CN104067125A

CN104067125A - 用于检测核小体加合物的方法

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Publication number: CN104067125A
Application number: CN201280060149.8A
Authority: CN
Inventors: J.V.米卡莱夫; M.E.埃克莱斯顿; M.赫佐格
Original assignee: Will Private Of Singapore LP
Current assignee: Belgium wills limited liability company
Priority date: 2011-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: CA2855375A1; AU2012349855B2; KR102039756B1; EP2788767B1; HK1202926A1; ZA201403260B; EP3264090A2; HRP20171680T1; BR112014013082A2; WO2013084002A2; US20170276684A1; EP3264090B1; SG11201402982TA; RU2014127493A; EP2788767A2; US20160097772A1; WO2013084002A3; DK2788767T3; EP4092415A1; ES2649404T3

Abstract

本发明涉及用于检测和测量核小体-蛋白质加合物的存在的方法以及此类测量用于疾病检测和诊断的用途。本发明还涉及鉴定核小体加合物生物标志用于疾病检测和诊断的方法和由所述方法鉴定的生物标志。

Description

用于检测核小体加合物的方法

发明领域

发明背景

人体包含几百种细胞类型。所有这些细胞类型均含有相同基因组，但广泛不同的表型和在体内不同的功能。该表型多样性是由于基因组在不同细胞类型中的差异表达。差异基因表达的控制并未完全了解，但基本机制包括由与基因相关的许多互联表观遗传信号(epigenetic signals)的基因调节，包括染色质包装为常染色质或异染色质的控制、核小体定位和核酸酶可接近位点的控制、DNA的甲基化和DNA在其周围缠绕的核小体结构中的变化。

核小体是染色质结构的基本单位并且由八个高度保守的核心组蛋白的蛋白质复合物组成（包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对）。在该复合物周围缠绕约146个碱基对的DNA。另一种组蛋白H1或H5充当接头，并且涉及染色质压实。DNA在通常被说成类似“串上的珠”的结构中绕在连续核小体周围，并且这构成开放的或常染色质的基本结构。在压实的或异染色质中，该串是卷曲的并且超卷曲成闭合和复杂的结构（Herranz和Esteller，2007）。

在成年人中的正常的细胞更新涉及每天通过约10¹¹细胞的细胞分裂的产生和主要通过细胞凋亡的相似数目的死亡。在细胞凋亡的过程期间，染色质分解成由细胞释放的单核小体和寡核小体。在正常条件下，这些被去除并且在健康个体中发现的循环核小体水平很低。升高水平在具有多种状况的个体中发现，所述状况包括多种癌症、自身免疫疾病、炎性状况、中风和心肌梗塞（Holdenrieder和Stieber，2009）。

单核小体和寡核小体可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测，并且几种方法已得到报道（Salgame等人，1997；Holdenrieder等人，2001；van Nieuwenhuijze等人，2003）。这些测定通常采用抗组蛋白抗体（例如抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3和H4）作为捕获抗体和抗DNA或抗H2A-H2B-DNA复合抗体作为检测抗体。然而，我们已发现这些测定的结果彼此不一致。此外，尽管血清或血浆中的大多数循环DNA据报道作为单核小体和寡核小体存在（Holdenrieder等人，2001），但测量的血清或血浆中的核小体和DNA水平并不良好吻合。循环细胞游离核小体(circulating cell free nucleosomes)水平的ELISA结果和如通过实时PCR（聚合酶链反应）测量的循环DNA水平之间的相关系数据报道在血清中是r=0.531，并且在血浆中是r=0.350（Holdenrieder等人，2005）。

核小体ELISA方法用于细胞培养中，主要作为检测细胞凋亡的方法（Salgame等人，1997；Holdenrieder等人，2001；van Nieuwenhuijze等人，2003），以及还用于测量血清和血浆中的循环细胞游离核小体（Holdenrieder等人，2001）。由濒死细胞释放到循环内的细胞游离血清和血浆核小体水平已通过ELISA方法在众多不同癌症的研究中进行测量，以评估其作为潜在生物标志的用途（Holdenrieder等人，2001）。平均循环核小体水平据报道在研究的大多数但并非全部癌症中很高。最高的循环核小体水平在肺癌个体中观察到。最低水平在前列腺癌中观察到，其在健康个体的正常范围内。然而，具有恶性肿瘤的个体据报道具有相当不同的血清核小体浓度，并且发现具有晚期肿瘤疾病的一些个体具有低循环核小体水平，在对于健康个体测量的范围内（Holdenrieder等人，2001）。由于这点和核小体水平升高的多种非癌症原因，循环核小体水平未在临床上用作癌症的生物标志（Holdenrieder和Stieber，2009）。

核小体的结构可以通过组蛋白的转录后修饰（PTM）和通过包括变体组蛋白而改变。组蛋白的PTM通常在八核组蛋白的尾部上发生，并且常见修饰包括赖氨酸残基的乙酰化、甲基化或泛素化以及精氨酸残基的甲基化和丝氨酸残基的磷酸化。组蛋白修饰已知涉及基因表达的表观遗传调节（Herranz和Esteller，2007）。核小体的结构还可以通过包括可选组蛋白同种型或变体而改变，所述可选组蛋白同种型或变体是不同基因或剪接产物，并且具有不同的氨基酸序列。组蛋白变体可以分类成多个家族，所述家族再分成各个类型。大量组蛋白变体的核苷酸序列是已知的，并且例如在下述中可公开获得：National Human Genome Research Institute NHGRI Histone DataBase（Mariño-Ramírez，L.，Levine，K.M.，Morales，M.，Zhang，S.，Moreland，R.T.，Baxevanis，A.D.和Landsman，D. The Histone Database：an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol.2011.（已投稿）和http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml）、GenBank（NIH遗传序列）DataBase、EMBL Nucleotide Sequence Database和DNA Data Bank of Japan（DDBJ）。

健康和患病细胞中存在的组蛋白变体和组蛋白修饰模式在众多（主要是免疫组织化学）研究中已显示是不同的（Herranz和Esteller，2007）。临床使用的免疫组织化学方法的一个缺点是组织样品收集涉及侵入性手术或活组织检查。

除由核小体结构和位置介导的表观遗传信号传导之外，细胞中的基因表达控制也由DNA的甲基化状态介导（Herranz和Esteller，2007）。一段时间以来本领域已知DNA可以在胞嘧啶核苷酸的第5位处甲基化，以形成5-甲基胞嘧啶。

DNA甲基化在癌症中的涉及早在1983年得到报道（Feinberg和Vogelstein，1983）。在癌细胞中观察到的DNA甲基化模式不同于健康细胞的那些。特别在近着丝粒区域周围的重复元件据报道相对于健康细胞在癌症中是低甲基化的，但特定基因的启动子据报道在癌症中是高甲基化的。这两种效应的平衡据报道导致癌细胞中的总体DNA低甲基化（Rodriguez-Paredes和Esteller，2011）。

某些特定基因的高甲基化可以用作癌症的诊断生物标志。例如，报道通过从血浆提取的DNA的PCR扩增用于检测Septin 9基因的高甲基化的方法据报道检测72%的结肠癌，伴随10%的假阳性率（Grutzmann等人，2008）。特定基因或基因座的DNA甲基化状态通常通过胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶至尿嘧啶的选择性亚硫酸氢盐脱氨基(bisulphite deamination)进行检测，导致可以通过测序或其他方法检测的一级DNA序列改变（Allen等人，2004）。

总体DNA低甲基化是癌细胞的标志（Esteller 2007和Hervouet等人，2010）。总体DNA甲基化可以使用免疫组织化学技术在细胞中进行研究。或者，从细胞中提取DNA用于分析。

多年来已知除核酸和组蛋白蛋白质之外，染色质包含与其组成成分DNA和/或组蛋白结合的大量非组蛋白蛋白质（Yoshida和Shimura，1972）。这些染色质相关蛋白质具有广泛多样的类型，并且具有多种功能，包括转录因子、转录增强因子、转录阻遏因子、组蛋白修饰酶、DNA损害修复蛋白质及许多其他功能。染色质结合蛋白质的研究已在很大程度上通过染色质免疫沉淀（ChIP）法进行。这些方法是本领域众所周知的，但却是复杂、费力和昂贵的。

在典型ChIP法中，细胞染色质是交联的，使得所有蛋白质和核酸组分彼此共价附着。随后剪切染色质以形成单核小体和寡核小体的制剂。将针对目的蛋白质的抗体加入剪切的染色质，以免疫沉淀含有蛋白质的那些染色质片段。抗体通常附着至固相（例如塑料珠），以促进含有目的蛋白质的染色质复合物的分离。随后逆转交联，并且通过用蛋白酶消化去除蛋白质。将与染色质复合物相关的DNA分离且分析，以测定与特定蛋白质结合相关的DNA序列、基因或基因座，其使用多种技术中的任一种，包括PCR随后凝胶电泳、DNA测序（ChIP-Seq）或DNA微阵列（ChIP-on-chip）。

这些ChIP法揭示与染色质结合组蛋白蛋白质相关的DNA序列。ChIP法的衍生方法已得到开发，以促进非组蛋白蛋白质与组蛋白和核小体的关系的研究，包括例如组蛋白相关测定（Ricke和Bielinsky，2005）。

与染色质结合的许多蛋白质涉及癌症及其他疾病机制，但其在循环中以核小体加合物形式的丰度先前未进行研究。实例包括高速泳动族盒蛋白(High Mobility Group Box Protein)1（HMGB1）、多梳蛋白(polycomb protein) Zeste同源物2的增强子（EZH2）和核受体族的蛋白质。

高速泳动族蛋白是以约3%的DNA或组蛋白重量存在的染色质组分。它们是与核小体结合的结构蛋白质，对潜在DNA序列没有任何已知特异性（Gerlitz等人；2009）。HMGB1是构筑染色体蛋白质和促炎介质。它涉及细胞死亡、细胞凋亡和众多疾病，包括多种炎性和自身免疫状况、脓毒症、脑膜炎和神经变性。HMGB1的过表达与癌症的所有关键标志相关（Tang等人；2010）。HMGB1紧密附着至细胞凋亡细胞的染色质。核小体-HMGB1复合物的研究已显示这些加合物在患有自身免疫疾病系统性红斑狼疮（SLE）的个体的循环中发现，并且该加合物涉及其为SLE关键特征的抗核抗体的发展。未附着至HMGB1的核小体不引发免疫应答。这些加合物中HMGB1与核小体的结合通过下述加以证实：用针对DNA或组蛋白的抗体免疫沉淀核小体，随后为使用抗HMGB1抗体的蛋白质印迹，以证实免疫沉淀的核小体中HMGB1的存在（Urbonaviciute等人；2008）。

