CN108450000A - 痰液样本中无细胞的核小体作为生物标记的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及无细胞的核小体作为一种在痰液样本中的生物标记在诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病中的用途。本发明还涉及在痰液样本中检测所述无细胞的核小体的方法，特别是诊断方法。

Description

痰液样本中无细胞的核小体作为生物标记的用途
发明领域
本发明涉及无细胞的核小体、特别是无细胞的核小体的表观遗传特征作为疾病的生物标记的用途。本发明还提供一种通过检测和测量痰液样本中核小体和表观遗传改变的核小体的存在检测肺癌和癌前期的方法。特别是所述方法涉及痰液样本中核小体染色质片段的检测和表观遗传分析，和使用这种表观遗传信息以确立它们在健康肺细胞的染色质中或在肺癌细胞的染色质中的细胞来源。
发明背景
肺癌是一种常见疾病，在2012年全世界估计有180万个新病例并有160万例死亡。大多数肺癌病例与吸烟有关。死亡率的变化在很大程度上取决于该疾病是在早期局部阶段被检出，此时有效的治疗选项是可采用的，还是在晚期阶段被检出，此时疾病可能已经在肺内扩散或超出治疗是更加困难的时间。5-年存活率在IA期检测出疾病的人群中可以是高达80%，但检测出晚期阶段疾病的人群中仅约4%。不幸地，目前大多数癌症在晚期阶段被检出。
检测肺癌的安全、非侵入性方法将能够检测早期癌症，导致早期治疗并拯救生命多年。早期癌症检测还将通过减少对昂贵的晚期癌症药物疗法和住院治疗的需要，为卫生保健提供者节省费用和资源。理想地，肺癌试验还将识别潜在恶性或癌前期的肺结节，其如果不加治疗会发展成癌症，但如果被识别则可以被切除或监控。
肺癌检测的当前方法包括胸部X-光和CT扫描，但这些方法的临床准确性差且使患者遭受潜在危险剂量的X-光。研究已经证实，用低剂量CT扫描的筛选在高危人群中检出潜在癌性结节，并降低死亡率。然而，低剂量CT扫描也具有缺点，包括其主观解释、对肺癌的低的临床特异性(导致高的假阳性率)和因重复使用X-光(即使以较低的剂量)引起的潜在安全问题。X-光和CT扫描方法的低的临床特异性意味着它们在许多受试者的肺中检测出未知病因的结节，其在性质上不能被鉴定为恶性的或非-恶性的，并且这已导致对肿瘤学家的另一个诊断挑战。因此对恶性与非-恶性肺结节的鉴别诊断的非-侵入性试验存在临床需求。
正在研究的其它肺癌试验方法包括DNA序列突变试验和特定基因序列甲基化试验。DNA异常是所有癌症疾病的特征。癌细胞的DNA在许多方面不同于健康细胞的DNA，包括，但不限于，点突变、易位、基因拷贝数、微卫星异常、DNA链的完整性和核苷酸修饰(例如胞嘧啶在5位的甲基化)。为了临床诊断、预后和个性化治疗选择目的，这些肿瘤相关的DNA结构或序列的改变在活组织检查或手术移除的癌细胞或组织中进行常规研究。然而，组织DNA试验对于广泛的测试或筛选目的而言是过于侵入性的。
癌症患者的血液含有循环肿瘤DNA (ctDNA)，其被认为源自垂死的或已死亡的癌细胞。对来自癌症患者的匹配的血液和组织样本的调查显示，存在于患者的肿瘤(但不存在于他/她的健康细胞)中的癌症相关突变也存在于从相同患者采集的血液样本的ctDNA中(Newman et al, 2014)。类似地，在癌细胞中被不同地甲基化(通过胞嘧啶残基的甲基化在表观遗传上改变)的DNA序列，特别是基因启动子序列也可作为循环中的ctDNA的甲基化序列被检出。
对于ctDNA序列突变试验的一个挑战是，任何特定的序列突变将仅仅发生在少数(通常一小部分)癌症中。因此任何依赖于序列突变的检测的癌症检测方法将具有低的临床灵敏性且检测仅仅一小部分癌症，即使它具有完美的分析表现并且总是检出突变(如果存在)。例如，当特定的突变发生在仅仅5%的癌症中时，则任何这样的试验可仅仅具有5%的临床灵敏性，即使方法本身具有100%的分析灵敏性。然而，由于所有癌症的DNA的确含有序列突变；癌症检测的临床灵敏性可通过测试通常在癌症中突变的多个DNA序列而增加。在最近的肺癌研究中，使用深度测序方法，对从肺癌患者采集的血液样本测试来自139种已知的致癌基因的534个频繁突变的基因序列。从患有II、III和IV期癌症的所有患者和50%的患有I期癌症的患者的样本中发现突变(Newman et al, 2014)。对数百个突变的深度测序的成本使得这种技术不适合于常规临床使用，但该方法可形成未来临床试验的基础。
还已研究某些特定ctDNA基因序列的高甲基化，用于肺癌中潜在的生物标记效用。例如，通过扩增从血浆提取的DNA，检测高度甲基化的隔蛋白(Septin)-9基因序列被报道检出44%的肺癌(Powrozek et al, 2014)。特定基因或基因座的DNA甲基化状态通常通过胞嘧啶(但不是5-甲基胞嘧啶(5mc))的选择性亚硫酸氢盐脱氨基为尿嘧啶，导致可通过测序或其它方法检测的一级DNA序列变化来检测(Allen et al, 2004)。
对鉴定患有早期肺癌的个体(特别是在吸烟者中)的准确、安全、非-侵入性、低成本试验有临床需求。不幸地，目前没有这样的试验可利用，并且只有约20%的肺癌被早期检出。
本发明涉及检测痰液样本中无细胞的核小体和无细胞的核小体的表观遗传特征。无细胞的核小体先前在血液中已有报道，其中它们被认为源自死亡的或垂死的细胞。从死亡细胞释放进入循环的机制尚不知道，但被认为涉及通过吞噬作用除去死亡细胞的循环巨噬细胞(Jiang et al, 2003)。健康受试者血液中发现的循环核小体的水平是低的，但升高的水平通常发现于患有各种疾病病症包括肺癌的受试者的血液中(Holdenrieder, 2001)。然而，升高的血液核小体水平是升高水平的细胞死亡的非-特异性标记物，并不能将肺癌与其它癌症或与其它疾病或与损伤或创伤区别开来。没有痰液中核小体的报道。
核小体由于其在基因表达的表观遗传调节中的作用而具有化学结构的广泛多样性。人体包含在体内具有广泛不同的表型和功能的许多不同细胞类型，尽管全部包含相同的基因组。这种表型多样性是由于基因组在不同的细胞类型中的差异表达。差异基因表达的控制尚不完全理解，但基本机制包括通过与基因相关的许多互连表观遗传信号的基因调节，包括非-编码核酸序列以及结构染色质方面，包括染色质包装的控制(例如，作为常染色质或异染色质)，核小体定位和核酸酶可接近位点的控制，DNA的化学修饰，例如胞嘧啶残基的甲基化，和组蛋白复合物的组成和结构的变化，在组蛋白复合物周围，例如通过组蛋白蛋白质的翻译后修饰或通过包括可供选择的组蛋白同工型，包绕DNA。因此细胞的染色质的化学结构，及其成分核小体，经受各种表观遗传改变，其一起形成复杂的基因调节系统。这种调节系统在癌症中被破坏，导致染色体结构中的整个外遗传性改变。改变的染色质特征导致与癌症发生和进展相关的基因误调节。而且，使用表观遗传药物抑制、预防或逆转染色质和核小体的这些表观遗传特征改变在癌症疾病的治疗中是有效的。这样的表观遗传药物包括，例如，组蛋白脱乙酰酶复合物抑制剂(HDACi)、组蛋白甲基转移酶抑制剂(HMTi)和DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)药物。
核小体是染色质结构的基本重复单元并由8个高度保守的核心组蛋白(包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对)的蛋白质复合物组成。大约146个碱基对的DNA包绕在这种复合物的周围。另一种组蛋白，H1或H5，用作接头并参与染色质致密过程。DNA缠绕在结构上通常认为类似“串珠”的连续的核小体周围，并且这形成开放或常染色质的基本结构。在致密结构或异染色质中，这种串被盘绕并超级盘绕成一个闭合和复杂的结构(Herranz和Esteller, 2007)。
细胞染色质中的核小体的结构可通过组蛋白蛋白质的翻译后修饰(PTM)和通过包括变体组蛋白蛋白质而改变。组蛋白蛋白质的PTM最常见发生(但不只)在8个核心组蛋白的尾部，且常见的修饰包括赖氨酸残基的乙酰化、甲基化或泛素化以及精氨酸残基的甲基化和丝氨酸残基的磷酸化。已知组蛋白修饰参与基因表达的表观遗传调节(Herranz和Esteller, 2007)。核小体的结构还可通过包括可供选择的组蛋白同工型或变体而改变，所述同工型或变体是不同的基因或剪接产物并具有不同的氨基酸序列。组蛋白变体可分类为许多家族，后者又被细分为各个类型。大量的组蛋白变体的核苷酸序列是已知的并可例如在国家人类基因组研究所NHGRI组蛋白数据库(http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml)，GenBank (NIH基因序列)数据库、EMBL核苷酸序列数据库和日本DNA数据库(DDBJ)中为公众获得的。
