ES2649404T3 - Procedimiento para detectar aductos de nucleosomas - Google Patents

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Abstract

Uso de un aducto de nucleosoma-proteína como biomarcador en una muestra de sangre para el diagnóstico de cáncer, donde la proteína en aducto con el nucleosoma comprende un factor de transcripción o una enzima modificadora de cromatina.

Description

DESCRIPCION
Procedimiento para detectar aductos de nucleosomas 5 CAMPO DE LA INVENClON
La invencion se refiere a la deteccion y medida de la presencia de aductos de nucleosoma-protefna y al uso de tales medidas para la deteccion y el diagnostico de enfermedades.
10 ANTECEDENTES DE LA INVENClON
El cuerpo humano comprende varios cientos de tipos celulares. Todos estos tipos celulares contienen el mismo genoma, pero fenotipos ampliamente diferentes y funciones diferentes en el cuerpo. Esta diversidad fenotfpica es debida a la expresion diferencial del genoma en diferentes tipos celulares. El control de la expresion genica 15 diferencial no se entiende totalmente, pero los mecanismos basicos incluyen regulacion genica por una serie de senales epigeneticas interconectadas asociadas al gen, incluyendo control del empaquetamiento de cromatina como eucromatina o heterocromatina, control de la localizacion de nucleosomas y sitios accesibles a nucleasa, metilacion del ADN y variacion de la estructura de los nucleosomas alrededor de los cuales se envuelve el ADN.
20 El nucleosoma es la unidad basica de la estructura de cromatina y consiste en un complejo proteico de ocho histonas nucleares altamente conservadas (que comprenden un par de cada histona H2A, H2B, H3 y H4). Alrededor de este complejo se envuelven aproximadamente 146 pares de bases de ADN. Otra histona, H1 o H5, actua como conector y esta implicada en la compactacion de cromatina. El ADN se arrolla alrededor de nucleosomas consecutivos en una estructura que a menudo se dice que parece de "collar de perlas" y esto forma 25 la estructura basica de la cromatina abierta o eucromatina. En la cromatina compactada o heterocromatina, este collar esta enrollado y superenrollado en una estructura cerrada y compleja (Herranz y Esteller, 2007).
El recambio celular normal en adultos humanos implica la creacion por division celular de unas 1011 celulas diariamente y la muerte de un numero similar, principalmente por apoptosis. Durante el proceso de apoptosis, se 30 degrada la cromatina en mononucleosomas y oligonucleosomas, que se liberan de las celulas. En condiciones normales, estos se eliminan y el nivel de nucleosomas en circulacion encontrado en sujetos sanos es bajo. Se encuentran niveles elevados en sujetos con una variedad de afecciones, incluyendo muchos canceres, enfermedades autoinmunitarias, afecciones inflamatorias, apoplejfa e infarto de miocardio (Holdenrieder y Stieber, 2009).
35
Se pueden detectar mononucleosomas y oligonucleosomas por ensayo de inmunosorcion ligado a enzima (ELISA) y se han resenado varios procedimientos (Salgame y col., 1997; Holdenrieder y col., 2001; van Nieuwenhuijze y col., 2003). Estos ensayos emplean tfpicamente un anticuerpo antihistona (por ejemplo, anti- H2B, anti-H3 o anti-H1, H2A, H2B, H3 y H4) como anticuerpo de captura y un anticuerpo anti-ADN o 40 anticomplejo de ADN de H2A-H2B como anticuerpo de deteccion. Sin embargo, se ha encontrado que los resultados de estos ensayos no coinciden entre si. Ademas, aunque la mayorfa del ADN en circulacion en suero o plasma se resena que existe como mononucleosomas y oligonucleosomas (Holdenrieder y col., 2001), los niveles medidos de nucleosomas y ADN en suero o plasma no coinciden bien. El coeficiente de correlacion entre los resultados de ELISA para niveles de nucleosomas exentos de celula en circulacion y los niveles de ADN en 45 circulacion medidos por PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) instantanea se ha resenado que es de r= 0,531 en suero y de r= 0,350 en plasma (Holdenrieder y col., 2005).
Se usan procedimientos ELISA de nucleosoma en cultivo celular, principalmente como procedimiento para detectar la apoptosis (Salgame y col., 1997; Holdenrieder y col., 2001; van Nieuwenhuijze y col., 2003) y se usan 50 tambien para la medida de los nucleosomas exentos de celula en circulacion en suero y plasma (Holdenrieder y col., 2001). Se han medido los niveles serico y plasmatico de nucleosomas exentos de celula liberados en la circulacion por celulas moribundas mediante procedimientos de ELISA en estudios de una serie de canceres diferentes para evaluar su uso como biomarcador potencial (Holdenrieder y col., 2001). Se resena que los niveles medios de nucleosomas en circulacion son altos en la mayorfa, pero no todos, los canceres estudiados. Se 55 observaron los niveles de nucleosomas en circulacion maximos en sujetos de cancer de pulmon. Se observaron los niveles mfnimos en cancer de prostata, que estaban dentro del intervalo normal de sujetos sanos. Sin embargo, se resena que los sujetos con tumores malignos tienen concentraciones sericas de nucleosomas que variaban considerablemente, y se encontro que algunos sujetos con enfermedad tumoral avanzada tenfan bajos niveles de nucleosomas en circulacion, dentro del intervalo medido para sujetos sanos (Holdenrieder y col., 60 2001). Debido a esto y a la variedad de causas no cancerosas de los niveles elevados de nucleosomas, los
niveles de nucleosomas en circulacion no se usan clfnicamente como biomarcador de cancer (Holdenrieder y Stieber, 2009).
La estructura de los nucleosomas puede variar por modificacion postranscripcional (MPT) de protefnas histonas y 5 por la inclusion de protefnas histonas variantes. La MPT de protefnas histonas aparece tfpicamente en las colas de las ocho histonas nucleares y las modificaciones comunes incluyen acetilacion, metilacion o ubiquitinacion de residuos de lisina, asf como metilacion de residuos de arginina y fosforilacion de residuos de serina.
Las modificaciones de histona son conocidas por estar implicadas en la regulacion epigenetica de la expresion 10 genica (Herranz y Esteller, 2007). La estructura del nucleosoma puede variar tambien por la inclusion de isoformas de histona alternativas o variantes que son diferentes productos genicos o de empalme y tienen diferentes secuencias aminoacfdicas. Las variantes de histona pueden clasificarse en una serie de familias que se subdividen en tipos individuales. Son conocidas las secuencias nucleotfdicas de un gran numero de variantes de histona y estan publicamente disponibles por ejemplo en la Base de datos de Histona del National Human 15 Genome Research Institute NHGRI (Marino-Ramfrez, L., Levine, K.M., Morales, M., Zhang, S., Moreland, R.T., Baxevanis, A.D. y Landsman, D. The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold- containing proteins. Database Vol. 2011. (remitido) y en
http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml), la base de datos GenBank (secuencia genetica NIH), la base de datos de secuencias nucleotfdicas EMBL y el DNA Data Bank of Japan (DdBj).
20
Se ha mostrado que difieren las variantes de histona y patrones de modificacion de histona presentes en celulas sanas y enfermas en numerosos estudios (la mayorfa inmunohistoquimicos) (Herranz y Esteller, 2007). Una desventaja de los procedimientos inmunohistoquimicos para uso clfnico es que la recogida de muestra de tejido es invasiva al implicar cirugfa o biopsia.
25
Ademas de la senalizacion epigenetica mediada por la estructura y posicion del nucleosoma, el control de la expresion genica en celulas esta tambien mediado por el estado de metilacion del ADN (Herranz y Esteller, 2007). Es conocido en la materia desde hace tiempo que el ADN puede metilarse en la posicion 5 de los nucleotidos de citosina formando 5-metilcitosina.
30
Se reseno la implicacion de la metilacion del ADN en el cancer tan temprano como en 1983 (Feinberg y Vogelstein, 1983). Los patrones de metilacion de ADN observados en celulas cancerosas difieren de aquellos de celulas sanas. Se resena que los elementos repetitivos, particularmente alrededor de las areas pericentromericas, estan hipometilados en las celulas cancerosas respecto a las sanas, pero se resena que los 35 promotores de genes especfficos estan hipermetilados en cancer. Se resena que el equilibrio de estos dos efectos da como resultado una hipometilacion de ADN global en celulas cancerosas (Rodrfguez-Paredes y Esteller, 2011).
La hipermetilacion de ciertos genes especfficos puede usarse como biomarcador de diagnostico para canceres. 40 Por ejemplo, se reseno que un procedimiento resenado para la deteccion de hipermetilacion del gen de septina 9 por amplificacion por PCR del ADN extrafdo de plasma detectaba un 72 % de los canceres de colon con una tasa de falsos positivos del 10 % (Grutzmann y col., 2008). El estado de metilacion del ADN de genes o loci especfficos se detecta habitualmente por desaminacion de citosina con bisulfito selectiva, pero no de 5- metilcitosina, hasta uracilo, conduciendo a un cambio en la estructura primaria del ADN que puede detectarse 45 secuenciando o por otros medios (Allen y col., 2004).
La hipometilacion de ADN global es un distintivo de las celulas cancerosas (Esteller 2007 y Hervouet y col., 2010). La metilacion de ADN global puede estudiarse en celulas usando tecnicas de inmunohistoqufmica. Como alternativa, se extrae el ADN de las celulas para analisis.
50
Es conocido desde hace muchos anos que, ademas de acido nucleico y protefnas histonas, la cromatina comprende un gran numero de protefnas no histonas unidas a su ADN y/o histonas constituyentes (Yoshida y Shimura, 1972). Estas protefnas asociadas a cromatina son de una amplia variedad de tipos y tienen una variedad de funciones, incluyendo factores de transcripcion, factores de potenciacion de la transcripcion, factores 55 de represion de la transcripcion, enzimas modificadoras de histona, protefnas reparadoras del dano al ADN y muchos mas. El estudio de las protefnas unidas a cromatina se ha llevado a cabo en gran medida por procedimientos de inmunoprecipitacion de cromatina (ChIP). Estos procedimientos son bien conocidos en la materia, pero son complejos, laboriosos y caros.
60 En un procedimiento de ChIP tfpico, la cromatina celular se reticula de modo que todos los componentes de
protefna y acido nucleico se enlacen covalentemente entre si. Se cizalla entonces la cromatina formando una preparacion de mononucleosomas y oligonucleosomas. Se anade un anticuerpo de la protefna de interes a la cromatina cizallada para inmunoprecipitar aquellos fragmentos de cromatina que contienen la protefna. El anticuerpo se enlaza normalmente con una fase solida (p.ej., perlas de plastico) para facilitar el aislamiento del 5 complejo de cromatina que contiene la protefna de interes. Se revierte entonces la reticulacion y se elimina la protefna por digestion con una proteinasa. Se afsla el ADN asociado al complejo de cromatina y se analiza para determinar la secuencia de ADN, gen o locus asociado a la union a protefna particular usando cualquiera de una variedad de tecnicas, incluyendo PCR seguida de electroforesis en gel, secuenciacion de ADN (ChIP-Seq) o micromatrices de ADN (ChlP-on-chip).
10
Estos procedimientos de ChIP revelan las secuencias de ADN asociadas a protefnas histonas unidas a cromatina. Se han desarrollado derivados del procedimiento de ChIP para facilitar estudios de la asociacion de protefnas no histonas con histonas y nucleosomas, incluyendo por ejemplo ensayos asociados a histonas (Ricke y Bielinsky, 2005).
15
Muchas protefnas que se unen a cromatina estan implicadas en el cancer y otros mecanismos patologicos, pero su abundancia en forma de aducto de nucleosoma en la circulacion no se ha investigado anteriormente. Los ejemplos incluyen la protefna de secuencia 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1), la protefna de Polycomb potenciadora del homologo de Zeste 2 (EZH2) y el grupo de protefnas receptores nucleares.
20
El grupo de alta movilidad de protefnas son un componente de la cromatina presente a aproximadamente un 3 % en peso del ADN o histonas. Son protefnas estructurales que se unen a nucleosomas sin ninguna especificidad conocida por la secuencia de ADN subyacente (Gerlitz y col., 2009). La HMGB1 es una protefna cromosomica arquitectural y un mediador proinflamatorio. Esta implicada en la muerte celular, apoptosis y en numerosas 25 enfermedades incluyendo diversas afecciones inflamatorias y autoinmunitarias, sepsis, meningitis y neurodegeneracion. La sobreexpresion de HMGB1 esta asociada a todos los distintivos esenciales del cancer (Tang y col., 2010). La HMGB1 esta estrechamente enlazada con la cromatina de celulas apoptoticas. Los estudios de complejos de nucleosoma-HMGB1 han mostrado que estos aductos se encuentran en la circulacion de sujetos que padecen la enfermedad autoinmunitaria lupus sistemico eritematoso (LSE) y que los aductos 30 estan implicados en el desarrollo de anticuerpos antinucleares, lo que es un rasgo clave del LSE. Los nucleosomas no enlazados con HMGB1 no desencadenan una respuesta inmunitaria. La union de HMGB1 a nucleosomas en estos aductos se demostro por inmunoprecipitacion de nucleosomas con un anticuerpo dirigido a ADN o histonas seguida de transferencia Western usando un anticuerpo anti-HMGB1 para demostrar la presencia de HMGB1 en los nucleosomas inmunoprecipitados (Urbonaviciute y col., 2008).