HMGB蛋白质与已知影响染色质功能的许多其他蛋白质相互作用，并且已显示存在涉及HMGB蛋白质加上另外蛋白质的染色质复合物（Gerlitz等人；2009）。因此，除简单的核小体-蛋白质加合物之外，在染色质中存在其中2种或多种蛋白质与核小体结合的核小体-蛋白质-复合加合物(complex adduct)。

EZH2是多梳族（PcG）家族的成员，其形成涉及维持基因的转录阻遏状态的多聚蛋白质复合物。EZH2是组蛋白修饰酶（组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶），其甲基化核小体的组蛋白3的赖氨酸27氨基酸残基。该组蛋白修饰与染色质凝聚和基因沉默相关（Cao等人；2002）。

核小体受体是在组蛋白或配体的控制下调节基因表达的分子，例如雌激素受体（ER）调节雌激素依赖性基因的表达。这些蛋白质中的许多涉及疾病过程，例如ER涉及乳腺癌的进展，并且许多乳腺癌治疗靶向ER和/或阻止ER与其配体雌二醇的相互作用。

除细胞中存在的核小体-蛋白质加合物之外，存在可以在细胞死亡后从细胞中释放核小体后形成的其他核小体-蛋白质加合物。此类核小体加合物包括其为SLE关键特征的核小体-免疫球蛋白加合物。

我们目前报道用于直接估计生物样品中的蛋白质-核小体加合物的简单免疫测定方法。我们已开发用于检测核小体结合的EZH2、HMGB1和几种核受体的简单方法，并且显示此类核小体加合物可以在血清样品中进行检测，并且它们具有作为疾病中的生物标志的用途。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供了核小体-蛋白质加合物作为血液中的生物标志用于诊断癌症、自身免疫疾病或炎性疾病的用途。

根据本发明的第二方面，提供了用于检测样品中的核小体-蛋白质加合物的存在的方法，其包括下述步骤：

（i）使样品与第一结合试剂接触，所述第一结合试剂结合核小体或其组分；

（ii）使核小体或样品与第二结合试剂接触，所述第二结合试剂结合与核小体加合的蛋白质；

（iii）检测或定量所述第二结合试剂与样品中的加合的蛋白质的结合；和

（iv）使用此类结合的存在或程度作为样品中的核小体加合物的存在的量度。

根据本发明的第三方面，提供了用于检测样品中的核小体加合物的存在的方法，其包括下述步骤：

（i）使样品与第一结合试剂接触，所述第一结合试剂结合与核小体加合的蛋白质；

（ii）使核小体或样品与第二结合试剂接触，所述第二结合试剂结合核小体或其组分；

（iii）检测或定量所述第二结合试剂与样品中的核小体或其组分的结合；和

根据本发明的进一步方面，提供了用于检测细胞中的核小体加合物的方法，其包括下述步骤：

（i）从细胞中分离染色质；

（ii）消化、超声处理或以其他方式分解染色质，以形成单核小体和/或寡核小体；和

（iii）根据上述第二或第三方面中所述的本发明的ELISA方法，检测或测量核小体加合物的存在。

根据本发明的进一步方面，提供了用于检测或诊断动物或人个体中的疾病状态的方法，其包括下述步骤：

（i）检测或测量个体体液中的核小体加合物；和

（ii）使用检测到的核小体加合物水平来鉴定个体的疾病状态。

根据本发明的进一步方面，提供了评估动物或人个体对医学治疗的适合性的方法，其包括下述步骤：

（i）检测或测量个体体液中的核小体加合物；和

（ii）使用检测到的核小体加合物水平作为选择个体的合适治疗的参数。

根据本发明的进一步方面，提供了用于监控动物或人个体的治疗的方法，其包括下述步骤：

（i）检测或测量个体体液中的核小体加合物；

（ii）在一个或多个场合重复个体体液中的核小体加合物的检测或测量；

（iii）使用检测到的核小体加合物水平中的任何改变作为个体状况中的任何改变的参数。

根据本发明的进一步方面，提供了用于鉴定核小体加合物生物标志用于检测或诊断动物或人个体中的疾病状态的方法，其包括下述步骤：

（i）检测或测量个体体液中的核小体加合物；

（ii）检测或测量健康个体或对照个体体液中的核小体加合物；和

（iii）使用在患病和对照个体中检测到的水平之间的差异，来鉴定核小体加合物是否可用作疾病状态的生物标志。

根据本发明的进一步方面，提供了依照本文限定的方法鉴定的生物标志。

根据本发明的进一步方面，提供了用于检测核小体加合物的试剂盒，其包括对于核小体加合物或其组成部分、或DNA碱基、核苷酸或核苷或其组成部分的结构/形状模拟物特异性的配体或结合剂，连同试剂盒的使用说明书。

附图简述

图1：用于检测稀释到马血清内的从Hela细胞中提取的消化染色质中的核小体EZH2加合物水平的ELISA剂量应答曲线。

图2：得自5个健康个体和11个患有肿瘤的个体的血清样品的核小体-EZH2加合物ELISA结果。

图3：用于检测稀释到马血清内的从Hela细胞中提取的消化染色质中的核小体-HMGB1加合物水平的ELISA剂量应答曲线。

图4：得自5个健康个体和11个患有肿瘤的个体的血清样品的核小体-HMGB1加合物ELISA结果。

图5：得自31个健康个体和74个患有（A）结肠癌、（B）乳腺癌或（C）肺癌的个体的血清样品的核小体-HMGB1加合物ELISA结果。

图6：在通过*Holdenrieder等人；2001的方法制备的细胞游离核小体中，用于检测核小体-孕酮受体加合物水平的ELISA剂量应答曲线。

图7：在2个前列腺癌病例和通过*Holdenrieder等人；2001的方法制备的细胞游离核小体样品中，用于检测核小体-雄激素受体加合物水平的ELISA结果。

图8：在通过*Holdenrieder等人；2001的方法制备的细胞游离核小体中，用于检测核小体-雌激素受体α（ERα）加合物水平的ELISA剂量应答曲线。

图9：用于检测消化的MCF7染色质中的核小体-ERβ加合物水平的ELISA结果。该测定以两种不同形式进行。在第一形式中，将抗核小体抗体包被到孔上，并且使抗ERβ抗体生物素化。在第二形式中，将抗ERβ抗体包被到孔上，并且使抗核小体抗体生物素化。

图10：核小体H2AZ-ERβ加合物ELISA结果。

图11：得12个健康个体和16个患有肿瘤的个体的血清样品的核小体-ERβ加合物ELISA结果。

发明详述

根据本发明的第一方面，提供了核小体-蛋白质加合物作为血液中的生物标志用于诊断癌症、自身免疫疾病或炎性疾病的用途。在一个实施方案中，生物标志用于诊断癌症。我们已显示含有HMGB1和EZH2的两种此类加合物存在于患有癌症的个体的循环中，但在健康个体的循环中未检测到。

本领域众所周知癌症可以是激素依赖性的，并且需要激素的存在用于生长。还众所周知核激素通过受体结合的激素复合物的核定位以及与基因组中的特定激素应答元件结合来起作用。与元件相关的基因的表达通过受体结合的激素复合物与基因组应答元件的结合进行调节。在一个实施方案中，本发明提供了激素受体-核小体加合物和激素-激素受体-核小体复合加合物生物标志，用于表征个体的肿瘤状态。这些加合物可以是血液或另一种体液中存在的循环加合物，或可以通过来自肿瘤组织样品的染色质消化而产生。

本领域众所周知核激素受体在激素或配体的控制下调节基因表达。例如，雌激素受体通过结合其在细胞表面膜处的底物（类固醇激素雌激素）起作用。结合随后为激素-受体复合物的内在化和核内定位，其中受体与基因组中的特定激素应答元件结合。雌激素受体与之结合的特定基因序列被称为雌激素应答元件（ERE）。与ERE相关的基因的表达可以通过受体调节，并且因此通过个体循环中的雌激素的存在或水平调节。本领域还众所周知乳腺癌的生长通常处于雌激素控制下，并且此类癌症通常被称为雌激素依赖性的。因为这些肿瘤过表达雌激素受体（ER），所以它们通常被称为ER+肿瘤。雌激素依赖性肿瘤的生长可以通过旨在阻止雌激素与雌激素受体结合的治疗干预得到减慢或阻止，并且这是乳腺癌治疗的常见方法。此类治疗的实例包括下述药物：充当雌激素依赖性乳腺癌中的雌激素拮抗剂的他莫昔芬，和减慢或阻止雌激素产生的芳香酶抑制剂。然而，随着时间过去，癌症发展成雌激素非依赖性肿瘤，其即使在不存在雌激素刺激的情况下也生长，并且需要不同治疗。雌激素依赖性和非依赖性肿瘤的诊断目前常规通过免疫染色肿瘤活组织检查组织进行，以测定肿瘤细胞中雌激素受体的丰度或其他方面。临床医生可能需要在肿瘤治疗过程期间反复再测试肿瘤的雌激素依赖性，以确定进一步的雌激素依赖性治疗是否适合或个体的治疗方案是否应改变，以反映随着疾病进展肿瘤的改变性质。不幸的是，目前测试是次优的，并且需要在进行测试的每个场合的重复疼痛的活组织检查。在本发明的一个实施方案中，将在乳腺癌患者的循环中雌激素受体-核小体加合物的检测用作肿瘤细胞的细胞核中雌激素受体与ERE结合的指标作为肿瘤的雌激素依赖性的指标，以帮助选择适当治疗和预测性预后信息。该方法具有指示肿瘤中的ERE-雌激素受体结合，而不是雌激素受体的存在或丰度的简单指标的优点，并且它可以如简单血液测试所需要的一样频繁地重复，而无需活组织检查。我们已开发用于检测和定量含有受体的ERα和ERβ形式的核小体-ER加合物的简单ELISA方法。令人惊讶的是，这些加合物存在于癌症患者的循环中。