存在于健康和有病的细胞中的组蛋白变体和组蛋白修饰模式已表明在众多的(主要为免疫组织化学)研究中是不同的(Herranz和Esteller, 2007)。临床上用于肺癌检测的免疫组织化学方法的一个缺点是，组织样本收集是侵入性的，涉及手术或活组织检查。
核小体结构还通过其DNA成分的化学修饰，包括DNA甲基化(Herranz和Esteller,2007)改变。在一段时间内本领域已知DNA可在胞嘧啶核苷酸的5位甲基化以形成5-甲基胞嘧啶，且DNA甲基化涉及癌症早在1983年已有报道(Feinberg和Vogelstein, 1983)。在癌细胞中观察到的DNA甲基化模式不同于健康细胞的DNA甲基化模式。重复元件，特别是近着丝粒区周围，被报道在癌症中是低甲基化的(相对于健康细胞)，但特定基因的启动子被报道在癌症中是高度甲基化的。这两种作用的平衡被报道导致癌症中整个DNA的低甲基化，且这个模式是癌细胞的标志(Esteller 2007, Hervouet et al, 2010, Rodriguez-Paredes &Esteller, 2011)。
核小体结构还通过核小体结合于存在于染色质中的任何众多的其它蛋白质以形成核小体加合物而变化。染色质包括大量的具有各种功能与各种类型的非-组蛋白蛋白质，包括转录因子、转录增强因子、转录抑制因子、组蛋白修饰酶、DNA损伤修复蛋白、核激素受体及结合于其成分DNA和/或组蛋白的许多其它蛋白(Yoshida和Shimura, 1972)。染色质结合蛋白质的研究主要通过染色质免疫沉淀(ChIP)方法进行。这些方法是本领域熟知的，但却是复杂、费力和昂贵的。
无细胞的核小体本身可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测且几种方法已有报道(Salgame et al, 1997; Holdenrieder et al, 2001; van Nieuwenhuijze et al,2003)。这些测定通常使用抗-组蛋白抗体(例如抗-H2B、抗-H3或抗-H1、H2A、H2B、H3和H4)作为捕获抗体和抗-DNA或抗-H2A-H2B-DNA复合物抗体作为检测抗体。
发明人先前已报道ELISA测定用于包含特定的表观遗传信号的核小体，包括包含特定的组蛋白修饰、特定的组蛋白变体和特定的DNA修饰的核小体以及特定的核小体加合物(WO 2005/019826、WO 2013/030579、WO 2013/030577、WO 2013/084002)。发明人先前已使用这些测定以显示表观遗传改变的循环无细胞的核小体可在患病患者的血液中检出。
令人惊讶地，发明人现在已经证实从患者获得的痰液样本中检出无细胞的核小体染色质片段，并且已经显示这些核小体的表观遗传性质或结构概况可被用来确定它们的来源。染色质片段已被鉴定为源自健康细胞或源自有病的细胞，包括源自肺癌细胞或源自细胞的混合物。本发明不涉及特定基因的DNA测序，但依赖于痰液核小体水平本身的测量以及痰液中核小体或其它染色质片段的基因组宽表观遗传改变的研究。发明人现在报道用于直接评估痰液样本中核小体和表观遗传改变的无细胞的核小体和核小体加合物的简单的免疫测定方法，以及它们具有健康或癌细胞染色质来源的确定。
发明简述
根据本发明的第一个方面，提供无细胞的核小体作为一种在痰液样本中的生物标记在诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病中的用途。
根据本发明的第二个方面，提供一种在动物或人类受试者中诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 检测或测量受试者的痰液样本中无细胞的核小体的表观遗传特征；和
(iii) 使用包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的测量水平作为受试者中存在所述疾病的指示。
附图简述
图1：在从患有肺癌、慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者和大约年龄-匹配的健康对照受试者获得的痰液样本上进行的核小体相关H3K9Ac ELISA的光密度结果的点状图。
图2：ROC曲线，显示对核小体相关痰液H3K9Ac ELISA将患有肺癌的受试者与大约年龄-匹配的健康对照受试者和与患有慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者区别开来的临床精确性获得的结果。
图3：在从患有肺癌、慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者和大约年龄-匹配的健康对照受试者获得的痰液样本上，执行包括核小体相关H3K9Ac、H4K16Ac和H4K20Me3的本发明的一组试验方法的结果的点状图。试验值使用数学模型从各个测定的OD结果计算；试验值 =1.94[H3K9Ac] - 1.24[H4K16Ac] - 0.55[H4K20Me3]。
图4：ROC曲线，显示对包括核小体相关H3K9Ac、H4K16Ac和H4K20Me3的本发明的一组试验方法将患有肺癌的受试者与大约年龄-匹配的健康对照受试者和与患有慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者区别开来的临床精确性获得的结果。
发明详述
本发明涉及无细胞的核小体、特别是无细胞的核小体的表观遗传特征作为疾病的生物标记的用途。本发明还提供一种通过检测和测量痰液样本中核小体和表观遗传改变的核小体的存在，检测肺癌和癌前期的方法。特别是，该方法涉及痰液样本中核小体染色质片段的检测和表观遗传分析并使用这种表观遗传信息，以确立它们在健康肺细胞的染色质中或在肺癌细胞的染色质中的细胞来源。发明人先前已经报道血液样本中的核小体染色质片段的检测和表观遗传分析(WO 2005/019826、WO 2013/030579、WO 2013/030577、WO 2013/084002)。在从受试者采集的血液样本中，改变的表观遗传染色质片段的存在可被用来指示受试者中存在癌症，但由于所有组织充满血液，对受该癌症影响的特定器官的信息量可能较少。应用痰液样本的特定的优点是样本本身限制改变的表观遗传染色质片段来源于呼吸道。在从受试者采集的痰液样本中改变的表观遗传染色质片段的存在可被用来指示受试者中存在癌症并鉴定该癌症为肺或呼吸道的癌症。
根据本发明的第一个方面，提供无细胞的核小体作为一种在痰液样本中的生物标记在诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病中的用途。
在一个实施方案中，癌症包括癌前期病症和原位癌。发明人已表明，患病患者的痰液样本中核小体(本身)的水平相对于健康受试者的痰液样本的水平有变化且这些核小体包含不同的绝对和相对水平的各种表观遗传结构。痰液作为患者样本的一个优点是在生物标记试验中其使用赋予的器官特异性的程度。
在一个实施方案中，生物标记被用于诊断或检测癌症，例如肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一个实施方案中，无细胞的核小体是单核小体、寡核小体或其它染色体片段。
在一个实施方案中，痰液生物标记包括核小体本身的水平。应该意识到痰液核小体本身的水平可例如使用类似于本领域已知方法的核小体免疫测定方法评价(Salgame et al, 1997; Holdenrieder et al, 2001; van Nieuwenhuijze et al, 2003)。
在一个实施方案中，痰液生物标记包括表观遗传改变的或以另外方式修饰的无细胞的核小体。因此，例如，生物标记是无细胞的核小体的表观遗传特征。
根据本发明的第二个方面，提供一种在动物或人类受试者中诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 检测或测量受试者的痰液样本中无细胞的核小体的表观遗传特征；和
(iii) 使用包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的测量水平作为受试者中存在所述疾病的指示。
在一个实施方案中，表观遗传特征选自：翻译后组蛋白修饰、组蛋白变体或同工型、DNA修饰或加合到核小体的蛋白质。