35
Las protefnas HMGB interaccionan con muchas otras protefnas conocidas por afectar a la funcion de la cromatina y se ha mostrado que aparecen complejos de cromatina que implican protefnas HMGB mas protefnas adicionales (Gerlitz y col., 2009). Por tanto, ademas de aductos de nucleosoma-protefna sencillos, aparecen en la cromatina aductos de complejos de nucleosoma-protefna en que estan asociadas dos o mas protefnas a 40 nucleosomas.
La EZH2 es un miembro de la familia del grupo Polycomb (PcG) que forma complejos proteicos multimericos implicados en el mantenimiento del estado represivo transcripcional de los genes. La EZH2 es una enzima de modificacion de histona (histona-lisina N-metiltransferasa) que metila el residuo aminoacfdico lisina 27 de la 45 histona 3 de nucleosomas. Esta modificacion de histona esta asociada a la condensacion de cromatina y el silenciamiento genico (Cao y col. 2002).
Los receptores nucleares son moleculas que regulan la expresion genica bajo el control de hormonas o ligandos, por ejemplo el receptor de estrogeno (ER) regula la expresion de genes dependientes de estrogeno. Muchas de 50 estas protefnas estan implicadas en procesos patologicos, por ejemplo eR esta implicado en la progresion de cancer de mama y muchos tratamientos de cancer de mama estan orientados a ER y/o a la prevencion de la interaccion de ER con su ligando estradiol.
Ademas de los aductos de nucleosoma-protefna que aparecen en la celula, hay otros aductos de nucleosoma- 55 protefna que pueden formarse despues de la liberacion de nucleosomas de la celula despues de la muerte celular. Tales aductos de nucleosomas incluyen los aductos de nucleosoma-inmunoglobulina que son un rasgo clave del LSE.
Urbonaviciute y col. (2011) J. Int. Med., 270(4): 309-318 y Urbonaviciute y col. (2008) J. Exp. Med., 205(13): 60 3007-3018 describen a HMGB1 como un marcador potencial en la sangre de pacientes con lSe. El documento
EP1668368 describe el diagnostico de afecciones patologicas mediante el analisis de las modificaciones postraduccionales de histona en nucleosomas exentos de celula. El documento WO2005/040814 describe la determinacion de la presencia o cantidad de modificacion postraduccional de residuos en secuencias de histona para la deteccion y el diagnostico de cancer. Fullgrabe y col. (2011) Oncogene, 30(31): 3391-3404 es una 5 revision de las modificaciones postraduccionales en histonas que se han ligando al cancer. Louie y col. (2003) PNAS, 100(5): 2226-2230 describe la inmunoprecipitacion de complejos de cromatina con anticuerpos antireceptor de androgeno (AR) para medir la ocupacion de cromatina de AR en el gen de antfgeno especffico de prostata (PSA). Sun y col. (1987) J. Steroid. Biochem, 26(1): 83-92describe una investigacion sobre las interacciones entre preparaciones de anticuerpo antireceptor y fracciones de cromatina aisladas de celulas 10 sensibles a hormonas.
Se resenan ahora procedimientos de inmunoensayo sencillos para la estimacion directa de aductos de protefna- nucleosoma en muestras biologicas. Se han desarrollado procedimientos sencillos para la deteccion de EZH2, HMGB1 y varios receptores nucleares unidos a nucleosoma y se ha mostrado que tales aductos de nucleosoma 15 pueden detectarse en muestras de suero y tienen uso como biomarcadores en enfermedades.
RESUMEN DE LA INVENCION
De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se proporciona el uso de un aducto de nucleosoma-protefna 20 como biomarcador en una muestra de sangre para el diagnostico del cancer, donde la protefna en aducto con el nucleosoma comprende un factor de transcripcion o una enzima modificadora de cromatina.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
25 Figura 1: Curva de dosis-respuesta de ELISA para la deteccion de los niveles de aducto de nucleosoma-EZH2 en cromatina digerida extrafda de celulas Hela diluida en suero equino.
Figura 2: Resultados de ELISA del aducto de nucleosoma-EZH2 para muestras de suero tomadas de 5 sujetos sanos y 11 sujetos con tumores.
Figura 3: Curva de dosis-respuesta de ELISA para la deteccion de los niveles de aducto de nucleosoma-HMGB1 30 en cromatina digerida extrafda de celulas Hela diluida en suero equino.
Figura 4: Resultados de ELISA del aducto de nucleosoma-HMGB1 para muestras de suero tomadas de 5 sujetos sanos y 11 sujetos con tumores.
Figura 5: Resultados de ELISA del aducto de nucleosoma-HMGB1 para muestras de suero tomadas de 31 sujetos sanos y 74 sujetos con (A) cancer de colon, (B) cancer de mama o (C) cancer de pulmon.
35 Figura 6: Curva de dosis-respuesta de ELISA para la deteccion de los niveles de aducto de nucleosoma-receptor de progesterona en nucleosomas exentos de celula preparados mediante el procedimiento de *Holdenrieder y col.;2001.
Figura 7: Resultados de ELISA para la deteccion de los niveles de aducto de nucleosoma-receptor de androgeno en 2 casos de cancer de prostata y una muestra de nucleosoma exento de celula preparada mediante el 40 procedimiento de *Holdenrieder y col.; 2001.
Figura 8: Curva de dosis-respuesta de ELISA para la deteccion de los niveles de aducto de nucleosoma-receptor alfa de estrogeno (ERa) en nucleosomas exentos de celula preparados mediante el procedimiento de *Holdenrieder y col.; 2001.
Figura 9: Resultados de ELISA para la deteccion de los niveles de aducto de nucleosoma-ERp en cromatina de 45 MCF7 digerida. Se llevo a cabo el ensayo en dos formatos diferentes. En el primer formato, se recubrio el anticuerpo antinucleosoma sobre los pocillos y se biotinilo el anticuerpo anti-ERp. En el segundo formato, se recubrio el anticuerpo anti-ERp sobre los pocillos y se biotinilo el anticuerpo antinucleosoma.
Figura 10: Resultados de ELISA del aducto de H2AZ de nucleosoma-ERp.
Figura 11: Resultados de ELISA del aducto de nucleosoma-ERp para muestras de suero tomadas de 12 sujetos 50 sanos y 16 sujetos con tumores.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se proporciona el uso de un aducto de nucleosoma-protefna 55 como biomarcador en una muestra de sangre para el diagnostico del cancer, donde la protefna en aducto con el nucleosoma incluye un factor de transcripcion o una enzima modificadora de cromatina. Se ha mostrado que tales dos aductos que contienen HMGB1 y EZH2 estan presentes en la circulacion de sujetos con cancer, pero no se detectan en la circulacion de sujetos sanos.
60 Es bien conocido en la materia que los canceres pueden ser dependientes de hormonas y requerir la presencia
de hormonas para el crecimiento. Es tambien bien conocido que las hormonas nucleares funcionan mediante localizacion nuclear del complejo de hormona unida a receptor y union a elementos de respuesta hormonal especfficos en el genoma. La expresion de genes asociados a los elementos esta regulada por la union del complejo de hormona unida a receptor al elemento de respuesta genomica. En una realizacion, la divulgacion 5 proporciona biomarcadores de aducto de receptor hormonal-nucleosoma y aducto de complejo de hormona- receptor hormonal-nucleosoma para caracterizar el estado tumoral de un sujeto. Estos aductos pueden ser aductos en circulacion presentes en la sangre o en otro fluido corporal o pueden producirse por la digestion de cromatina de una muestra de tejido tumoral.
10 Es bien conocido en la materia que los receptores de hormonas nucleares regulan la expresion genica bajo control hormonal o de ligando. Por ejemplo, el receptor de estrogeno funciona uniendose a su sustrato (la hormona esteroidea estrogeno) en la membrana de la superficie celular. La union es seguida por la internalizacion del complejo de hormona-receptor y la localizacion intranuclear, donde el receptor se une a elementos de respuesta hormonal especfficos en el genoma. La secuencia genica especffica a la que se une el 15 receptor de estrogeno es conocida como el elemento de respuesta a estrogeno (ERE). La expresion de genes asociados al ERE puede regularse por el receptor y, por ello, por la presencia o nivel de estrogeno en la circulacion de un sujeto. Es tambien bien conocido en la materia que el crecimiento de cancer de mama esta a menudo bajo control estrogenico y que tal cancer se denomina a menudo dependiente de estrogeno. Como estos tumores sobreexpresaan el receptor de estrogeno (ER), se denominan a menudo tumores ER+. El crecimiento 20 de tumores dependientes de estrogeno puede retardarse o prevenirse por intervenciones terapeuticas dirigidas a la prevencion de la union de estrogeno al receptor de estrogeno y este es un procedimiento comun de tratamiento de cancer de mama. Los ejemplos de tales tratamientos incluyen el farmaco tamoxifeno, que actua como antagonista de estrogeno en cancer de mama dependiente de estrogeno e inhibidores de aromatasa, que retardan o previenen la produccion de estrogeno. Sin embargo, con el tiempo, los canceres evolucionan a 25 tumores independientes de estrogeno que creceran incluso en ausencia de estimulacion estrogenica y requeriran tratamientos diferentes. El diagnostico de tumores dependientes e independientes de estrogeno se practica actualmente de forma rutinaria por inmunotincion de tejido de biopsia tumoral para determinar la abundancia o lo contrario de receptor de estrogeno en las celulas tumorales. Los medicos clfnicos pueden tener que volver a ensayar la dependencia de estrogeno de un tumor repetidamente durante el transcurso del tratamiento tumoral 30 para determinar si es apropiado o no un tratamiento dependiente de estrogeno adicional, o si deberfa alterarse el regimen de tratamiento del sujeto para reflejar la naturaleza cambiante del tumor a medida que progresa la enfermedad. Desgraciadamente, las pruebas actuales son suboptimas y requieren una dolorosa biopsia repetida en cada ocasion que se practica la prueba. En una realizacion de la invencion, se usa la deteccion de aductos de receptor de estrogeno-nucleosoma en la circulacion de pacientes de cancer de mama como indicador de la union 35 de receptor de estrogeno a ERE en el nucleo de celulas tumorales como indicador de la dependencia de estrogeno de un tumor, para ayudar a la seleccion del tratamiento apropiado y para informacion de pronostico predictivo. Este procedimiento tiene las ventajas de que es indicativo de union de ERE-receptor de estrogeno en el tumor, en lugar de un simple indicador de la presencia o abundancia de receptor de estrogeno, y que puede repetirse lo frecuentemente que se desee mediante una sencilla prueba sangufnea sin necesidad de biopsia. Se 40 han desarrollado procedimientos de ELISA sencillos para la deteccion y cuantificacion de aductos de nucleosoma-ER que contienen ambas formas ERa y ERp del receptor. Sorprendentemente, estos aductos estan presentes en la circulacion de pacientes de cancer.
Resultara evidente para los especialistas en la materia que puede aplicarse el mismo principio para la deteccion 45 de aductos de receptor de estrogeno-nucleosoma en digestiones de cromatina celular producidas a partir del tejido tumoral mismo. Este procedimiento para valorar la dependencia de estrogeno de un tumor es superior a los procedimientos actuales porque es indicativo de la union de ERE-receptor de estrogeno en el tumor, en lugar de un simple indicador de la presencia o abundancia de receptor de estrogeno.
50 En otra realizacion de la invencion, la deteccion de la presencia del estrogeno esteroideo mismo en un aducto de complejo de estrogeno-receptor de estrogeno-nucleosoma en la circulacion o en otro fluido corporal, o en nucleosomas producidos como digestion de cromatina desde tejido tumoral, se usa como indicador del estado de dependencia de estrogeno de un tumor.
55 Se resena que los nucleosomas en circulacion son elevados en endometriosis (Holdenrieder y col.; 2001) y, como el tejido de endometriosis es sensible a estrogeno, la union del receptor de estrogeno en la cromatina de celulas de endometriosis puede conducir a aductos de receptor de estrogeno-nucleosoma o aductos de complejo de estrogeno-receptor de estrogeno-nucleosoma en la circulacion. Los aductos de receptor de estrogeno- nucleosoma o aductos de complejo de estrogeno-receptor de estrogeno-nucleosoma pueden detectarse en un 60 fluido corporal como biomarcador de la presencia de una afeccion ginecologica dependiente de estrogeno
incluyendo, por ejemplo, endometriosis.