本领域技术人员将明确的是，相同原理可以应用于检测由肿瘤组织自身产生的细胞染色质消化物中的雌激素受体-核小体加合物。这种评价肿瘤的雌激素依赖性的方法优于目前方法，因为它指示肿瘤中的ERE-雌激素受体结合，而不是雌激素受体的存在或丰度的简单指标。

在本发明的另一个实施方案中，将在循环中、或在另一种体液中、或在作为来自肿瘤组织的染色质消化物产生的核小体中，在雌激素-雌激素受体-核小体复合加合物中的类固醇雌激素自身的存在的检测，用作肿瘤的雌激素依赖性状态的指标。

据报道循环核小体在子宫内膜异位症中是升高的（Holdenrieder等人；2001），并且因为子宫内膜异位症组织是雌激素响应的，所以在子宫内膜异位症细胞的染色质中雌激素受体的结合可以导致在循环中的雌激素受体-核小体加合物或雌激素-雌激素受体-核小体复合加合物。在本发明的进一步实施方案中，在体液中检测雌激素受体-核小体加合物或雌激素-雌激素受体-核小体复合加合物，作为雌激素依赖性妇科状况（包括例如子宫内膜异位症）存在的生物标志。

以与雌激素依赖性乳腺癌相似的方式，雄激素依赖性前列腺癌的生长需要雄激素或由雄激素加速。雄激素依赖性前列腺肿瘤类似地通过阻止雄激素与雄激素受体（AR）结合的方法进行治疗。雄激素依赖性前列腺肿瘤还可以发展变成雄激素非依赖性的，并且因此对治疗（包括物理阉割或通过药物的化学阉割，以阻止雄激素与其受体结合）是抗性的。肿瘤的雄激素依赖性状态可以通过雄激素受体与基因组中的雄激素应答元件（ARE）的结合水平来确定，并且这可以通过分析个体循环或来自前列腺组织的染色质消化物中存在的雄激素受体-核小体加合物水平进行确定。用于该目的的本发明实施方案包括在个体循环或体液或者由来自个体肿瘤组织的染色质消化产生的核小体中，雄激素受体-核小体加合物或雄激素-雄激素受体-核小体复合加合物的检测。我们目前已开发用于检测和定量核小体-AR加合物的简单ELISA方法，且证实其效用。我们还已开发用于检测和定量核小体-孕酮受体加合物的简单ELISA方法。其他激素依赖性疾病可以用本发明方法的相似实施方案加以解决。此类实施方案包括检测其他受体-核小体加合物，包括例如糖皮质激素受体、甲状腺激素受体和视黄酸受体-核小体加合物，用于检测肿瘤包括例如涉及视黄酸受体的多个类型的白血病。

根据本发明的进一步方面，上文描述的方法可以用于检测激素-激素受体-核小体复合加合物。在一个实施方案中，激素-激素受体-核小体复合加合物包含甲状腺素-甲状腺激素受体-核小体复合加合物、三碘甲状腺原氨酸-甲状腺激素受体-核小体复合加合物、视黄酸-视黄酸受体-核小体复合加合物、雄激素-雄激素受体-核小体复合加合物、或雌激素-雌激素受体-核小体复合加合物。本发明的这个方面具有区分激素活化的加合物以及含有野生型或正常激素受体的加合物，与例如由于在疾病进展的过程中（例如在雌激素非依赖性乳腺癌中）的突变而不结合其配体的激素受体的优点。本发明的这个方面可以以多种方式进行。在一个实施方案中，使用定向结合激素自身的抗体或其他结合剂，代替定向结合激素受体的抗体。在可替代实施方案中，激素从抗体捕获的激素-激素受体-核小体复合加合物中提取，并且通过建立的方法定量，所述方法例如免疫测定法、光谱法或色谱法，包括高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱法随后为质谱法（LC/MS）或气相色谱法随后为质谱法（GC/MS）。例如，雄激素-雄激素受体-核小体复合加合物通过定向结合加合物上（例如在雄激素受体或核小体上）存在的表位的固定抗体捕获。激素随后从固相结合的加合物提取到有机溶剂（例如二乙醚）内。将溶剂转移，干燥且将雄激素再溶解于测定缓冲液中，并且测量其浓度（例如通过竞争性免疫测定）。本领域技术人员将明确的是，该实施方案将具有用于小分子激素例如类固醇和甲状腺激素的特定应用。

本发明旨在检测与核小体结合的蛋白质。这可以借助于双抗体ELISA测试完成，其中一种抗体定向结合核小体，并且另一种定向结合与核小体结合的蛋白质。然而，定向结合核小体的抗体无需定向整体核小体复合物，而是可以定向核小体的蛋白质或核酸组成部分。在本发明的这个实施方案中，用于结合核小体的抗体可以定向结合核小体的任何组成部分，包括例如特定组蛋白、组蛋白修饰、组蛋白变体或同种型、或特定核苷酸或经修饰的核苷酸。我们已显示这种测定设计使用定向结合组蛋白变体H2AZ的抗体作为核小体的结合剂的实例良好工作。本领域技术人员将明确的是，该方法具有仅选择性结合含有加合物中的目的蛋白质和H2AZ的那些核小体的另外优点。该设计提供用于测试加合物蛋白质与任何特定组蛋白、组蛋白修饰、组蛋白变体、核苷酸、经修饰的核苷酸或其他核小体结构的任何组合的测定方法。

本领域技术人员将明确的是，待检测的结合试剂可以选择为针对加合蛋白质或者针对核小体或核小体的组成部分的抗体。

在一个实施方案中，核小体加合物包括促炎蛋白、高速泳动族蛋白、多梳蛋白、染色质修饰酶、核受体或激素。在可替代实施方案中，核小体加合物包括高速泳动族蛋白、多梳蛋白、染色质修饰酶、激素受体或激素。在进一步的实施方案中，核小体加合物包括染色质修饰酶、核受体或激素。在进一步的实施方案中，高速泳动族蛋白是HMGB1。在一个实施方案中，当生物标志用于诊断癌症时，核小体-蛋白质加合物包括高速泳动族蛋白。

在一个实施方案中，染色质修饰酶是组蛋白乙酰化、去乙酰化、甲基化、去甲基化、磷酸化、去磷酸化、泛素化(ubiquitination)、去泛素化、苏素化(sumoylation)、去苏素化或DNA甲基转移酶酶。在可替代实施方案中，染色质修饰酶是EZH2。

在一个实施方案中，当核小体-蛋白质加合物包括核受体时，所述核受体是雌激素受体、雄激素受体、孕酮受体、甲状腺激素受体、糖皮质激素受体或视黄酸受体。在可替代实施方案中，当核小体-蛋白质加合物包括核受体时，所述核受体是雌激素受体、雄激素受体或视黄酸受体。

在一个实施方案中，当核小体-蛋白质加合物包括激素时，所述激素是甲状腺激素、糖皮质激素或类固醇激素，包括雌激素、雄激素、孕激素、皮质类固醇或视黄酸。在可替代实施方案中，当核小体-蛋白质加合物包括激素时，所述激素是类固醇激素，包括雌激素、雄激素、皮质类固醇或视黄酸。

在一个实施方案中，当核小体-蛋白质加合物包括激素受体时，所述激素受体是雌激素受体、雄激素受体、孕酮受体、甲状腺激素受体或视黄酸受体。

我们已显示该方法可以使用与定向结合与核小体加合的蛋白质的抗体组合的针对核小体自身的抗体进行，或使用再次与定向结合与核小体加合的蛋白质的抗体组合的针对核小体组分的抗体进行。在一个实施方案中，核小体或核小体组分抗体或结合剂定向结合特定表观遗传核小体表位；例如任何组蛋白变体（例如H2AZ）、任何组蛋白修饰（例如三甲基H3K9）或任何核苷酸或经修饰的核苷酸（例如5-甲基胞嘧啶）。在可替代实施方案中，核小体或核小体组分结合剂定向结合特定表观遗传信号结构，使得仅检测含有所述表观遗传信号结构的核小体加合物的特定子集。

在一个实施方案中，使用的结合试剂是抗体、抗体片段或适体。在进一步的实施方案中，使用的结合试剂是抗体。

在一个实施方案中，样品是生物流体。在进一步的实施方案中，样品是血液或血清或血浆。本领域技术人员将明确的是，体液中的核小体加合物的检测具有是不需要活组织检查的最低限度侵入性方法的优点。

然而，在一些情况下，可能优选直接通过下述评价细胞的核小体加合物状态：由该细胞产生核小体，并且就特定核小体加合物的存在分析核小体。

（i）从细胞中分离染色质；

（iii）根据上述第二至第六方面中任一项所述的本发明的ELISA方法，检测或测量核小体加合物的存在。

（i）检测或测量个体体液中的核小体加合物；和

在本发明的一个实施方案中，样品中核小体加合物的存在用于确定需要此类治疗的个体中的最优治疗方案。此类实施方案的一个实例是检测核激素受体-核小体加合物或激素-激素受体-核小体复合加合物，用于评价肿瘤的激素依赖性。

根据本发明的进一步方面，提供了用于评价动物或人个体对医学治疗的适合性的方法，其包括下述步骤：

（i）检测或测量个体体液中的核小体加合物；和

（i）检测或测量个体体液中的核小体加合物；

在一个实施方案中，检测或测量核小体加合物作为一组测量之一。

根据本发明的进一步方面，提供了单独或作为一组测量的部分的用于检测或测量核小体加合物的方法，其用于以下目的：检测或诊断疾病状态，或用于评价动物或人个体对医学治疗的适合性，或用于监控动物或人个体的治疗，所述方法用于在患有实际或可疑癌症、良性肿瘤、炎性疾病、自身免疫疾病、子宫内膜异位症、传染病、脓毒症、中风或心肌梗塞的个体中。

