですすいだ。

濾過は，ペリスタポンプを用いて流速約１００ｍｌ／ｍｉｎで行い，濾液を滅菌した無発熱物質の５Ｌまたは１０Ｌの使い捨てボトルに回収した。

濾過したバルクについて行ったＢＣＡアッセイにしたがって，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＮａＣｌ８ｇ／ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４０，１９ｇ／ｌ，Ｎａ_２ＨＰＯ_４２，３８ｇ／ｌ）を濾過により加えることにより，濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調節した。サンプリングの後，滅菌したバルクをＰＥＴＧ２０００ｍｌ Ｎａｌｇｅｎｅボトル（±１５００ｍｌ−１７００ｍｌ／本）に分注した。滅菌したバルクは−２０℃で保存した。製造工程の概要図を図１に示す。

実施例４：ｈＨ１．３およびｂｉｓ−ｍｅｔｈＨ１．３の精製効率
５０Ｌ発酵槽でＢＬ２１［ＤＥ３］−ｂｉｓ−ｍｅｔｒＨ１．３を培養した結果，全溶解細胞の段階的希釈のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析で評価して，回収時の収量は少なくとも６００ｍｇ／Ｌ培養物であった。完全な精製プロセスの後の最終収量は，５００ｍｇ／Ｌを越える純粋なｂｉｓ−ｍｅｔｒＨ１３であった。

５０Ｌ発酵槽中でＢＬ２１［ＤＥ３］−ｈＨ１．３を培養することにより，溶解細胞全体の連続希釈のＳＤＳ−ｐａｇｅ分析により評価して，回収時に少なくとも６００ｍｇ／Ｌの培養物が得られた。細胞は，標準的なプロトコルにしたがって，ホモジナイズおよびＨＣｌＯ_４沈殿により処理した。得られた結果は予測と一致した。Ｍａｃｒｏ Ｐｒｅｐ
Ｈｉｇｈ−Ｓへの負荷も通常どおり行ったが，ｒｈＨ１．３蛋白質は，１０ＣＶの１０ｍＭＮａＣＨ_３ＣＯＯ（ｐＨ２．０）中３０％（０．６ＭＮａＣｌ）から７５％（１．５ＭＮａＣｌ）の導電率直線勾配および１０ｍＭＮａＣＨ_３ＣＯＯ＋２ＭＮａＣｌ（ｐＨ２．０）を用いてカラムから溶出することができなかった。

ｒｈＨ１．３蛋白質は２ＭＮａＣｌで溶出されたが，この工程によっては，十分な精製ができず，蛋白質をさらに加工することができなかった。したがって，精製は失敗であったと考えられる。この失敗は，２つの異なる発酵物の２回の独立した精製の試行により確認された。

実施例５：ｂｉｓ−ｍｅｔヒストンＨ１．３のインビトロでの効果
阻害ゾーンアッセイ
抗微生物剤および抗ウイルス剤としての組換えヒストンの効果を測定するために，標準的な方法にしたがって阻害ゾーンアッセイを行った。さらに，抗真菌剤としての組換えヒストンの効果も試験した。細菌および真菌を，上述した方法にしたがって製造したｂｉｓ−ｍｅｔヒストンＨ１．３の存在下で成長させ，平均ゾーン直径を測定した（表１を参照）。

グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方および真菌は，表１に示されるように，有効に排除された。

細胞毒性アッセイ：
この細胞試験は，ヒストンがヒストン−感受性白血病細胞株（例えば，Ｕ−９３７）に及ぼす毒性効果を検出するものである。種々のヒストン濃度でインキュベーションした後の白血病癌細胞の生存率を，Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイにより，細胞の生存率に応答して変化する酸化還元指示薬の蛍光の観察に基づいてモニターした。ヒストンの抗癌活性は，ＩＣ５０により特徴づけられ，これは癌細胞の５０％の生存率が観察されるヒストン濃度に相当する。細胞毒性アッセイ，ならびに臨床試験に用いたバッチを表２にまとめる。表１に示されるように，試験したすべてのサンプルは，Ｈ１．３およびｂｉｓ−Ｍｅｔの含有の相違にかかわらず，腫瘍細胞株Ｕ−９３７に対して同様の高い細胞毒性を示す（表３を参照）。