在一个实施方案中，无细胞的核小体的表观遗传特征包括一个或多个组蛋白翻译后修饰。大量的这样的组蛋白修饰是本领域已知的且这个数目随着新鉴定的修饰增加。例如，但不限于，组蛋白含有在多个位置的各种氨基酸残基，包括在组蛋白H2、H3和H4中的赖氨酸、丝氨酸、精氨酸和苏氨酸残基，以及它们的同工型或序列变体。氨基酸残基可以多个方式修饰，例如但不限于，赖氨酸残基可被乙酰化、泛素化、生物素化或单、二或三-甲基化。任何组蛋白修饰可以是一种用于本发明的合适的表观遗传特征，无论是作为各个修饰的组蛋白部分检测或测量，或无论是作为无细胞的单核小体、寡核小体或其它染色质片段的修饰的组蛋白成分检测或测量，例如：使用色谱、质谱光度测量、生物传感器、染色质免疫沉淀(ChIP)、免疫测定或其它检测方法。在优选的实施方案中，核小体相关的修饰的组蛋白通过2-位点免疫测定(免疫测量)方法，利用一种对核小体表位的抗体或其它选择性结合剂和另一种对感兴趣的特定组蛋白修饰的抗体或其它选择性结合剂来测量。发明人已表明，在患病患者的痰液样本中核小体相关组蛋白翻译后修饰水平的相对水平与健康受试者的痰液样本的水平比较有变化。
在本发明的一个实施方案中，在痰液样本中对一组或一类相关的组蛋白修饰(而非单一的修饰)进行了研究。这个实施方案的典型例子，但不限于，将涉及2-位点免疫测定，该测定使用导向结合于核小体的一种抗体或其它选择性结合剂和导向结合该组提及的组蛋白修饰的一种抗体或其它选择性结合剂。导向结合于一组组蛋白修饰的此类抗体的例子将包括，为了说明的目的而不限于，抗-泛-乙酰化抗体(例如：泛-乙酰基H4抗体)、抗-瓜氨酸化抗体或抗-泛素化抗体。
在一个备选的实施方案中，无细胞的核小体的表观遗传特征包括一个或多个组蛋白变体或同工型。许多组蛋白变体是本领域已知的(例如但不限于：组蛋白H2的变体包括H2A1、H2A2、mH2A1、mH2A2、H2AX和H2AZ)，和这个数目随着新鉴定的同工型增加。组蛋白同工型或变体蛋白质结构还易于翻译后修饰。例如：H2A变体H2AX可在丝氨酸139处经翻译后磷酸化且这部分通常称为γ-H2AX。任何组蛋白变体，包括任何翻译后修饰的变体，可以是用于本发明的合适的表观遗传特征，无论是作为各个组蛋白变体部分检测或测量，例如使用免疫测定、色谱、质谱光度测量、ChIP、生物传感器或检测组蛋白同工型部分的其它方法，或无论是作为结合组蛋白变体的无细胞的单核小体、寡核小体或其它染色质片段的组蛋白成分检测或测量。在优选的实施方案中，核小体相关的组蛋白变体通过2-位点免疫测定，利用一种对核小体表位的抗体或其它选择性结合剂和另一种对感兴趣的特定组蛋白变体或同工型的抗体或其它选择性结合剂测量。发明人已表明，患病患者的痰液样本中核小体相关组蛋白变体水平的相对水平与健康受试者的痰液样本的水平比较有变化。
在一个备选的实施方案中，无细胞的核小体的表观遗传特征包括一个或多个DNA修饰。许多特定的DNA修饰是本领域已知的(例如：胞嘧啶的甲基化、羟基甲基化和羧基甲基化)且这个数目随着新鉴定的修饰增加。任何修饰的核苷酸可以是用于本发明的合适的表观遗传特征，无论是在分离的DNA、核酸、核苷酸或核苷部分中检测或测量，例如使用免疫测定、色谱、质谱光度测量、ChIP、生物传感器或检测修饰的核酸部分的其它方法，或无论是通过结合特定修饰的核苷酸或DNA修饰的无细胞的单核小体、寡核小体或其它染色质片段的任何方法检测或测量。在优选的实施方案中，核小体相关的DNA修饰通过2-位点免疫测定，利用一种对核小体表位的抗体或其它选择性结合剂和另一种对感兴趣的特定DNA修饰的抗体或其它选择性结合剂来测量。发明人已表明，患病患者的痰液样本中核小体相关的5-甲基胞嘧啶水平的相对水平与健康受试者的痰液样本的水平比较有改变。为了清楚起见，本发明的方法不涉及任何特定的DNA序列或基因的甲基化(或其它DNA修饰)状况的评价，而是涉及痰液试验样本中存在的核小体或染色质片段的整个DNA修饰状况。
在一个备选的实施方案中，无细胞的核小体的表观遗传特征包括一个或多个蛋白质-核小体加合物或复合物。已知大量的蛋白质-核小体加合物或复合物出现在染色质中(例如：HMGB、EZH2和细胞核激素受体-核小体加合物)且该数目随着在染色质中有活性的新鉴定的蛋白质而增加。任何蛋白质-核小体加合物可以是用于本发明的合适的表观遗传特征，无论是通过结合特定的蛋白质的无细胞的单核小体加合物、寡核小体加合物或其它染色质片段加合物的任何方法检测或测量，例如2-位点免疫测定，利用一种对核小体表位的抗体或其它选择性结合剂和另一种对包含在加合物中的特定蛋白质的抗体或其它选择性结合剂。发明人已表明，患病患者的痰液样本中的核小体相关核小体加合物水平的相对水平与健康受试者的痰液样本的水平比较有变化。
在一个实施方案中，无细胞的核小体本身和/或无细胞的核小体表观遗传特征的两次或更多次测量作为一组核小体特征进行。
在一个进一步的实施方案中，生物标记包括一组选自以下的生物标记：核小体本身的水平，一个或多个特定的组蛋白修饰或包含特定组蛋白修饰的无细胞的核小体、组蛋白变体或包含特定组蛋白变体的无细胞的核小体、DNA修饰或包含特定的DNA修饰的无细胞的核小体或核小体加合物。由于不同的群体可以不是表观遗传相同的或类似的，对于不同的动物或不同的群体选择的最适组可以不同。因此，用来在人中检测肺癌(例如)所选择的一组这样的生物标记可以与用于另一物种(例如猫或狗)所选择的一组不同。类似地，用来检测男人和女人(或任何其它动物)的肺癌的最适组可以是不同的。类似地，用来在不同的人类亚-群或种族中检测肺癌的最适组可以不同。或者，相同的组可用于不同的群体(例如在男性和女性中)，但不同的权重用于组测定成员。例如：包含测定“A”、“B”和“C”的3个测定组的试验值可在男性中从数学表达计算，例如“试验值 = A + 2B + 3C”，具有截止值“X”，以确定阳性或阴性结果；并在女性中从不同的数学表达计算，例如“试验值 = 3A + 2B +C”，具有不同截止值“Y”。
根据本发明的进一步的方面，提供一种在从动物或人类受试者获得的痰液样本中检测或量化无细胞的核小体的表观遗传特征的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 使痰液样本与结合无细胞的核小体或其成分的第一结合剂接触；
(iii) 使痰液样本或无细胞的核小体与第二结合剂接触，第二结合剂结合所述无细胞的核小体内的表观遗传特征；
(iv) 检测或量化在痰液样本中所述第二结合剂与所述无细胞的核小体内的表观遗传特征的结合；和
(v) 使用这样的结合的存在、程度或量作为包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体在痰液样本中存在的量度。
提及的表观遗传特征可以是特定的翻译后组蛋白修饰、特定的组蛋白变体或同工型、特定的DNA修饰或加合到所述核小体的特定的蛋白质。
根据本发明的进一步的方面，提供一种在从动物或人类受试者获得的痰液样本中检测或量化无细胞的核小体的表观遗传特征的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 使痰液样本与第一结合剂接触，第一结合剂结合所述无细胞的核小体内的表观遗传特征；
(iii) 使痰液样本或无细胞的核小体与结合无细胞的核小体或其成分的第二结合剂接触；
(iv) 检测或量化痰液样本中所述第二结合剂与无细胞的核小体或其成分的结合；和
(v) 使用这样的结合的存在、程度或量作为包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体在痰液样本中存在的量度。
提及的表观遗传特征可以是特定的翻译后组蛋白修饰、特定的组蛋白变体或同工型、特定的DNA修饰或加合到所述核小体的特定的蛋白质。
在本发明的进一步的方面，包含特定表观遗传结构的核小体的测量水平被用来确定存在于痰液样本中的核小体的细胞来源。例如：痰液核小体是否源自健康细胞、肺癌细胞或具有其它损害的细胞的染色质或源自这样的细胞的任何混合物。本领域技术人员将显而易见的是，其肺含有癌细胞的受试者也将含有健康细胞且从这样的受试者获得的痰液样本可含有源自健康细胞以及源自癌细胞的核小体。类似地，具有其它来源的组合的核小体可出现于患有不同的医学病症的受试者中，包括来自健康细胞的核小体以及来自一或多种类型的具有一种或不同损害的病变细胞的核小体。在优选的实施方案中，测定一组痰液核小体表观遗传结构水平，结果被用来确定存在于样本中的核小体的一种或多种细胞来源。
