CN109791154A - 结肠直肠癌的组合测试 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测和/或筛查患者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括鉴别发现便潜血阳性的患者和进一步测试一种或多种另外的因子。所述方法可以用于评估患者对结肠镜检查的适合性。

Description

结肠直肠癌的组合测试
发明领域
本发明涉及检测和筛查方法，特别是筛查患者的结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的方法。
发明背景
结肠直肠癌（CRC）是一种具有高死亡率的常见疾病。该疾病的生物学理解为涉及从具有不断增加的发育异常的癌前腺瘤（息肉）进展，导致I、II、III期和最终导致IV期CRC。死亡率变化很大，这取决于是否在早期局限阶段检测到疾病、何时可获得有效治疗选择，或在晚期，此时疾病可能在结肠或直肠内或超出结肠或直肠扩散，此时治疗更加困难。对于在I期检测到疾病的那些，5年生存率大于90％，但对于检测到IV期转移性疾病的那些，仅约10％生存率。出于此原因，许多国家都有CRC筛查程序来鉴别患有CRC或癌前腺瘤或息肉的个体。CRC发病率依赖于年龄和性别；男性比女性中更常见，并且老年人中更常见。 CRC在50岁以下的人中少见，因此筛查年龄较大的人更有用。所测试的实际筛查年龄范围在不同国家的筛查程序中有所不同，但通常为大约50-74岁。将来，筛查年龄范围可能会扩展到更年轻的年龄（由于年龄小于50岁的人中发病率不断增加）以及更老的年龄（由于预期寿命不断延长）两者。
CRC筛查程序使得能够与另外的情况相比更早检测到CRC，导致更早的治疗和挽救生命多年。更早的CRC检测还通过减少昂贵的晚期癌药物治疗和住院的需要，为卫生保健提供者节省资金和资源。理想情况下，CRC筛查程序还可以检测癌前结肠直肠息肉或腺瘤，其如果不治疗可能会进展为CRC，但如果检测到，则可在癌发展前除去。这样的患者的预后良好。
通常用于CRC检测和/或筛查的方法都具有主要缺点。美国采用的主要CRC筛查方法是结肠镜检查。结肠镜检查本质上涉及使用穿过降结肠、横结肠和升结肠的窥镜来目视检查结肠，以发现任何癌病变或潜在癌前病变。结肠镜检查的主要优点是其检测准确性（其对CRC的临床灵敏度为大约95％），以及对于癌前腺瘤的非常高的检出率（都具有非常高的临床特异性(大于95％)）。这种准确性使得结肠镜检查成为CRC检测的金标准，特别是因为在检测到低分级病变时可以除去它们。然而，结肠镜检查作为前线CRC检测或筛查方法受到一些限制。结肠镜检查是一种需要手术许可的高度侵入性程序，该程序通常在麻醉下进行，需要患者提前准备肠道，在某些情况下会导致患者受损伤（例如肠道撕裂）并且价格昂贵（超过$1000）。在大约0.5％的筛查结肠镜检查中检测到CRC，因此筛查的绝大多数人接受手术程序而仅获得很少的益处。由于这些缺点，患者对结肠镜检查的依从性低，并且许多筛查年龄的人不进行该程序。由于这些原因，在世界上大多数国家，结肠镜检查不被用作前线CRC检测或筛查方法。
一些卫生保健提供者采用称为乙状结肠镜检查的相关方法，其中使用更短的窥镜来仅仅检查降结肠。虽然这种方法错过了三分之二的结肠，但它确实检查了最常观察到癌的区域。乙状结肠镜检查的缺点与结肠镜检查的缺点相似，并且出于相似的原因，它通常不被用作前线检查。还使用虚拟结肠镜检查或计算机X线断层摄影术（CT）结肠成像。该程序采用X射线和计算机技术的组合来创建直肠和结肠的图像以检测结肠直肠肿瘤和息肉。
已经调查了包括癌胚抗原（CEA）的经典生物标志物作为CRC的可能的基于血液的生物标志物，但是它们的临床准确性对于常规使用来说太低并且它们更好地用于患者监测。最近以来，已经调查了特定基因序列的过度甲基化用作血液中癌的诊断生物标志物。例如，报道了通过PCR扩增从血浆中提取的DNA来检测Septin 9基因的过度甲基化的方法，其检测到72％的结肠癌，假阳性率为10％（Grutzmann等，2008）。特定基因或基因座的DNA甲基化状态通常通过以下来检测：胞嘧啶（而不是5-甲基胞嘧啶）选择性亚硫酸氢盐脱氨基为尿嘧啶，导致可通过测序或其它手段检测的一级DNA序列改变（Allen等，2004）。
最常用的CRC检测和筛查方法涉及两阶段程序，其中首先用非侵入性前线粪便测试来对筛查年龄的群体进行筛查，以鉴别具有较高CRC风险的筛查群体的亚组。在粪便测试中测试为阳性的人被转诊进行后续结肠镜检查。粪便筛查的结果对大多数人来说是阴性的，因此该两阶段方法防止了对大多数没有病变的人进行不必要的结肠镜检查。粪便筛查的结果对于约5％的人是阳性的，并且该组被认为具有较高的CRC风险。在这个风险较高的组中，大约5％的人通常会被发现患有CRC。因此，目前的粪便测试具有较差的临床准确性，并且需要可负担的、更准确的粪便CRC测试。
目前CRC的粪便测试的基本原理是检测结肠或直肠的出血。简单来说，当结肠或直肠被侵入的癌生长或癌前生长部分阻塞时，大便通过阻塞物的移动可能导致损伤和出血。通过测试粪便样品中血红蛋白的存在来检测这种出血。由于出血程度可能每天变化很大，因此可能需要在分开的日子进行几次测试。
所有目前的粪便CRC测试都是设计用于检测粪便血红蛋白。愈创木脂便潜血测试（FOBT或gFOBT）是血红蛋白的化学测试方法，其中患者或操作者通常将少量粪便涂抹在α-愈创木脂酸涂布的纸或其它基质上。如果粪便中存在血液，则在由血红素（血红蛋白的一种组分）催化的反应中，通过将α-愈创木脂酸氧化成蓝色的醌，在纸上添加过氧化氢会产生快速的颜色改变。食用肉类（以及因此血红素）以及一些蔬菜（其含有在测试中与血红素表现相似的其它催化剂分子）可导致假阳性结果。相似地，一些物质，包括维生素C，可导致假阴性结果，因此在测试前通常建议饮食限制。愈创木脂FOBT测试取决于所使用的截止值可以具有高临床特异性，并且对于CRC的检测具有60-70％的灵敏度。癌前息肉或腺瘤的检测差。化学FOBT方法在过去是选择的方法，并且尽管仍然广泛使用，但是正在被粪便免疫化学测试方法取代。
粪便免疫化学测试或FIT方法（也称为iFOBT或FOBTi）本质上是粪便样品中人血红蛋白的免疫测定测试。FIT方法较不易受到由于饮食因素的干扰导致的假阳性和阴性结果的影响，并且可以检测到粪便中的较少量血液。这些测试与gFOBT具有相似的特异性，但检测临床上略微更相关的癌病变。息肉或腺瘤的检测差。
使用FIT血红蛋白测试在许多国家建立了用于筛查年龄的人的完整群体CRC筛查程序，并导致CRC引起的死亡率降低。然而，由于在筛查时发现粪便血红蛋白阳性的人中只有约5％实际上在结肠镜检查中发现了CRC，所以进行的大多数结肠镜检查事后看来都是不必要的。进行这些不必要的结肠镜检查对患者和卫生保健提供者有一些不利后果，包括：（i）对健康人进行大量不必要的侵入性医学结肠镜检查程序，（ii）对昂贵且不必要的结肠镜检查的大量卫生保健花费，（iii）由于历史上对结肠镜检查基础设施的投资不足，卫生保健提供者的结肠镜检查能力（特别是在欧洲CRC筛查程序中）目前不足以满足医疗需求或需要，导致未进行的结肠镜检查积压增加，以及对FIT阳性的人的结肠镜检查等待时间增加，以及（iv）这种增加的等待时间导致了对于那些确实患有CRC的患者潜在致命的CRC治疗开始延迟。
CRC筛查程序正在努力解决这个问题。常见的解决方案是提高所用FIT测试的阳性/阴影截止阈值，例如，从每克粪便20μg血红蛋白（20μgHb/g粪便）提高至40μg/g（或如果收集在缓冲液中稀释的粪便，则为液体等价浓度），或者对于Eiken OC-传感器FIT测试，例如从100ng/ml的粪便血红蛋白提高到200ng/ml。这将导致更少的人被送去进行结肠镜检查，但也会导致确实检测到CRC的那些人的数量减少，并且因此导致CRC死亡率增加。在目前截止阈值（通常为20μg/g粪便），FIT测试对约70％的CRC病例为阳性，并且提高阈值将进一步减少该数字（例如，至CRC病例的60％或65％），这意味着所有CRC病例中的超过三分之一将保持不被检测到。
因此，本领域需要减少被转诊进行不必要的结肠镜检查的人数，同时保持检测到那些确实患有CRC的人的方法。反直觉地，做到这一点的最佳方法可能不是改进CRC的检测，而是设计测试系统来鉴别一个亚群的人，尽管他们对粪便血红蛋白测试为阳性，但不患有CRC，并且因此不需要被转诊进行结肠镜检查。此外，鉴别没有疾病的人的方法也可以反直觉地增加FIT方法的灵敏度，以通过以下检测更多患有CRC的人：（i）提高后续结肠镜检查的检出率和（ii）允许使用更优化和动态的FIT截止水平来增加具有更高疾病发生率的患者组中的检出。我们现在报道具有高CRC阴性预测值的方法以鉴别这样的人。本发明的方法可以用于将对于粪便血红蛋白测试为阳性的人分成极低CRC风险组（其不需要结肠镜检查）和高CRC风险组（其需要结肠镜检查或进一步调查），从而减少结肠镜检查转诊，同时继续检测出所有或大多数真正的CRC病例。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了检测和/或筛查患者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
（a）鉴别发现便潜血阳性的患者；和
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的一种或多种部分的水平，其中所述部分选自无细胞核小体、无细胞核小体的外遗传特征、癌胚抗原、铁代谢生物标志物或低氧诱导因子，
其中步骤（b）中获得的结果表明患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的可能性。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于评估患者对结肠镜检查的适合性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的一种或多种部分的水平，其中所述部分选自无细胞核小体、无细胞核小体的外遗传特征、癌胚抗原、铁代谢生物标志物或低氧诱导因子;和