表１に示す細菌および真菌に加えて，当該技術分野において知られる方法，例えば本明細書に概説される方法の任意のものを用いて，さらに別の細菌，真菌およびウイルスを適宜試験することができる。非限定的例としては，エプスタインバーウイルス，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａが挙げられる。

実施例６：臨床データ
再発または不応性ＡＭＬの患者，および化学療法を拒否した患者または化学療法に適合しない患者において，組換えヒトヒストンＨ１．３（ｒｈＨ１．３）の最大耐量（ＭＴＤ）を評価するための第Ｉ／ＩＩ相用量増加試験を実施した。

対象患者選定基準は次のとおりである：インフォームドコンセントに署名，任意の人種，両方の性別，少なくとも１８歳，骨髄に少なくとも２０％の芽球を有する，組織学的に証明されたＡＭＬ，標準的な化学療法後に失敗または不適合または拒否，適正な動作状態（Ｋａｒｎｏｗｓｋｙ指数＞６０％），および少なくとも３０日間の余命。患者の排除につながる基準は，顕著な臓器不全，既知のＨＩＶ感染，既知のＣ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス感染，妊娠中または授乳中，他の悪性腫瘍，循環抗Ｈ１抗体，１回目の来院前２週間または試験中におけるヘパリン治療，ｒｈＨ１．３治療に干渉する可能性のあることが知られている活動的な医学的状態，例えば，慢性関節リウマチまたは全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ），ならびにアルコールおよび／または薬物乱用。

実験の設計
患者には，１週間に３回の注入を３週間続けて投与した。最初の用量は３８ｍｇ／ｍ²
であった。用いた用量増加スキームは表３に示される。

ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）患者によるフェーズＩ／ＩＩ臨床試験は，ｔｈｅ Ｓａａｒｌａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｈｏｍｂｕｒｇ）で実施した。この試験で用いた医薬品のバッチは，Ｂ１，Ｂ２，Ｂ３およびＢ４であった。これらの４つのバッチおよび毒性試験で用いた１つのＧＬＰバッチの特性を下記の表４に示す。

６．１予備的評価
表５は，最初の２２名のＡＭＬ患者を，組換えヒトヒストンＨ１．３（ｒｈＨ１．３，“Ｏｎｃｏｈｉｓｔ”）で，漸増用量レベルで（いわゆるＦｉｂｏｎａｃｃｉスキーム）で治療した，前臨床試験の結果をまとめたものである。

患者ＷＷ１３およびＷＷ２７には，それぞれ２回の治療サイクルを行った（１サイクルは１週間に３回の注入を３週間，全体で９回からなる）。ＷＷ２７には，各サイクルについて用量を増加した。すなわち，５−５−６：２週間，用量レベル５，第３週，用量レベル６，同様に第２サイクルの用量レベル：６−６−７。

表５から明らかなように，薬剤の副作用は，エンドトキシンの夾雑の結果としてのみ生じた（表３も参照）。天然に生ずるヒストンＨ１．３と“ｂｉｓＭｅｔ”誘導体は両方とも，有効性の臨床兆候に関する限り，同様の特性を示す。

免疫原性
すべての患者は，治療の前，間および後に，抗ヒストンＨ１．３自己抗体の存在について調べた。治療を受けた患者は，１サイクルの治療を受けた者も，２サイクルの治療を受けた者も，治療の間に自己抗体を生成しなかった。ヒストンＨ１は非常に進化的に保存された蛋白質であり，免疫原性であるとは予測されず，証明されていなかった。臨床データから，天然に生ずるヒストンＨ１．３または“ｂｉｓＭｅｔ”誘導体を用いたときに，免疫原性活性が観察されないことが確認された。