根据本发明的进一步的方面，提供一种在动物或人类受试者中确定痰液无细胞的核小体的细胞来源的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 检测或测量受试者的痰液样本中无细胞的核小体的表观遗传特征；和
(iii) 使用包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的测量水平作为无细胞的核小体是否源自健康肺细胞、肺癌细胞或具有其它损害的细胞或源自这样的细胞的任何混合物的指示物。
在本发明的优选的实施方案中，执行对于两种或更多种表观遗传特征的痰液测定，以产生由多个表观遗传核小体特征组成的表观遗传概况。表观遗传概况可被用来确定存在于样本中的核小体的来源(是否源自健康细胞、肺癌细胞或具有其它损害的细胞的染色质或源自这样的细胞的任何混合物)。表观遗传概况可被用来在从其中采集痰液样本的受试者中确定肺癌或其它损害的存在或其它情况。
根据本发明的进一步的方面，提供一种根据任何上述方法，在从受试者获得的痰液样本中检测具有表观遗传特征的痰液无细胞的核小体的方法，所述特征包括核小体加合物和核小体相关组蛋白修饰、DNA修饰和组蛋白变体，所述方法包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 使痰液样本与第一和第二结合剂接触，其中所述结合剂之一结合于无细胞的核小体或其成分，所述结合剂的另一个结合于所述无细胞的核小体的表观遗传特征；
(iii) 检测或量化痰液样本中所述结合剂的任一个或两个的结合；和
(iv) 使用这样的结合的存在、程度或量作为痰液样本中具有所述表观遗传特征的无细胞的核小体存在的量度。
应该意识到，本文描述的表观遗传特征也可独立于它们包括(或以其它方式)在核小体内而测定。因此，根据本发明的进一步的方面，提供一种在动物或人类受试者中诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 检测或测量痰液样本中的特定的组蛋白变体、组蛋白同工型或包含特定的翻译后修饰的组蛋白或核小体加合物的水平；
(iii) 使用痰液样本中特定的组蛋白变体、同工型或修饰的测量水平作为受试者中存在所述疾病的指示物。
在本发明的一个实施方案中，测定痰液样本中的组蛋白以确定所述样本的组蛋白变体、同工型或组蛋白修饰组成。在一个实施方案中，痰液样本中的组蛋白可例如但不限于，通过样本的酸提取被分离，以供这样一种测定。在另一个实施方案中，提供一种用于组蛋白修饰的免疫测定，该测定使用第一抗-组蛋白结合剂与另一种导向结合在相同组蛋白部分上的组蛋白修饰的结合剂的组合。在另一个实施方案中，提供组蛋白变体或同工型免疫测定，该测定使用导向结合在相同组蛋白部分上的不同表位的两种抗-组蛋白结合剂，其至少一种是对感兴趣的同工型特异性的。
根据本发明的进一步的方面，提供一种在动物或人类受试者中诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 检测或测量痰液样本中的表观遗传修饰的核苷酸的水平；和
(iii) 使用痰液样本中表观遗传修饰的核苷酸的测量水平作为受试者中存在所述疾病的指示物。
在这个方面的优选的实施方案中，在痰液染色质片段中测量的表观遗传修饰的核苷酸是5-甲基胞嘧啶或甲基化DNA。为清楚起见，本发明的这个方面不应与用于基因甲基化测试的方法混淆，后者涉及特定基因或DNA序列的胞嘧啶甲基化状态的研究，例如如由Powrozek et al, 2014所述的。相比之下，本发明涉及5-甲基胞嘧啶总水平的测定，而无论基因序列如何。
在本发明的一个实施方案中，测定痰液样本中的修饰的核苷酸以确定所述样本的修饰的核苷酸组成。在一个实施方案中，痰液样本中的核苷酸和/或DNA可例如但不限于，通过样本的有机溶剂或色谱DNA提取被分离以供这样一种测定。在另一个实施方案中，提供用于修饰的核苷酸的免疫测定。这可以是使用抗-核苷酸结合剂，例如抗-5甲基胞嘧啶结合剂的单一抗体免疫测定，或2-位点免疫测定，例如使用第一抗-单链或双链DNA结合剂与另一种导向结合于修饰的核苷酸的结合剂的组合。
在本发明的优选的实施方案中，提供了使用固定化抗-核小体结合剂与抗-组蛋白修饰或抗-组蛋白变体或抗-DNA修饰或抗-加合蛋白质检测结合剂的组合，用于原位测量核小体结合的表观遗传特征的2-位点免疫测定方法。在本发明的另一个实施方案中，提供使用抗-核小体检测结合剂与固定化抗-组蛋白修饰或抗-组蛋白变体或抗-DNA修饰或抗-加合蛋白质结合剂的组合的2-位点免疫测定。在一个实施方案中，核小体加合物包括高迁移率族蛋白(High Mobility Group Protein)、polycomb蛋白、染色质修饰酶或细胞核激素受体。
在优选的实施方案中，一组多个表观遗传核小体特征被用来检测受试者中肺癌的存在。此外，进一步的试验可被包括在这样一组内，以增加其临床精确性，包括例如用于血红蛋白和/或其它肿瘤标记物(例如：癌胚抗原(CEA)、CA125和CA19.9)和/或特定突变或甲基化基因序列的试验。另外的参数可包括任何相关的临床信息，例如但不限于年龄、性别、体重指数、吸烟状况和饮食习惯。
在本发明的一个实施方案中，痰液样本中核小体的特定结构表观遗传特征的水平，或两个或更多个这样的表观遗传特征的一组水平，被用来在需要这样的治疗的受试者中确定最适药物治疗或其它治疗方案。
根据本发明的进一步的方面，提供一种评价动物或人类受试者对医学治疗的适宜性的方法，其包括以下步骤：
(i) 在从受试者获得的痰液样本中，检测或测量包含表观遗传特征的无细胞的核小体；和
(ii) 使用具有检测的所述特征的无细胞的核小体的测量水平，作为用于为受试者选择合适的治疗的参数。
根据本发明的进一步的方面，提供一种在患有，或疑似患有，或疑似易患癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的动物或人类受试者中监测疗法的功效的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 测量受试者的痰液样本中无细胞的核小体的表观遗传特征；和
(iii) 使用与从所述受试者采集的早期样本比较，包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的测量水平作为所述疗法的功效的指示。
根据本发明的进一步的方面，提供一种确定患有癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的动物或人类受试者的预后的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 测量受试者的痰液样本中无细胞的核小体的表观遗传特征；和
(iii) 使用包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的水平，作为癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的预后的指示。
根据本发明的进一步的方面，提供一种检测或测量具有表观遗传特征的痰液无细胞的核小体的方法(单独或者作为一组测量的一部分)，其目的是检测或诊断疾病状况，或评价动物或人类受试者对医学治疗的适宜性，或监测动物或人类受试者的治疗，用于患有实际或疑似癌症、良性肿瘤、炎性疾病或自身免疫性疾病的受试者。
根据本发明的进一步的方面，提供一种鉴定痰液无细胞的核小体相关的表观遗传生物标记，以供检测或诊断动物或人类受试者的疾病状况的方法，其包括以下步骤：
(i) 检测或测量患病的受试者的痰液样本中具有表观遗传特征的痰液无细胞的核小体；
(ii) 在健康受试者或对照受试者的痰液样本中，检测或测量具有相同表观遗传特征的无细胞的核小体；和
(iii) 使用在患病和对照受试者中检测的测量水平之间的差异，鉴定具有表观遗传特征的核小体是否可用作疾病状况的生物标记，其作为单独的生物标记或与其它生物标记组合。
根据本发明的进一步的方面，提供试剂盒在诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病中的用途，所述试剂盒包含一种或多种能够检测和/或量化痰液无细胞的核小体的表观遗传特征的结合剂。
根据本发明的进一步的方面，提供一组试验以获得关于多个表观遗传核小体特征的痰液核小体的表观遗传概况。这样一个试验组可例如由包含不同核小体表位的核小体的两次或更多次测量组成；包括但不限于不同的加合物和/或组蛋白变体和/或组蛋白修饰和/或DNA修饰和/或核小体本身的测量，或任何这些和任何其它核小体表位的任何组合或比例。本领域技术人员将显而易见的是，任何这些小组还可包括其它(非-表观遗传和/或非核小体的)标记物，包括血红蛋白和任何其它已知的肿瘤标记物。