（c）使用（b）中获得的结果作为患者对结肠镜检查的适合性的指示物。
附图说明
图1. 1907个FIT阳性受试者的接受者操作曲线（ROC），其显示一个组的CRC检测的灵敏度和特异性，所述组包括数字FIT结果，以及含有5-甲基胞嘧啶、H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3和核小体-HMGB1加合物的外遗传特征的核小体ELISA测定结果和受试者的年龄。
发明详述
本发明是对具有阳性粪便血红蛋白测试结果的人进行的FIT组合测试，其可用于改进涉及这样的粪便测试的CRC筛查的灵敏度和特异性，同时使结肠镜检查资源的最佳使用最大化，改进筛查程序的健康经济方面，并使经历不必要的结肠镜检查程序的人数最小化。该方法可以涉及以下参数中的任何两个或更多个的组合：
i.测量的粪便血红蛋白水平的数值（FIT水平）：较高的FIT水平与较高的CRC概率相关；
ii.循环核小体的外遗传特征：癌是遗传和外遗传错误调节的疾病，并且已经将循环血清或血浆核小体和/或它们的相关DNA中的这样的错误调节的检测用于癌检测。我们在此显示，健康循环血清/血浆外遗传核小体概况(profile)的建立可以与其它因子组合使用以排除癌;
iii.循环铁代谢生物标志物：在FIT测试中，无论其它因子如何，高于某一阈值截止值的血红蛋白水平被认为是阳性结果。然而，大便中血红蛋白的存在可能是假阳性。癌通常可能与贫血相关，并且此外，真阳性粪便血红蛋白结果可能与延长的时间段内的胃肠道出血（GI出血）相关，并且与患者的铁代谢干扰相关。可以通过测量血液/血清/血浆中的一些铁代谢生物标志物来检测这种干扰，所述生物标志物包括患者的血细胞比容、红细胞压积、血红蛋白水平、铁蛋白水平、转铁蛋白水平、可溶性转铁蛋白受体（sTfR）水平、铁调素（hepcidin）水平、血幼素（hemojuvelin，HJV）水平和/或骨形态发生蛋白6（BMP6）水平。铁代谢标志物在男性和女性中具有不同的正常水平，因此患者的性别可用于结果的解释。我们在此显示铁蛋白可以为此目的单独和组合用作血清生物标志物。可以使用铁代谢破坏的其它标志物，因为铁蛋白是急性期蛋白，其可能由于炎症而升高。这样的标志物包括与炎症无关的血细胞比容和血红蛋白水平。转铁蛋白也与炎症无关，并且与血细胞比容或血红蛋白水平相比，对铁代谢的较小破坏更敏感。STfR也可准确地代表铁平衡的少量损失，并且因此可用作铁平衡健康/状态的预测物。慢性低水平铁代谢破坏导致可检测的可溶性HJV水平升高。铁调素是系统铁稳态的调节剂，其直接响应铁水平的波动，并且因此也可用作标志物。如果铁水平下降，肝细胞停止铁调素产生，引发饮食铁吸收的上调和铁的系统动员/再循环/保存。铁调素依赖性上调可以在慢性低体积Gl出血中长期维持中性铁平衡。BMP6水平也与铁水平的波动直接相关。BMP6是在铁调素活化的主要途径中有活性的细胞因子。
iv.低氧诱导因子（HIF）：低氧诱导因子（HIF），包括HIF-1以及其亚基HIF-1a、HIF-1b，HIF-2以及其亚基HIF-2a和HIF-1b以及HIF-3，是在低氧条件下诱导的转录因子。它们通过改变基因表达促进广泛的细胞内和细胞外改变，使细胞能够在由于系统性贫血（其中身体的所有细胞都经历低氧并导致HIF升高）和限于肿瘤微环境的低氧（其导致HIF合成的局部升高）之一或两者导致的低氧环境中适应并存活。
v.循环癌胚抗原（CEA）或CRC的其它已知标志物的水平：增加的CEA水平与CRC疾病的更高概率并与更晚期疾病相关。
vi.患者的其它患者参数，特别是性别和年龄，或出生日期：患者参数如年龄、性别、吸烟史、体重或体重指数（BMI）也与CRC疾病的概率相关。我们在此显示了组合的年龄和数字FIT水平相对于使用单独的FIT，提高了组合测试的准确性。
因此，根据本发明的第一方面，提供了检测和/或筛查患者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
（a）鉴别发现便潜血阳性的患者；和
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的一种或多种部分的水平，其中所述部分选自无细胞核小体、无细胞核小体的外遗传特征、癌胚抗原、铁代谢生物标志物或低氧诱导因子，
其中步骤（b）中获得的结果表明患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的可能性。
在一个实施方案中，如果步骤（b）中获得的结果对于患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉为阳性，则患者被鉴别为具有患CRC、结肠直肠腺瘤或息肉的高可能性。在一个替代实施方案中，如果步骤（b）中获得的结果对于患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉为阴性，则患者被鉴别为具有患CRC、结肠直肠腺瘤或息肉的低可能性。
可以理解，当确定便潜血以高于用于测试的（单一）阈值截止水平的水平存在于粪便样品中时，认为患者在步骤（a）中已经被测试为“阳性”。
步骤（b）中获得的结果可以与数字便潜血结果和/或其它因子组合使用。在一个优选的实施方案中，使用选自上文列出的6组因子之一的因子。在一个高度优选的实施方案中，其它因子是患者年龄和/或性别和/或铁代谢生物标志物。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了检测和/或筛查患者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
（a）鉴别发现便潜血阳性的患者；和
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的核小体自身的水平和/或无细胞核小体的外遗传特征的水平，
其中步骤（b）中获得的结果表明患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的可能性。
可以理解，贯穿本文件中的术语无细胞核小体意欲包括任何包含一个或多个核小体的无细胞染色质片段。步骤（b）中提及的无细胞核小体的外遗传特征可以包括但不限于一种或多种组蛋白翻译后修饰、组蛋白同种型、修饰的核苷酸和/或与核小体-蛋白加合物中的核小体结合的蛋白。
目前的便潜血测试，例如FIT测试，并不足以单独地足够准确地成功诊断患有结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的患者。因此，必须通过侵入性结肠镜检查确认诊断。然而，本发明人已经发现，将数字便潜血测试结果与其它患者参数和/或铁蛋白测定和/或无细胞核小体测定相组合，提供了用于鉴别没有结肠直肠癌或结肠直肠腺瘤或息肉的患者亚群的测试。
在阳性便潜血测试后转诊进行结肠镜检查的患者中，通常这些患者中只有约5％发现患有结肠直肠癌（CRC）。本发明人已经发现将便潜血测试结果与血液/血清/血浆测试和/或与患者的临床数据相组合（其组合起来具有高的阴性预测值），提供了组合测试，其使得怀疑患有CRC的患者总数减少了约20％至50％或甚至更多。这减少了转诊进行结肠镜检查的健康患者的数量（例如，减少了50％），这不仅防止患者经受不必要的侵入性程序，还通过减少结肠镜检查转诊的数量降低了卫生保健成本。
在便潜血测试中测试为阳性的测试群体中，本发明的理想测试将允许鉴别患者的亚组，他们都不患有CRC。如图1中的接受者操作曲线（ROC）所示，本发明人已经实现了这一点，所述图1中的ROC通过使用本发明的方法测试1907个在便潜血测试中测试为阳性的人而产生。该ROC曲线显示，在25％的特异性，组测试的灵敏度为100％。这意味着这25％的受试者不需要结肠镜检查，并且不对这些受试者进行进一步调查将不会导致任何遗漏的CRC病例。因此，这25％的受试者代表1907个受试者的FIT阳性组中的极低CRC风险亚组。此外，特异性可以增加到33％，同时保持97.4％的灵敏度。因此，使用涉及FIT水平、年龄和5种循环血清核小体类型(包括5-甲基胞嘧啶、H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3和核小体-HMGB1加合物)的水平的组合的本发明的该实施方案，结肠镜检查的转诊可以减少四分之一而没有遗漏任何CRC病例，或减少三分之一，同时遗漏了2.6％的CRC病例。相比之下，通过提高FIT / FOBT测试阈值截止水平，最多遗漏10％的CRC病例。
此外，目前结肠镜检查的能力不足以满足便潜血测试为阳性的患者的筛查程序需求。因此，减少转诊对卫生保健提供者来说将具有很大的操作益处，同时还确保最有可能患有CRC的那些人通过减少等待时间来更快地接受结肠镜检查治疗。
因此，根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于评估患者对结肠镜检查的适合性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的一种或多种部分的水平，其中所述部分选自无细胞核小体、无细胞核小体的外遗传特征、癌胚抗原、铁代谢生物标志物或低氧诱导因子;和
（c）使用（b）中获得的结果作为患者对结肠镜检查的适合性的指示物。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于将发现粪便样品中的便潜血为阳性的受试者划分为具有CRC或息肉的极低风险/可能性，或CRC或息肉的高风险/可能性，并且因此评估患者对结肠镜检查的适合性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的核小体自身的水平和/或无细胞核小体的外遗传特征的水平;和
（c）使用步骤（b）中产生的无细胞核小体结果作为患者对结肠镜检查的适合性的指示物。
可以理解，当患者被鉴别为便潜血阳性时，进行步骤（b）。此外，当在步骤（c）中确立患者对结肠镜检查的适合性时，步骤（b）中产生的结果可以与数字FIT水平或其它一种或多种因子组合使用。
在一个实施方案中，步骤（b）中获得的结果与数字便潜血结果，例如步骤（a）中获得的数字便潜血结果组合使用。在一个进一步的实施方案中，数字便潜血结果的截止水平为至少10μg Hb/g，例如至少20、30、40或50 μg Hb/g，特别是至少约20μg Hb/g。