治療効果
約５０％の患者は血小板の増加を示し，これらの患者の一部は白血球の増加も示した。これらはいずれも，ＡＭＬの非常に重要なバイオマーカーである。３名の患者は部分的寛解を示した（腫瘍細胞は最初の値の５０％未満に減少。患者ＷＷ１３は血小板が正常レベル（２１０ｘ１０^９／ｌ）まで増加し，これは１８か月継続した。Ｏｎｃｏｈｉｓｔによる治療前のこの患者の血小板数は４７ｘ１０^９／ｌであった。

６．２臨床結果の最終評価
表６は，用量漸増レベル（Ｆｉｂｏｎａｃｃｉスキーム）の組換えヒトヒストンＨ１．３（ｒｈＨ１．３，“Ｏｎｃｏｈｉｓｔ”）で治療した２２名のＡＭＬ患者のより詳細な分析後の臨床結果をまとめたものである。

上述したように，患者ＷＷ１３およびＷＷ２７は，それぞれ２サイクルの治療を受けた（１サイクルは１週間に３回の注入を３週間，合計９回からなる）。ＷＷ２７は各サイクルで投与量を増加させた。すなわち，５−５−６：２週間投与量レベル５，第３週投与量レベル６，および同様に第２サイクルの投与量レベル：６−６−７。

治療効果
最終評価にしたがえば，２２名のうち７名の患者は，血小板の増加を示し，これらの患者の一部は白血球の増加も示した。これは両方とも，ＡＭＬの非常に重要なバイオマーカーである。３名の患者は部分寛解（腫瘍細胞は６−２５％未満に低下し，同時に他の血液値は改善された）を示した。患者ＷＷ１３は，血小板の正常レベル（２１０ｘ１０^９／ｌ）への増加を示し，これは１８か月持続した。この患者のＯｎｃｏｈｉｓｔによる治療前の血小板カウントは４７ｘ１０^９／ｌであった。

安全性評価
臨床試験報告では，ｒｈＨ１．３（Ｏｎｃｏｈｉｓｔ）は，これまでに治療した投与量では安全であることを示した。重篤な副作用は観察されなかったが，ただし１症例についてｒｈＨ１．３の注入により心房性細動があり，これはおそらく試験薬剤に関連するもの
と考えられた。１７名の患者が１クールの治療（８−９回の投与）を完了し，応答した２名の患者は，副作用なしに第２クールの治療を受けた。用量制限毒性は認められず，６２８ｍｇ／ｍ^２では最大許容投与量に到達しなかった。

最も重要なことには，純粋な，エンドトキシンを含まない試験薬剤は，細胞増殖抑制に反して，患者によりよく許容され，すなわち副作用がなかった。この結果は，前臨床試験の結果と一致しており，組換えヒトヒストンＨ１．３誘導体が健康な血液細胞に障害を与えず，耐性を引き起こさないことを示す。

実施例７：サンプル中におけるｂｉｓ−ｍｅｔｈＨ１．３の存在の評価
“ｂｉｓ−Ｍｅｔ”ヒストンｈＨ１．３は，ＭＳにより，内因性ヒストンＨ１から容易に区別することができる。これは，元のプロセシングされていないｒｈＨ１．３薬品溶液のＥＳＩ−ＱＴＯＦ検出により，またはＲＰ−ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳプロセスによって，ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー分離および続くＥＳＩ−ＭＳ検出により，直接分析することができる。図２に示されるように，バッチＢ１は，ヒストンＨ１．３およびＮ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−誘導体の両方を含む。図３は，３つのバッチの１つ（Ｂ２）を示し，これは主としてＮ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｈ１．３から構成される。組成にかかわらず，異なるバッチは白血病細胞に対する同程度の細胞毒性活性を示す（表３）。