应该意识到，任何上述方法可作为单独的试验或与已有试验组合使用。
获得的表观遗传核小体概况可被用来确定其中产生核小体的染色质片段的细胞来源。同样地，细胞的来源可包括例如健康细胞、肺癌细胞、炎症细胞、COPD细胞、哮喘症细胞和任何其它胸部受损的细胞。痰液染色质片段可包括源自两种或更多种不同的细胞类型，例如但不限于来自健康细胞以及肺癌细胞的混合物的片段。如果存在于痰液样本中的任何(即使是少数)核小体染色质片段源自病变细胞，例如肺癌细胞，这指示在从其中获得痰液的受试者中存在疾病病症，例如肺癌。
本领域技术人员将显而易见的是，所用的两种抗体或其它结合剂可被导向结合于完整的核小体或结合于核小体的任何成分部分，包括但不限于针对组蛋白、组蛋白变体、组蛋白修饰或任何核苷酸(修饰的或其它)，或核小体的DNA成分的其它部分。这以任何组合应用于固定化和检测抗体(或其它结合剂)二者，用于经典的2-位点免疫测定。因此在本发明的进一步的方面，提供一种检测(仅仅)那些含有结合剂导向的两种特征的核小体的方法。这种设计的优点是痰液核小体表位可被选择为表位，其在痰液核小体中的共同存在与健康细胞或肺癌细胞或其它病变细胞相关。使用对疾病(例如：癌症)来源的许多或大多数或所有核小体共有(但在健康细胞来源的核小体中是缺乏或较罕见)的表位有选择性的这样一种抗体或结合剂作为免疫吸附剂(通常是固相抗体)将选择病变细胞来源的这样的核小体。这为测定提供了肿瘤核小体选择性或富集状况。
在本发明的一个实施方案中，被选择作为抗-核小体结合剂的抗体或其它选择性结合剂对肿瘤来源的核小体的富集是选择性的。在优选的实施方案中，所用的抗体或其它抗-核小体选择性结合剂被导向结合于组蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t。对肿瘤来源的核小体有选择性的结合剂可用于任何测定，包括对核小体本身(肿瘤来源的)、任何特定的组蛋白修饰或包含特定组蛋白修饰的无细胞的核小体、组蛋白变体或包含特定组蛋白变体的无细胞的核小体、DNA修饰或包含特定DNA修饰的无细胞的核小体或核小体加合物的水平的测定。
收集痰液样本的方法已采用多年且是本领域熟知的。用于本研究的痰液收集方法包括要求受试者通过包含NaCl溶液的雾化器呼吸，以诱导痰液形成5分钟，接着经咳嗽进入容器。如果没有痰液产生，则重复这个过程至最多另外3次(即；用雾化器呼吸至多总共20分钟)。测量样本体积并用磷酸盐缓冲盐水稀释样本。稀释的样本经离心以除去细胞材料，通过薄纱过滤并冷冻直至用于测定。
用于收集痰液样本材料的装置是可市售获得的，包括，例如：LungFlute，其是一种通过产生声波和振动在肺的气道中诱导痰液的小型自供电音频设备(Anjuman et al,2013)。本领域技术人员将显而易见的是，任何痰液样本收集方法可用于本发明。类似地，已经稀释、过滤、分离、纯化或以别的方式制备用于分析的任何源自痰液的样本可用于本发明。
用于分离和/或检测或测量组蛋白修饰和/或包含特定的组蛋白修饰的无细胞的核小体和/或组蛋白变体和/或包含特定的组蛋白变体的无细胞的核小体和/或DNA修饰和/或包含特定的DNA修饰的无细胞的核小体和/或核小体加合物和/或核小体本身的水平作为痰液样本中的生物标记的任何方法可用于本发明。检测或测量这些分析物的方法的例子包括色谱、光谱法(特别是质谱)、生物传感器、ChIP和免疫化学方法。一些检测或测量方法可涉及，例如通过方法包括溶剂提取(例如提取核酸)、酸提取(例如提取组蛋白蛋白质)、色谱或亲和力纯化/分离，使用选择性抗体结合剂或其它特异性的分析物结合剂，从痰液样本预先富集或分离这些分析物。
发明人已证实本发明的方法可用于痰液样本，以检测非小细胞肺癌(NSCLC)，包括早期肺癌。本领域技术人员将显而易见的是痰液物质可通过或经过肺癌。呼吸冷凝液、支气管肺泡灌洗液(BAL)和胸腔积液是也通过或经过胸腔的液体，其中胸部癌症和特别是肺癌和癌前期可形成。显然，本发明的方法也可应用于呼吸冷凝液、BAL和胸腔积液。
本领域技术人员将显而易见的是，描述的本发明的方法包括各种实施方案，包括例如由USA的ForteBio Incorporated上市的生物传感器类型测定和无标记测定类型。
本领域技术人员将显而易见的是，涉及本发明的任何方面的术语抗体、结合剂或配体不受限制，但意欲包括任何能够结合特定的分子或实体的结合剂，并且任何合适的结合剂可用于本发明的方法中。也将显而易见的是，术语核小体意欲包括无细胞的单核小体和寡核小体和可在液体介质中分析的任何这样的染色质片段。
本发明的进一步的方面提供能够特异性结合于生物标记的配体或结合剂，例如天然存在的或化学合成的化合物。根据本发明的配体或结合剂可包含肽、抗体或其片段，或合成的配体例如可塑抗体，或适体或寡核苷酸，其能够特异性结合于生物标记。抗体可以是能够特异性结合于生物标记的单克隆抗体或其片段。根据本发明的配体可用可检测的标记物，例如发光、荧光、酶或放射性标记物标记；或者或另外地，根据本发明的配体可用亲和性标签，例如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素或His (例如六-His)标签标记。或者，配体结合可使用无标记技术例如ForteBio Inc的技术测定。
根据本发明的生物传感器可包含能够特异性结合于针对生物标记的抗体的生物标记或其结构/形状模拟物。包含如在此描述的配体或模拟物的阵列也被提供。
本发明还提供一种或多种如在此描述的配体(所述配体可以是天然存在的或化学合成的，且适合是肽、抗体或其片段、适体或寡核苷酸)，或本发明的生物传感器，或本发明的阵列，或本发明的试剂盒检测和/或量化生物标记的用途。在这些用途中，检测和/或量化可在如在此定义的生物样本上执行。
为执行本发明的方法，提供了诊断或监测试剂盒。这样的试剂盒将合适地包含根据本发明的配体(用于检测和/或量化生物标记)，和/或生物传感器，和/或如在此描述的阵列，以及任选试剂盒的使用说明书。
本发明的进一步的方面是用于检测疾病状态的存在的试剂盒，其包含能够检测和/或量化一种或多种如在此定义的生物标记的生物传感器。
用于检测疾病的存在的生物标记是发现新的靶标和药物分子(其延迟或阻止疾病的进展)的重要靶标。由于生物标记的水平是疾病和药物反应的指示，生物标记可用于在体外和/或体内测定中鉴定新的治疗化合物。本发明的生物标记可用于筛选调节生物标记的活性的化合物的方法中。
因此，在本发明的进一步的方面，提供所述结合剂或配体(其可以是根据本发明的肽、抗体或其片段或适体或寡核苷酸)，或根据本发明生物传感器，或根据本发明的阵列，或根据本发明的试剂盒鉴定能够促进和/或抑制生物标记生成的物质的用途。
还提供一种鉴定能够在受试者中促进或抑制生物标记生成的物质的方法，包括给予受试者动物试验物质并检测和/或量化存在于来自受试者的试验样本中的生物标记的水平。
术语“生物标记”意指过程、事件或状况的独特的生物或生物学衍生的指示物。生物标记可用于诊断方法，例如临床筛选，和预后评估，以及监测疗法的结果，鉴定最可能对特定的治疗性治疗有反应的受试者、药物筛选和开发。生物标记及其使用对鉴定新药物治疗和发现药物治疗的新靶标是有价值的。
如在此所用的术语“检测”和“诊断”涵盖鉴定、证实和/或表征疾病状态。根据本发明的检测、监测和诊断方法可用来证实疾病的存在，通过评价发病和进展监测疾病的发展，或评价疾病的缓解或消退。检测、监测和诊断的方法也可用于临床筛选的评估、预后、疗法的选择、治疗益处的评价，即药物筛选和药物开发的方法中。
有效的诊断和监测方法通过建立正确的诊断，提供非常有效的具有改善预后的潜力的“主题方案”，允许快速鉴定最适宜的治疗(因此减少对有害的药物副作用的不必要的暴露)，和减少复发率。
在一个实施方案中，所述生物标记从肿瘤细胞释放。因此，根据本发明的进一步的方面，提供一种检测肿瘤生长的方法，其包括以下步骤：(i) 测量生物样本中与肿瘤细胞相关或从肿瘤细胞释放的生物标记和(ii) 证实所述生物标记的水平与肿瘤的大小、阶段、侵袭性或传播相关。
本发明的免疫测定包括使用一种或多种抗体或其它特异性结合剂的任何方法，所述抗体或结合剂导向结合于核小体或结合于核小体成分或结合于核小体的表观遗传特征。免疫测定包括2-位点免疫测定或免疫分析测定，其可以是较少标记的测定或使用(但不限于)放射性、酶、荧光、时间分辨荧光、化学发光、比浊或微粒检测方法。测定也可以是单-位点免疫测定、试剂限制的免疫测定或竞争性免疫测定方法，包括使用各种标记类型包括放射性、酶、荧光、时间分辨荧光、化学发光、比浊和微粒标记物的标记抗原和标记抗体单抗体免疫测定方法。所有的所述免疫测定方法是本领域熟知的。