De manera similar al cancer de mama dependiente de estrogeno, el crecimiento de cancer de prostata dependiente de androgeno requiere, o se acelera por, androgeno. Los tumores de prostata dependientes de 5 androgeno se tratan de forma similar mediante procedimientos que previenen la union de androgeno al receptor de androgeno (AR). Los tumores de prostata dependientes de androgeno pueden desarrollarse tambien convirtiendose en independientes de androgeno, y por ello resistentes a tratamientos que incluyen castracion ffsica o qufmica por farmacos para prevenir la union de androgeno a su receptor. El estado de dependencia de androgeno de un tumor puede determinarse por el nivel de union de receptor de androgeno a elementos de 10 respuesta a androgeno (ARE) en el genoma, y esto puede determinarse mediante el analisis de los niveles de aducto de receptor de androgeno-nucleosoma presentes en la circulacion de un sujeto o en las digestiones de cromatina de tejido de prostata. Las realizaciones de la invencion con este fin incluyen la deteccion de aductos de receptor de androgeno-nucleosoma o aductos de complejo de androgeno-receptor de androgeno-nucleosoma en la circulacion o en un fluido corporal de un sujeto o en nucleosomas producidos por digestion de cromatina de 15 tejido tumoral de un sujeto. Se han desarrollado ahora procedimientos de ELISA sencillos para la deteccion y cuantificacion de aductos de nucleosoma-AR y se ha demostrado su utilidad. Se han desarrollado tambien procedimientos de ELISA sencillos para la deteccion y cuantificacion de aductos de nucleosoma-receptor de progesterona. Pueden abordarse otras enfermedades dependientes de hormona con procedimientos similares de la divulgacion. Tales procedimientos incluyen la deteccion de otros aductos de receptor-nucleosoma que 20 incluyen, por ejemplo, aductos de receptor de glucocorticoide, receptor de hormona tiroidea y receptor de acido retinoico con nucleosoma para la deteccion de tumores incluyendo, por ejemplo. diversos tipos de leucemia que implican al receptor de acido retinoico.
De acuerdo con una realizacion adicional de la invencion, el aducto de nucleosoma-protefna comprende aductos 25 de complejo de hormona-receptor hormonal-nucleosoma. En una realizacion, los aductos de complejo de hormona-receptor hormonal-nucleosoma comprenden un aducto de complejo de tiroxina-receptor de hormona tiroidea-nucleosoma, un aducto de complejo de triyodotironina-receptor de hormona tiroidea-nucleosoma o un aducto de complejo de acido retinoico-receptor de acido retinoico-nucleosoma, un aducto de complejo de androgeno-receptor de androgeno-nucleosoma o un aducto de complejo de estrogeno-receptor de estrogeno- 30 nucleosoma. Esta realizacion de la invencion tiene la ventaja de distinguir los aductos activados por hormona asf como los aductos que contienen receptor hormonal de tipo silvestre o normal del receptor hormonal que no se une a su ligando, por ejemplo debido a mutacion en el transcurso de la progresion de la enfermedad (por ejemplo, en cancer de mama independiente de estrogeno). Esta realizacion de la invencion puede llevarse a cabo de multiples modos. En una realizacion, se usa un anticuerpo u otro ligador dirigido a unirse a la hormona 35 misma en lugar del anticuerpo dirigido a unirse al receptor hormonal. En una realizacion alternativa, se extrae la hormona de un aducto de complejo de hormona capturada por anticuerpo-receptor hormonal-nucleosoma y se cuantifica mediante procedimientos establecidos, por ejemplo procedimientos de inmunoensayo, procedimientos espectrograficos incluyendo cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC), cromatograffa lfquida seguida de espectroscopfa de masas (LC/MS) o cromatograffa de gases seguida de espectroscopfa de masas (GC/MS). Por 40 ejemplo, se captura el aducto de complejo de androgeno-receptor de androgeno-nucleosoma por anticuerpos inmovilizados dirigidos a unirse a un epftopo presente en el aducto (por ejemplo, en el receptor de androgeno o en un nucleosoma). Se extrae entonces la hormona del aducto unido a la fase solida en un disolvente organico (por ejemplo, dietileter). Se transfiere el disolvente, se seca, se redisuelve el androgeno en tampon de ensayo y se mide su concentracion (por ejemplo, mediante inmunoensayo competitivo). Resultara evidente para los 45 especialistas en la materia que esta realizacion tendra aplicacion particular para hormonas de molecula pequena tales como hormonas esteroideas y tiroideas.
La presente invencion esta encaminada a la deteccion de protefnas que estan unidas a nucleosomas. Esto puede realizarse mediante una prueba ELISA de doble anticuerpo en que un anticuerpo esta dirigido a unirse a 50 nucleosomas y el otro esta dirigido a unirse a la protefna unida al nucleosoma. Sin embargo, el anticuerpo dirigido a unirse al nucleosoma no tiene que estar dirigido a todo el complejo de nucleosoma, sino que puede estar dirigido a una protefna o acido nucleico parte componente del nucleosoma. En esta realizacion de la invencion, el anticuerpo empleado para unirse al nucleosoma puede dirigirse a unirse a cualquier parte componente de un nucleosoma incluyendo, por ejemplo, a una histona particular, modificacion de histona, 55 variante o isoforma de histona o a un nucleotido particular o nucleotido modificado. Se ha mostrado que este diseno de ensayo funciona bien usando el ejemplo de uso de un anticuerpo dirigido a unirse a la variante de histona H2AZ como ligador de nucleosomas. Resultara evidente para los especialistas en la materia que este procedimiento tiene la ventaja adicional de unirse selectivamente solo a aquellos nucleosomas que contienen tanto la protefna de interes en el aducto como H2AZ. Este diseno proporciona un procedimiento de un ensayo 60 para probar cualquier combinacion de protefna de aducto con cualquier histona particular, modificacion de
histona, variante de histona, nucleotido, nucleotido modificado u otra estructura de nucleosoma.
De acuerdo con un segundo aspecto de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de un aducto de nucleosoma-protefna en una muestra que comprende las etapas de:
5
(i) poner en contacto la muestra con un primer agente de union que se une a nucleosomas o un componente de los mismos;
(ii) poner en contacto los nucleosomas o muestra con un segundo agente de union que se une a una protefna en aducto con un nucleosoma;
10 (iii) detectar o cuantificar la union de dicho segundo agente de union a la protefna en aducto en la muestra y (iv) usar la presencia o el grado de dicha union como medida de la presencia de aductos de nucleosoma en la muestra.
Resultara evidente para los especialistas en la materia que el agente de union para detectar puede seleccionarse 15 para ser el anticuerpo dirigido a la protefna en aducto o al nucleosoma o a una parte componente del nucleosoma.
De acuerdo con un tercer aspecto de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de un aducto de nucleosoma en una muestra que comprende las etapas de:
20
(ii) poner en contacto una muestra con un primer agente de union que se une a una protefna en aducto con un nucleosoma;
(ii) poner en contacto los nucleosomas o muestra con un segundo agente de union que se une a nucleosomas o un componente de los mismos;
25 (iii) detectar o cuantificar la union de dicho segundo agente de union a nucleosomas o un componente de los mismos en la muestra y
(iv) usar la presencia o el grado de dicha union como medida de la presencia de aductos de nucleosoma en la muestra.
30 En una realizacion, la protefna en aducto con el nucleosoma es un factor de transcripcion. En una realizacion adicional, el factor de transcripcion es un receptor de hormona nuclear.
En una realizacion, la enzima modificadora de cromatina es una enzima de acetilacion, desacetilacion, metilacion, desmetilacion, fosforilacion, desfosforilacion, ubiquitinacion, desubiquitinacion, sumoilacion, 35 desumoilacion o ADN metiltransferasa de histona. En una realizacion alternativa, la enzima modificadora de cromatina es EZH2.
En una realizacion, cuando el aducto de nucleosoma-protefna incluye un receptor de hormona nuclear, dicho receptor de hormona nuclear es un receptor de estrogeno, receptor de androgeno, receptor de progesterona, 40 receptor de hormona tiroidea, receptor de glucocorticoide o receptor de acido retinoico. En una realizacion alternativa, cuando el aducto de nucleosoma-protefna incluye un receptor nuclear, dicho receptor de hormona nuclear es el receptor de estrogeno, receptor de androgeno o receptor de acido retinoico.
En una realizacion, cuando el aducto de nucleosoma-protefna incluye una hormona, dicha hormona es una 45 hormona tiroidea, un estrogeno, un androgeno o acido retinoico.
En una realizacion, cuando el aducto de nucleosoma-protefna incluye un receptor hormonal, dicho receptor hormonal es el receptor de estrogeno, receptor de androgeno, receptor de progesterona, receptor de hormona tiroidea o receptor de acido retinoico.
50
Se ha mostrado que el procedimiento puede practicarse usando un anticuerpo dirigido al nucleosoma mismo en combinacion con un anticuerpo dirigido a unirse a la protefna en aducto con el nucleosoma o usando un anticuerpo dirigido a un componente de un nucleosoma, de nuevo en combinacion con un anticuerpo dirigido a unirse a la protefna en aducto con el nucleosoma. En una realizacion, el anticuerpo o ligador de nucleosoma o 55 componente de nucleosoma esta dirigido a unirse a un epftopo de nucleosoma epigenetico particular, por ejemplo cualquier variante de histona (p.ej. H2AZ), cualquier modificacion de histona (p.ej., trimetil-H3K9) o cualquier nucleotido o nucleotido modificado (p.ej., 5-metilcitosina). En una realizacion alternativa, el ligador de nucleosoma o componente de nucleosoma esta dirigido a unirse a una estructura de senal epigenetica particular de tal modo que solo se detecte un subconjunto particular de aductos de nucleosoma que contengan dicha 60 estructura de senal epigenetica.
En una realizacion, el agente de union usado es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un aptamero. En una realizacion adicional, el agente de union usado es un anticuerpo.
5 La muestra puede ser un fluido biologico. La muestra puede ser sangre o suero o plasma. Resultara evidente para los especialistas en la materia que la deteccion de aductos de nucleosoma en un fluido corporal tiene la ventaja de ser un procedimiento mfnimamente invasivo que no requiere biopsia.
En algunos casos, sin embargo, puede ser preferible valorar el estado del aducto de nucleosoma de una celula 10 directamente produciendo nucleosomas a partir de esa celula y analizando en los nucleosomas la presencia de aductos de nucleosoma particulares.
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar un aducto de nucleosoma en una celula que comprende las etapas de:
15
(i) aislar cromatina de una celula;
(ii) digerir, sonicar o degradar de otro modo la cromatina formando mononucleosomas y/u oligonucleosomas y
(iii) detectar o medir la presencia del aducto de nucleosoma de acuerdo con un procedimiento de ELISA descrito en cualquiera de los segundo a sexto aspectos anteriores.
20
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar o diagnosticar un estado patologico en un sujeto animal o humano que comprende las etapas de:
(i) detectar o medir un aducto de nucleosoma en un fluido corporal de un sujeto; y
25 (ii) usar el nivel de aducto de nucleosoma detectado para identificar el estado patologico del sujeto.
Puede usarse la presencia de un aducto de nucleosoma en una muestra para determinar el regimen de tratamiento optimo para un sujeto necesitado de tal tratamiento. Es un ejemplo la deteccion de un aducto de receptor de hormona nuclear-nucleosoma o un aducto de complejo de hormona-receptor hormonal-nucleosoma 30 para la valoracion de la dependencia de hormona de un tumor.
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para la valoracion en un sujeto animal o humano de la idoneidad de un tratamiento medico que comprende las etapas de:
35 (i) detectar o medir un aducto de nucleosoma en un fluido corporal del sujeto; y
(ii) usar el nivel de aducto de nucleosoma detectado como parametro para la seleccion de un tratamiento adecuado para el sujeto.
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para monitorizar un 40 tratamiento de un sujeto animal o humano que comprende las etapas de:
(i) detectar o medir un aducto de nucleosoma en un fluido corporal del sujeto;
(ii) repetir la deteccion o medida de un aducto de nucleosoma en un fluido corporal del sujeto en una o mas ocasiones;
45 (iii) usar cualquier cambio en el nivel de aducto de nucleosoma detectado como parametro para cualquier cambio en la afeccion del sujeto.
El aducto de nucleosoma puede detectarse o medirse como uno de un panel de medidas.
50 De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar o medir un aducto de nucleosoma, solo o como parte de un panel de medidas, con fines de detectar o diagnosticar un estado patologico, o para valoracion en un sujeto animal o humano de la idoneidad de un tratamiento medico, o para monitorizar un tratamiento de un sujeto animal o humano para uso en sujetos con cancer real o sospechado, tumores benignos, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria, endometriosis, 55 enfermedad infecciosa, sepsis, apoplejfa o infarto de miocardio.