在本发明的这个方面，例如，如果步骤（b）中产生的结果是阳性的，那么患者适合于结肠镜检查。这是因为在便潜血测试和高阴性预测值测试（例如无细胞核小体组合测试）中获得的结果均为阳性。然而，如果步骤（b）中产生的结果是阴性，那么患者不适合进行结肠镜检查，因为高阴性预测值测试（例如无细胞核小体组合测试）不能与便潜血测试的结果相符合。
因此，根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于将发现粪便样品中的便潜血为阳性的受试者划分为具有CRC或息肉的极低风险/可能性，或CRC或息肉的高风险/可能性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的核小体自身的水平和/或无细胞核小体的外遗传特征的水平;和
（c）使用任选与FIT水平和其它一种或多种因子组合的、（b）中产生的无细胞核小体结果作为患者患有CRC和/或息肉的相对风险的指示物。
可以明白，所有这些方法的目的都是鉴别需要或不需要进一步调查CRC和/或结直肠息肉（例如通过结肠镜检查或乙状结肠镜检查）的受试者亚组:（i）通过鉴别具有CRC和/或结肠直肠腺瘤和/或结直肠息肉的极低风险且无需进一步调查的个体；和/或（ii）通过鉴别具有CRC和/或结肠息肉的较高风险并且确实需要进一步调查的个体。
可以理解，当确定粪便样品中存在便潜血时，患者被认为已经在便潜血测试中被测试为“阳性”。
本文所述的核小体测定使用核小体自身和/或含有特定外遗传结构的核小体的存在或水平作为所述受试者患有癌的可能性的指示物。因此，当核小体自身的水平和/或无细胞核小体的外遗传特征的存在或水平不同于一种或多种“癌”（“真正的CRC”）对照样品，即患者对于存在粪便血红蛋白为阳性但对于结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉为阴性时，患者被认为已经对于步骤（c）中的结肠镜检查的适合性测试为“阴性”，并且不是结肠镜检查的适合的候选人。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了检测和/或筛查患者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
（a）鉴别发现便潜血阳性的患者；和
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的铁代谢生物标志物的水平；和
（c）使用任选与FIT水平和/或其它一种或多种因子组合的、步骤（b）中获得的铁代谢生物标志物结果作为患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的可能性的指示物。
在一个实施方案中，铁代谢生物标志物选自：铁蛋白、血细胞比容、血红蛋白、转铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体（sTfR）、铁调素、血幼素（HJV）和骨形态发生蛋白6（BMP6）。在一个实施方案中，铁代谢生物标志物是铁蛋白。在一个实施方案中，红细胞压积也可以用作铁代谢生物标志物。
在一个实施方案中，如果步骤（c）中获得的结果对于患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉为阳性，则患者被鉴别为具有患CRC、结肠直肠腺瘤或息肉的高可能性。在一个替代实施方案中，如果步骤（c）中获得的结果对于患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉为阴性，则患者被鉴别为具有患CRC、结肠直肠腺瘤或息肉的低可能性。
可以理解，当确定便潜血以高于用于测试的阈值截止水平的水平存在于粪便样品中时，认为患者在步骤（a）中已经被测试为“阳性”。
在便潜血测试中已经测试为阳性的群体中，本发明的测定将允许鉴别CRC风险低的患者亚组。这样的测定与其它因子组合，将促成本发明的组合测试。我们测定了599个筛查年龄的受试者，所述受试者在用于铁代谢标志物铁蛋白的20μg Hb/g粪便截止阈值测试为FIT阳性。对于男性和女性二者，使用192 ng/ml的单一铁蛋白水平截止值，鉴别出了具有25％的受试者的低风险亚组，其仅包括10％（118个中的12个）的CRC病例。对男性（208 ng/ml）和女性（164 ng/ml）使用分开的截止值使遗漏的CRC病例增加了1例(118的1%)，但使遗漏的潜在癌前腺瘤减少了7例(178个病例的4%)。
在一个实施方案中，铁代谢生物标志物是铁蛋白，并且使用至少150 ng/ml，例如至少160、170、180、190、200、210、220、230、240或250 ng/ml，特别是190 ng/ml的截止水平。截止水平可以通过性别进一步区分，因此在一个进一步的实施方案中，如果患者是男性，铁蛋白截止水平为至少190、195、200、205或210 ng/ml，和/或如果患者是女性，铁蛋白截止水平为至少150、155、160、165、170、175、180、185或190 ng/ml。在一个又进一步的实施方案中，如果患者是男性，铁蛋白截止水平为至少200 ng/ml，和/或如果患者为女性，铁蛋白截止水平为至少160 ng/ml。
在一个实施方案中，步骤（b）中获得的铁代谢生物标志物结果与数字便潜血结果，例如步骤（a）中获得的数字便潜血结果组合使用。在一个进一步的实施方案中，数字便潜血结果的截止水平为至少10 µg Hb/g，例如至少20、30、40或50 μg Hb/g，特别是至少约20μgHb/g。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于将发现粪便样品中的便潜血为阳性的受试者划分为具有CRC或息肉的极低风险/可能性，或CRC或息肉的高风险/可能性，并且因此评估患者对结肠镜检查的适合性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的铁代谢生物标志物的水平；和
（c）使用任选与FIT水平和/或其它一种或多种因子组合的、步骤（b）中产生的铁代谢生物标志物结果作为患者对结肠镜检查的适合性的指示物。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于将发现粪便样品中的便潜血为阳性的受试者划分为具有CRC或息肉的极低风险/可能性，或CRC或息肉的高风险/可能性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的铁代谢生物标志物的水平;和
（c）使用任选与FIT水平和/或其它一种或多种因子组合的、（b）中产生的铁代谢生物标志物结果作为患者患有CRC和/或息肉的相对风险的指示物。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了检测和/或筛查患者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
（a）鉴别发现便潜血阳性的患者；和
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的已知CRC生物标志物的水平；和
（c）使用任选与FIT水平和/或其它一种或多种因子组合的、步骤（b）中获得的CRC生物标志物结果作为患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的可能性的指示物。
在一个实施方案中，如果步骤（c）中获得的结果对于患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉为阳性，则患者被鉴别为具有患CRC、结肠直肠腺瘤或息肉的高可能性。在一个替代实施方案中，如果步骤（c）中获得的结果对于患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉为阴性，则患者被鉴别为具有患CRC、结肠直肠腺瘤或息肉的低可能性。
可以理解，当确定便潜血以高于用于测试的（单一）阈值截止水平的水平存在于粪便样品中时，认为患者在步骤（a）中已经被测试为“阳性”。
存在一些用于CRC的已知血液生物标志物，包括但不限于癌胚抗原（CEA）、骨桥蛋白、CYFRA-21-1、seprase、Timp-1、抗p53抗体和抗AFP抗体。因此，在一个实施方案中，CRC生物标志物选自：CEA、骨桥蛋白、CYFRA-21-1、seprase、Timp-1、抗p53抗体和抗AFP抗体。在一个进一步的实施方案中，CRC生物标志物是CEA。
在便潜血测试中已经测试为阳性的群体中，本发明的测定将允许鉴别CRC风险低的患者亚组。这样的测定与其它因子组合，将促成本发明的组合测试。我们测定了599个筛查年龄的受试者，所述受试者在用于CRC生物标志物CEA的20μg Hb/g粪便截止阈值测试为FIT阳性。使用1.3 ng/ml的单一CEA水平截止值，鉴别出了具有25％的受试者的低风险亚组，其包括仅15％（118个中的18个）的CRC病例。
在一个实施方案中，CRC生物标志物是CEA并且使用至少0.5 ng/ml，例如至少0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5 ng/ml，特别是1.3 ng/ml的截止水平。
在一个实施方案中，步骤（b）中获得的CRC生物标志物结果与数字便潜血结果，例如步骤（a）中获得的数字便潜血结果组合使用。在一个进一步的实施方案中，数字便潜血结果的截止水平为至少10 µg Hb/g，例如至少20、30、40或50 μg Hb/g，特别是至少约20μgHb/g。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于将发现粪便样品中的便潜血为阳性的受试者划分为具有CRC或息肉的极低风险/可能性，或CRC或息肉的高风险/可能性，并且因此评估患者对结肠镜检查的适合性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的已知CRC生物标志物的水平；和