（i）检测或测量个体体液中的核小体加合物；

除组蛋白和核酸组分之外，已知染色质含有广泛多样的蛋白质，其执行广泛范围的功能。我们选择HMGB1、EZH2和几种核受体作为这些蛋白质的实例，并且已开发用于检测这些蛋白质的单核小体和寡核小体加合物的简单ELISA方法。我们直接对得自健康和患病个体的血清样品进行这些ELISA方法，并且该方法不需要样品提取或其他样品预处理。令人惊讶的是，我们已显示这些核小体加合物可以在癌症个体的血清中检测到，并且核小体加合物ELISA测定可用于疾病状态的检测和诊断。

HMGB1是与细胞死亡、细胞凋亡和众多疾病相关的损伤相关分子模式（DAMP）蛋白质，所述疾病包括多种炎性和自身免疫状况、脓毒症、脑膜炎、神经变性、SLE和癌症（Tang等人；2010）。升高的HMGB1表达在许多癌症中发生，并且被认为与侵入和转移相关（Sims等人，2010）。升高的HMGB1水平也在癌症患者的血液中以及多种其他状况下发生（Stoetzer等人，2012）。循环HMGB1可以通过ELISA进行测量，但此类测量不用于常规临床实践中，因为循环HMGB1以结合和游离形式存在，并且目前可用于区分这些的蛋白质免疫印迹方法不适合于常规用途。因此，存在区分游离HMGB1和HMGB1复合物的可靠方法的需要（Urbonaviciute和Voll，2011）。重要种类的循环HMGB1复合物是HMGB1-核小体加合物，并且本发明的一个实施方案针对HMGB1-核小体加合物及其他HMG-核小体加合物的检测。我们已显示HMG-核小体加合物可以使用快速和简单的ELISA方法，在癌症患者的血液中进行测量。

HMGB1紧密附着至细胞凋亡细胞的染色质。核小体-HMGB1复合物的研究已显示这些加合物在患有自身免疫疾病SLE的个体的循环中发现，并且加合物涉及其为SLE关键特征的抗核抗体的发生。这些加合物在循环中的存在仍未用于临床诊断目的，因为用于其检测的蛋白质印迹方法是昂贵、缓慢和费力的，并且不适合于常规临床用途。本发明克服了这些缺点。

EZH2是染色质修饰酶（组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶），其甲基化核小体的组蛋白3的赖氨酸27氨基酸残基，导致染色质凝聚和基因沉默（Cao等人；2002）。该蛋白质已知结合活细胞的细胞核中的染色质。令人惊讶的是，我们已显示EZH2在细胞死亡后保持与核小体结合，并且使用本发明的新ELISA方法，可以在癌症个体的血清中检测到单核小体-EZH2和寡核小体-EZH2加合物。

已知染色质修饰酶涉及癌症（Fullgrabe等人，2011），并且通过使用靶向药物抑制这些酶的活性是主要形式的癌症治疗。这些药物包括例如但不限于组蛋白去乙酰化复合物抑制剂（HDACi）、组蛋白甲基转移酶抑制剂（HMTi）和DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTi）。虽然HMGB1加合物在循环中的存在已知是病理的，并且与抗核抗体相关，但染色质修饰酶-核小体加合物存在于循环中的发现先前未得到报道。染色质修饰酶-核小体加合物的测定具有在癌症中的多种用途，包括例如评价癌症疾病状态和测定染色质修饰酶抑制剂药物的功效，例如测定循环染色质修饰酶-核小体加合物的水平是否通过用特定药物的治疗改变。本发明的方法可以用于测定循环染色质修饰酶-核小体加合物水平，用于广泛多样的疾病诊断目的，包括疾病检测、监控、预后、鉴别诊断和选择治疗方案。我们已显示含有HMT酶EZH2的核小体加合物可以在癌症患者的循环中检测到。本领域技术人员将明确的是，本发明的方法可以应用于其他染色质修饰酶，包括以前提及的HDAC和DNMT酶以及许多其他酶，包括例如用于组蛋白乙酰化、去甲基化、磷酸化、去磷酸化、泛素化、去泛素化、苏素化和去苏素化的酶。

核受体在配体激素控制下在细胞核中发挥其基因调节作用。实例包括类固醇激素受体、甲状腺受体、糖皮质激素受体以及视黄酸和维生素D受体。这些受体涉及多种癌症及其他疾病机制。一些实例包括视黄酸受体（RAR）在白血病中的涉及、雌激素受体（ER）在乳腺癌和子宫内膜异位症中的涉及、雄激素受体（AR）在前列腺癌中的涉及、以及甲状腺激素受体在甲状腺疾病和癌症中的涉及。

令人惊讶的是，我们已显示核受体-核小体加合物可以在癌症患者的循环中检测到。

因此，我们选择研究的所有细胞内染色质相关蛋白质可以以核小体加合物的形式在癌症患者的血清中发现。这些发现指示此类加合物可能不是罕见的，并且涉及许多不同染色质相关蛋白质的许多此类细胞内核小体蛋白质加合物可以在细胞死亡后保留其完整性，并且顺应通过本发明的方法在癌症、自身免疫和炎性疾病患者的血清中的检测。

我们已使用与适当的特异性抗染色质蛋白质（抗HMGB1、抗EZH2或抗核受体）抗体组合的抗组蛋白抗体，作为用于这些测定的捕获抗体。我们已使用测定以显示含有特定蛋白质的核小体加合物可以在得自患有癌症的个体的血样中进行测量，并且区别用作非侵入性或最低限度侵入性生物标志。在得自患病个体的血清样品中检测到的核小体-加合物水平不同于在来自健康个体的血清样品中检测到的那些。

我们测量得自3个患有结肠癌的个体、6个患有肺癌的个体和2个患有胰腺癌的个体的血样中的循环细胞游离核小体-HMGB1和核小体-EZH2加合物水平，并且比较这些与来自5个健康个体的血样中存在的水平，以及如文献（*Holdenrieder等人，2001）中所述制备的来自健康个体的人工产生的血清核小体制剂，和通过由Hela细胞提取的染色质消化制备的商购可得的核小体制剂。

对于核小体-HMGB1和核小体-EZH2加合物，由5个健康个体的结果计算正常范围（平均结果±平均值的2个标准差），并且检查癌症个体的结果以查看它们是落入各自正常范围之内还是之外。数据显示3个结肠癌样品中的2个、6个肺癌样品中的4个和2个胰腺癌样品中的1个具有升高的核小体-HMGB1加合物水平，并且类似地3个结肠癌样品中的2个、6个肺癌样品中的4个和2个胰腺癌样品中的1个具有升高的核小体-EZH2加合物水平（光密度结果高于正常范围的顶端）。

我们已类似地测量健康和患病患者中的核受体-核小体加合物水平，并且显示这些存在于癌症患者的血清中。

与染色质结合的蛋白质包括但不限于核受体、高速泳动族蛋白（例如HMGB1）、多梳蛋白、染色质修饰酶（例如EZH2）、DNA修饰酶、核受体、转录因子、构筑或结构蛋白质、转录增强因子、转录阻遏因子、复制蛋白、DNA损伤修复蛋白以及涉及基因表达、染色质包装或复制控制的任何其他蛋白质。

核小体加合物还可以由于细胞死亡后在生物流体(biological fluid)中存在的核小体的结合而存在。此类加合物的实例将是自身免疫疾病例如SLE形成的核小体-抗体加合物。

因此，在本发明的一个实施方案中，提供了用于检测或测量核小体-蛋白质复合物或加合物的存在的方法。待测量的核小体加合物可以具有任何起源，包括但不限于由于健康或患病状况在生物流体中存在的天然存在的核小体加合物，或核小体加合物可以通过由细胞提取的染色质消化而产生，或它们可以通过诱导的细胞凋亡或细胞坏死而产生（例如通过*Holdenrieder等人；2001的方法）。令人惊讶的是，我们已显示核小体加合物在所有这些情形下存在，并且可以通过本发明的方法进行检测。

在本发明的另一个实施方案中，提供了用于检测或测量生物流体中的核小体-蛋白质加合物的存在的方法。

在本发明的进一步实施方案中，提供了通过就一种或多种核小体-蛋白质复合物或加合物的存在或水平测试个体样品，用于检测或诊断疾病的存在、类型、复发或严重性，或评价最优药物或其他治疗选项的方法。

在本发明的进一步实施方案中，提供了通过就核小体-蛋白质复合物或加合物的存在或水平测试得自个体的样品作为一组测试的部分，用于检测或诊断疾病的存在、类型、复发或严重性，或评价最优药物或其他治疗选项的方法。用于检测含有不同组蛋白修饰的细胞游离核小体的ELISA方法已得到报道（Bawden等人；2005）。

因此，此类一组测试可以由例如含有不同核小体表位的核小体的两种或更多种测量组成；包括但不限于不同加合物和/或组蛋白修饰和/或组蛋白变体和/或经修饰的核苷酸和/或核小体自身的测量，或这些中的任何和任何其他核小体表位的任何组合或比，作为个体的健康或疾病状态的指标。

我们得出结论本发明的方法是用于检测和测量含有特定蛋白质的核小体加合物的成功方法，并且该方法是比本领域的方法更佳的用于检测核小体加合物的方法。该方法是快速、低成本的且适合用于复杂生物介质和流体，包括血液及其衍生物。我们已证实本发明的方法可以用于检测血液中的核小体加合物，并且这可以用作癌症的生物标志。本领域技术人员将明确的是，血液中存在的生物标志具有用于癌症及其他与升高的循环核小体相关的疾病的广泛范围的诊断和疾病筛选目的的价值（Holdenrieder等人，2001）。

根据本发明的一个方面，提供了用于检测且测量样品中的细胞游离核小体加合物的双抗体、免疫测定或夹心(sandwich)免疫测定方法。这个方面的一个实施方案是免疫测定，其包含下述步骤：