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para identificar un biomarcador de aducto de nucleosoma para detectar o diagnosticar un estado patologico en un sujeto animal o humano que comprende las etapas de:
(i) detectar o medir un aducto de nucleosoma en un fluido corporal del sujeto;
(ii) detectar o medir un aducto de nucleosoma en un fluido corporal de un sujeto sano o un sujeto de control; y
(iii) usar la diferencia entre los niveles detectados en los sujetos enfermos y de control para identificar si un aducto de nucleosoma es util como biomarcador para el estado patologico.
5
Ademas de los componentes de histona y acido nucleico, la cromatina es conocida por contener una amplia variedad de protefnas que practican un amplio intervalo de funciones. Se seleccionaron HMGB1, EZH2 y varios receptores nucleares como ejemplos de estas protefnas y se han desarrollado procedimientos de ELISA sencillos para la deteccion de aductos de mononucleosoma y oligonucleosoma de estas protefnas. Se practicaron estos 10 procedimientos de ELISA directamente en muestras de suero tomadas de sujetos sanos y enfermos y los procedimientos no requieren extraccion de muestra ni otro pretratamiento de muestra. Sorprendentemente, se ha mostrado que estos aductos de nucleosoma pueden detectarse en el suero de sujetos de cancer y que los ensayos ELlSA de aducto de nucleosoma son utiles en la deteccion y diagnostico de estados patologicos.
15 La HMGB1 es una protefna de patron molecular asociado al dano (DAMP) asociada a muerte celular, apoptosis y numerosas enfermedades, incluyendo diversas afecciones inflamatorias y autoinmunitarias, sepsis, meningitis, neurodegeneracion, LSE y cancer (Tang y col.; 2010). Aparece una expresion elevada de HMGB1 en muchos canceres y se cree que esta asociada a invasion y metastasis (Sims y col., 2010). Aparecen tambien niveles elevados de HMGB1 en la sangre de pacientes de cancer asf como en una variedad de otras afecciones 20 (Stoetzer y col., 2012). La HMGB1 en circulacion puede medirse por ELISA, pero tales medidas no se usan en la practica clfnica rutinaria porque la HMGB1 en circulacion aparece en formas unida y libre y los procedimientos de inmunotransferencia Western actualmente disponibles para distinguir estas no son adecuados para uso rutinario. Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento fiable para distinguir entre HMGB1 libre y complejos de HMGB1 (Urbonaviciute y Voll, 2011). Es una clase importante de complejos de HMGB1 en circulacion los 25 aductos de HMGB1-nucleosoma y un aspecto de la presente divulgacion esta dirigido a la deteccion de aductos de HMGB1-nucleosoma y otros aductos de HMG-nucleosoma. Se ha mostrado que los aductos de HMG- nucleosoma pueden medirse en la sangre de pacientes de cancer usando un procedimiento ELISA rapido y sencillo.
30 La HMGB1 esta estrechamente enlazada con la cromatina de celulas apoptoticas. Los estudios de complejos de nucleosoma-HMGB1 han mostrado que estos aductos se encuentran en la circulacion de sujetos que padecen la enfermedad autoinmunitaria LSE y que los aductos estan implicados en el desarrollo de anticuerpos antinucleares, lo que es un rasgo clave del LSE. La presencia de estos aductos en la circulacion no se ha usado con fines de diagnostico clfnico porque los procedimientos de transferencia Western usados para su deteccion 35 son caros, lentos y laboriosos y no adecuados para uso clfnico rutinario. La presente divulgacion supera estos inconvenientes.
La EZH2 es una enzima de modificacion de cromatina (histona lisina N-metiltransferasa) que metila el residuo aminoacfdico lisina 27 de la histona 3 de nucleosomas, conduciendo a la condensacion de cromatina y el 40 silenciamiento genico (Cao y col.; 2002). Esta protefna es conocida por unirse a la cromatina en el nucleo de celulas vivas. Sorprendentemente, se ha mostrado que la EZH2 permanece unida a nucleosomas despues de la muerte celular y pueden detectarse aductos de mononucleosoma-EZH2 y oligonucleosoma-EZH2 en el suero de sujetos de cancer usando los procedimientos ELISA novedosos divulgados en la presente memoria.
45 Es conocido que las enzimas modificadoras de cromatina estan implicadas en el cancer (Fullgrabe y col., 2011) y la inhibicion de la actividad de estas enzimas mediante el uso de farmacos orientados es una forma importante de terapia de cancer. Estos farmacos incluyen, por ejemplo y sin limitacion, inhibidores del complejo de desacetilacion de histona (HDACi), inhibidores de histona metiltransferasa (HMTi) e inhibidores de ADN metiltransferasa (DNMTi). Aunque la presencia de aductos de HMGB1 en la circulacion es conocida por ser 50 patologica y estar asociada a anticuerpos antinucleares, el hallazgo de que los aductos de enzima modificadora de cromatina-nucleosoma estan presentes en la circulacion no se ha resenado anteriormente. Los ensayos de aductos de enzima modificadora de cromatina-nucleosoma tienen multiples usos en el cancer, incluyendo por ejemplo en la valoracion de los estados patologicos cancerosos y en la determinacion de la eficacia de los farmacos inhibidores de la enzima modificadora de cromatina, por ejemplo para determinar si el nivel de aducto 55 de enzima modificadora de cromatina-nucleosoma en circulacion se altera por el tratamiento con farmacos particulares. El procedimiento de la divulgacion puede usarse para determinar los niveles de aducto de enzima modificadora de cromatina-nucleosoma en circulacion para una amplia variedad de fines de diagnostico patologico, incluyendo deteccion, monitorizacion, pronostico, diagnostico diferencial de enfermedades y eleccion de regfmenes de tratamiento. Se ha mostrado que los aductos de nucleosoma que contienen la enzima HMT 60 EZH2 pueden detectarse en la circulacion de pacientes de cancer. Resultara evidente para los especialistas en la
materia que el uso de la invencion puede aplicarse a otras enzimas modificadoras de cromatina, incluyendo las enzimas HDAC y DNMT anteriormente mencionadas, asf como muchas otras enzimas incluyendo, por ejemplo, enzimas para acetilacion, desmetilacion, fosforilacion, desfosforilacion, ubiquitinacion, desubiquitinacion, sumoilacion y desumoilacion de histona.
5
Los receptores nucleares ejercen sus efectos reguladores genicos en el nucleo bajo el control hormonal de ligando. Los ejemplos incluyen los receptores de hormona esteroidea, receptor tiroideo, receptor de glucocorticoide y acido retinoico y receptor de vitamina D. Estos receptores estan implicados en una variedad de canceres y otros mecanismos patologicos. Algunos ejemplos incluyen la implicacion del receptor de acido 10 retinoico (RAR) en la leucemia, del receptor de estrogeno (ER) en el cancer de mama y endometriosis, del receptor de androgeno (AR) en el cancer de prostata y del receptor de hormona tiroidea en enfermedad y cancer tiroideos.
Sorprendentemente, se ha mostrado que los aductos de receptor nuclear-nucleosoma pueden detectarse en la 15 circulacion de pacientes de cancer.
Por tanto, todas las protefnas asociadas a cromatina intracelular que se eligieron para el estudio pueden encontrarse en el suero de pacientes de cancer en forma de aductos de nucleosoma. Estos hallazgos indican que tales aductos pueden no ser inhabituales y que muchos de tales aductos de nucleosoma-protefna 20 intracelulares, que implican muchas protefnas asociadas a cromatina diferentes, pueden retener su integridad despues de la muerte celular y ser susceptibles de deteccion en el suero de pacientes de cancer, enfermedad autoinmunitaria e inflamatoria mediante el procedimiento de la presente divulgacion.
Se ha usado un anticuerpo antihistona como anticuerpo de captura para estos ensayos en combinacion con un 25 anticuerpo antiprotefna de cromatina especffico apropiado (anti-HMGBI, anti-EZH2 o antireceptor nuclear). Se han usado los ensayos para mostrar que pueden medirse aductos de nucleosoma que contienen protefnas especfficas en muestras de sangre tomadas de sujetos con cancer y son discriminativos para uso como biomarcadores no invasivos o mfnimamente invasivos. Los niveles de aducto de nucleosoma detectados en muestras de suero tomadas de sujetos enfermos diferfan de aquellos detectados en muestras de suero de 30 sujetos sanos.
Se han medido los niveles de aductos de nucleosoma-HMGBI y aductos de nucleosoma-EZH2 exentos de celula en circulacion en muestras de sangre tomadas de 3 sujetos con cancer de colon, 6 sujetos con cancer de pulmon y 2 sujetos con cancer pancreatico y se han comparado estos con los niveles presentes en muestras de sangre 35 de 5 sujetos sanos asf como con una preparacion producida artificialmente de nucleosomas sericos de sujetos sanos preparada como se describe en la bibliograffa (*Holdenrieder y col., 2001) y con una preparacion comercialmente disponible de nucleosomas preparados por digestion de cromatina extrafda de celulas Hela.
Se calcularon los intervalos normales a partir de los resultados de los 5 sujetos sanos (resultado medio ± 2 40 desviaciones estandares de la media) para los aductos de nucleosoma-HMBGI y nucleosoma-EZH2 y se examinaron los resultados para sujetos de cancer para ver si entran dentro, o fuera, del intervalo normal respectivo. Los datos muestran que 2 de las 3 muestras de cancer de colon, 4 de las 6 muestras de cancer de pulmon y 1 de las 2 muestras de cancer pancreatico tenfan niveles elevados de aducto de nucleosoma-HMBGI, y de forma similar, que 2 de las 3 muestras de cancer de colon, 4 de las 6 muestras de cancer de pulmon y 1 de 45 las 2 muestras de cancer pancreatico tenfan niveles elevados de aducto de nucleosoma-EZH2 (resultados de densidad optica mayores que el maximo del intervalo normal).
Se han medido de forma similar los niveles de aductos de receptor nuclear-nucleosoma en pacientes sanos y enfermos y se ha mostrado que estos estan presentes en el suero de pacientes de cancer.
50
Las protefnas que se unen a cromatina incluyen, sin limitacion, receptores nucleares, protefnas del grupo de alta movilidad (tales como HMGB1), protefnas Polycomb, enzimas de modificacion de cromatina (tales como EZH2), enzimas de modificacion de ADN, receptores nucleares, factores de transcripcion, protefnas arquitecturales o estructurales, factores de potenciacion, factores de represion de la transcripcion, protefnas de replicacion, 55 protefnas de reparacion del dano de ADN y cualquier otra protefna implicada en el control de la expresion genica, empaquetamiento de cromatina o replicacion.
Los aductos de nucleosoma pueden aparecer tambien debido a la union de nucleosomas presentes en un fluido biologico despues de la muerte celular. Serfa un ejemplo de tal aducto un aducto de nucleosoma-anticuerpo 60 formado en una enfermedad autoinmunitaria tal como LSE.
Por tanto, en un aspecto de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para la deteccion o medida de la presencia de un complejo o aducto de nucleosoma-protefna. Los aductos de nucleosoma para medir pueden ser de cualquier origen incluyendo, sin limitacion, aductos de nucleosoma de origen natural presentes en fluidos 5 biologicos como consecuencia de una condicion sana o enferma o aductos de nucleosoma producidos por la digestion de cromatina extrafda de celulas, o pueden producirse por apoptosis inducida o necrosis de celulas (por ejemplo, mediante el procedimiento de *Holdenrieder y col.; 2001). Sorprendentemente, se ha mostrado que los aductos de nucleosoma aparecen en todas estas situaciones y pueden detectarse mediante el procedimiento de la divulgacion.
10
En otro aspecto de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar o medir la presencia de un aducto de nucleosoma-protefna en un fluido biologico.
En un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar o diagnosticar la 15 presencia, tipo, recurrencia o gravedad de una enfermedad o valorar el farmaco optimo u otras opciones de

tratamiento ensayando en una muestra de sujeto la presencia o nivel de uno o mas complejos o aductos de
nucleosoma-protefna.

En un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar o diagnosticar la

20 presencia, tipo, recurrencia o gravedad de un enfermedad o valorar el farmaco optimo u otras opciones de
tratamiento ensayando en una muestra tomada de un sujeto la presencia o nivel de un complejo o aducto de nucleosoma-protefna como parte de un panel de pruebas. Se ha resenado un procedimiento ELISA para la deteccion de nucleosomas exentos de celula que contienen diferentes modificaciones de histona (Bawden y col.; 2005).
25
Por tanto, tal panel de pruebas puede consistir, por ejemplo, en dos o mas medidas de nucleosomas que contienen diferentes epftopos de nucleosoma; incluyendo sin limitacion diferentes aductos y/o modificaciones de histona y/o variantes de histona y/o nucleotidos modificados y/o medidas de nucleosomas per se , o cualquier combinacion o relacion de cualquiera de estos y cualquier otro epftopo de nucleosoma, como indicador del 30 estado de salud o enfermedad de un sujeto.