（c）使用任选与FIT水平和/或其它一种或多种因子组合的、步骤（b）中产生的CRC生物标志物结果作为患者对结肠镜检查的适合性的指示物。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于将发现粪便样品中的便潜血为阳性的受试者划分为具有CRC或息肉的极低风险/可能性，或CRC或息肉的高风险/可能性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的已知CRC生物标志物的水平;和
（c）使用任选与FIT水平和/或其它一种或多种因子组合的、（b）中产生的CRC生物标志物结果作为患者患有CRC和/或息肉的相对风险的指示物。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了检测和/或筛查患者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
（a）鉴别发现便潜血阳性的患者；和
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的低氧诱导因子的水平；和
（c）使用任选与FIT水平和/或其它一种或多种因子组合的、步骤（b）中获得的低氧诱导因子结果作为患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的可能性的指示物。
在一个实施方案中，如果步骤（c）中获得的结果对于患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉为阳性，则患者被鉴别为具有患CRC、结肠直肠腺瘤或息肉的高可能性。在一个替代实施方案中，如果步骤（c）中获得的结果对于患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉为阴性，则患者被鉴别为具有患CRC、结肠直肠腺瘤或息肉的低可能性。
在一个实施方案中，低氧诱导因子选自：HIF-1、HIF-2和HIF-3。
在一个实施方案中，步骤（b）中获得的低氧诱导因子生物标志物结果与数字便潜血结果，例如步骤（a）中获得的数字便潜血结果组合使用。在一个进一步的实施方案中，数字便潜血结果的截止水平为至少10 µg Hb/g，例如至少20、30、40或50 μg Hb/g，特别是至少约20μg Hb/g。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于将发现粪便样品中的便潜血为阳性的受试者划分为具有CRC或息肉的极低风险/可能性，或CRC或息肉的高风险/可能性，并且因此评估患者对结肠镜检查的适合性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的低氧诱导因子的水平；和
（c）使用任选与FIT水平和/或其它一种或多种因子组合的、步骤（b）中产生的低氧诱导因子结果作为患者对结肠镜检查的适合性的指示物。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于将发现粪便样品中的便潜血为阳性的受试者划分为具有CRC或息肉的极低风险/可能性，或CRC或息肉的高风险/可能性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的低氧诱导因子的水平;和
（c）使用与FIT水平和/或其它一种或多种因子组合的、（b）中产生的低氧诱导因子结果作为患者患有CRC和/或息肉的相对风险的指示物。
我们在此显示组合测试的性能超过用于鉴别筛查的CEA风险低的FIT阳性受试者亚组的任何单独测试的性能。我们使用本发明的方法来在599个受试者（其在20μg Hb/g粪便的截止阈值测试为FIT阳性）中鉴别CRC风险低的150个受试者的亚组（25％）。在这599个受试者中，118个受试者被诊断患有CRC。通过单独的FIT水平鉴别的150个受试者的低风险组包括6例CRC，表明简单地提高截止水平以排除25％的结肠镜检查将导致遗漏118个CRC病例中的6例。通过年龄、CEA水平或铁蛋白水平鉴别的150个受试者的低风险组各自分别包括11、18或12例CRC。包括FIT水平和年龄二者的组合测试鉴别出了150个受试者的低风险组，其仅包括6个CRC病例。然而，包括FIT水平、年龄、铁蛋白和CEA的组合测试鉴别出了150个受试者的低风险组，其仅包括2个CRC病例。因此，本发明的该实施方案可用于将结肠镜检查转诊减少约25％，同时仅遗漏了少于2％的CRC病例。在组合测试中，癌前腺瘤的数量也减少了。
FIT测试可以定性地（其中结果是阳性或阴性）或定量地（其中估计粪便血红蛋白浓度）使用。定量粪便免疫化学测试提供数字粪便血红蛋白水平，并允许最终用户选择截止粪便血红蛋白浓度，所述浓度可用于鉴别进行后续结肠镜检查的患者。
在一个优选的实施方案中，确定患者不患有结肠直肠癌或结肠直肠腺瘤或息肉的方法另外涉及在算法中使用其它患者数据。该数据可包括但不限于患者在FIT或FOBT测试中发现的数字粪便血红蛋白水平（与简单的阳性/阴性结果相反）、患者的年龄、性别、体重指数（BMI）、吸烟状况和饮食习惯。使用算法分析患者数据和无细胞核小体和/或铁代谢生物标志物和/或低氧诱导因子和/或CRC的其它已知生物标志物的测定数据，所述算法的输出是CRC或息肉的存在或不存在的指示，或是CRC或息肉存在或不存在的概率指示物，或是患者对结肠镜检查的适合性的指示物。
在一个实施方案中，患者的临床数据（特别是患者的年龄和/或性别）与数字FIT或FOBT结果一起用于算法中以确定受试者中结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的存在或不存在。该实施方案提供了检测和/或筛查发现粪便样品中便潜血阳性的受试者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
(i)鉴别发现便潜血阳性的患者；
(ii)使用粪便血红蛋白水平和其它患者数据作为受试者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的可能性的指示物。
在一个实施方案中，确定患者不患有结肠直肠癌或结肠直肠腺瘤或息肉的方法另外涉及在算法中使用其它测定数据。该数据可包括任何发现相关的测试结果，包括但不限于患者的血液或粪便癌胚抗原（CEA）水平、C-反应蛋白（CRP）水平、铁蛋白水平、血液血红蛋白水平、铁代谢生物标志物水平、低氧诱导因子水平和/或CRC的其它已知生物标志物。这些测试结果可以附加或替代地用于本文所述的无细胞核小体测定。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于确定发现粪便样品中便潜血阳性的患者是否需要结肠镜检查的方法，包括：
（a）鉴别发现便潜血阳性的受试者；和
（b）使用受试者的年龄和粪便血红蛋白水平来将受试者指定为具有患结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的高或低可能性。
高可能性将患者鉴别为需要结肠镜检查。因此，在一个实施方案中，该方法另外包括：（c）使用步骤（b）中产生的结果作为患者对结肠镜检查的适合性的指示物。
本发明这方面的步骤（b）（使用受试者的年龄和粪便血红蛋白水平来将受试者指定为具有患结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的高或低可能性）可以使用线性或非线性算法进行。在一个实施方案中，将粪便血红蛋白（Hb）水平（以μg Hb / g粪便为单位）和患者年龄（以岁为单位）输入线性表达式：
0.0129 x FIT水平(µg Hb/g 粪便) + 0.0688 x年龄(岁)
表达式的输出值可以根据期望的结果以多种方式使用。特别地，该表达式可以用于提供可以与预定截止值进行比较的值，以便将受试者指定为具有患结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的高或低可能性。例如，如果期望的结果是实现结肠镜检查减少约25％，则可以使用约5的截止值，使得如果表达式的输出值大于5，则患者被指定为CRC的高风险并且应该被转诊进行结肠镜检查。相应地，如果表达式的输出值小于5，则患者被指定为CRC的低风险并且不需要被转诊进行结肠镜检查。在一个实施方案中，截止值为约5.0，例如5.0和4.5之间，或4.9和4.7之间。在一个进一步的实施方案中，截止值为约4.8。
本领域技术人员可以理解，可以改变用于表达式的单位（例如，年龄可以以天、周、月等表示，或者Hb水平可以表示为溶解和/或稀释后的浓度或以任意单位（AU）表示），并且这将改变表达式中的项而不改变方法的基础。
使用20μg Hb/g粪便的截止阈值和4.8的截止值，将该方法用于在FIT测试中测试为阳性的1907个受试者的队列，我们能够实现使结肠镜检查减少25％，同时使患CRC的患者进行结肠镜检查的转诊率保持在96.6%。相似地，对于患高风险腺瘤的患者，保持了88.1%的转诊率。因此，结肠镜检查可减少25％，同时仅遗漏3.4％的CRC病例和11.9％的高风险腺瘤病例。
在一个实施方案中，本发明的算法先验地用于为任何给定年龄建立可变FIT截止水平。例如，如表1所示，上述表达式可以转换为随增加的年龄而改变的FIT截止水平的表格。在1907个受试者的队列中，低于20μg Hb/g粪便的可变截止值是不可能的，因为所有1907个受试者在20μg Hb/g粪便的阈值均为FIT阳性。因此，使用表1中具有20μg Hb/g粪便的最小截止值的列。然而，可以使用更低的最小阈值，并且我们已经在表1中以10和16μgHb/g粪便的阈值对此进行了举例说明（不限于此）。也可能设定0μg Hb/g粪便的更低阈值。相似地，可以使用最大更高阈值，并且我们已经在表1中以80μg Hb/g粪便的最大阈值并且在表1中以10μg Hb/g的更低阈值对此进行了举例说明（不限于此）。当然，可以使用任何水平的最小和/或最大阈值，或者不使用。
表1.