（i）使可能含有核小体加合物的样品与第一抗体或其他结合剂接触，所述第一抗体或其他结合剂结合核小体或其组分；

（ii）使核小体或样品与第二抗体或其他结合剂接触，所述第二抗体或其他结合剂结合可能作为核小体-蛋白质加合物存在的蛋白质；

（iii）检测和/或定量所述第二抗体或其他结合剂与样品中的核小体-蛋白质加合物的结合；和

（iv）使用此类结合的存在或程度作为样品中的核小体-蛋白质加合物的存在的量度。

根据本发明的另一个方面，提供了通过免疫测量免疫测定用于检测且测量样品中的细胞游离核小体加合物的方法，其包含下述步骤：

（i）使可能包含含有特定蛋白质的核小体加合物的样品与第一抗体或其他结合剂接触，所述第一抗体或其他结合剂结合目的蛋白质；

（ii）使核小体或样品与第二抗体或其他结合剂接触，所述第二抗体或其他结合剂结合核小体或其组分；

（iii）用结合样品中的核小体或其组分的第二抗体或其他结合剂检测和/或定量所述第二抗体或其他结合剂与核小体样品的结合；和

（iv）使用此类结合的存在或程度作为样品中核小体加合物的存在的量度。

本领域技术人员将明确的是，在上文第一方面的阶段（i）和上文第二方面的阶段（ii）中，用于结合核小体或其组分的抗体或其他结合剂可以是针对完整核小体或针对核小体的任何组成部分的抗体（或其他结合剂），包括但不限于针对组蛋白、组蛋白变体、组蛋白修饰、核苷酸、经修饰的核苷酸或核小体的DNA组分的其他部分。因此，在本发明的进一步方面，提供了用于（仅）检测那些核小体-蛋白质加合物的方法，所述核小体-蛋白质加合物另外含有该结合剂针对其的另一个特征，包括但不限于特定组蛋白修饰、组蛋白变体或核苷酸。该设计的优点在于测定的核小体组分表位和加合的蛋白质表位可以选择为其水平在健康或患病患者，或处于研究下的其他患者状态中极大不同的表位。因此有可能降低通过测定检测到的核小体比例，而增加测定的临床选择性或特异性。

我们已使用与抗EZH2抗体结合的针对核小体组分H2AZ的抗体作为抗核小体抗体，进行测定的该设计，并且显示与H2AZ特异性相关的核小体-EZH2加合物可以通过此类测定检测，并且这些测定可以用于区分得自健康和患病个体的样品。

在本发明的进一步方面，待检测的核小体加合物可以含有超过一种蛋白质。加合物中的进一步蛋白质可以直接或间接结合核小体。例如，核小体可以结合HMGB蛋白质，并且另外结合进一步的一种蛋白质或多种蛋白质。进一步的一种或多种蛋白质可以直接结合核小体或可以结合HMGB蛋白质，并且因此间接结合核小体。核小体加合物可以含有由多种蛋白质组分组成的大蛋白质复合物，其中复合加合物中的特定蛋白质与核小体的结合可以通过多种中间结合连接。本领域技术人员将明确的是，核小体加合物中直接或间接结合核小体的蛋白质可以通过本发明的方法进行检测。

本领域技术人员将明确的是，所述本发明的方法包括多个实施方案，包括生物传感器型测定和例如由美国的ForteBio Incorporated销售的无标记测定类型。

根据本发明的进一步方面，提供了用于检测样品中包含特定核小体加合物的核小体比例的方法，其包括下述步骤：

（i）检测或测量样品中的核小体水平；

（ii）根据本发明的方法检测或测量核小体加合物水平；和

（iii）使用两种测量来测定包含核苷酸加合物的核小体比例。

我们已显示得自个体的血液中的核小体加合物的检测和测量可以用作诊断方法，以鉴定患有癌症的个体且区分其与健康个体。根据本发明的进一步方面，提供了用于检测或诊断疾病的存在的方法，通过测量或检测体液中的细胞游离核小体加合物的存在和/或水平或浓度，并且使用检测的水平作为个体的疾病状态的生物标志，包括但不限于疾病的临床诊断、疾病类型或亚型的鉴别诊断、或疾病预后、或疾病复发、或对治疗方案的个体敏感性的诊断。本领域技术人员应当理解用于诊断测试的体液包括但不限于血液、血清、血浆、尿、脑脊液及其他流体。在一个优选实施方案中，选择为样品的体液是血液、血清或血浆。体液中的核小体加合物的测定应答、水平、浓度或数量可以表示为绝对项或相对项，例如但不限于作为存在的总核小体水平的比例，或者作为与含有另一种核小体结构如组蛋白修饰的核小体水平或与总DNA水平的比例。

在本发明的一个实施方案中，核小体加合物测量用作测试的诊断组的成员或用于检测或诊断个体的疾病状态的测量，包括但不限于疾病的临床诊断、疾病类型或亚型、或疾病预后、或疾病复发的鉴别诊断、或对治疗方案的个体敏感性的诊断。

根据本发明的另一个方面，提供了用于检测或测量细胞中的蛋白质的染色质结合的存在和/或水平的方法，其包括下述步骤：

（i）从细胞中分离染色质；

（ii）分解染色质，以形成单核小体和/或寡核小体；和

（iii）借助于本发明的免疫测定方法，检测或测量单核小体和/或寡核小体中的核小体加合物的存在。

用于由染色质产生单核小体和/或寡核小体的方法是本领域众所周知的，并且包括酶消化和超声处理（Dai等人，2011）。我们已证实用于由Hela和MCF7细胞产生的核小体的这个方面。

本领域技术人员将明确的是，就本发明的任何方面而言的术语抗体、结合剂或配体不是限制性的，而是旨在包括抗体片段、适体或任何能够与特定分子或实体结合的结合剂，并且任何合适的结合剂均可用于本发明的方法中。还将明确的是，术语核小体旨在包括单核小体和寡核小体，以及可以在流体介质中分析的任何此类染色质片段。

根据本发明的另一个方面，提供了用于检测或测量核小体加合物的试剂盒，其包括对于核小体加合物或其组成部分、或核小体加合物或其组成部分的结构/形状模拟物特异性的配体或结合剂，连同依照本文定义的任何方法的试剂盒的使用说明书。

根据本发明的另一个方面，提供了用于鉴定核小体加合物生物标志用于检测或诊断动物或人中的疾病状态的方法，其包括下述步骤：

（i）检测或测量患病个体的体液中的细胞游离核小体加合物的水平；

（ii）检测或测量对照个体的体液中的细胞游离核小体加合物的水平；和

（iii）使用患病和对照个体中检测到的水平之间的差异，来鉴定核小体加合物是否可用作该疾病的生物标志。

本领域技术人员将明确的是，对照个体可以在多种基础上加以选择，所述基础可以包括例如已知不患有疾病的个体，或可以是患有不同疾病的个体（例如，用于研究鉴别诊断）。

根据本发明的进一步方面，提供了用于鉴定核小体加合物生物标志用于评价患病动物或人个体的预后的方法，其包括下述步骤：

（i）检测或测量患病个体的体液中的细胞游离核小体加合物的水平；和

（ii）使患病个体的体液中检测的细胞游离核小体加合物的水平与个体的疾病结果关联。

根据本发明的进一步方面，提供了用于鉴定核小体加合物生物标志的方法，所述核小体加合物生物标志待用于选择需要治疗的患病动物或人个体的治疗方案，所述方法包括下述步骤：

（ii）使患病个体的体液中检测的细胞游离核小体加合物的水平与那些个体中观察到的治疗方案功效关联。

根据本发明的进一步方面，提供了用于鉴定核小体加合物生物标志的方法，所述核小体加合物生物标志待用于监控患病动物或人个体的治疗，所述方法包括下述步骤：

（ii）在个体的疾病进展过程中的一个或多个场合，重复所述检测或测量；和

（iii）使患病个体的体液中检测的细胞游离核小体加合物的水平与个体中的疾病进展关联。

根据本发明的进一步方面，提供了通过如本文定义的方法鉴定的生物标志。

本发明的进一步方面提供了能够与生物标志特异性结合的配体或结合剂，例如天然存在的或化学合成的化合物。根据本发明的配体或结合剂可以包含能够与生物标志特异性结合的肽、抗体或其片段，或合成配体例如塑料抗体，或适体或寡核苷酸。抗体可以是能够与生物标志特异性结合的单克隆抗体或其片段。根据本发明的配体可以用可检测标记物进行标记，所述可检测标记物例如发光、荧光、酶或放射性标记物；或者或另外地，根据本发明的配体可以用亲和标签进行标记，所述亲和标签例如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或His（例如六His）标签。或者，配体结合可以使用无标记技术例如ForteBio Inc的技术进行测定。

根据本发明的生物传感器可以包括能够与针对生物标志的抗体特异性结合的生物标志或其结构/形状模拟物。还提供的是包含如本文描述的配体或模拟物的阵列。

本发明还提供的是如本文描述的一种或多种配体的用途，或本发明的生物传感器、或本发明的阵列或本发明的试剂盒检测和/或定量生物标志的用途，所述一种或多种配体可以是天然存在的或化学合成的，并且适合地是肽、抗体或其片段，适体或寡核苷酸。在这些用途中，检测和/或定量可以对如本文定义的生物样品进行。

提供用于进行本发明的方法的诊断或监控试剂盒。此类试剂盒适当地包括用于检测和/或定量生物标志的根据本发明的配体，和/或生物传感器，和/或如本文描述的阵列，任选连同试剂盒的使用说明书。

本发明的进一步方面是用于检测疾病状态的存在的试剂盒，其包括能够检测和/或定量如本文定义的一种或多种生物标志的生物传感器。

用于检测疾病存在的生物标志是用于发现新靶和药物分子的必需靶，所述新靶和药物分子延缓或停止病症的进展。因为生物标志的水平指示病症和药物应答，所以生物标志可用于在体外和/或体内测定中鉴定新治疗化合物。本发明的生物标志可以用于筛选化合物的方法中，所述化合物调节生物标志的活性。

因此，在本发明的进一步方面，提供了如所述的结合剂或配体的用途，所述结合剂或配体可以是根据本发明的肽、抗体或其片段或适体或寡核苷酸；或根据本发明的生物传感器、或根据本发明的阵列；或根据本发明的试剂盒的用途，用于鉴定能够促进和/或抑制生物标志生成的物质。

还提供的是鉴定能够促进或抑制个体中的生物标志生成的物质的方法，其包括给受试动物施用测试物质，和检测和/或定量来自个体的测试样品中存在的生物标志水平。

术语“生物标志”意指过程、事件或状况的鉴别性的生物或生物衍生的指示物。生物标志可以用于诊断例如临床筛选和预后评价的方法中，以及用于监控治疗的结果、鉴定最可能响应特定治疗处理的个体、药物筛选和开发。生物标志及其用途对于鉴定新药物治疗和发现药物治疗的新靶是有价值的。