Se concluye que el procedimiento divulgado es un procedimiento exitoso para la deteccion y la medida de aductos de nucleosoma que contienen protefnas particulares, y que este procedimiento es un procedimiento superior para la deteccion de aductos de nucleosomas que los procedimientos de la materia actuales. El 35 procedimiento es rapido, de bajo coste y adecuado para uso en medios y fluidos biologicos complejos incluyendo sangre y sus derivados. Se ha demostrado que el procedimiento puede usarse para detectar aductos de nucleosoma en sangre, y que este puede usarse como biomarcador para cancer. Resultara evidente para los especialistas en la materia que un biomarcador presente en la sangre tiene valor para un amplio intervalo de fines de diagnostico y cribado de enfermedades para cancer y otras enfermedades que estan asociadas a 40 nucleosomas en circulacion elevados (Holdenrieder y col., 2001).
De acuerdo con un aspecto de la divulgacion, se proporciona un procedimiento de anticuerpo doble, inmunometrico o de inmunoensayo en sandwich para detectar y medir aductos de nucleosoma exentos de celula en una muestra. Es un ejemplo de este aspecto un inmunoensayo que comprende las etapas de:
45
(i) poner en contacto una muestra que puede contener aductos de nucleosoma con un primer anticuerpo u otro ligador que se una a nucleosomas o un componente de los mismos;
(ii) poner en contacto los nucleosomas o muestra con un segundo anticuerpo u otro ligador que se una a una protefna que puede estar presente como aducto de nucleosoma-protefna;
50 (iii) detectar y/o cuantificar la union de dicho segundo anticuerpo u otro ligador a un aducto de nucleosoma- protefna en la muestra; y
(iv) usar la presencia o el grado de dicha union como medida de la presencia de un aducto de nucleosoma- protefna en la muestra.
55 De acuerdo con otro aspecto de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar y medir aductos de nucleosoma exentos de celula en una muestra mediante un inmunoensayo inmunometrico que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto la muestra que puede contener aductos de nucleosoma que contienen una protefna 60 particular con un primer anticuerpo u otro ligador que se una a la protefna de interes;
(ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo anticuerpo u otro ligador que se una a nucleosomas o un componente de los mismos;
(iii) detectar y/o cuantificar la union de dicho segundo anticuerpo u otro ligador a una muestra de nucleosomas con un segundo anticuerpo u otro ligador que se una a nucleosomas o un componente del mismo en la muestra;
5 y
(iv) usar la presencia o el grado de dicha union como medida de la presencia de un aducto de nucleosoma en la muestra.
Resultara evidente para los especialistas en la materia que el anticuerpo u otro ligador usado para unirse a 10 nucleosomas o un componente de los mismos en la fase (i) del primer aspecto anterior y en la fase (ii) del segundo aspecto anterior puede ser un anticuerpo (u otro ligador) dirigido contra nucleosomas intactos o contra cualquier parte componente de un nucleosoma incluyendo, sin limitacion, una histona, una variante de histona, una modificacion de histona, un nucleotido, un nucleotido modificado u otra parte del componente de ADN de un nucleosoma. Por tanto, en un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar 15 (solo) aquellos aductos de nucleosoma-protefna que contienen adicionalmente otro rasgo al que esta dirigido este ligador incluyendo, sin limitacion, una modificacion de histona, variante de histona o nucleotido particular. Es una ventaja de este diseno que el epftopo del componente de nucleosoma y el epftopo de la protefna en aducto del ensayo pueden seleccionarse para ser epftopos cuyos niveles difieren ambos en gran medida en paciente sanos o enfermos, o en otro estado del paciente bajo investigacion. Por tanto, es probable reducir la proporcion 20 de nucleosomas detectados por el ensayo, pero aumentar la selectividad o especificidad clfnica del ensayo.
Se ha practicado este diseno de ensayo usando un anticuerpo dirigido al componente H2AZ de nucleosoma como anticuerpo antinucleosoma junto con anticuerpos anti-EZH2 y se ha mostrado que los aductos de nucleosoma-EZH2 asociados especfficamente a H2AZ pueden detectarse mediante tales ensayos y que estos 25 ensayos pueden usarse para discriminar entre muestras tomadas de sujetos sanos y enfermos.
En un aspecto adicional de la invencion, el aducto de nucleosoma para detectar puede contener mas de una protefna. Las protefnas adicionales en un aducto pueden unirse directa o indirectamente al nucleosoma. Por ejemplo, un nucleosoma puede unirse a una protefna HMGB y adicionalmente a una protefna o protefna 30 adicionales. La protefna o protefnas adicionales pueden unirse directamente al nucleosoma o pueden unirse a la protefna HMGB, y por ello indirectamente al nucleosoma. Los aductos de nucleosoma pueden contener grandes complejos de protefna consistentes en multiples componentes de protefna, donde la union de una protefna particular en el aducto de complejo al nucleosoma puede ser a traves de multiples conexiones de union intermedias. Resultara evidente para los especialistas en la materia que una protefna unida a un nucleosoma en 35 un aducto de nucleosoma, directa o indirectamente, puede detectarse mediante un procedimiento de la presente divulgacion.
Resultara evidente para los especialistas en la materia que los procedimientos de la divulgacion descritos incluyen una variedad de realizaciones, incluyendo ensayos de tipo biosensor y ensayos exentos de marcacion 40 del tipo comercializado, por ejemplo, por ForteBio Incorporated de EE.UU.
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar la proporcion de nucleosomas que comprende un aducto de nucleosoma particular en una muestra que comprende las etapas de:
45
(i) detectar o medir el nivel de nucleosomas en una muestra;
(ii) detectar o medir el nivel de un aducto de nucleosoma de acuerdo con un procedimiento de la presente divulgacion; y
(iii) usar las dos medidas para determinar la proporcion de nucleosomas que comprende el aducto de nucleotido. 50
Se ha mostrado que la deteccion y la medida de aductos de nucleosoma en la sangre tomada de sujetos pueden usarse como procedimiento de diagnostico para identificar sujetos con cancer y para diferenciarlos de los sujetos sanos. De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar o diagnosticar la presencia de una enfermedad midiendo o detectando la presencia y/o el nivel o concentracion de 55 aductos de nucleosoma exentos de celula en un fluido corporal, y usando el nivel detectado como biomarcador del estado patologico de un sujeto incluyendo, sin limitacion, un diagnostico clfnico de una enfermedad, un diagnostico diferencial de un tipo o subtipo de enfermedad o un pronostico de enfermedad, o una recafda de enfermedad o un diagnostico de la susceptibilidad del sujeto a regfmenes de tratamiento. Se apreciara por los especialistas en la materia que los fluidos corporales usados para ensayo de diagnostico incluyen, sin limitacion, 60 sangre, suero, plasma, orina, lfquido cefalorraqufdeo y otros fluidos. En una realizacion preferida, el fluido
corporal seleccionado como muestra es sangre, suero o plasma. La respuesta al ensayo, nivel, concentracion o cantidad de un aducto de nucleosoma en un fluido corporal pueden expresarse en terminos absolutos o terminos relativos, por ejemplo sin limitacion como la proporcion del nivel de nucleosoma total presente o como la relacion del nivel de nucleosomas que contienen otra estructura de nucleosoma tal como una modificacion de histona o 5 del nivel de ADN total.
La medida del aducto de nucleosoma puede usarse como miembro de un panel de diagnostico de pruebas o medidas para la deteccion o el diagnostico del estado patologico de un sujeto incluyendo, sin limitacion, un diagnostico clfnico de una enfermedad, un diagnostico diferencial de un tipo o subtipo de enfermedad o un 10 pronostico de enfermedad o una recafda de enfermedad o un diagnostico de la susceptibilidad del sujeto a regfmenes de tratamiento.
De acuerdo con otro aspecto de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para detectar o medir la presencia y/o el nivel de union a cromatina de una protefna en una celula que comprende las etapas de:
15
(i) aislar cromatina de una celula;
(ii) degradar la cromatina formando mononucleosomas y/u oligonucleosomas; y
(iii) detectar o medir la presencia de un aducto de nucleosoma en los mononucleosomas y/u oligonucleosomas mediante un procedimiento de inmunoensayo de la divulgacion.
20
Los procedimientos para producir mononucleosomas y/u oligonucleosomas a partir de cromatina son bien conocidos en la materia e incluyen digestion enzimatica y sonicacion (Dai y col., 2011). Se ha demostrado este aspecto para nucleosomas producidos a partir de celulas Hela y MCF7.
25 Resultara evidente para los especialistas en la materia que los terminos anticuerpo, ligador o ligando no son limitantes, sino que pretenden incluir fragmentos de anticuerpo, aptameros o cualquier ligador capaz de unirse a moleculas o entidades particulares y que puede usarse cualquier ligador adecuado en el procedimiento divulgado. Resultara tambien
evidente que el termino nucleosomas pretende incluir mononucleosomas y oligonucleosomas y cualquiera de 30 tales fragmentos de cromatina que pueda analizarse en medios fluidos.
De acuerdo con otro aspecto de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para identificar un biomarcador aducto de nucleosoma para detectar o diagnosticar el estado patologico en animales o seres humanos que comprende las etapas de:
35
(i) detectar o medir el nivel de un aducto de nucleosoma exento de celula en un fluido corporal de sujetos enfermos;
(ii) detectar o medir el nivel de un aducto de nucleosoma exento de celula en un fluido corporal de sujetos de control; y
40 (iii) usar la diferencia entre los niveles detectados en los sujetos enfermos y de control para identificar si un aducto de nucleosoma es util como biomarcador para esa enfermedad.
Resultara evidente para los especialistas en la materia que los sujetos de control pueden seleccionarse con una variedad de bases que pueden incluir, por ejemplo, sujetos conocidos por estar exentos de la enfermedad o 45 pueden ser sujetos con una enfermedad diferente (por ejemplo, para la investigacion de diagnostico diferencial).
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para identificar un biomarcador de aducto de nucleosoma para valorar el pronostico de un animal o sujeto humano enfermo que comprende las etapas de:
50
(i) detectar o medir el nivel de un aducto de nucleosoma exento de celula en un fluido corporal de sujetos enfermos; y
(ii) correlacionar el nivel de aducto de nucleosoma exento de celula detectado en un fluido corporal de sujetos enfermos con el resultado clfnico de la enfermedad de los sujetos.
55
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para identificar un biomarcador de aducto de nucleosoma para usar para la seleccion de un regimen de tratamiento para un sujeto animal o humano enfermo necesitado de tratamiento que comprende las etapas de:
60 (i) detectar o medir el nivel de un aducto de nucleosoma exento de celula en un fluido corporal de sujetos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
enfermos; y
(ii) correlacionar el nivel de aducto de nucleosoma exento de celula detectado en un fluido corporal de sujetos enfermos con la eficacia observada de un regimen de tratamiento en esos sujetos.
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para identificar un biomarcador de aducto de nucleosoma para usar para monitorizar el tratamiento de un sujeto animal o humano enfermo que comprende las etapas de:
(i) detectar o medir el nivel de un aducto de nucleosoma exento de celula en un fluido corporal de un sujeto enfermo;
(ii) repetir dicha deteccion o medida en una o mas ocasiones durante la progresion de la enfermedad del sujeto; y
(iii) correlacionar el nivel de aducto de nucleosoma exento de celula detectado en un fluido corporal de un sujeto enfermo con la progresion de la enfermedad en el sujeto.
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un biomarcador identificado mediante el procedimiento como se define en la presente memoria.
Un aspecto adicional de la divulgacion proporciona ligandos o ligadores, tales como compuestos de origen natural o sintetizados qufmicamente, capaces de union especffica al biomarcador. Un ligando o ligador de acuerdo con la divulgacion puede comprender un peptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo, o un ligando sintetico tal como un anticuerpo plastico, o un aptamero u oligonucleotido capaz de union especffica al biomarcador. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo capaz de union especffica al biomarcador. Un ligando de acuerdo con la divulgacion puede marcarse con un marcador detectable, tal como un marcador luminiscente, fluorescente, enzimatico o radiactivo; como alternativa o adicionalmente, un ligando de acuerdo con la divulgacion puede marcarse con un marcaje de afinidad, p.ej. un marcaje de biotina, avidina, estreptavidina o His (p.ej., hexa-His). Como alternativa, la union de ligando puede determinarse usando tecnologfa exenta de marcacion, por ejemplo aquella de ForteBio Inc.
Un biosensor de acuerdo con la divulgacion puede comprender el biomarcador o un mimetico estructural/conformacional del mismo capaz de union especffica a un anticuerpo contra el biomarcador. Se proporciona tambien una matriz que comprende un ligando o mimetico como se describe en la presente memoria.