我们已经显示了使用表1中所示的可变FIT截止水平（具有20μgHb/g粪便的较低截止水平）导致结肠镜检查转诊减少25％，同时使患有CRC和高风险腺瘤的患者的转诊率分别保持在96.6％和88.1％。
在目前的临床实践中，用于FIT测试的20µg Hb/g粪便截止阈值是最常用的阈值，并且是制造商推荐的。该阈值在约95％的特异性给出70-75％灵敏度的可接受准确性，并且代表了对遗漏的CRC病例数量与在没有病变的受试者上进行的不必要的结肠镜检查数量之间的权衡的折中。该权衡使大约25-30％的CRC病例未被检测到，并且结肠镜检查转诊率为约5％。在转诊进行结肠镜检查的受试者中，约5％将被诊断患有CRC（超过筛查的那些患者的1％），并且另外约30％将被诊断患有潜在癌前腺瘤（息肉）。因此，大多数结肠镜检查是在没有获益的受试者上进行的。使用上述动态截止阈值导致将结肠镜检查转诊数量减少了25％，同时使发现CRC病例的结肠镜检查比例提高到近7％，并使发现潜在癌前腺瘤病例的结肠镜检查比例提高到34％。
当CRC筛查程序发现了使用的20µg Hb/g粪便截止值中固有的权衡不合适时，他们总是：（i）增加截止值以降低结肠镜检查转诊率并接受遗漏的癌数量的同时增加；或（ii）降低截止值以减少遗漏的癌数量，并接受结肠镜检查转诊率的同时增加。用于FIT测试的20µgHb/g粪便截止阈值是简单的、恒定的阈值，无论任何其它患者参数如何，都使用该阈值。相似地，其它升高或降低的阈值是简单的恒定的阈值。然而，采用其它患者参数（例如年龄和性别），CRC发病率和数字FIT结果的模式不是恒定的。实际上，使用本发明的可变或动态截止值，实现的是在具有相对低的（但是大于20µg Hb/g粪便）数字FIT结果的较年轻患者（其CRC风险较低）中排除结肠镜检查，同时继续将年龄较大的FIT阳性受试者（其CRC风险较高）转诊进行结肠镜检查。
此外，尽管上面提到的1907个受试者都具有大于20µg Hb/ g粪便的数字FIT水平，但是可以将线性动态截止值的下限延伸到低于该水平。例如，对于年龄大于66岁的受试者（其中CRC的发病率较高），使用小于20µg Hb/g粪便的更低FIT截止阈值水平，将增加测试的总体灵敏度，同时通过避免具有中度提高的FIT水平的较年轻受试者（其CRC发病率较低）中的结肠镜检查使总体结肠镜检查率最小化。相似地，可以应用上限作为用于FIT的最高截止值，如表1所示。
我们调查了已经在10µg Hb/g 粪便的更低FIT截止阈值测试为FIT阳性的年龄大于50岁的受试者的一个队列，所述队列包括4个患有CRC的受试者、8个患有潜在癌前晚期腺瘤的受试者和20个健康受试者。在这些受试者中，4个患有癌的受试者中的2个、8个患有腺瘤的受试者中的3个和20个健康受试者中的1个具有大于16µg Hb/g粪便的FIT值。这些数据表明，采用16µg Hb/g粪便的更低截止水平的本发明的方法，如表1所示，可用于增加FIT的总体灵敏度，并通过降低最小更低阈值（例如降低至16µg Hb/g粪便）来检测更多CRC病例，同时通过以下方式使结肠镜检查转诊率最小化：通过使更少的较年轻受试者（其具有20-105µg Hb/g粪便之间的FIT水平）转诊来抵消年龄较大的受试者中结肠镜检查的增加。
非线性算法也可以用作本发明的实施方案。我们已经发现涉及log[FIT]或[FIT]-0.1（FIT水平的-0.1次方）的非线性算法是本发明特别有用的实施方案。在一个实施方案中，将粪便血红蛋白（Hb）水平（以μg Hb / g粪便为单位）和患者年龄（以岁为单位）输入表达式：
0.063 x 年龄(岁) – 19.2 x (5 x FIT水平)-0.1
在本发明的另一个实施方案中，将粪便血红蛋白（Hb）水平（以μg Hb / g粪便为单位）和患者年龄（以岁为单位）输入以2为底的对数表达式：
0.063 x 年龄(岁) -1.58 x LOG(FIT水平)
这些表达式的输出值可以根据期望的结果以多种方式使用。特别地，该表达式可以用于提供可以与预定截止值进行比较的值，以便将受试者指定为具有患结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的高或低可能性。例如，如果期望的结果是实现结肠镜检查减少约25％，则约7.4或9.5的截止值可以分别用于(5 x FIT水平)-0.1或LOG(FIT水平)表达式，使得如果表达式的输出值分别大于7.4或9.5，则患者被指定为CRC的高风险，并且应该转诊进行结肠镜检查。相应地，如果表达式的输出值分别小于7.4或9.5，则患者被指定为CRC的低风险并且不需要转诊进行结肠镜检查。本领域技术人员可以明白，非线性表达式也可以转换成如先前对线性表达式所示的年龄特异性FIT截止水平。
当本发明的这些实施方案中的任一个用于在20µg Hb/g粪便的截止值测试为FIT阳性的7943个受试者的群体时，鉴别出具有25％的受试者的低风险组，其仅包括5％的CRC病例（430个CRC病例中的23个）。
在一个实施方案中，本文所述的方法另外包括测量患者的至少一个临床参数并将此用作结果解释中的参数。另外的参数可包括任何相关的临床信息，例如但不限于性别、体重、体重指数（BMI）、吸烟状况和饮食习惯。因此，在一个进一步的实施方案中，临床参数选自：性别和体重指数（BMI）。
在一个实施方案中，该方法另外包括通过结肠镜检查和/或手术和/或将治疗剂施用于受试者而治疗，所述受试者在步骤（b）中鉴别为具有患结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的高可能性的受试者。
因此，根据本发明的一个进一步的方面，提供了治疗动物或人类受试者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血；
（b）使用受试者的年龄和粪便血红蛋白水平将受试者指定为具有患结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的高或低可能性；和
（d）通过结肠镜检查和/或手术和/或将治疗剂施用于受试者而治疗，所述受试者在步骤（c）中鉴别为具有患结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的高可能性的受试者。
在一个实施方案中，步骤（b）包括使用本文所述的算法。
在一个实施方案中，该方法另外包括检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的核小体自身的水平和/或无细胞核小体的外遗传特征的水平。
在一个实施方案中，本文所述的方法包括检测或测量核小体自身的水平。可以理解，可以例如使用核小体的免疫测定方法估计核小体自身的水平，所述核小体的免疫测定方法类似于本领域已知的那些。在Salgame等，1997；Holdenrieder等，2001;和vanNieuwenhuijze等，2003中报道了酶联免疫吸附测定（ELISA）和几种方法。这些测定通常使用抗组蛋白抗体（例如抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3和H4）作为捕获抗体和抗DNA或抗H2A-H2B-DNA复合物抗体作为检测抗体。
在一个实施方案中，无细胞核小体是单核小体、寡核小体或其它染色体片段。
核小体是染色质结构的基本重复单元，并且由八个高度保守的核心组蛋白（包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对）的蛋白复合物组成。该复合物周围包裹大约146个碱基对的DNA。另一种组蛋白H1或H5充当接头并参与染色质致密化(chromatin compaction)。 在通常称为类似“串珠”的结构中，DNA缠绕在连续核小体周围，并且这形成了开放的或常染色质的基本结构。在致密的或异染色质中，这种串是螺旋的并超螺旋为封闭且复杂的结构（Herranz和Esteller，2007）。
细胞染色质中核小体的结构可以通过组蛋白蛋白的翻译后修饰（PTM）和通过引入变体组蛋白蛋白来改变。组蛋白蛋白的PTM最常但不仅仅发生在八核心组蛋白的尾部，并且常见的修饰包括赖氨酸残基的乙酰化、甲基化或遍在蛋白化以及精氨酸残基的甲基化和丝氨酸残基的磷酸化。已知组蛋白修饰参与基因表达的外遗传调控（Herranz和Esteller，2007）。核小体的结构也可以通过引入替代的组蛋白同种型或变体来改变，所述替代的组蛋白同种型或变体是不同的基因或剪接产物并且具有不同的氨基酸序列。组蛋白变体可以分类为一些家族，所述家族被细分为各个类型。大量组蛋白变体的核苷酸序列是已知的并且可公开获得，例如在National Human Genome Research Institute NHGRI HistoneDataBase (http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml)、GenBank (NIH遗传序列) DataBase、EMBL Nucleotide Sequence Database和DNA Data Bank of Japan(DDBJ)中。
存在于健康和患病细胞中的组蛋白变体和组蛋白修饰模式已经显示出在许多（大多数是免疫组织化学）研究中不同（Herranz和Esteller，2007）。
核小体结构也通过其DNA组分的化学修饰，包括DNA的甲基化状态而改变（Herranz和Esteller，2007）。本领域已经有一段时间已知DNA可以在胞嘧啶核苷酸的5位甲基化以形成5-甲基胞嘧啶，并且早在1983年就报道了DNA甲基化在癌中的涉及（Feinberg和Vogelstein，1983）。在癌细胞中观察到的DNA甲基化模式不同于健康细胞的那些。据报道，相对于健康细胞，重复元件（特别是围绕着丝粒周区域）在癌中是甲基化不足的，但据报道特定基因的启动子在癌中是过度甲基化的。据报道，这两种作用的平衡导致癌中的总体DNA甲基化不足，并且这是癌细胞的标志（Esteller 2007，Hervouet等，2010，Rodriguez-Paredes＆Esteller，2011）。