如本文使用的术语“检测”和“诊断”包含疾病状态的鉴定、证实和/或表征。根据本发明的检测、监控和诊断方法可用于证实疾病的存在，通过评价发作和进展来监控疾病的发展，或评价疾病的好转或消退。检测、监控和诊断方法还可用于评价临床筛选、预后、治疗选择、评估临床利益的方法中，即用于药物筛选和药物开发。

通过确定正确诊断，允许快速鉴定最适当的治疗（因此减少不需要的对有害药物副作用的暴露），并且降低复发率，有效诊断和监控方法提供了非常有力的“个体解决方案”，具有改进预后的潜力。

在一个实施方案中，所述生物标志从肿瘤细胞中释放。因此，根据本发明的进一步方面，提供了用于检测肿瘤生长的方法，其包括下述步骤：（i）测量生物样品中的生物标志，其与肿瘤细胞相关或从肿瘤细胞中释放，和（ii）证实所述生物标志的水平与肿瘤大小、分期、侵占性或散布相关。

已知增加的细胞更新、细胞死亡和细胞凋亡导致增加的细胞游离核小体的循环水平（Holdenrieder等人，2001）。循环细胞游离核小体水平是非特异性指标，并且存在于多种状况中，包括炎性疾病、许多种良性和恶性状况、自身免疫疾病、以及在创伤或缺血后（Holdenrieder等人2001）。本领域技术人员将明确的是，本发明将具有在其中循环核小体已在个体中发现的多种疾病领域中的应用。这些包括但不限于创伤（例如，严重损伤或手术）、过度锻炼（例如跑马拉松）、中风和心脏病发作、脓毒症或其他严重感染和子宫内膜异位症。

本发明的免疫测定包括采用酶检测方法（例如ELISA）的免疫测量测定、荧光标记的免疫测量测定、时间分辨的荧光标记的免疫测量测定、化学发光免疫测量测定、免疫比浊测定、微粒标记的免疫测量测定和免疫放射测定和竞争性免疫测定方法，包括标记的抗原和标记的抗体竞争性免疫测定方法，其具有多种标记类型包括放射性、酶、荧光、时间分辨的荧光和微粒标记。所有所述免疫测定方法均是本领域众所周知的，参见例如Salgame等人，1997和van Nieuwenhuijze等人，2003。

在一个实施方案中，所述生物样品包含体液。例如，可以在本发明的方法中测试的生物样品包括脑脊液（CSF）、全血、血液血清、血浆、月经血、子宫内膜流体、尿、唾液或其他体液（粪便、泪液、滑液、痰）、呼气例如凝结的呼气、或由其的提取物或纯化物或其稀释物。生物样品还包括来自活个体的或死后获得的样本。样品可以以通常方式进行制备（例如适当时，稀释或浓缩）且贮存。

在一个实施方案中，本发明的方法在多个场合重复。该实施方案提供了允许经过一段时期监控的检测结果的优点。此类安排将提供监控或评价疾病状态的治疗功效的利益。本发明的此类监控方法可以用于监控发作、进展、稳定、好转、复发和/或缓解。

因此，本发明还提供了就怀疑患有此类疾病的个体中的疾病状态监控治疗功效的方法，其包括检测和/或定量来自所述个体的生物样品中存在的生物标志。在监控方法中，测试样品可以在两个或更多个场合获得。该方法可以进一步包括比较测试样品中存在的一种或多种生物标志的水平，与一种或多种对照和/或例如在治疗开始前，较早得自相同测试个体，和/或在治疗的较早阶段来自相同测试个体的一种或多种先前测试样品。该方法可以包括检测在不同场合获得的测试样品中的一种或多种生物标志的性质或量中的改变。

因此，根据本发明的进一步方面，提供了用于就人或动物个体中的疾病状态监控治疗功效的方法，其包括：

（a）定量如本文定义的生物标志的量；和

（b）比较测试样品中的所述生物标志的量与一种或多种对照和/或在较早时间得自相同测试个体的一种或多种先前测试样品中存在的量。

相对于较早得自相同测试个体的先前测试样品中的水平，测试样品中的生物标志水平中的改变可以指示所述治疗对病症或可疑病症的有利效应，例如稳定或改善。此外，一旦治疗已完成，本发明的方法就可以定期重复，以便监控疾病的复发。

用于监控治疗功效的方法可以用于监控现有治疗和新治疗在人个体和非人动物中（例如动物模型中）的治疗有效性。这些监控方法可以并入新药物质和物质组合的筛选内。

在进一步的实施方案中，由于速效治疗的更快速改变的监控可以以数小时或数天的更短间隔进行。

根据本发明的进一步方面，提供了用于鉴定检测疾病状态的存在的生物标志的方法。如本文使用的术语“鉴定”意指证实生物样品中存在的生物标志的存在。定量样品中存在的生物标志的量可以包括测定样品中存在的生物标志的浓度。鉴定和/或定量可以直接对样品或间接对由其的提取物或其稀释物进行。

在本发明的可替代方面，生物标志的存在通过检测和/或定量能够与生物标志特异性结合的抗体或其片段（其由个体身体响应所述生物标志而生成，并且因此存在于来自具有疾病状态的个体的生物样品中）进行评价。

鉴定和/或定量可以通过适合于鉴定来自个体的生物样品中或者生物样品的纯化物或提取物或者其稀释物中的特定蛋白质的存在和/或量的任何方法进行。在本发明的方法中，定量可以通过测量一种或多种样品中的生物标志的浓度进行。可以在本发明的方法中测试的生物样品包括如上文定义的生物样品。样品可以以通常方式进行制备（例如适当时，稀释或浓缩）且贮存。

生物标志的鉴定和/或定量可以通过检测生物标志或其片段进行，所述片段例如具有C末端截短或具有N末端截短的片段。片段适当地长度大于4个氨基酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。特别指出与组蛋白尾部的序列相同或相关的序列的肽是特别有用的组蛋白片段。

生物标志可以例如通过SELDI或MALDI-TOF直接检测。或者，生物标志可以经由与一种或多种配体的相互作用而直接或间接检测，所述一种或多种配体例如能够特异性结合生物标志的抗体或其生物标志结合片段、或其他肽、或配体例如适体或寡核苷酸。配体或结合剂可以具有可检测标记，例如发光、荧光或放射性标记和/或亲和标签。

例如，检测和/或定量可以通过选自下述的一种或多种方法进行：SELDI（-TOF）、MALDI（-TOF）、基于1-D凝胶的分析、基于2-D凝胶的分析、质谱法（MS）、反相（RP）LC、大小渗透（凝胶过滤）、离子交换、亲和力、HPLC、UPLC及其他基于LC或LC MS的技术。适当的LC MS技术包括ICAT®（Applied Biosystems，CA，USA）或iTRAQ®（Applied Biosystems，CA，USA）。还可以使用液相色谱法（例如高压液相色谱法（HPLC）或低压液相色谱法（LPLC））、薄层色谱法、NMR（核磁共振）光谱法。

根据本发明的诊断或监控方法可以包括通过SELDI TOF或MALDI TOF分析样品，以检测生物标志的存在或水平。这些方法还适合于临床筛选、预后、监控治疗的结果、鉴定最可能响应特定治疗处理的个体，适合于药物筛选和开发、和鉴定药物治疗的新靶。

鉴定和/或定量分析物生物标志可以使用免疫学方法进行，其涉及能够与生物标志特异性结合的抗体或其片段。合适的免疫学方法包括夹心免疫测定例如夹心ELISA，其中分析物生物标志的检测使用两种抗体进行，所述抗体识别分析物生物标志上的不同表位；放射性免疫测定（RIA），直接、间接或竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA），酶免疫测定（EIA），荧光免疫测定（FIA），蛋白质印迹，免疫沉淀和任何基于颗粒的免疫测定（例如使用金、银或乳胶颗粒，磁性颗粒，或量子点(Q-dots)）。免疫学方法可以例如以微量滴定板或条形式进行。

在一个实施方案中，一种或多种生物标志可以替换为在生物途径中的生物标志上游或下游发现的分子、或该分子可测量的片段。

对于疾病特异性的关键生物标志的鉴定对于诊断程序和治疗方案的整合是关键的。使用预测生物标志，可以开发适当的诊断工具例如生物传感器；相应地，在本发明的方法和用途中，鉴定和定量可以使用生物传感器、微分析系统、微工程系统、微分离系统、免疫色谱法系统或其他合适的分析装置进行。生物传感器可以并入免疫学方法用于检测一种或多种生物标志、电、热、磁、光学（例如全息图）或声学技术。使用此类生物传感器，能够检测在生物样品中发现的以预期浓度的一种或多种靶生物标志。

如本文使用的，术语“生物传感器”意指能够检测生物标志的存在的任何事物。生物传感器的实例在本文中描述。

根据本发明的生物传感器可以包括能够与生物标志特异性结合的如本文描述的配体结合剂或配体。此类生物传感器可用于检测和/或定量本发明的生物标志。

本发明的一种或多种生物标志可以使用下述进行检测：并入基于“智能”全息图的技术的生物传感器，或高频声学系统，此类系统特别顺应“条形码”或阵列配置。

在智能全息图传感器（Smart Holograms Ltd，Cambridge，UK）中，全息图像贮存于对与生物标志特异性反应致敏的薄聚合物膜中。在暴露后，生物标志与聚合物反应，导致由全息图展示的图像中的改变。测试结果读出可以是光亮度、图像、颜色和/或图像位置中的改变。对于定量和半定量应用，传感器全息图可以由眼阅读，因此去除检测设备的需要。当需要定量测量时，简单的颜色传感器可以用于阅读信号。样品的不透明度或颜色不干扰传感器的操作。传感器的形式允许用于同时检测几种物质的多路技术。可以设计可逆和不可逆传感器以满足不同需要，并且连续监控特定目的生物标志是可行的。

适当地，用于检测本发明的一种或多种生物标志的生物传感器组合生物分子识别与适当方法，以将样品中的生物标志的存在或定量的检测转换成信号。生物传感器可以适于“备选场地”诊断测试，例如在病室、个体外科室（outsubjects' department）、手术、家庭、野外和工作场所中。