Se proporciona tambien por la divulgacion el uso de uno o mas ligandos como se describen en la presente memoria, que pueden ser de origen natural o sintetizados qufmicamente, y es adecuadamente un peptido, anticuerpo o fragmento del mismo, aptamero u oligonucleotido, o el uso de un biosensor de la divulgacion, o un kit de la divulgacion, para detectar y/o cuantificar el biomarcador. En estos usos, la deteccion y/o cuantificacion pueden practicarse en una muestra biologica como se define en la presente memoria.
Se proporcionan kits de diagnostico o monitorizacion para practicar los procedimientos de la divulgacion. Tales kits comprenderan adecuadamente un ligando de acuerdo con la divulgacion para la deteccion y/o cuantificacion del biomarcador y/o un biosensor y/o una matriz como se describe en la presente memoria, opcionalmente junto con instrucciones para el uso del kit.
Es un aspecto adicional de la divulgacion un kit para detectar la presencia de un estado patologico, que comprende un biosensor capaz de detectar y/o cuantificar uno o mas de los biomarcadores definidos en la presente memoria.
Los biomarcadores para detectar la presencia de una enfermedad son dianas esenciales para el descubrimiento de dianas novedosas y moleculas farmacologicas que retarden o detengan la progresion del trastorno. Como el nivel de biomarcador es indicativo de enfermedad y de respuesta farmacologica, el biomarcador es util para la identificacion de compuestos terapeuticos novedoso en ensayos in vitro y/o in vivo. Los biomarcadores pueden emplearse en procedimientos para el cribado de compuestos que modulen la actividad del biomarcador.
Por tanto, en un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona el uso de un ligador o ligando como se describe que puede ser un peptido, anticuerpo o fragmento del mismo o aptamero u oligonucleotido de acuerdo con la divulgacion; o el uso de un biosensor de acuerdo con la divulgacion, o una matriz de acuerdo con la divulgacion, o un kit de acuerdo con la divulgacion, para identificar una sustancia capaz de promover y/o suprimir la generacion del biomarcador.
Se proporciona tambien un procedimiento de identificacion de una sustancia capaz de promover o suprimir la generacion del biomarcador en un sujeto, que comprende administrar una sustancia de prueba a un sujeto animal y detectar y/o cuantificar el nivel del biomarcador presente en una muestra de prueba del sujeto.
5 El termino "biomarcador" significa un indicador biologico o derivado biologicamente distintivo de un proceso, evento o afeccion. Los biomarcadores pueden usarse en procedimientos de diagnostico, p.ej. cribado clfnico y en valoracion de pronostico y en monitorizacion de los resultados de la terapia, identificacion de los sujetos que es mas probable que respondan a un tratamiento terapeutico particular, cribado y desarrollo de farmacos. Los biomarcadores y usos de los mismos son valiosos para la identificacion de nuevos tratamientos farmacologicos y 10 para el descubrimiento de nuevas diana para tratamiento farmacologico.
Los terminos "detectar" y "diagnosticar" como se usan en la presente memoria engloban identificacion, confirmacion y/o caracterizacion de un estado patologico. Los procedimientos de deteccion, monitorizacion y diagnostico de acuerdo con la divulgacion son utiles para confirmar la existencia de una enfermedad, para 15 monitorizar el desarrollo de la enfermedad valorando inicio y progresion o para valorar la mejora o regresion de la enfermedad. Los procedimientos de deteccion, monitorizacion y diagnostico son tambien utiles en procedimientos para la valoracion de cribado clfnico, pronostico, eleccion de terapia y evaluacion del beneficio terapeutico, es decir para el cribado de farmacos y el desarrollo de farmacos.
20 Los procedimientos de diagnostico y monitorizacion eficientes proporcionan "soluciones de sujeto" muy potentes con el potencial de un pronostico mejorado al establecer el diagnostico correcto, permitir una identificacion rapida del tratamiento mas apropiado (por tanto rebajando la exposicion innecesaria a los efectos secundarios farmacologicos daninos) y reducir las tasas de recafda.
25 Dicho biomarcador puede liberarse a partir de las celulas de un tumor. Por tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para la deteccion de un crecimiento tumoral que comprende las etapas de (i) medir un biomarcador en una muestra biologica que esta asociado a o liberado a partir de las celulas de un tumor y (ii) demostrar que el nivel de dicho biomarcador esta asociado al tamano, fase, agresividad o difusion del tumor.
30
Es conocido que un recambio celular, muerte celular y apoptosis aumentados conducen a niveles circulatorios aumentados de nucleosomas exentos de celulas (Holdenrieder y col., 2001). El nivel de nucleosomas exentos de celula en circulacion es un indicador no especffico y aparece en una variedad de afecciones incluyendo enfermedades inflamatorias, una gran variedad de afecciones benignas y malignas, enfermedades 35 autoinmunitarias asf como despues de traumatismo o isquemia (Holdenrieder y col. 2001). Resultara evidente para los especialistas en la materia que la divulgacion tendra aplicacion en una variedad de areas de enfermedades donde se han encontrado nucleosomas en circulacion en sujetos. Estas incluyen, sin limitacion, traumatismo (por ejemplo, lesion grave o cirugfa), ejercicio extremo (por ejemplo, correr una maraton), apoplejfa y ataque cardiaco, sepsis u otra afeccion grave y endometriosis.
40
Los inmunoensayos de la divulgacion incluyen ensayos inmunometricos que emplean procedimientos de deteccion enzimatica (por ejemplo ELISA), ensayos inmunometricos marcados con fluorescencia, ensayos inmunometricos marcados con fluorescencia resueltos en el tiempo, ensayos inmunometricos quimioluminiscentes, ensayos inmunoturbidimetricos, ensayos inmunometricos marcados con partfculas y 45 ensayos inmunoradiometricos y procedimientos de inmunoensayo competitivo incluyendo procedimientos de inmunoensayo competitivo de antfgeno marcado y anticuerpo marcado con una variedad de tipos de marcacion, incluyendo marcaciones radiactiva, enzimatica, fluorescente, fluorescente resuelta en el tiempo y con partfculas. Todos dichos procedimientos de inmunoensayo son bien conocidos en la materia, veanse por ejemplo Salgame y col., 1997 y van Nieuwenhuijze y col., 2003.
50
Dicha muestra biologica puede comprender un fluido corporal. Por ejemplo, las muestras biologicas que pueden ensayarse en un procedimiento de la divulgacion incluyen lfquido cefalorraqufdeo (LCR), sangre completa, suero sangufneo, plasma, sangre menstrual, fluido endometrico, orina, saliva u otro fluido corporal (heces, lfquido lagrimal, lfquido sinovial, esputo), aliento, p.ej. como aliento condensado, o un extracto o purificacion de las 55 mismas o dilucion de las mismas. Las muestras biologicas incluyen tambien especfmenes de un sujeto vivo, o tomados postmortem. Las muestras pueden prepararse, por ejemplo, cuando sea apropiado diluirse o concentrarse, y almacenarse de la manera habitual.
El procedimiento de la divulgacion puede repetirse en multiples ocasiones. Esto proporciona la ventaja de 60 permitir monitorizar los resultados de la deteccion durante un periodo de tiempo. Tal disposicion proporcionara el
beneficio de monitorizar o valorar la eficacia de tratamiento de un estado patologico. Pueden usarse tales procedimientos de monitorizacion de la divulgacion para monitorizar el inicio, progresion, estabilizacion, mejora, recafda y/o remision.
5 Por tanto, la divulgacion proporciona tambien un procedimiento de monitorizacion de la eficacia de una terapia para un estado patologico en un sujeto sospechoso de tener tal enfermedad, que comprende detectar y/o cuantificar el biomarcador presente en una muestra biologica de dicho sujeto. En procedimientos de monitorizacion, pueden tomarse muestras de prueba en dos o mas ocasiones. El procedimiento puede comprender ademas comparar el nivel del biomarcador o biomarcadores presentes en la muestra de prueba con 10 uno o mas controles y/o con una o mas muestras de prueba anteriores tomadas previamente del mismo sujeto de prueba, p.ej. antes del comienzo de la terapia, y/o del mismo sujeto de prueba en una fase previa de la terapia. El procedimiento puede comprender detectar un cambio en la naturaleza o la cantidad de biomarcador o biomarcadores en muestras de prueba tomadas en diferentes ocasiones.
15 Por tanto, de acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para monitorizar la eficacia de la terapia para un estado patologico en un sujeto humano o animal que comprende:
(a) cuantificar la cantidad de biomarcador como se define en la presente memoria; y
(b) comparar la cantidad de dicho biomarcador en una muestra de prueba con la cantidad presente en uno o mas 20 controles y/o una o mas muestras de prueba anteriores tomadas en un momento previo del mismo sujeto de
prueba.
Un cambio en el nivel del biomarcador en la muestra de prueba respecto al nivel en una muestra de prueba anterior tomada previamente del mismo sujeto de prueba puede ser indicativo de un efecto beneficioso, p.ej. 25 estabilizacion o mejora, de dicha terapia sobre el trastorno o trastorno sospechado. Ademas, una vez se ha completado el tratamiento, puede repetirse el procedimiento de la divulgacion periodicamente para monitorizar la recurrencia de una enfermedad.
Los procedimientos para monitorizar la eficacia de una terapia pueden usarse para monitorizar la efectividad 30 terapeutica de terapias existentes y nuevas terapias en sujetos humanos y en animales no humanos (p.ej. en modelos animales). Estos procedimientos de monitorizacion pueden incorporarse a cribados de nuevas sustancias farmacologicas y combinaciones de sustancias.
La monitorizacion de cambios mas rapidos debidos a terapias de accion rapida puede realizarse en intervalos 35 mas cortos de horas o dfas.
De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion, se proporciona un procedimiento para identificar un biomarcador para detectar la presencia de un estado patologico. El termino "identificar" como se usa en la presente memoria significa confirmar la presencia del biomarcador presente en la muestra biologica. Cuantificar 40 la cantidad de biomarcador presente en una muestra puede incluir determinar la concentracion del biomarcador presente en la muestra. La identificacion y/o cuantificacion puede practicarse directamente en la muestra, o indirectamente en un extracto de la misma, o en una dilucion de la misma.
En aspectos alternativos de la divulgacion, se valora la presencia del biomarcador detectando y/o cuantificando 45 el anticuerpo o fragmentos del mismo capaces de union especffica al biomarcador que se generan por el cuerpo del sujeto en respuesta al biomarcador y por tanto estan presentes en una muestra biologica de un sujeto que tiene un estado patologico.
La identificacion y/o cuantificacion pueden practicarse mediante cualquier procedimiento adecuado para 50 identificar la presencia y/o cantidad de una protefna especffica en una muestra biologica de un sujeto o una purificacion o extracto de una muestra biologica o una dilucion de la misma. En el uso de la invencion, la cuantificacion puede practicarse midiendo la concentracion del biomarcador en la muestra o muestras. Las muestras biologicas que pueden ensayarse en un procedimiento de la divulgacion incluyen aquellas definidas anteriormente en la presente memoria. Las muestras pueden prepararse, por ejemplo, cuando sea apropiado 55 diluirse o concentrarse, y almacenarse de la manera habitual.
La identificacion y/o cuantificacion de los biomarcadores puede practicarse mediante la deteccion del biomarcador o de un fragmento de mismo, p.ej. un fragmento con truncamiento C-terminal, o con truncamiento N-terminal. Los fragmentos son adecuadamente mayores de 4 aminoacidos de longitud, por ejemplo de 5, 6, 7, 60 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoacidos de longitud. Se senala en particular que los peptidos
de la misma secuencia o relacionada con la de colas de histona son fragmentos particularmente utiles de protefnas histonas.
El biomarcador puede detectarse directamente, p.ej. por SELDI o MALDI-TOF. Como alternativa, el biomarcador 5 puede detectarse directa o indirectamente mediante interaccion con un ligando o ligandos tales como un anticuerpo o fragmento de union a biomarcador del mismo, u otro peptido o ligando, p.ej. aptamero, u oligonucleotido, capaz de unirse especfficamente al biomarcador. El ligando o ligador puede poseer una marcacion detectable, tal como una marcacion luminiscente, fluorescente o radiactiva y/o un marcaje de afinidad.
10 Por ejemplo, la deteccion y/o cuantificacion pueden practicarse mediante uno o mas de los procedimientos seleccionados del grupo consistente en: SELDI (-TOF), MALDI (-TOF), analisis basado en gel 1D, analisis basado en gel 2D, espectroscopfa de masas (MS), LC en fase inversa (RP), permeacion por tamano (filtracion en gel), intercambio ionico, afinidad, HPLC, UPLC u otras tecnicas basadas en LC o LC MS. Las tecnicas de LC MS apropiadas incluyen ICAT® (Applied Biosystems, CA, EE.UU.), o iTRAQ® (Applied Biosystems, CA, EE.UU.). 15 Podrfan usarse tambien cromatograffa lfquida (p.ej., cromatograffa lfquida de alta presion (HPLC) o cromatograffa lfquida de baja presion (LPLC)), cromatograffa en capa fina y espectroscopfa de RMN (resonancia magnetica nuclear).