核小体结构也通过核小体与染色质中存在的大量其它蛋白中的任何蛋白结合以形成核小体加合物而改变。染色质包含具有多种功能的各种类型的大量非组蛋白蛋白，包括转录因子、转录增强因子、转录抑制因子、组蛋白修饰酶、DNA损伤修复蛋白、核激素受体以及更多。已经主要通过染色质免疫沉淀（ChIP）方法进行了染色质结合的蛋白的研究。这些方法是本领域中公知的，但是复杂、费力且昂贵。
我们先前已经报道了用于含有特定外遗传信号的核小体，包括含有特定组蛋白修饰、特定组蛋白变体和特定DNA修饰的核小体以及特定核小体加合物的ELISA测定（WO2005/019826、WO 2013/030579、WO 2013/030577、WO 2013/084002）。我们先前已经使用这些测定来显示在患病患者的血液中可以检测到外遗传改变的循环无细胞核小体。因此，在一个实施方案中，检测或测量（例如，在步骤（b）中）包括：
（i）使样品与第一结合剂接触，所述第一结合剂结合无细胞核小体或其组分;
（ii）使样品或无细胞核小体与第二结合剂接触，所述第二结合剂结合所述无细胞核小体内的外遗传特征;和
（iii）对样品中所述第二结合剂与所述无细胞核小体内的外遗传特征的结合进行检测或定量。
在一个替代的实施方案中，步骤（b）中的检测或测量包括：
（i）使样品与第一结合剂接触，所述第一结合剂结合所述无细胞核小体内的外遗传特征;
（ii）使样品或无细胞核小体与第二结合剂接触，所述第二结合剂结合无细胞核小体或其组分;和
（iii）对样品中所述第二结合剂与无细胞核小体或其组分的结合进行检测或定量。
在一个实施方案中，该方法包括检测或测量外遗传改变的或以其它方式修饰的无细胞核小体。因此，例如，步骤（b）包括检测无细胞核小体的外遗传特征。
在一个实施方案中，外遗传特征选自：翻译后组蛋白修饰、组蛋白变体或同种型、DNA修饰或加合到核小体的蛋白。
在一个进一步的实施方案中，无细胞核小体的外遗传特征包括一种或多种组蛋白翻译后修饰。大量的这种组蛋白修饰在本领域中是已知的，并且该数量随着新鉴别的修饰而增加。例如但不限于，组蛋白在多个位置含有多种氨基酸残基，包括组蛋白H2、H3和H4中的赖氨酸、丝氨酸、精氨酸和苏氨酸残基，以及它们的同种型或序列变体。这些可以以多种方式修饰，所述方式包括例如但不限于赖氨酸残基的乙酰化、遍在蛋白化、生物素化或一、二或三甲基化。任何组蛋白修饰可以是用于本发明的合适特征，无论是作为单独的修饰的组蛋白部分检测或测量，还是作为无细胞单核小体、寡核小体或其它染色质片段的组蛋白组分检测或测量，所述检测或测量例如使用色谱、质谱分光光度法、生物传感器、染色质免疫沉淀（ChIP）、免疫测定或其它检测方法。在一个优选的实施方案中，核小体相关的修饰的组蛋白通过2位点免疫测定（免疫检测 (immunometric)）方法测量，该方法利用一种针对核小体表位的抗体或其它选择性结合剂和另一种针对特定的目标组蛋白修饰的抗体或其它选择性结合剂。
在本发明的一个实施方案中，检测一组或一类相关的组蛋白修饰（而不是单一修饰）。该实施方案的典型实例（不限于此）将涉及2位点免疫测定，其利用一种定向结合核小体的抗体或其它选择性结合剂和一种定向结合所讨论的该组组蛋白修饰的抗体或其它选择性结合剂。这样的定向结合一组组蛋白修饰的抗体的实例将包括（为举例说明的目的但不限于此）抗泛乙酰化抗体（例如泛乙酰基H4抗体）、抗瓜氨酸化抗体或抗遍在蛋白化抗体。
在一个实施方案中，翻译后组蛋白修饰选自：H2AK119Ub、pH2AX、H3K9Me3、H3K9Ac、H3K27Me3、H3K36Me3、H3S10Ph、H4K16Ac、H4K20Me3、ubiquityl-H2A和H4PanAc （泛乙酰化H4）。在一个进一步的实施方案中，翻译后组蛋白修饰选自：H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3、H3S10Ph和H4PanAc。在一个又进一步的实施方案中，翻译后组蛋白修饰选自：H2AK119Ub、pH2AX和H3K36Me3。
在一个替代的实施方案中，无细胞核小体的外遗传特征包括一种或多种组蛋白变体或同种型。许多组蛋白变体是本领域已知的（例如，组蛋白H2的变体包括H2A1、H2A2、mH2A1、mH2A2、H2AX和H2AZ），并且该数量随着新鉴别的同种型而增加。组蛋白同种型变体蛋白结构也容易进行翻译后修饰。例如，H2A变体H2AX可以在丝氨酸139处翻译后磷酸化，并且该部分通常称为γ-H2AX。任何组蛋白变体，包括任何修饰的变体，可以是用于本发明的合适特征，无论是作为单独的组蛋白变体部分检测或测量（例如使用免疫测定、色谱、质谱分光光度法、ChIP、生物传感器、或组蛋白同种型部分的其它检测方法）还是作为掺入了组蛋白变体的无细胞单核小体、寡核小体或其它染色质片段的组蛋白组分检测或测量。在一个优选的实施方案中，核小体相关的组蛋白变体通过2位点免疫测定进行测量，该2位点免疫测定利用一种针对核小体表位的抗体或其它选择性结合剂和另一种针对特定的目标组蛋白变体或同种型的抗体或其它选择性结合剂。
在一个实施方案中，组蛋白变体或同种型选自mH2A1.1、H2AZ和γ-H2AX。
在一个替代的实施方案中，无细胞核小体的外遗传特征包括一个或多个DNA修饰。一些特定的DNA修饰是本领域已知的（例如，胞嘧啶的甲基化、羟甲基化和羧甲基化），并且该数量随着新鉴别的修饰而增加。任何修饰的核苷酸或核苷或任何DNA修饰可以是用于本发明的合适特征，无论是在分离的DNA、核酸、核苷酸或核苷部分中检测或测量（例如使用免疫测定、色谱、质谱分光光度法、ChIP、生物传感器或修饰的核酸部分的其它检测方法），还是通过用于掺入了特定DNA修饰的无细胞单核小体、寡核小体或其它染色质片段的任何方法检测或测量。在一个优选的实施方案中，核小体相关的DNA修饰通过2位点免疫测定来测量，该2位点免疫测定利用一种针对核小体表位的抗体或其它选择性结合剂和另一种针对特定的目标DNA修饰的抗体或其它选择性结合剂。
在一个实施方案中，DNA修饰选自5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。
在一个优选的实施方案中，在染色质片段中测量的外遗传修饰的核苷酸是5-甲基胞嘧啶或甲基化的DNA。为清楚起见，本发明的这个方面不应与用于基因甲基化测试的方法相混淆，所述方法涉及调查特定基因或DNA序列的胞嘧啶甲基化状态，例如在Cologuard方法中使用的。相反，本发明涉及确定5-甲基胞嘧啶的总体水平，而与基因序列无关。
在一个替代的实施方案中，无细胞核小体的外遗传特征包括一种或多种蛋白-核小体加合物或复合物。已知大量蛋白-核小体加合物或复合物存在于染色质中（例如，转录因子、HMGB1、EZH2和核激素受体-核小体加合物），并且该数量随着新鉴别的与染色质相关的蛋白而增加。任何蛋白-核小体加合物都可以是用于本发明的合适特征，无论是通过用于掺入了特定蛋白的无细胞单核小体加合物、寡核小体加合物或其它染色质片段加合物的任何方法检测或测量，所述方法例如2位点免疫测定，该2位点免疫测定利用一种针对核小体表位的抗体或其它选择性结合剂和另一种针对包含在加合物中的特定蛋白的抗体或其它选择性结合剂。
在一个实施方案中，加合到核小体的蛋白选自：转录因子、高速泳动族蛋白或染色质修饰酶。提及“转录因子”是指与DNA结合并通过促进（即激活物）或抑制（即阻抑物）转录来调节基因表达的蛋白。转录因子含有一个或多个DNA结合结构域（DBDs），其附着于与它们调节的基因相邻的DNA的特定序列。
在一个实施方案中，核小体加合物包括高速泳动族蛋白、多梳蛋白（polycombprotein）、染色质修饰酶或核激素受体。
在一个实施方案中，加合到核小体的蛋白选自HMGB1和EZH2。
在一个实施方案中，步骤（b）中的检测或测量包括免疫测定、免疫化学、质谱法、色谱、染色质免疫沉淀或生物传感器方法。
在一个实施方案中，该方法包括无细胞核小体自身和/或无细胞核小体外遗传特征的两次或更多次测量（其是作为一组核小体特征进行的）。
在一个实施方案中，该组核小体特征包括选自以下的两种或更多种核小体特征：5-甲基胞嘧啶、H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3、H2AZ和HMGB1。在一个进一步的实施方案中，该组核小体特征包括：5-甲基胞嘧啶、H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3和HMGB1。该组核小体特征可以另外包括测量核小体自身的水平。
在一个进一步的实施方案中，该方法包括测量一组核小体生物标志物，其选自：核小体的水平、一种或多种特定的组蛋白修饰或包含特定组蛋白修饰的无细胞核小体、组蛋白变体或包含特定组蛋白变体的无细胞核小体、DNA修饰或包含特定DNA修饰的无细胞核小体，或核小体加合物。由于不同的群体可能在外遗传上不相同或不相似，因此针对不同动物或不同群体选择的最优组可以变化。因此，选择用于（例如）在人类中确定或排除CRC的一组这样的生物标志物可能与选择用于另一物种（例如猫或狗）的组不同。相似地，用于在男人和女人（或雄性和雌性的任何其它动物）中确定或排除CRC的最优组可能是不同的。相似地，用于在不同的人类亚群或种族中确定或排除CRC的最优组可能不同。或者，相同的组可用于不同的群体（例如在雄性和雌性中），但具有用于组测定成员的不同权重。例如，包含测定“A”、“B”和“C”的三个测定和患者数据参数组的测试值结果可以采用“X”的截止值从雄性中的数学表达式例如（测试值= A + 2B + 3C）计算，以及以“Y”的不同截止值从雌性中的不同的数学表达式例如（测试值= 3A + 2B + C）计算。
在一个实施方案中，用于检测或测量样品中无细胞核小体的外遗传特征的方法包括：
（i）从受试者获得样品；
（ii）使样品与第一和第二结合剂接触，其中所述结合剂之一结合无细胞核小体或其组分，并且所述结合剂的另一种结合所述无细胞核小体的外遗传特征；和
（iii）对样品中所述结合剂的任一种或两种的结合进行检测或定量。
可以理解，本文所述外遗传特征也可以在核小体内独立于它们的内容物或以其它方式进行测定。因此，在一个实施方案中，用于检测或测量样品中无细胞核小体的外遗传特征的方法包括：
（i）从受试者获得样品；和
（ii）检测或测量样品中特定组蛋白变体、组蛋白同种型、含有特定翻译后修饰的组蛋白或核小体加合物的水平。