在一个实施方案中，本发明的方法重复多次。这个实施方案提供允许监测检测结果一段时间的优点。这样一种安排将提供监测或评价疾病状态的疗法的功效的益处。本发明的这样的监测方法可被用来监测发病、进展、稳定、改善、复发和/或减轻。
因此，本发明还提供一种在疑似患有疾病状态的受试者中监测这样的疾病的疗法的功效的方法，包括检测和/或量化存在于来自所述受试者的生物样本中的生物标记。在监测方法中，试验样本可采集两次或更多次。该方法还可包括将存在于试验样本中的生物标记的水平与一个或多个对照和/或与早先从相同试验受试者，例如在开始治疗之前，和/或从相同试验受试者在治疗的早期阶段采集的一个或多个先前的试验样本进行比较。所述方法可包括检测在不同场合采集的试验样本中的生物标记的性质或量的变化。
因此，根据本发明的进一步的方面，提供一种在人类或动物受试者中监测疾病状态的疗法的功效的方法，包括：
(i) 量化如在此定义的生物标记的量；和
(ii) 比较试验样本中所述生物标记的量与存在于一个或多个对照和/或在早期从相同试验受试者采集的一个或多个先前的试验样本中的量。
试验样本中的生物标记的水平相对于在早期从相同试验受试者采集的早先试验样本的水平的变化可以是所述疗法对疾病或疑似疾病的有益作用，例如稳定或改进的指示。此外，一旦治疗已经完成，本发明的方法可周期性地重复以监测疾病的复发。
监测疗法的功效的方法可被用来监测现有疗法和新疗法在人类受试者和非-人类动物(例如动物模型)中的治疗有效性。这些监测方法可结合到对新药物物质和物质的组合的筛选中。
在一个进一步的实施方案中，由于快速起效疗法的较快变化的监测可以数小时或数天的较短的时间间隔进行。
根据本发明的进一步的方面，提供一种鉴定用于检测疾病状态存在的生物标记的方法。如在此所用的术语“鉴定”意指证实存在于生物样本中的生物标记的存在。量化存在于样本中的生物标记的量可包括测定存在于样本中的生物标记的浓度。鉴定和/或量化可直接在样本上，或间接在从中的提取物上，或在其稀释液中执行。
在本发明的备选方面，生物标记的存在通过检测和/或量化能够特异性结合于生物标记的抗体或其片段评价，所述抗体或其片段由受试者的机体响应于生物标记而生成，因此存在于来自具有疾病状态的受试者的生物样本中。
鉴定和/或量化可通过任何适合于鉴定在来自受试者的生物样本或纯化或提取的生物样本或其稀释液中特定蛋白的存在和/或量的方法执行。在本发明的方法中，量化可通过测量生物标记在一个或多个样本中的浓度执行。可以在本发明的方法中测试的生物样本包括如之前在此定义的那些。样本可被制备，例如当适合时稀释或浓缩，并以通常的方式贮存。
生物标记的鉴定和/或量化可通过检测生物标记或其片段，例如具有C-端截短，或具有N-端截短的片段执行。片段的长度适合大于4个氨基酸，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度。特别注意，具有与组蛋白尾相同或相关的序列的肽是组蛋白蛋白质的特别有用的片段。
生物标记可例如通过SELDI或MALDI-TOF直接检测。或者，生物标记可经由与一个或多个能够特异性地结合生物标记的配体，例如抗体或其生物标记-结合片段，或其它肽，或配体，例如适体，或寡核苷酸相互作用，直接或间接地检测。配体或结合剂可具有可检测的标记物，例如发光、荧光或放射性标记物，和/或亲和性标签。
例如，检测和/或量化可通过一个或多个选自以下的方法执行：SELDI (-TOF)、MALDI (-TOF)、基于1-D凝胶的分析、基于2-D凝胶的分析、质谱(MS)、反相(RP) LC、尺寸渗透(凝胶过滤)、离子交换、亲和、HPLC、UPLC和其它基于LC或LC MS的技术。适宜的LC MS技术包括ICAT® (Applied BioSystems, CA, USA)，或iTRAQ® (Applied BioSystems, CA,USA)。液相色谱(例如高压液相色谱(HPLC)或低压液相色谱(LPLC))、薄层色谱、NMR (核磁共振)光谱也可采用。
根据本发明的诊断或监测的方法可包括经SELDI TOF或MALDI TOF分析样本，以检测生物标记的存在或水平。这些方法也适合于临床筛选，预后，监测疗法的结果，鉴定对特定的治疗性治疗最有可能反应的受试者，供药物筛选和开发，并鉴定用于药物治疗的新靶标。
鉴定和/或量化分析物生物标记可使用涉及能够特异性结合于生物标记的抗体或其片段的免疫学方法执行。合适的免疫学方法包括2-位点免疫测定(免疫分析测定或夹心免疫测定)，例如夹心ELISA，其中分析物生物标记的检测使用识别分析物生物标记上的不同表位的两种抗体进行；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和任何基于颗粒的免疫测定(例如使用金、银或乳胶颗粒、磁颗粒，或Q-dots)。免疫学方法可例如在微量滴定板或条状格式板上执行。
根据本发明的进一步的方面，提供由如在此定义的方法鉴定的生物标记。
在一个实施方案中，一种或多种生物标记可被生物途径中生物标记的上游或下游发现的分子，或分子的可测量的片段替代。
根据本发明的进一步的方面，提供翻译后组蛋白修饰、组蛋白变体或同工型或修饰的核苷酸作为一种在痰液样本中的生物标记在诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病中的用途。
鉴定对疾病特异性的关键生物标记是整合诊断程序和治疗方案的核心。使用预测性生物标记，合适的诊断工具例如生物传感器可被开发；因此，在本发明的方法和应用中，鉴定和量化可使用生物传感器、微分析系统、微工程化系统、微分离系统、免疫色谱系统或其它合适的分析装置执行。生物传感器可结合用于检测生物标记的免疫学方法、电、热、磁、光(例如全息图)或声学技术。使用这样的生物传感器，有可能以生物样本中发现的预期浓度检测靶生物标记。
如本文所用的，术语“生物传感器”意指能够检测生物标记的存在的任何物体。生物传感器的例子在本文描述。
根据本发明的生物传感器可包含配体结合剂或配体，如在此描述的，其能够特异性结合于生物标记。这样的生物传感器可用于检测和/或量化本发明的生物标记。
本发明的生物标记可使用结合基于“智能(smart)”全息图的技术或高频声学系统的生物传感器检测。这样的系统特别适于“条形码”或阵列配置。
在智能全息图传感器(Smart Holograms Ltd, Cambridge, UK)中，全息图像储存在经敏化以与生物标记特异性反应的聚合物薄膜中。在暴露时，生物标记与聚合物反应，导致通过全息图显示的图像改变。试验结果读出可以是光学亮度、图像、图像色彩和/或位置的变化。对于定性和半定量应用，传感器全息图可用肉眼看出，因此排除了对检测设备的需求。当需要定量测量时，单色传感器可被用来读出信号。样本的不透明性或颜色不干扰传感器的操作。传感器的格式允许多路技术用于同时检测几种物质。可逆和不可逆传感器可被设计以满足不同的需求，感兴趣的特定生物标记的连续监测是可行的。
合适地，用于检测本发明的一种或多种生物标记的生物传感器结合生物分子识别与适宜的装置，以将样本中的生物标记的存在或量化的检测转化为信号。生物传感器可适合于"交替场所(alternate site)"诊断测试，例如在病房内、门诊患者部门、手术、家庭、野外和工作场所。
检测本发明的一种或多种生物标记的生物传感器包括声学、等离子体共振、全息、生物层干涉技术(BLI)和微工程化传感器。印迹识别元件、薄膜晶体管技术、磁声谐振器装置和其它新的声电系统可在生物传感器中使用，以供检测本发明的一种或多种生物标记。
涉及本发明的一种或多种生物标记的鉴定和/或量化的方法可在台式(bench-top)仪器上执行，或可结合到可用于非-实验室环境(例如在医生办公室内或在患者床边)的一次性诊断或监测平台上。执行本发明方法的合适的生物传感器包括具有光或声阅读器的“信用”卡。生物传感器可被配置以允许收集的数据以电子方式传送到医生来解释，因此可形成电子医疗的基础。
用于诊断和监测疾病状态存在的诊断试剂盒在此描述。在一个实施方案中，试剂盒还含有能够鉴定和/或量化生物标记的生物传感器。合适地，根据本发明的试剂盒可含有一个或多个选自以下的成分：对生物标记或生物标记的结构/形状模拟物特异性的配体结合剂或配体、一种或多种对照、一种或多种试剂和一种或多种消耗品；任选地与根据本文定义的任何方法的试剂盒的使用说明书一起。