Los procedimientos de diagnostico o monitorizacion de acuerdo con la divulgacion pueden comprender analizar 20 una muestra por SELDI TOF o MALDI TOF para detectar la presencia o nivel del biomarcador. Estos procedimientos son tambien adecuados para cribado clfnico, pronostico, monitorizacion de los resultados de la terapia, identificacion de los sujetos que es mas probable que respondan a un tratamiento terapeutico particular, cribado y desarrollo de farmacos e identificacion de nuevas dianas para tratamiento farmacologico.
25 La identificacion y/o cuantificacion de los biomarcadores de analito pueden practicarse usando un procedimiento inmunologico, que implica un anticuerpo o fragmento del mismo capaz de union especffica al biomarcador. Los procedimientos inmunologicos adecuados incluyen inmunoensayos de sandwich, tales como ELISA de sandwich, en que la deteccion de los biomarcadores de analito se practica usando dos anticuerpos que reconocen diferentes epftopos en un biomarcador de analito; radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunosorcion ligada a 30 enzima (ELISA) directa, indirecta o competitiva, inmunoensayos enzimaticos (EIA), inmunoensayos de fluorescencia (FIA), transferencia Western, inmunoprecipitacion y cualquier inmunoensayo basado en partfculas (p.ej., que usa partfculas de oro, plata o latex, partfculas magneticas o puntos cuanticos). Los procedimientos inmunologicos pueden practicarse, por ejemplo, en formato de placa de microvaloracion o tira.
35 La identificacion de biomarcadores clave especfficos de una enfermedad es esencial para la integracion de los procedimientos de diagnostico y regfmenes terapeuticos. Usando biomarcadores predictivos pueden desarrollarse herramientas de diagnostico apropiadas tales como biosensores; por consiguiente, en usos de la invencion, la identificacion y cuantificacion pueden practicarse usando un biosensor, sistema microanalftico, sistema micromanipulado, sistema de microseparacion, sistema inmunocromatografico u otros dispositivos 40 analfticos adecuados. El biosensor puede incorporar un procedimiento inmunologico para la deteccion del biomarcador o biomarcadores, tecnologfas electrica, termica, magnetica, optica (p.ej. holograma) o acustica. Usando tales biosensores, es posible detectar el biomarcador o biomarcadores diana a la concentraciones previstas encontradas en muestras biologicas.
45 Como se usa en la presente memoria, el termino "biosensor" significa algo capaz de detectar la presencia del biomarcador. Se describen en la presente memoria ejemplos de biosensores.
Los biosensores pueden comprender un ligador ligando o ligandos, como se describen en la presente memoria, capaces de union especffica al biomarcador. Tales biosensores son utiles en la deteccion y/o cuantificacion de 50 un biomarcador.
El biomarcador o biomarcadores pueden detectarse usando un biosensor que incorpora tecnologfas basadas en hologramas "inteligentes" o sistemas acusticos de alta frecuencia, tales sistemas son particularmente susceptibles de configuraciones de "codigo de barras" o matriz.
55
En sensores de hologramas inteligentes (Smart Holograms Ltd, Cambridge, RU), se almacena una imagen holografica en una pelfcula polimerica fina que se sensibiliza para reaccionar especfficamente con el biomarcador. Tras la exposicion, el biomarcador reacciona con el polfmero conduciendo a una alteracion de la imagen exhibida por el holograma. La lectura resultado de la prueba puede ser un cambio en el brillo optico, 60 imagen, color y/o posicion de la imagen. Para aplicaciones cualitativas y semicuantitativas, puede leerse un
holograma sensor a simple vista, eliminando por tanto la necesidad de un equipo de deteccion. Puede usarse un sensor de color sencillo para leer la senal cuando se requieren medidas cuantitativas. La opacidad del color de la muestra no interfiere con la operacion del sensor. El formato del sensor permite la multiplexacion para deteccion simultanea de varias sustancias. Pueden disenarse sensores reversibles e irreversibles para satisfacer diferentes 5 requisitos, y es factible una monitorizacion continua de un biomarcador particular de interes.
Adecuadamente, los biosensores para la deteccion de uno o mas biomarcadores combinan el reconocimiento biomolecular con medios apropiados para convertir la deteccion de la presencia, o la cuantificacion, del biomarcador en la muestra en una senal. Los biosensores pueden adaptarse para un ensayo de diagnostico de 10 "sitio alternativo", p.ej. en sala, servicio ambulatorio, cirugfa, hogar, campo y lugar de trabajo.
Los biosensores para detectar uno o mas biomarcadores incluyen sensores acusticos, de resonancia de plasmon, holografico, de interferometrfa de biocapa (BLI) y micromanipulados. Pueden emplearse elementos de reconocimiento grabados, tecnologfa de transistor de pelfcula fina, dispositivos resonadores acusticos 15 magneticos y otros sistemas acusticoelectricos novedosos en biosensores para la deteccion de uno o mas biomarcadores.
Los procedimientos que implican la identificacion y/o cuantificacion de uno o mas biomarcadores pueden practicarse en instrumentos de laboratorio o pueden incorporarse a plataformas de diagnostico o monitorizacion 20 desechables que pueden usarse en un entorno no de laboratorio, p.ej. en la consulta del medico o en el lecho del sujeto. Los biosensores adecuados para practicar los procedimientos de la divulgacion incluyen tarjetas "de credito" con lectores opticos o acusticos. Los biosensores pueden configurarse para permitir transmitir electronicamente los datos recogidos al medico para interpretacion y por tanto pueden constituir la base de medicina a distancia.
25
Se describen en la presente memoria kits de diagnostico para el diagnostico y la monitorizacion de la presencia de un estado patologico. Los kits pueden contener adicionalmente un biosensor capaz de identificar y/o cuantificar un biomarcador. Adecuadamente, un kit puede contener uno o mas componentes seleccionados del grupo de: un ligador ligando o ligandos especfficos del biomarcador o un mimetico estructural/conformacional del 30 biomarcador, uno o mas controles, uno o mas reactivos y uno o mas consumibles; opcionalmente junto con instrucciones para el uso del kit de acuerdo con cualquiera de los procedimientos definidos en la presente memoria.
La identificacion de biomarcadores para un estado patologico permite la integracion de los procedimientos de 35 diagnostico y los regfmenes terapeuticos. La deteccion de un biomarcador puede usarse para cribar sujetos antes de su participacion en ensayos clfnicos. Los biomarcadores proporcionan los medios para manifestar la respuesta terapeutica, falta de respuesta, perfil de efectos secundarios desfavorable, grado de cumplimiento de la medicacion y consecucion de niveles sericos de farmaco adecuados. Los biomarcadores pueden usarse para proporcionar avisos de respuesta adversa a farmacos. Los biomarcadores son utiles en el desarrollo de terapias 40 personalizadas, como valoracion de respuesta pueden usarse para ajuste fino de la dosificacion, minimizar el numero de medicaciones prescritas, reducir el retraso en el logro de una terapia efectiva y evitar reacciones farmacologicas adversas. Por tanto, al monitorizar un biomarcador, la asistencia al sujeto puede adaptarse precisamente para satisfacer las necesidades determinadas por el trastorno y el perfil farmacogenomico del sujeto, por tanto el biomarcador puede usarse para titular la dosis optima, predecir una respuesta terapeutica 45 positiva e identificar aquellos sujetos con alto riesgo de efectos secundarios graves.
Las pruebas basadas en biomarcadores proporcionan una valoracion de primera lfnea de sujetos "nuevos" y proporcionan medidas objetivas para un diagnostico exacto y rapido, no alcanzable usando las medidas actuales.
50 Ademas, las pruebas de biomarcador de diagnostico son utiles para identificar miembros de la familia o sujetos con enfermedad leve o asintomatica o que puedan estar con alto riesgo de desarrollar la enfermedad sintomatica. Esto permite el inicio de una terapia apropiada o de medidas preventivas, p.ej., gestionando los factores de riesgo. Se reconoce que estos enfoques mejoran el resultado clfnico y pueden prevenir un inicio evidente del trastorno.
55
Los procedimientos de monitorizacion de biomarcador, biosensores y kits son tambien vitales como herramientas de monitorizacion del sujeto, para posibilitar al medico determinar si la recafda es debida al empeoramiento del trastorno. Si se valora que el tratamiento farmacologico es inadecuado, entonces puede restablecerse o aumentarse la terapia; puede darse un cambio de terapia si es apropiado. Como los biomarcadores son 60 sensibles al estado del trastorno, proporcionan una indicacion del impacto de la terapia farmacologica.
La invencion se ilustrara ahora con referenda a los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLO 1
5
Se tomaron muestras de suero de 5 sujetos sanos, 3 sujetos con cancer de colon, 6 sujetos con cancer de pulmon y 2 sujetos con cancer pancreatico. Se diluyo en serie en suero equino una preparacion de nucleosoma comercialmente disponible producida mediante digestion de cromatina extrafda de celulas Hela, en que el ADN y las protefnas en el nucleosoma estan reticuladas para estabilidad. Se preparo una preparacion de nucleosoma 10 en sangre humana de acuerdo con el procedimiento de Holdenrieder (*Holdenrieder y col.; 2001). Se ensayo en estas muestras y preparaciones por duplicado el educto de nucleosoma-EZH2 mediante el procedimiento de la divulgacion. Se ensayo tambien suero equino puro disponible comercialmente producido para uso en cultivo de tejido como muestra de control negativo que no contiene nucleosomas ni aductos de nucleosoma.
15 El procedimiento ELISA usaba un anticuerpo de captura antihistona en fase solida que se une a nucleosomas intactos y un anticuerpo monoclonal de deteccion anti-EZH2 biotinilado como sigue: Se anadio una solucion de anticuerpo antihistona en tampon fosfato 0,1 M a pH 7,4 a pocillos de microvaloracion (100 pl/pocillo) y se incubo durante una noche a 4 °C para recubrir los pocillos con anticuerpo de captura. Se decanto el anticuerpo antihistona en exceso. Se anadio una solucion de seroalbumina bovina (20 g/l) a los pocillos (200 pl/pocillo) y se 20 incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear los sitios de union a protefna en exceso en los pocillos. Se decanto la solucion de seroalbumina bovina en exceso y se lavaron los pocillos tres veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo, tampon TRIS/HCl 0,05 M pH 7,5 que contiene 1 % de Tween 20). Se anadieron muestra de suero (10 pl/pocillo) y tampon de ensayo (50 pl/pocillo, TRIS/HCl 0,05 M pH 7,5 que contiene 0,9 % de NaCl, 0,05 % de desoxicolato de sodio y 1 % de sustituto de Nonidet P40) a los pocillos incubados durante 25 una noche a 4 °C. Se decanto la mezcla de suero y tampon de ensayo y se lavaron los pocillos tres veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo). Se anadio una solucion de anticuerpo de deteccion anti-EZH2 biotinilado (50 pl/pocillo) y se incubo durante 90 minutos a temperatura ambiente con agitacion suave. Se decanto el anticuerpo de deteccion en exceso y se lavaron de nuevo los pocillos tres veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo). Se anadio una solucion que contiene conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rabano picante (50 pl/pocillo) y se 30 incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitacion suave. Se decanto el conjugado en exceso y se lavaron de nuevo los pocillos tres veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo). Se anadio una solucion de sustrato coloreado (100 pl/pocillo, sal de diamonio del acido 2,2'-azinobis[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico] y se incubo durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitacion suave. Se midio la densidad optica (DO) de los pocillos a una longitud de onda de 405 nm usando un lector de placas de microvaloracion estandar. Se observo 35 una curva de dosis-respuesta de color creciente con una concentracion creciente de aducto de nucleosoma- EZH2, con una baja senal de fondo observada en ausencia de aducto de nucleosoma (suero equino). La senal de ELISA positiva indica que la EZH2 detectada por ELISA esta incorporada a un aducto de nucleosoma-EZH2 que comprende tanto protefna histona como EZH2 ya que (i) el anticuerpo de captura se une a las histonas de la muestra y (ii) el anticuerpo de deteccion se une al componente EZH2 del aducto. Se muestran los resultados en 40 las Figuras 1 y 2.
EJEMPLO2
Se tomaron muestras de suero de 5 sujetos sanos, 3 sujetos con cancer de colon, 6 sujetos con cancer de 45 pulmon y 2 sujetos con cancer pancreatico. Se diluyo en serie en suero equino una preparacion de nucleosoma disponible comercialmente mediante digestion de cromatina extrafda de celulas Hela. Se preparo una preparacion de nucleosoma en sangre humana de acuerdo con el procedimiento de Holdenrieder (*Holdenrieder y col.; 2001). Se ensayo en estas muestras y preparaciones por duplicado el aducto de nucleosoma-HMGB1 mediante el procedimiento de la divulgacion. Se ensayo tambien suero equino puro como muestra de control 50 negativo que no contiene nucleosomas ni aductos de nucleosoma.