在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种用于原位测量核小体掺入的外遗传特征的2位点免疫测定方法，该方法采用与标记的抗组蛋白修饰或抗组蛋白变体或抗DNA修饰或抗加合蛋白检测结合剂组合的固定的抗核小体结合剂。在本发明的另一个实施方案中，提供了2位点免疫测定，其采用与固定的抗组蛋白修饰或抗组蛋白变体或抗DNA修饰或抗加合蛋白结合剂组合的标记的抗核小体检测结合剂。
可以理解，可以通过以下方式鉴别被鉴别为便潜血阳性的人：测试从患者获得的粪便样品中的便潜血。在一个实施方案中，便潜血测试选自：粪便免疫化学测试（FIT，也称为免疫化学便潜血测试或iFOBT）、用于便潜血的大便愈创木脂测试（gFOBT）或粪便卟啉定量（如HemoQuant）。在一个进一步的实施方案中，便潜血测试是粪便免疫化学测试。FIT产品利用特异性抗体检测珠蛋白，并且目前是最常用的结肠癌筛查测试之一。
用于收集粪便样品材料的装置是商购可得的，例如在商购可得的FIT测试中。该装置包括用于舀取少量大便材料的样品棒。然后将探针插入其管中，在此从棒中取出过量样品，并将10mg粪便样品加入2ml缓冲液中。该管还包括过滤系统，以在取出一部分液体样品用于分析时除去固体。本领域技术人员将明白，已经稀释、过滤、分离、纯化或以其它方式制备用于分析的任何源自粪便的样品可以用于本发明。
可以理解，尽管对来自患者的粪便样品进行便潜血测试，但可以使用相同或另一种类型的样品以便测试一种或多种部分，例如核小体的水平。在一个实施方案中，样品是体液样品，例如选自以下的样品：血液或血清或血浆（特别是血液样品）。本领域技术人员将明白，体液中核小体加合物的检测具有以下优点：其是不需要活组织检查的微创方法。
在一个实施方案中，所述疾病选自癌，例如结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉。
此外，本发明的方法可以包括进一步的测试，以提高其临床准确性，包括例如用于血红蛋白、其它已知的肿瘤标志物包括癌胚抗原（CEA）和/或特定的突变或甲基化基因序列的测试。因此，在一个实施方案中，该方法另外包括检测或测量从患者获得的样品中的癌胚抗原（CEA）的水平。
在一个实施方案中，该方法另外包括测试特定的突变或甲基化的基因序列。例如，目前有用于CRC检测的粪便测试，除了分析血红蛋白外，其还涉及大便中DNA序列的分析。在这些方法中，从大便中提取DNA并进行分析以鉴别癌相关的序列突变和/或基因特异性DNA甲基化改变。 Exact Sciences公司生产的Cologuard测试提供了这种方法的一个实例。该测试涉及大便中一组11种CRC的标志物，包括血红蛋白、7种DNA序列突变、2种DNA序列甲基化和β肌动蛋白的DNA序列（作为结果标准化的对照）。在该测试中，在实验室处理患者大便样品以从大便中分离DNA。然后扩增DNA，并通过定量等位基因特异性实时靶和信号放大来调查NDRG4和BMP3基因甲基化。还使用这些测定调查了癌相关的KRAS突变，并且所有都是与总DNA水平关联评估的，所述总DNA水平是通过β肌动蛋白扩增评估的。将DNA甲基化、突变和血红蛋白结果组合以提供阳性或阴性结果。Cologuard测试比简单的FOBT或FIT测试更准确，并且检测到92％的癌和42％的息肉，特异性为87％（The Medical Letter，2014）。将该测试与针对本发明描述的核小体测定相组合将进一步提高这些测试的准确性。
在一个实施方案中，该方法另外包括测量患者的至少一种临床参数。另外的参数可以包括任何相关的临床信息，例如但不限于年龄、性别、体重指数（BMI）、吸烟状况和饮食习惯。因此，在一个进一步的实施方案中，临床参数选自：年龄、性别和体重指数（BMI）。
在一个实施方案中，一种或多种结合剂包括对无细胞核小体或其组成部分，或核小体或其组成部分的结构/形状模拟物特异的配体或结合剂。
在本发明的一个实施方案中，选择作为抗核小体结合剂的抗体或其它选择性结合剂对肿瘤来源的核小体的富集具有选择性。在一个优选的实施方案中，使用的抗体或其它抗核小体选择性结合剂定向结合于组蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t。对肿瘤来源的核小体具有选择性的结合剂可用于任何测定，包括用于核小体自身（肿瘤来源的）、任何特定组蛋白修饰或包含特定组蛋白修饰的无细胞核小体、组蛋白变体或包含特定组蛋白变体的无细胞核小体、DNA修饰或包含特定DNA修饰的无细胞核小体，或核小体加合物的水平的测定。
用于分离和/或检测或测量样品中作为生物标志物的组蛋白修饰和/或包含特定组蛋白修饰的无细胞核小体和/或组蛋白变体和/或包含特定组蛋白变体的无细胞核小体和/或DNA修饰和/或包含特定DNA修饰的无细胞核小体和/或核小体加合物和/或核小体自身的水平的任何方法都可以用于本发明。用于检测或测量这些分析物的方法的实例包括色谱、光谱法（特别是质谱法）、生物传感器、ChIP和免疫化学方法。一些检测或测量方法可涉及从样品中预先富集或分离这些分析物（例如通过包括色谱法或亲和纯化/分离的方法，所述方法使用选择性抗体结合剂或其它特异性分析物结合剂）。可以通过本领域已知的DNA提取方法实现DNA修饰分离或纯化。
本领域技术人员将明白，关于本发明任何方面的术语抗体、结合剂或配体不是限制性的，而是意欲包括能够结合特定分子或实体的任何结合剂，并且任何合适的结合剂都可以用于本发明的方法中。也将明白术语“核小体”意欲包括单核小体和寡核小体以及可在流体介质中分析的任何这种染色质片段。
在一个实施方案中，本发明的配体或结合剂包括能够特异性结合期望的靶的天然存在或化学合成的化合物。配体或结合剂可包括能够特异性结合期望的靶的肽、抗体或其片段，或合成配体，例如可塑性抗体，或适体或寡核苷酸。抗体可以是单克隆抗体或其片段。配体可以用可检测标志物，例如发光、荧光、酶或放射性标志物进行标记；替代地或另外地，根据本发明的配体可以用亲和标记物，例如，生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或His（例如六-His）标记物进行标记。替代地，可以使用无标记技术，例如ForteBio Inc.的无标记技术测定配体结合。
本文使用的术语“检测”或“诊断”包括疾病状态的鉴别、确认和/或表征。根据本发明的检测、监测和诊断的方法可用于确认疾病的存在、通过评估发作和进展来监测疾病的发展，或评估疾病的改善或消退。检测、监测和诊断的方法也可用于评估临床筛查、预后、治疗选择、估计治疗益处，即用于药物筛选和药物开发的方法。
本发明的免疫测定包括采用定向结合于核小体或核小体组分或核小体的外遗传特征的一种或多种抗体或其它特异性结合剂的任何方法。免疫测定包括2位点免疫测定或使用酶检测方法（例如ELISA）的免疫测定、荧光标记的免疫测定、时间分辨荧光标记的免疫测定、化学发光免疫测定、免疫比浊测定、颗粒标记的免疫测定和免疫放射测定以及单位点免疫测定、试剂限制的免疫测定、包括标记的抗原的竞争性免疫测定方法和具有多种标记类型（包括放射性、酶、荧光、时间分辨荧光和颗粒标记）的标记抗体单抗体免疫测定方法。所有所述免疫测定方法都是本领域熟知的，参见例如Salgame等，1997和vanNieuwenhuijze等，2003。
可以通过适合于鉴别来自受试者的生物样品或生物样品的纯化物或提取物或其稀释物中的特定蛋白的存在和/或量的任何方法来进行鉴别和/或定量。在本发明的方法中，可以通过测量一种或多种样品中的靶的浓度来进行定量。可以在本发明的方法中测试的生物样品包括如上文所定义的那些。可以制备，例如在适当的情况下稀释或浓缩，并以常规方式储存样品。
生物标志物的鉴别和/或定量可以通过生物标志物或其片段（例如具有C末端截短或具有N末端截短的片段）的检测来进行。片段长度合适地大于4个氨基酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。特别注意到，具有与组蛋白尾的序列相同或相关的序列的肽是组蛋白蛋白的特别有用的片段。
例如，检测和/或定量可以通过选自以下的一种或多种方法进行：SELDI（-TOF）、MALDI（-TOF）、基于1-D凝胶的分析、基于2-D凝胶的分析、质谱（MS）、反相（RP）LC、尺寸渗透（凝胶过滤）、离子交换、亲和力、HPLC、UPLC和其它基于LC或LC MS的技术。合适的LC MS技术包括 ICAT®（Applied Biosystems，CA，USA）或iTRAQ®（Applied Biosystems，CA，USA）。也可以使用液相色谱（例如高压液相色谱（HPLC）或低压液相色谱（LPLC））、薄层色谱、NMR（核磁共振）光谱。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了治疗动物或人类受试者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从受试者获得的血液、血清或血浆样品中的一种或多种部分的水平，其中所述部分选自无细胞核小体、无细胞核小体的外遗传特征、癌胚抗原、铁代谢或低氧诱导因子;
（c）使用（b）中产生的结果作为受试者患有结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的可能性的指示物；和
（d）通过结肠镜检查和/或手术和/或将治疗剂施用于受试者而治疗，所述受试者在步骤（c）中鉴别为具有患结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的高可能性的受试者。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了治疗动物或人类受试者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从受试者获得的血液、血清或血浆样品中核小体自身的水平和/或无细胞核小体的外遗传特征的水平;
（c）使用（b）中产生的无细胞核小体结果作为受试者患有结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的可能性的指示物；和