用于疾病状态的生物标记的鉴定允许诊断程序和治疗方案的整合。本发明的生物标记的检测可被用来筛选受试者，然后他们参与临床试验。生物标记提供指示治疗反应、反应失败、不利的副作用特性、用药依从性的程度和足够的血清药物水平的实现的工具。生物标记可被用来提供不利的药物反应的预警。生物标记可用于发展个性化疗法，因为反应的评估可被用来细调剂量，最大限度地减少开具药物的数目，减少达到有效治疗的延迟和避免不利的药物反应。因此通过监测本发明的生物标记，受试者护理可被精确定制以匹配由受试者的疾病和药物基因组学概况确定的需求，生物标记可因此被用来滴定测定最佳剂量，预测阳性治疗反应和鉴定处于严重副作用的高风险的那些受试者。
基于生物标记的试验提供“新”受试者的第一线评估，并提供使用目前的措施不能实现的对准确和快速诊断的客观评价。
此外，诊断生物标记试验可用来鉴定具有轻微或无症状疾病或可能处于发展有症状的疾病的高风险中的家族成员或受试者。这允许启动适宜的疗法，或预防性措施，例如管控危险因素。这些途径被识别以改善后果并可预防疾病的明显发作。
生物标记监测方法、生物传感器和试剂盒作为受试者监测工具也是至关重要的，其能够使医师确定是否复发是由于疾病的恶化所致。如果药理学治疗被评价为不充分的，则疗法可恢复或增加；如果适合，可给出疗法的修改。由于生物标记对疾病状态是敏感的，它们提供药物疗法的影响的指示。
根据本发明的进一步的方面，提供一种在动物或人类受试者中治疗癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包括以下步骤：
(i) 检测或测量受试者的痰液样本中无细胞的核小体的表观遗传特征；
(ii) 使用包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的测量水平作为受试者中存在所述疾病的指示；和
(iii) 给予在步骤(ii)中诊断为患有癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的患者的受试者治疗剂。
根据本发明的进一步的方面，提供一种在有需要的个体中治疗癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包括给予患者治疗剂的步骤，当与来自对照受试者的无细胞的核小体的所述表观遗传特征水平比较时，所述患者被鉴定为在痰液样本中具有不同水平的无细胞的核小体的表观遗传特征。
在一个实施方案中，治疗方法包括治疗癌症，例如肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)。
本发明现在将参考以下非-限制性实施例说明。
实施例1
痰液样本从17例经诊断患有非小细胞肺癌(NSCLC)的初次接受治疗的受试者收集，包括患有T1期疾病的2例受试者，患有T2期疾病的2例受试者，患有T3期疾病的5例受试者，患有T4期疾病的4例受试者和患有不确定Tx期疾病的4例受试者。痰液样本也从10例经诊断患有慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者和12例年龄大致匹配的健康对照受试者收集。为了收集，受试者被要求通过包含NaCl溶液的雾化器呼吸，以诱导痰液形成5分钟，接着咳嗽到容器中。如果没有痰液产生，则重复这样至多另外3次(即在雾化器上呼吸至多总共20分钟)。测量样本体积且样本用磷酸盐缓冲盐水按1+3稀释。离心稀释的样本以除去细胞材料，通过薄纱过滤并冷冻直至用于测定。
使用本发明的ELISA方法，测试稀释的痰液样本用于9种不同的核小体测定，包括核小体本身的浓度，以及以下的核小体相关的表观遗传特征：DNA修饰：5-甲基胞嘧啶；组蛋白变体：γ-H2AX；组蛋白修饰：H3K9Me3、H3K9Ac、H3K27Me3、H4K16Ac、H4K20Me3、H4PanAc(泛-乙酰化H4)。对于各种测定，按一式两份加入10µl稀释的痰液至用抗-核小体抗体预先包被的微量滴定孔中并于4℃孵育过夜。用洗涤缓冲液(200 µL/孔，包含1% Tween 20的0.05M Tris/HCl缓冲液pH 7.5)洗涤各孔3次，和50µl生物素化抗体的溶液(在包含0.9%NaCl、0.05%脱氧胆酸钠和1% Nonidet P40代用品的0.05M Tris/HCl pH 7.5中稀释)，所述抗体被导向结合于感兴趣的表观遗传特征(即分别导向结合于核小体本身，或5-甲基胞嘧啶，或γ-H2AX，或H3K9Me3，或H3K9Ac，或H3K27Me3，或H4K16Ac，或H4K20Me3或H4PanAc)。于室温下，使各孔进一步孵育90分钟，如前再次洗涤，加入辣根过氧化物酶-标记的链霉抗生物素溶液并孵育另外30分钟。再次洗涤孔，加入发色底物溶液(100 µL/孔，2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐)并于室温下孵育20分钟。在405nm波长处，使用标准微量滴定板读出仪测量孔的光密度(OD)。观察到颜色随着核小体相关的表观遗传结构浓度的增加而加深的剂量反应曲线，在不包含核小体的阴性对照中观察到低的背景信号。
9种独立的表观遗传核小体测定各自的OD结果被绘制为点状图和作为接收者工作特征(ROC)曲线。所有9种测定的曲线下面积(AUC)结果示于表1中。
表1
本发明的单一ELISA方法对患有肺癌的受试者与健康受试者的区别，和对患有肺癌的受试者与患有慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者的区别。结果表示为通过接收者工作特征(ROC)分析计算的曲线下面积(AUC)百分比。
表1显示，在NSCLC中测试的一些表观遗传特征比其它的有更多的改变。最大变化(最高AUC图形)是H3K9Ac、H4K16Ac、核小体水平本身和5-甲基胞嘧啶。这些测定总体上也是癌症患者比COPD患者有最大不同的测定。对于痰液H3K9Ac的各个测定的点状图和ROC曲线分别在图1和2中显示。使用痰液染色体片段的这种单一表观遗传特征检出82%的患有肺癌的受试者，且对于健康受试者没有假阳性结果，并且令人吃惊地检出78%的患有肺癌的受试者，且对于患有COPD的受试者没有假阳性结果。这证实本发明的方法可检测肺癌并使其与其它肺病区分。对于肺癌外科医生，区分恶性和非-恶性肺病的能力是重要的未满足的临床需求。
实施例2
在以上实施例1进行的各种单一表观遗传特征测量的光密度(OD)结果，以各种组合汇集以获得试验小组结果。本发明的多个小组ELISA方法鉴定患有肺癌的受试者与健康受试者和患有慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者的识别力使用简单算法数学模型确定(采用对各个ELISA方法的OD结果的费舍尔线性判别分析计算)。使用各个模型的ROC分析评估结果，对于一些小组方法计算的临床灵敏性(以100%和90%的临床特异性)示于表2中。
表2
对患有肺癌的受试者与健康受试者和对患有癌症的受试者与患有慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者，本发明的一些多个小组ELISA方法的识别力。对于小组的数学模型使用对各个ELISA方法的OD结果的费舍尔线性判别分析计算。结果表示为对于NSCLC对比健康或对于NSCLC对比COPD，以100%或90%特异性观察到的临床灵敏性百分比。
对于几个测定小组组合(包括H3K9Ac和5-甲基胞嘧啶)，获得100%的临床灵敏性值以及100%的特异性，显示完美区分该小组中的癌症患者与健康患者，如在表2中所示的。令人吃惊地，H3K9Ac和H4K20Me3的组合也给出完美的区分。这显示，单独可能是NSCLC的差的鉴别器的表观遗传特征(例如H4K20Me3)当用作包括其它测定的小组的一部分时，还是可用作鉴别器。
令人吃惊地，小组试验结果显示，在几种不同的小组试验的该组中，区分患有NSCLC的受试者与健康受试者，以及完美区分癌症患者与COPD患者的100%临床精确性(100%临床灵敏性与100%临床特异性)(表2)。这证实本发明的精确性和可靠性。对于小组试验(包括H3K9Ac、H4K16Ac和H4K20Me3)获得的点状图和ROC曲线在图3和4中显示。使用这个小组得到癌症患者与健康受试者的完美区分，和对于以90%特异性区分患有NSCLC的受试者与患有COPD的受试者，得到82%的临床灵敏性。这是令人吃惊的，因为肺癌与其它肺病的鉴别诊断在临床上是特别困难的问题。发明人得出结论，这些试验比涉及X-光的癌症检测的扫描方法更安全，且在这个小的受试者组中达到的临床精确性超过对于NSCLC的目前可利用的任何非-侵入性试验的精确性。