El procedimiento ELISA usaba un anticuerpo de captura antihistona en fase solida que se une a nucleosomas intactos y un anticuerpo monoclonal de deteccion anti-HMGB1 biotinilado como sigue: Se anadio una solucion de anticuerpo antihistona en tampon fosfato 0,1 M a pH 7,4 a pocillos de microvaloracion (100 pl/pocillo) y se incubo 55 durante una noche a 4 °C para recubrir los pocillos con anticuerpo de captura. Se decanto el anticuerpo antihistona en exceso. Se anadio una solucion de seroalbumina bovina (20 g/l) a los pocillos (200 pl/pocillo) y se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear los sitios de union a protefna en exceso en los pocillos. Se decanto la solucion de seroalbumina bovina en exceso y se lavaron los pocillos tres veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo, tampon TRIS/HCl 0,05 M pH 7,5 que contiene 1 % de Tween 20). Se anadieron 60 muestra de suero (10 pl/pocillo) y tampon de ensayo (50 pl/pocillo, TRIS/HCl 0,05 M pH 7,5 que contiene 0,9 %
de NaCI, 0,05 % de desoxicolato de sodio y 1 % de sustituto de Nonidet P40) a los pocillos incubados durante una noche a 4 °C. Se decanto la mezcla de suero y tampon de ensayo y se lavaron los pocillos tres veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo). Se anadio una solucion de anticuerpo de deteccion anti-HMGBI biotinilado (50 pl/pocillo) y se incubo durante 90 minutos a temperatura ambiente con agitacion suave. Se decanto el anticuerpo 5 de deteccion en exceso y se lavaron de nuevo los pocillos tres veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo). Se anadio una solucion que contiene conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rabano picante (50 pl/pocillo) y se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitacion suave. Se decanto el conjugado en exceso y se lavaron de nuevo los pocillos tres veces con tampon de lavado (200 pl/pocillo). Se anadio una solucion de sustrato coloreado (100 pl/pocillo, sal de diamonio del acido 2,2'-azinobis[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico] y se 10 incubo durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitacion suave. Se midio la densidad optica (DO) de los pocillos a una longitud de onda de 405 nm usando un lector de placas de microvaloracion estandar. Se observo una curva de dosis-respuesta de color creciente con una concentracion creciente de aducto de nucleosoma- HMGB1, con una baja senal de fondo observada en ausencia de aducto de nucleosoma (suero equino). La senal de ELISA positiva indica que la HMGB1 detectada por ELISA esta incorporada a un aducto de nucleosoma- 15 HMGB1 que comprende tanto protefna histona como HMGB1 ya que (i) el anticuerpo de captura se une a las histonas de la muestra y (ii) el anticuerpo de deteccion se une al componente HMGB1 del aducto. Se muestran los resultados en las Figuras 3 y 4.
En un experimento mayor, se tomaron muestras de suero de 25 pacientes con cancer de colon, 25 pacientes con 20 cancer de mama y 24 pacientes con cancer de pulmon, asf como muestras de 31 sujetos sanos. Se ensayo en las muestras el nivel de nucleosoma-HMGB1 y, usando el resultado medio sano mas 2 desviaciones estandares de la media como corte, se obtuvieron los siguientes resultados para cancer de colon, mama y pulmon:
• Colon: Se detectaron un 76 % de los canceres (19 de 25 pacientes) con un 90 % de especificidad (3 falsos 25 positivos de 31 muestras sanas);
• Mama: Se detectaron un 96 % de los canceres (24 de 25 pacientes) con un 90 % de especificidad (3 falsos positivos de 31 muestras sanas); y
• Pulmon: Se detectaron un 100 % de los canceres (24 de 24 pacientes) con un 86 % de especificidad (4 falsos positivos de 28 muestras sanas);
30 donde un nivel de aducto de nucleosoma-HMGB1 medido por encima del nivel de corte se considera un resultado positivo y un nivel menor se considera un resultado negativo. Se muestran los resultados en la Figura 5.
Se llevo a cabo el ensayo de los niveles de aducto de nucleosoma-HMGB1 tambien en formato inverso, donde 35 se recubrio el anticuerpo anti-HMGB1 en pocillos como anticuerpo de captura y se biotinilo el anticuerpo antinucleosoma y se uso como anticuerpo de deteccion. Este formato de ensayo detectaba tambien exitosamente los aductos de nucleosoma-HMGB1 en los controles positivos usados (DO405 nm= 1,15), pero no en suero equino o tampon (ambos DO406 nm= 0,13).
40 EJEMPLO3
Se llevo a cabo un ensayo ELISA de nucleosoma-PR usando el procedimiento del Ejemplo 1 anterior, excepto porque se dirigio el anticuerpo biotinilado a unirse al receptor de progesterona (PR). Se muestran los resultados en la Figura 6.
45
EJEMPLO 4
Se ensayaron muestras de suero tomadas de dos pacientes de cancer de prostata, asf como controles positivos y negativos, usando un ensayo ELISA de aducto de nucleosoma-AR llevado a cabo usando el procedimiento del 50 Ejemplo 1 anterior, excepto porque se dirigio el anticuerpo biotinilado usado a unirse al receptor de androgeno (Ar). Se muestran los resultados en la Figura 7.
EJEMPLO 5
55 Se llevo a cabo un ensayo ELISA de aducto de nucleosoma-ERa usando una muestra de nucleosoma preparada mediante el procedimiento de *Holdenrieder y col.; 2001 mediante el procedimiento del Ejemplo 1, excepto porque se dirigio el anticuerpo biotinilado usado a unirse a la forma alfa del receptor de estrogeno (ERa). Se muestran los resultados en la Figura 8.
60 EJEMPLO 6
Se preparo una muestra de nucleosoma mediante digestion de cromatina extrafda de celulas MCF7 y se ensayo el aducto de nucleosoma-ERp por ELISA. Se llevo a cabo el ensayo mediante un procedimiento similar al del Ejemplo 1 anterior, excepto porque se practico el ensayo usando un anticuerpo antinucleosoma diferente y un 5 anticuerpo dirigido a unirse a la forma beta del receptor de estrogeno (ERp). Se llevo a cabo el ensayo en dos formatos diferentes. En el primer formato, se recubrio el anticuerpo antinucleosoma sobre los pocillos y se biotinilo el anticuerpo anti-ERp. En el segundo formato, se recubrio el anticuerpo anti-ERp sobre los pocillos y se biotinilo el anticuerpo antinucleosoma. El ensayo fue exitoso en ambos formatos. De forma interesante, el ensayo parecfa practicarse menos bien cuando la cromatina de MCF7 estaba reticulada, como se realiza a menudo en 10 los procedimientos de ChIP. Se muestran los resultados en la Figura 9.
EJEMPLO 7
Se llevo a cabo un ensayo ELISA de aducto de H2AZ de nucleosoma-ERp usando una muestra de nucleosoma 15 preparada mediante el procedimiento de *Holdenrieder y col.; 2001 mediante el procedimiento del Ejemplo 6 anterior, donde se recubrio el anticuerpo anti-ERp sobre los pocillos, excepto porque se dirigio el anticuerpo biotinilado usado a unirse a la variante de histona H2AZ de tal modo que se detectara solo el subconjunto de aductos de nucleosoma-ERp que contuviera H2AZ. Usando este procedimiento, donde el ligador de nucleosoma o componente de nucleosoma se dirige a unirse a una estructura de senal epigenetica particular, es posible 20 detectar un subconjunto particular de aductos de nucleosoma que contienen solo esa senal epigenetica. Se muestran los resultados en la Figura 10.
EJEMPLO 8
25 Se tomaron muestras de suero de 12 sujetos sanos, 3 sujetos con cancer de colon, 6 sujetos con cancer de mama, 3 sujetos con cancer de pulmon y 4 sujetos con cancer pancreatico. Se preparo una preparacion de nucleosoma en sangre humana de acuerdo con el procedimiento de Holdenrieder (*Holdenrieder y col.; 2001) y se diluyo en serie en suero equino. Se ensayo en estas muestras y preparaciones por duplicado el educto de nucleosoma-ERp mediante el procedimiento de la divulgacion. Se ensayo tambien suero equino puro disponible 30 comercialmente producido para uso en cultivo de tejido como muestra de control negativo que no contiene nucleosomas ni aductos de nucleosoma. Se llevo a cabo el ensayo usando el procedimiento del Ejemplo 1 anterior, excepto porque se dirigio el anticuerpo de deteccion usado contra el receptor de estrogeno (ERp). Usando un corte calculado como el resultado sano medio mas 2 desviaciones estandares de la media; se encontro que 2 de las 3 muestras de cancer de colon, 3 de las 6 muestras de cancer de mama, 2 de las 3 35 muestras de cancer de pulmon y 4 de las 4 muestras de cancer pancreatico eran positivas de aducto de nucleosoma-ERp. Se muestran los resultados en la Figura 11.
EJEMPLO 9
40 Se lleva a cabo un ensayo ELISA de nucleosoma-receptor de estrogeno-estrogeno esteroideo usando el procedimiento del Ejemplo 6 anterior, excepto porque se dirigio el anticuerpo de deteccion usado contra estrogeno esteroideo. Este ensayo detectaba por lo tanto solo aductos de nucleosoma-receptor de estrogeno que contenfan adicionalmente hormona esteroidea.
45 EJEMPLO 10
Se lleva a cabo un ensayo ELISA de aducto de nucleosoma-receptor de estrogeno-estrogeno usando un procedimiento similar al del Ejemplo anterior, excepto porque se practica el ensayo en una placa de microvaloracion o tubo que es resistente a disolventes organicos y, despues de la captura por el anticuerpo 50 antinucleosoma de los aductos de nucleosoma-receptor de estrogeno sobre la superficie del pocillo, se decantan los contenidos solidos del pocillo y se anade dietileter para disolver cualquier esteroide presente en el aducto capturado. Se transfiere el eter a otro pocillo o tubo y se seca. Se redisuelve el extracto secado en tampon de ensayo y se determina la concentracion de estrogeno usando un procedimiento de inmunoensayo competitivo clasico para analisis de estrogeno. Este ensayo detecta por lo tanto solo aductos de nucleosoma-receptor de 55 estrogeno que contienen adicionalmente estrogeno.
EJEMPLO 11
Se lleva a cabo un ensayo ELISA de nucleosoma-receptor de acido retinoico-acido retinoico usando el 60 procedimiento del Ejemplo 10 anterior, excepto porque se dirigio el inmunoensayo competitivo esteroideo usado
contra acido retinoico. Este ensayo por lo tanto detecta solo aductos de nucleosoma-receptor de acido retinoico que contienen adicionalmente el esteroide acido retinoico.
EJEMPLO 12
5
Se practican ensayos de aducto de nucleosoma similares a los descritos en los Ejemplos 1-10, excepto porque se dirigio el anticuerpo recubierto en fase solida usado contra 5-metilcitidina. Estos ensayos por lo tanto detectan solo aductos de nucleosoma-receptor hormonal y aductos de complejo de nucleosoma-receptor hormonal- hormona que estan adicionalmente asociados a ADN metilado.
10
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Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Uso de un aducto de nucleosoma-protefna como biomarcador en una muestra de sangre para el diagnostico de cancer, donde la protefna en aducto con el nucleosoma comprende un factor de transcripcion o
    5 una enzima modificadora de cromatina.
  2. 2. Uso como se define en la reivindicacion 1, donde la protefna en aducto con el nucleosoma es un factor de transcripcion.
    10 3. Uso como se define en la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde el factor de transcripcion es
    un receptor de hormona nuclear.
  3. 4. Uso como se define en la reivindicacion 1, donde la enzima modificadora de cromatina es una enzima de acetilacion, desacetilacion, metilacion, desmetilacion, fosforilacion, desfosforilacion, ubiquitinacion,
    15 desubiquitinacion, sumoilacion, desumoilacion o ADN metiltransferasa de histona.
  4. 5. Uso como se define en la reivindicacion 1 o la reivindicacion 4, donde la enzima modificadora de cromatina es EZH2.
    20 6. Uso como se define en la reivindicacion 3, donde el receptor de hormona nuclear es un receptor de
    estrogeno, receptor de androgeno, receptor de progesterona, receptor de hormona tiroidea, receptor de glucocorticoide o receptor de acido retinoico.
  5. 7. Uso como se define en la reivindicacion 6, donde el receptor de hormona nuclear esta
    25 adicionalmente unido a una hormona que se selecciona de una hormona tiroidea, un estrogeno, un androgeno o acido retinoico.
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