（d）通过结肠镜检查和/或手术和/或将治疗剂施用于受试者而治疗，所述受试者在步骤（c）中鉴别为具有患结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的高可能性的受试者。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了治疗患者（所述患者需要该治疗）中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，该方法包括通过结肠镜检查和/或手术和/或将治疗剂施用于患者而治疗的步骤，所述患者（i）粪便样品中便潜血测试为阳性；并且（ii）当与来自对照受试者的一种或多种选自以下的部分的水平相比时，样品中具有不同的或相似的所述部分的水平：核小体自身、无细胞核小体的外遗传特征、癌胚抗原、铁代谢或低氧诱导因子。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了治疗患者（所述患者需要该治疗）中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，该方法包括通过结肠镜检查和/或手术和/或将治疗剂施用于患者而治疗的步骤，所述患者（i）粪便样品中便潜血测试为阳性；并且（ii）当与来自对照受试者的核小体和/或无细胞核小体的外遗传特征的水平相比时样品中具有不同的或相似的核小体自身和/或所述无细胞核小体的外遗传特征的水平。
在一个实施方案中，对照受试者是健康/未患病的受试者。因此，在该实施方案中，可以理解，样品中核小体自身和/或无细胞核小体的外遗传特征的不同水平表明患者具有患结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的高可能性，因此应该治疗。在一个替代的实施方案中，对照受试者是被诊断患有CRC（即“真正的CRC”受试者）、结肠直肠腺瘤或息肉的受试者。在该实施方案中，可以理解，样品中核小体自身和/或无细胞核小体的外遗传特征的不同水平表明患者具有患结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的低可能性，因此不应治疗。
存在许多用于治疗结肠直肠癌的方法，例如通过结肠镜检查和/或手术和/或将治疗剂施用于患者。通过手术治疗可包括腹腔镜手术或用于直肠癌的结肠造口术。治疗还可以包括放射治疗，例如外束放射治疗或术中放射治疗（即在手术期间给予）。在一个实施方案中，治疗剂可包括化学治疗，例如选自以下的化学治疗：卡培他滨（希罗达）、氟尿嘧啶（5-FU，Adrucil）、伊立替康（Camptosar）、奥沙利铂（乐沙定）、贝伐单抗（阿瓦斯汀）、西妥昔单抗（爱必妥）、帕尼单抗（Vectibix）、雷莫芦单抗（Cyramza）、瑞格非尼（拜万戈）、阿柏西普（Zaltrap）或其组合（例如 Xelox，其是奥沙利铂和卡培他滨的组合）。也可以使用靶向治疗，例如抗血管发生治疗或表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂。
本文所述了用于诊断和监测疾病状态的存在的诊断试剂盒。因此，根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于诊断结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的试剂盒，包括：
（a）便潜血测试（FOBT）和/或粪便免疫化学测试（FIT）；和
（b）对选自无细胞核小体、无细胞核小体的外遗传特征、癌胚抗原、铁代谢或低氧诱导因子的一种或多种部分特异的配体或结合剂。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于诊断结肠直肠癌、结肠直肠腺瘤或息肉的试剂盒，包括：
（a）便潜血测试（FOBT）和/或粪便免疫化学测试（FIT）；和
（b）对无细胞核小体的外遗传特征和/或无细胞核小体自身的检测特异的配体或结合剂。
合适地，根据本发明的试剂盒可以含有一种或多种选自以下的组分：对无细胞核小体的外遗传特征和/或无细胞核小体自身或其结构/形状模拟物特异的配体结合剂或配体、一种或多种对照、一种或多种试剂和一种或多种耗材；任选地连同根据本文定义的任何方法使用该试剂盒的说明书。
可以理解，本文所述的实施方案可以应用于本发明的所有方面。此外，本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，均通过引用并入本文，如同完整阐述一样。
现在将参考以下非限制性实施例举例说明本发明。
实施例1
1907个在FIT（便潜血）测试中测试为阳性并出于此原因被转诊进行结肠镜检查的人给出了提供血液样品和匿名使用患者数据的知情同意书。在结肠镜检查之前采集血液样品并使用一些测定进行分析，所述测定用于无细胞核小体，包括核小体自身和含有5-甲基胞嘧啶修饰的DNA、组蛋白变体H2AZ和mH2A1.1、组蛋白修饰pH2AX、H2AK119Ub、H3K36Me3、H4K20Me3、H4PanAc和H3S10Ph，以及核小体加合物核小体-HMGB1和核小体-EZH2的外遗传特征的核小体。
所有这些核小体测定都可用于本发明的方法。涉及5个核小体测定（5-甲基胞嘧啶、H2AK119Ub、pH2AX、H3K36Me3和核小体-HMGB1加合物）连同人的数字FIT水平和年龄的一个组的结果在图1中的ROC曲线中显示，所述结果用于针对结肠镜检查没有发现的病例鉴别CRC病例。ROC曲线显示，在25％的特异性，组测试的灵敏度为100％（诊断患有CRC的118个人中的118个被正确鉴别为需要结肠镜检查）。这意味着这25％的受试者不需要结肠镜检查，并且不对这些受试者进行进一步调查将不会导致任何遗漏的CRC病例。因此，这25％的受试者代表1907个受试者的FIT阳性组中的极低CRC风险亚组，其可以在结肠镜检查前鉴别出来。此外，特异性可以增加到33％，同时保持97.4％的灵敏度（诊断患有CRC的118个患者中的115个被正确地鉴别为需要结肠镜检查）。因此，结肠镜检查的转诊可以减少四分之一而没有遗漏任何CRC病例，或减少三分之一，同时遗漏了2.6％的CRC病例。相比之下，通过提高FIT / FOBT测试阈值截止水平，最多遗漏10％的CRC病例。
实施例2
1907个在FIT（便潜血）测试中测试为阳性并出于此原因被转诊进行结肠镜检查的人给出了匿名使用患者数据的知情同意书。对于每个人，将他们的粪便血红蛋白（Hb）水平（以μgHb / g粪便为单位）和患者年龄（以岁为单位）输入表达式：
0.0129 x FIT水平(µg Hb/g 粪便) + 0.0688 x年龄(岁)
如果表达式的输出值大于4.8，则患者被指定为CRC的高风险并且需要结肠镜检查。相应地，如果表达式的输出值小于4.8，则患者被指定为CRC的低风险且不需要结肠镜检查。
在118个诊断出的CRC病例中，使用该方法将114个正确指定为需要结肠镜检查。相似地，252个高风险腺瘤病例中的222个（88.1％）被正确指定为需要结肠镜检查。ROC曲线显示，在25％的特异性，用于CRC的方法的灵敏度高于95％。这意味着不对这些受试者进行进一步调查将导致少于5％的遗漏的CRC病例。因此，这25％的受试者代表1907个受试者的FIT阳性组中的低CRC风险亚组，其可以在结肠镜检查前鉴别出来。相比之下，通过提高FIT /FOBT测试阈值截止水平，最多遗漏10％的CRC病例。
实施例3
599个在FIT（便潜血）测试中测试为阳性并出于此原因被转诊进行结肠镜检查的人给出了提供血液样品和匿名使用患者数据的知情同意书。在结肠镜检查之前采集血液样品并分析铁蛋白和CEA。将与患者的年龄和数字FIT结果组合的测定结果输入表达式：
0.51 x 年龄(岁) + 0.17 x CEA (ng/ml) - 17.85 x (5xFIT)-0.1 (µg Hb/g粪便) -0.17 x 转铁蛋白(ng/ml)
该表达式被设定为使结肠镜检查转诊减少25％。如果表达式的输出值大于-8.6，则患者被指定为CRC的高风险并且需要结肠镜检查。相应地，如果表达的输出值小于-8.6，则患者被指定为CRC的低风险且不需要结肠镜检查。在118个诊断出的CRC病例中，使用本发明的这种方法将116个正确指定为需要结肠镜检查，证明可以避免25％的结肠镜检查，同时遗漏少于2％的癌病例。相似地，87个高风险腺瘤病例中的79个被正确指定为需要结肠镜检查，证明有9％的高风险腺瘤病例被遗漏。
本领域技术人员可以理解，创建该表达式和本文的其它表达式以提供结肠镜检查转诊的特定减少。可以出于其它目的修改表达式，但是所有这种表达式都包含在本文中。
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Claims (5)

1.检测和/或筛查患者中的结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的方法，包括：
（a）鉴别发现便潜血阳性的患者；和
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的一种或多种部分的水平，其中所述部分选自无细胞核小体、无细胞核小体的外遗传特征、癌胚抗原、铁代谢生物标志物或低氧诱导因子，
其中步骤（b）中获得的结果表明患者患有结肠直肠癌（CRC）、结肠直肠腺瘤或息肉的可能性。
2.用于评估患者对结肠镜检查的适合性的方法，包括：
（a）测试从患者获得的粪便样品中的便潜血;
（b）检测或测量从患者获得的血液、血清或血浆样品中的一种或多种部分的水平，其中所述部分选自无细胞核小体、无细胞核小体的外遗传特征、癌胚抗原、铁代谢生物标志物或低氧诱导因子;和
（c）使用（b）中获得的结果作为患者对结肠镜检查的适合性的指示物。
3.如权利要求1-2的任一项定义的方法，其另外包括使用数字便潜血结果作为步骤(b)中的参数。
4.如权利要求1-3的任一项定义的方法，其另外包括在步骤(b)中使用临床参数。
5.如权利要求4定义的方法，其中所述临床参数选自：年龄、性别和体重指数(BMI)。
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