实施例3
在使用药物或其它疗法(例如HDACi、HMTi、DNMTi或其它表观遗传药物)的可能的治疗方案之前，从肺癌患者获得痰液样本并使用本发明的方法(例如用于包含特定表观遗传特征的核小体的2-位点免疫测定或一组这样的2-位点免疫测定)，评价肿瘤的表观遗传状况。痰液核小体的表观遗传状况被用来确定何种疗法对于患者可能是有效的或最佳的治疗。
实施例4
在治疗方案(例如使用表观遗传药物，包括HDACi、HMTi、DNMTi)之前从肺癌患者获得痰液样本，并使用本发明的方法(例如用于包含特定表观遗传特征的核小体的2-位点免疫测定或一组这样的2-位点免疫测定)，评价肿瘤的表观遗传状况。从治疗后的患者获得更多的痰液样本，并再评价痰液核小体的表观遗传状况的任何改变以核查或监测患者的药物效果。
实施例5
从肺癌患者获得痰液样本，并使用本发明的方法(例如用于包含特定表观遗传特征的核小体的2-位点免疫测定或一组这样的2-位点免疫测定)，评价肿瘤的表观遗传状况。痰液核小体的表观遗传状况被用来评价患者的预后。
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Claims (19)

1.无细胞的核小体作为一种在痰液样本中的生物标记在诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病中的用途。
2.权利要求1定义的用途，其中所述生物标记是无细胞的核小体的表观遗传特征。
3.权利要求1或权利要求2定义的用途，其中无细胞的核小体是单核小体、寡核小体或其它染色体片段。
4.一种在动物或人类受试者中诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 检测或测量受试者的痰液样本中无细胞的核小体的表观遗传特征；和
(iii) 使用包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的测量水平作为受试者中存在所述疾病的指示。
5. 权利要求1-4的任一项定义的用途或方法，其中表观遗传特征选自：翻译后组蛋白修饰、组蛋白变体或同工型、DNA修饰或加合到核小体的蛋白质，例如选自5-甲基胞嘧啶的DNA修饰，选自γ-H2AX和H2AZ的一个或多个组蛋白变体，或选自H3K9Me3、H3K9Ac、H3K27Me3、H4K16Ac、H4K20Me3、泛素化-H2A和H4PanAc (泛-乙酰化H4)的一个或多个组蛋白修饰。
6.一种在患有，或疑似患有，或疑似易患癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的动物或人类受试者中监测疗法的功效的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 测量受试者的痰液样本中的无细胞的核小体的表观遗传特征；和
(iii) 使用与从所述受试者采集的早期样本比较，包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的测量水平作为所述疗法的功效的指示。
7.一种确定患有癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的动物或人类受试者的预后的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 测量受试者的痰液样本中的无细胞的核小体的表观遗传特征；和
(iii) 使用包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的水平，作为癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的预后的指示。
8.权利要求1-7的任一项定义的用途或方法，其用于诊断或检测癌症，例如肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)。
9.一种在动物或人类受试者中确定痰液无细胞的核小体的细胞来源的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 检测或测量受试者的痰液样本中无细胞的核小体的表观遗传特征；和
(iii) 使用包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的测量水平，作为无细胞的核小体是否源自健康肺细胞、肺癌细胞或具有其它损害的细胞或源自这样的细胞的任何混合物的指示。
10.权利要求1-9的任一项定义的用途或方法，其中所述检测或测量包括免疫测定、免疫化学、质谱分析、色谱、染色质免疫沉淀或生物传感器方法。
11.权利要求1-10的任一项定义的用途或方法，其中无细胞的核小体本身和/或无细胞的核小体表观遗传特征的两次或更多次测量作为一组核小体特征进行。
12.包含一种或多种能够检测和/或量化痰液无细胞的核小体的表观遗传特征的结合剂的试剂盒在诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病中的用途。
13.一种在从动物或人类受试者获得的痰液样本中检测或量化无细胞的核小体的表观遗传特征的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 使痰液样本与结合无细胞的核小体或其成分的第一结合剂接触；
(iii) 使痰液样本或无细胞的核小体与第二结合剂接触，所述第二结合剂结合所述无细胞的核小体内的表观遗传特征；
(iv) 在痰液样本中的所述无细胞的核小体内，检测或量化所述第二结合剂与表观遗传特征的结合；和
(v) 使用这样的结合的存在、程度或量作为痰液样本中包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体存在的量度。
14.一种在从动物或人类受试者获得的痰液样本中检测或量化无细胞的核小体的表观遗传特征的方法，其包括以下步骤：
(i) 从受试者获得痰液样本；
(ii) 使痰液样本与结合所述无细胞的核小体内的表观遗传特征的第一结合剂接触；
(iii) 使痰液样本或无细胞的核小体与结合无细胞的核小体或其成分的第二结合剂接触；
(iv) 检测或量化痰液样本中所述第二结合剂与无细胞的核小体或其成分的结合；和
(v) 使用这样的结合的存在、程度或量作为痰液样本中包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体存在的量度。
15. 权利要求13或权利要求14定义的用途，其中表观遗传特征选自：翻译后组蛋白修饰、组蛋白变体或同工型、DNA修饰或加合到所述核小体的蛋白质，例如选自5-甲基胞嘧啶的DNA修饰，选自γ-H2AX和H2AZ的一个或多个组蛋白变体，或选自H3K9Me3、H3K9Ac、H3K27Me3、H4K16Ac、H4K20Me3、泛素化-H2A和H4PanAc (泛-乙酰化H4)的一个或多个组蛋白修饰。
16.一种在动物或人类受试者中治疗癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包括以下步骤：
(i) 检测或测量受试者的痰液样本中无细胞的核小体的表观遗传特征；
(ii) 使用包含所述表观遗传特征的无细胞的核小体的测量水平作为受试者中存在所述疾病的指示；和
(iii) 给予在步骤(ii)中诊断为患有癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的患者的受试者治疗剂。
17.一种在有需要的个体中治疗癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包括给予患者治疗剂的步骤，所述患者当与来自对照受试者的无细胞的核小体的所述表观遗传特征水平比较时被鉴定为在痰液样本中具有不同水平的无细胞的核小体的表观遗传特征。
18.权利要求16或权利要求17定义的方法，其用于治疗癌症，例如肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)。
19.翻译后组蛋白修饰、组蛋白变体或同工型或修饰的核苷酸作为一种在痰液样本中的生物标记在诊断或检测癌症、腺瘤、自身免疫性疾病或炎性疾病中的用途。
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