检测本发明的一种或多种生物标志的生物传感器包括声学、等离子共振、全息、生物层干涉测量法（BLI）和微工程传感器。印刷的识别元件、薄膜晶体管技术、磁声波谐振器装置及其他新的声电系统可以用于传感器中，用于检测本发明的一种或多种生物标志。

涉及本发明的一种或多种生物标志的鉴定和/或定量的方法可以在台式仪器上进行，或可以并入一次性使用的诊断或监控平台上，其可以用于非实验室环境中，例如医生的办公室中或在个体的床边。用于进行本发明的方法的合适生物传感器包括具有光或声阅读器的“信用(credit)”卡。生物传感器可以配置为允许收集数据以电子传输给医生用于解释，并且因此可以形成电子医学(e-medicine)的基础。

在本文中描述了用于疾病状态的存在的诊断和监控的诊断试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒另外含有能够鉴定和/或定量生物标志的生物传感器。适当地，根据本发明的试剂盒可以含有选自下述的一种或多种组分：对于生物标志或生物标志的结构/形状模拟物特异性的配体结合剂或配体，一种或多种对照，一种或多种试剂和一种或多种消耗品；任选连同依照本文定义的任何方法的试剂盒的使用说明书。

用于疾病状态的生物标志的鉴定允许整合诊断程序和治疗方案。本发明的生物标志的检测可以用于在其参与临床试验之前筛选个体。生物标志提供指示治疗应答、未能应答、不利的副作用概况、用药顺应程度和足够的血清药物水平的实现的方法。生物标志可以用于提供不利药物应答的警告。生物标志可用于开发个人化治疗，因为应答的评价可以用于细调剂量，使开出的用药数目降到最低，降低获得有效治疗中的延迟且避免不利的药物反应。因此，通过监控本发明的生物标志，个体护理可以精确地量身定制，以匹配由病症和个体的药物基因组概况确定的需要，生物标志因此可以用于滴定最优剂量，预测阳性治疗应答且鉴定处于严重副作用的高风险中的那些个体。

基于生物标志的测试提供‘新’个体的第一线评价，并且提供使用目前测量无法实现的准确且快速诊断的客观测量。

此外，诊断生物标志测试可用于鉴定患有轻度的或无症状疾病，或可能处于发生有症状疾病的高风险中的家庭成员或个体。这允许起始适当治疗，或预防措施，例如管理危险因素。这些方法公认改进结果且可能预防病症的明显发作。

生物标志监控方法、生物传感器和试剂盒作为个体监控工具也是极其重要的，以使得医生能够确定复发是否是由于病症的恶化。如果药理学治疗被评价为不充分的，则治疗可以恢复或增加；如果适当，则可以给予治疗中的改变。因为生物标志对病症的状态敏感，所以它们提供药物治疗影响的指示。

本发明现在将参考下述非限制性实施例进行举例说明。

实施例1

从5个健康个体、3个患有结肠癌的个体、6个患有肺癌的个体和2个患有胰腺癌的个体获得血清样品。在马血清中系列稀释通过由Hela细胞提取的染色质消化产生的商购可得的核小体制剂，其中核小体中的DNA和蛋白质是交联的用于稳定性。根据Holdenrieder的方法（*Holdenrieder等人；2001）制备人血中的核小体制剂。这些样品和制剂通过本发明的方法对于核小体-EZH2加合物一式两份地进行测定。生产用于组织培养的商购可得的纯马血清也作为不含核小体或核小体加合物的阴性对照样品进行测定。

ELISA方法如下使用结合完整核小体的固相抗组蛋白捕获抗体和生物素化的单克隆抗EZH2检测抗体：将在0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.4中的抗组蛋白抗体溶液加入微量滴定孔（100 µL/孔）中，并且在4℃下温育过夜，以用捕获抗体包被孔。倾倒过量的抗组蛋白抗体。将牛血清白蛋白溶液（20g/L）加入孔（200 µL/孔）中，并且在室温下温育30分钟，以封闭孔上的过量蛋白质结合位点。倾倒过量牛血清白蛋白溶液，并且将孔用洗涤缓冲液（200 µL/孔，含有1% Tween 20的0.05M TRIS/HCl缓冲液pH 7.5）洗涤三次。将血清样品（10 µL/孔）和测定缓冲液（50 µL/孔，含有0.9% NaCl、0.05%脱氧胆酸钠和1% Nonidet P40代用品的0.05M TRIS/HCl pH 7.5）加入在4℃下温育过夜的孔中。倾倒血清和测定缓冲液混合物，并且将孔用洗涤缓冲液（200 µL/孔）洗涤三次。加入生物素化的抗EZH2检测抗体溶液（50 µL/孔），并且在室温下伴随轻微搅动温育90分钟。倾倒过量检测抗体，并且再次将孔用洗涤缓冲液（200 µL/孔）洗涤三次。加入含有链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物的溶液（50 µL/孔），并且在室温下伴随轻微搅动温育30分钟。倾倒过量缀合物，并且再次将孔用洗涤缓冲液（200 µL/孔）洗涤三次。加入有色底物溶液（100 µL/孔，2,2'-连氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]二铵盐），并且在室温下伴随轻微搅动温育20分钟。使用标准微量滴定板阅读器，在405nm的波长处测量孔的光密度（OD）。观察到随着核小体-EZH2加合物浓度增加而增加颜色的剂量应答曲线，其中在不存在核小体加合物的情况下（马血清）观察到低本底信号。阳性ELISA信号指示通过ELISA检测到的EZH2掺入包含组蛋白和EZH2的核小体-EZH2加合物内，因为（i）捕获抗体结合样品中的组蛋白，和（ii）检测抗体结合加合物的EZH2组分。结果显示于图1和2中。

实施例2

从5个健康个体、3个患有结肠癌的个体、6个患有肺癌的个体和2个患有胰腺癌的个体获得血清样品。在马血清中系列稀释通过由Hela细胞提取的染色质消化产生的商购可得的核小体制剂。根据Holdenrieder的方法（*Holdenrieder等人；2001）制备人血中的核小体制剂。这些样品和制剂通过本发明的方法对于核小体-HMGB1加合物一式两份地进行测定。纯马血清也作为不含核小体或核小体加合物的阴性对照样品进行测定。

ELISA方法如下使用结合完整核小体的固相抗组蛋白捕获抗体和生物素化的单克隆抗HMGB1检测抗体：将在0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.4中的抗组蛋白抗体溶液加入微量滴定孔（100 µL/孔）中，并且在4℃下温育过夜，以用捕获抗体包被孔。倾倒过量抗组蛋白抗体。将牛血清白蛋白溶液（20g/L）加入孔（200 µL/孔）中，并且在室温下温育30分钟，以封闭孔上的过量的蛋白质结合位点。倾倒过量牛血清白蛋白溶液，并且将孔用洗涤缓冲液（200 µL/孔，含有1% Tween 20的0.05M TRIS/HCl缓冲液pH 7.5）洗涤三次。将血清样品（10 µL/孔）和测定缓冲液（50 µL/孔，含有0.9% NaCl、0.05%脱氧胆酸钠和1% Nonidet P40代用品的0.05M TRIS/HCl pH 7.5）加入在4℃下温育过夜的孔中。倾倒血清和测定缓冲液混合物，并且将孔用洗涤缓冲液（200 µL/孔）洗涤三次。加入生物素化的抗HMGB1检测抗体溶液（50 µL/孔），并且在室温下伴随轻微搅动温育90分钟。倾倒过量检测抗体，并且再次将孔用洗涤缓冲液（200 µL/孔）洗涤三次。加入含有链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物的溶液（50 µL/孔），并且在室温下伴随轻微搅动温育30分钟。倾倒过量缀合物，并且再次将孔用洗涤缓冲液（200 µL/孔）洗涤三次。加入有色底物溶液（100 µL/孔，2,2'-连氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]二铵盐），并且在室温下伴随轻微搅动温育20分钟。使用标准微量滴定板阅读器，在405nm的波长处测量孔的光密度（OD）。观察到随着核小体-HMGB1加合物浓度增加而增加颜色的剂量应答曲线，其中在不存在核小体加合物的情况下（马血清）观察到低本底信号。阳性ELISA信号指示通过ELISA检测到的HMGB1掺入包含组蛋白和HMGB1的核小体-HMGB1加合物中，因为（i）捕获抗体结合样品中的组蛋白，和（ii）检测抗体结合加合物的HMGB1组分。结果显示于图3和4中。

在更大型的实验中，从25位患有结肠癌的患者、25位患有乳腺癌的患者和24位患有肺癌的患者获得血清样品，以及来自31个健康个体的样品。样品就核小体-HMGB1水平进行测试，使用平均健康结果加上平均值中的2个标准差作为截止，对于结肠癌、乳腺癌和肺癌获得下述结果：

• 结肠：检测到76%的癌症（25位患者中的19位）和90%特异性（来自31个健康样品的3个假阳性）；

• 乳腺：检测到96%的癌症（25位患者中的24位）和90%特异性（来自31个健康样品的3个假阳性）；和

• 肺：检测到100%的癌症（24位患者中的24位）和86%特异性（来自28个健康样品的4个假阳性）；

其中测量的高于截止水平的核小体-HMGB1加合物水平视为阳性结果，并且较低水平视为阴性结果。结果显示于图5中。

核小体-HMGB1加合物水平的测定也以反向形式进行，其中将抗HMGB1抗体包被至孔作为捕获抗体，并且使抗核小体抗体生物素化且用作检测抗体。这种测定形式也成功地检测到使用的阳性对照中的核小体-HMGB1加合物（OD405nm=1.15），但在马血清或缓冲液中则没有检测到（两者OD406nm=0.13）。

实施例3

使用上文实施例1的方法进行核小体-PR ELISA测定，除了使用的生物素化的抗体定向结合孕酮受体（PR）之外。结果显示于图6中。

实施例4

使用使用上文实施例1的方法进行的核小体-AR加合物ELISA测定，除了使用的生物素化的抗体定向结合雄激素受体（AR）之外，测定得自两个前列腺癌症患者的血清样品以及阳性和阴性对照。结果显示于图7中。