下記のスペクトルは，タンデム質量分析（ＱＴＯＦ，四極子と飛行時間スペクトロメトリを組み合わせた単一の装置）により取得した。図２に示されるように，バッチＢ１はヒストンＨ１．３とｔｈｅＮ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−誘導体の両方を含む。図３は，３つのバッチの１つ（Ｂ２）を示し，これは主としてＮ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｈ１．３から構成される。組成にかかわらず，異なるバッチは白血病細胞に対する同程度の細胞毒性活性を示す（表３）。

Claims (19)

1. ａ）第１および第２のＮ末端アミノ酸残基として、ペプチド結合を介して成熟真核生物Ｈ１ヒストン（ａｂ）に連結されている２つのメチオニン残基（ａａ）を含んでなるポリペプチドをコードするか；
   ｂ）第１および第２のＮ末端アミノ酸残基として、ペプチド結合を介して、配列番号７、９、１１または１３の成熟真核生物ヒストンと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつその生物学的活性を少なくとも５０％保持している成熟真核生物ポリペプチド（ｂｂ）に連結されている２つのメチオニン残基（ｂａ）を含んでなるポリペプチドをコードするか；または
   ｃ）配列番号６、８、１０または１２と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子（ここで、該核酸分子は、少なくとも２つのＮ末端アミノ酸残基を有し、その生物学的活性を少なくとも５０％保持している成熟真核生物Ｈ１ヒストンをコードする）の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、
   単離された核酸分子。
2. 前記ストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、７５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液中での４２℃におけるインキュベーション手順、または、
   ６００ｍＭ塩化ナトリウムおよび６０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液中での６５℃におけるインキュベーション手順を含む、請求項１記載の核酸分子。
3. 請求項１または２記載の核酸分子に相補的な単離された核酸分子。
4. 請求項１〜３のいずれか一項の核酸分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、（ａａ）、（ｂａ）または（ｃ）の２つのＮ末端メチオニン残基をコードするヌクレオチドトリプレットに相補的なヌクレオチドを含み、かつ最少長さ１０ヌクレオチドを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチド。
5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
6. 請求項５記載のベクターによりトランスフォームされた宿主細胞。
7. 細菌、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞または植物細胞である、請求項６記載の宿主細胞。
8. ポリペプチドを製造する方法であって、請求項６または７記載の宿主細胞を適当な条件で培養し、産生されたポリペプチドを単離することを含む方法。
9. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子によりコードされるか、または請求項８記載の方法により製造されるポリペプチド。
10. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、請求項６または７記載の宿主細胞、請求項８記載の方法により製造されるポリペプチド、または請求項９記載のポリペプチドを含む組成物。
11. さらに成熟真核生物ヒストンを含む、請求項１０記載の組成物。
12. 薬学的に許容しうる担体および／または希釈剤をさらに含む医薬組成物である、請求項１１記載の組成物。
13. 診断用組成物である、請求項１１記載の組成物。
14. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８記載の方法により製造されるポリペプチド、または請求項９記載のポリペプチドを特異的に認識するが、対応する成熟真核生物ヒストンには結合しない抗体またはアプタマーまたはファージ。
15. 請求項１４記載の抗体、アプタマーおよび／またはファージを含む診断用組成物。
16. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項９記載のポリペプチドの存在を試験する方法であって、被験者から取得したサンプルを、前記核酸分子またはポリペプチドの存在についてアッセイすることを含む方法。
17. 前記サンプルは、血液、血清、血漿、唾液、尿、粘膜組織、または粘液である、請求項１６記載の方法。
18. １またはそれ以上の容器中に、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項５記載のベクター、請求項６または７記載の宿主細胞、または請求項９記載のポリペプチドを含むキット。
19. １またはそれ以上の容器中に、請求項１４記載の抗体、アプタマーおよび／またはファージを含むキット。