实施例5

通过上文实施例1的方法，除了使用的生物素化的抗体定向结合α形式的雌激素受体（ERα）之外，使用通过*Holdenrieder等人；2001的方法制备的核小体样品进行核小体-ERα加合物ELISA测定。结果显示于图8中。

实施例6

通过由MCF7细胞提取的染色质消化制备核小体样品，并且通过ELISA测定核小体-ERβ加合物。测定通过类似于上文实施例1的方法的方法进行，除了测定使用不同的抗核小体抗体和定向结合β形式的雌激素受体（ERβ）的抗体进行之外。该测定以两种不同形式进行。在第一形式中，将抗核小体抗体包被到孔上，并且使抗ERβ抗体生物素化。在第二形式中，将抗ERβ抗体包被到孔上，并且使抗核小体抗体生物素化。在两种形式中测定均是成功的。有趣的是，测定看起来在如通常在ChIP法中完成的MCF7染色质交联时表现不那么好。结果显示于图9中。

实施例7

通过上文实施例6的方法，使用通过*Holdenrieder等人；2001的方法制备的核小体样品进行核小体H2AZ-ERβ加合物ELISA测定，其中将抗ERβ抗体包被到孔上，除了使用的生物素化的抗体定向结合组蛋白变体H2AZ，使得仅检测含有H2AZ的核小体-ERβ加合物子集之外。使用该方法，其中核小体或核小体组分结合剂定向结合特定表观遗传信号结构，能够检测仅含有该表观遗传信号的特定核小体加合物子集。结果显示于图10中。

实施例8

从12个健康个体、3个患有结肠癌的个体、6个患有乳腺癌的个体、3个患有肺癌的个体和4个患有胰腺癌的个体获得血清样品。根据Holdenrieder的方法（*Holdenrieder等人；2001）制备人血中的核小体制剂并在马血清中连续稀释。这些样品和制剂通过本发明的方法对核小体-ERβ加合物一式两份地进行测定。生产用于组织培养的商购可得的纯马血清也作为不含核小体或核小体加合物的阴性对照样品进行测定。测定使用上文实施例1的方法进行，除了使用的检测抗体针对雌激素受体（ERβ）之外。使用计算为平均健康结果加上平均值的2个标准差的截止，3个结肠癌样品中的2个、6个乳腺癌样品中的3个、3个肺癌样品中的2个和4个胰腺癌样品中的4个对于核小体-ERβ加合物发现是阳性的。结果显示于图11中。

实施例9

使用上文实施例6的方法进行核小体-雌激素受体-类固醇雌激素ELISA测定，除了使用的检测抗体针对类固醇雌激素之外。该测定因此仅检测另外含有类固醇激素的核小体-雌激素受体加合物。

实施例10

使用类似于上文实施例的方法进行核小体-雌激素受体-雌激素加合物ELISA测定，除了下述之外：测定在对有机溶剂是抗性的微量滴定板或管中进行，在抗核小体抗体在孔表面上捕获核小体-雌激素受体加合物后，倾倒孔的液体内含物，并且加入二乙醚以溶解捕获的加合物中存在的任何类固醇。将醚转移至另一个孔或管并干燥。将干燥提取物再溶解于测定缓冲液中，并且使用用于雌激素分析的经典竞争性免疫测定方法测定雌激素浓度。该测定因此仅检测另外含有雌激素的核小体-雌激素受体加合物。

实施例11

使用上文实施例10的方法进行核小体-视黄酸受体-视黄酸ELISA测定，除了使用的类固醇竞争性免疫测定针对视黄酸之外。该测定因此仅检测另外含有类固醇视黄酸的核小体-视黄酸受体加合物。

实施例12

进行类似于实施例1-10中所述的那些核小体加合物测定，除了使用的固相包被抗体针对5-甲基胞苷之外。这些测定因此仅检测核小体-激素受体加合物和另外与甲基化DNA相关的核小体-激素受体-激素复合加合物。

参考文献

Claims

1.核小体-蛋白质加合物作为血液中的生物标志用于诊断癌症、自身免疫疾病或炎性疾病的用途。

2.如权利要求1中限定的用途，其中所述生物标志用于诊断癌症。

3.如权利要求1或权利要求2中限定的用途，其中所述核小体-蛋白质加合物包括染色质修饰酶、核受体或激素。

4.如权利要求2中限定的用途，其中所述核小体-蛋白质加合物包括高速泳动族蛋白。

5.如权利要求3中限定的用途，其中所述染色质修饰酶是组蛋白乙酰化、去乙酰化、甲基化、去甲基化、磷酸化、去磷酸化、泛素化、去泛素化、苏素化、去苏素化或DNA甲基转移酶酶。

6.如权利要求3中限定的用途，其中所述核受体是雌激素受体、雄激素受体、孕酮受体、甲状腺激素受体、糖皮质激素受体或视黄酸受体。

7.如权利要求3中限定的用途，其中所述激素是甲状腺激素、糖皮质激素或类固醇激素，包括雌激素、雄激素、孕激素、皮质类固醇或视黄酸。

8.用于检测样品中核小体-蛋白质加合物的存在的方法，其包括下述步骤：

（i）使所述样品与第一结合试剂接触，所述第一结合试剂结合核小体或其组分；

（ii）使所述核小体或样品与第二结合试剂接触，所述第二结合试剂结合与核小体加合的蛋白质；

（iii）检测或定量所述第二结合试剂与所述样品中的加合的蛋白质的结合；和

（iv）使用此类结合的存在或程度作为所述样品中核小体加合物的存在的量度。

9.用于检测样品中核小体加合物的存在的方法，其包括下述步骤：

（ii）使所述核小体或样品与第二结合试剂接触，所述第二结合试剂结合核小体或其组分；

（iii）检测或定量所述第二结合试剂与所述样品中的核小体或其组分的结合；和

10.如权利要求8或权利要求9中限定的方法，其中所述核小体加合物包括促炎蛋白、高速泳动族蛋白、多梳蛋白、染色质修饰酶、核受体或激素。

11.如权利要求10中限定的方法，其中所述高速泳动族蛋白是HMGB1。

12.如权利要求10中限定的方法，其中所述染色质修饰酶是EZH2。

13.如权利要求10中限定的方法，其中所述激素受体是雌激素受体、雄激素受体、孕酮受体、甲状腺激素受体或视黄酸受体。

14.如权利要求10中限定的方法，其中所述激素是甲状腺激素、糖皮质激素或类固醇激素，包括雌激素、雄激素、孕激素或视黄酸。

15.如权利要求8-14中任一项中限定的方法，其中所述核小体或核小体组分结合剂定向结合特定表观遗传信号结构，使得仅检测含有所述表观遗传信号结构的核小体加合物的特定子集。

16.如权利要求8-15中任一项中限定的方法，其中所述结合试剂是抗体、抗体片段或适体。

17.如权利要求8-16中任一项中限定的方法，其中所述样品是生物流体。

18.如权利要求8-17中任一项中限定的方法，其中所述样品是血液或血清或血浆。

19.如权利要求8-18中任一项中限定的用于检测细胞中的核小体-蛋白质加合物的存在的方法，其包括下述步骤：

（i）从细胞中分离染色质；

（ii）消化、超声处理或以其他方式分解所述染色质，以形成单核小体和/或寡核小体；和

（iii）如权利要求8-18中任一项的方法中限定的，检测或测量所述核小体加合物的存在。

20.用于检测或诊断动物或人个体中的疾病状态的方法，其包括下述步骤：

（i）如权利要求8或权利要求9的方法的任一种限定的，检测或测量个体的体液中的核小体加合物；和

（ii）使用检测到的所述核小体加合物水平来鉴定所述个体的疾病状态。

21.用于评价动物或人个体对医学治疗的适合性的方法，其包括下述步骤：

（i）如权利要求8或权利要求9的方法的任一种限定的，检测或测量所述个体的体液中的核小体加合物；和

（ii）使用检测到的所述核小体加合物水平作为选择所述个体的合适治疗的参数。

22.用于监控动物或人个体的治疗的方法，其包括下述步骤：

（i）如权利要求8或权利要求9的方法的任一种限定的，检测或测量所述个体的体液中的核小体加合物；

（ii）在一个或多个场合重复所述个体的体液中的核小体加合物的检测或测量；

（iii）使用检测到的所述核小体加合物水平中的任何改变作为所述个体的状况中的任何改变的参数。

23.如权利要求20-22中任一项中限定的方法，其中检测或测量所述核小体加合物作为一组测量之一。

24.如权利要求20-23中任一项中限定的方法，其用于在患有实际或可疑癌症、良性肿瘤、炎性疾病、自身免疫疾病、子宫内膜异位症、传染病、脓毒症、中风或心肌梗塞的个体中。

25.如权利要求8-24中任一项中限定的方法，其用于检测激素-激素受体-核小体复合加合物。

26.如权利要求25中限定的方法，其中所述激素-激素受体-核小体复合加合物包含甲状腺素-甲状腺激素受体-核小体复合加合物、三碘甲状腺原氨酸-甲状腺激素受体-核小体复合加合物、视黄酸-视黄酸受体-核小体复合加合物、雄激素-雄激素受体-核小体复合加合物或雌激素-雌激素受体-核小体复合加合物。

27.如权利要求25或权利要求26中限定的方法，其包括定向结合所述激素的抗体或其他结合剂。

28.如权利要求25或权利要求26中限定的方法，其包括从抗体捕获的激素-激素受体-核小体复合加合物中提取所述激素的步骤，随后为定量步骤。

29.鉴定核小体加合物生物标志用于检测或诊断动物或人个体中的疾病状态的方法，其包括下述步骤：

（ii）检测或测量健康个体或对照个体的体液中的核小体加合物；和

（iii）使用在患病和对照个体中检测到的水平之间的差异，来鉴定核小体加合物是否可用作所述疾病状态的生物标志。

30.生物标志，其由如权利要求29中限定的方法鉴定。

31.用于检测核小体加合物的试剂盒，其包括对于所述加合物或其组成部分中的蛋白质、或所述加合物或其组成部分中的蛋白质的结构/形状模拟物特异性的配体或结合剂，连同依照权利要求3-28中限定的任何一种方法的所述试剂盒的使用说明书。